CN115372628B - 与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的代谢标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的代谢标志物及其应用，所述代谢标志物包括Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2。本发明首次发现了上述代谢标志物在转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者与健康人群中呈现显著性差异，且具有较高的AUC值，提示代谢标志物在转甲状腺素蛋白淀粉样变性中具有较高的诊断价值。

Description

与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的代谢标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的代谢标志物及其应用。

背景技术

转甲状腺素蛋白淀粉样变性(transthyretin amyloidosis，ATTR)是由转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)错误折叠导致其在组织中异常沉积引起的疾病。转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)是一种血浆转运蛋白，主要由肝合成，以四聚体形态与甲状腺素和视黄醇结合并进行转运。TTR蛋白的异常解聚是该病的核心机制，TTR基因突变位点、年龄、性别、家族史等多项危险因素与上述病理机制密切相关。根据有无TTR基因突变，ATTR分为突变型(ATTRm)和野生型(wild-type TTR，ATTRwt)。ATTRm是一种常染色体显性遗传病，目前已发现超过120个致病的TTR基因突变位点，ATTRm发病率仅为0.87/100,000，截至2016年全球患病人数仅有38468人，是一种罕见病，已入选我国第一批罕见病目录。ATTR疾病具有发病率低、进行性加重、临床表现多样、临床诊断及鉴别诊断难度大等特点，且预后极差，5年生存率不到50％。

代谢组学是一门新兴发展的学科，作为系统生物学的最下游，是基因组学、转录组学和蛋白质组学之后系统生物学的重要组成部分。代谢组学整体的研究模式可以帮助更加全面的理解代谢物质在疾病发生、发展过程中的变化规律，因此被普遍应用于疾病的诊断、治疗和疗效评估等方面。作为基因组学和蛋白质组学的延伸，代谢组学比前两者更能说明确实已经发生了的事情，反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物等诸多因素综合作用于机体后的总的反应，是基因表达的终产物，分析结果提供的信息也较基因组学和蛋白组学更为全面。通过一系列的数据采集手段得到包含全部代谢产物信息的指纹图谱，并利用化学计量学对这些信息进行提取，找出有用的信息，通过对上述小分子代谢产物的分析给出最终的、整体的结果。

因此，研究转甲状腺素蛋白淀粉样变性的代谢组学，对于发病机制的揭示以及疾病的诊断、治疗和疗效评估具有重要的意义。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的代谢物，通过检测代谢物的水平，判断患者是否患有转甲状腺素蛋白淀粉样变性，从而为转甲状腺素蛋白淀粉样变性的早期诊断提供一种新的手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测样本中代谢标志物的试剂在制备诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性的产品中的应用，所述代谢标志物包括Lysopc 20:4、LysoPE16:0或Prostaglandin B2的一种或几种。

进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、液质联用法检测样本中Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2含量的试剂。

进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。

进一步，所述样本选自血液。

本发明的第二方面提供了一种用于诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性的产品，所述产品包括检测样本中Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2的试剂。

进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、液质联用法检测样本中代谢标志物含量的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片。

本发明的第三方面提供了Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2在构建诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性的计算模型中的应用。

本发明的第四方面提供了一种系统，所述系统包括：

1)用于测定样本中Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2特征值的工具；

2)比较样本中代谢值特征值的工具；

3)数据存储介质。

本发明的第五方面提供了Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2在制备治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的药物组合物中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关的代谢标志物，通过检测代谢标志物的含量可以判断受试者是否患有转甲状腺素蛋白淀粉样变性，以实现转甲状腺素蛋白淀粉样变性的早期诊断，从而在疾病早期进行干预治疗，提高患者的生存质量。

附图说明

图1是Lysopc 20:4箱式图和ROC诊断图，其中，1A是箱式图，1B是ROC诊断图；

图2是LysoPE 16:0箱式图和ROC诊断图，其中，2A是箱式图，2B是ROC诊断图；

图3是Prostaglandin B2箱式图和ROC诊断图，其中，3A是箱式图，3B是ROC诊断图。

具体实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本发明提供了检测样本中代谢标志物的试剂在制备诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性的产品中的应用，所述代谢标志物包括Lysopc 20:4、LysoPE 16:0或ProstaglandinB2的一种或几种。

在本发明中，“代谢标志物”或“代谢物标志物”被定义为适合作为转甲状腺素蛋白淀粉样变性存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。“代谢标志物”或“代谢物标志物”通常在本发明的上下文中同义使用，并且通常是指一种代谢物的量或两种或更多种代谢物的含量或比率。

在本发明中，“代谢物”意指由代谢产生的或必需用于或参与具体代谢过程的任何物质。该术语不包括大的巨大分子，诸如大的蛋白质(如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的蛋白质)；大的核酸(如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的核酸)；或大的多糖(如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的多糖)。术语代谢物包括在化学反应中的信号转导分子和中间体，所述反应将源于食物的能量转换为可用的形式，包括但不限于：糖、脂肪酸、氨基酸、核苷、抗氧化剂、维生素、辅助因子、脂质、在细胞过程(cellular processes)中形成的中间体和其它小分子。

在本发明中，代谢物的水平或含量可为以下的一个或多个：代谢物的绝对或相对量或浓度；代谢物的存在或缺乏；代谢物的量或浓度的范围；代谢物的最小和/或最大量或浓度；代谢物的平均量或浓度；和/或代谢物的中位数量或浓度。作为一种可选择的实施方案，对于代谢物的组合的水平也可为相关彼此的两个或更多个代谢物的绝对或相对量或浓度的比值。可通过检测在一个或多个适当的患者中所需代谢物的水平，确定对于特定疾病状态、其显型或缺乏的适当代谢物的阳性和阴性参考水平，且这样的参考水平可被修改使之适合于特殊的患者群体(如，参考水平可为年龄相匹配的，以便可在得自某个年龄的患者样品中的代谢物水平与在某个年龄组中的具体疾病状态、其显型或缺乏的参考水平之间进行比较)。作为另外一种可选择的实施方式，参考水平可被修改使之适合于特殊的技术，所述技术可被用于检测生物样品中的代谢物水平(如LC-MS、GC-MS等)，在那里代谢物水平基于所用的特殊技术可不同。

在本发明中，术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的实施方案中，基于分析样本中的代谢标志物来诊断对象中的转甲状腺素蛋白淀粉样变性。

在本发明的实施方案中，可在疾病进展的临床体征出现之前作出诊断。在一个实施方案中，本发明提供在患者中诊断受试者患转甲状腺素蛋白淀粉样变性的方法，其中从患者收集样品并检测样品中一种或多种代谢物的水平。基于所检测的代谢物的水平，判断患者是否患有转甲状腺素蛋白淀粉样变性。在本发明的实施方案中，所检测的代谢物包括Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2。本发明可采用本领域熟知的方法进行检测，包括并不限于简单比较法如手工比较法、统计分析法如t-检验、Welch′sT-检验、Wilcoxon′s秩和检验、随机森林算法。

进一步，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、液质联用法检测样本中代谢标志物含量的试剂。

在本发明的实施方案中，通过色谱法检测样本中代谢标志物含量。色谱包括GC，CE，LC，HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振。

在本发明的实施方案中，通过质谱法检测样本中代谢标志物含量。质谱法包括例如串联质谱法、基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法、MALDI-TOF-TOF质谱法、MALDI四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱法、电喷射离子化(ESI)-TOF质谱法、ESI-Q-TOF、ESI-TOF-TOF、ESI-离子阱质谱法、ESI三重四极杆质谱法、ESI傅立叶变换质谱法(FTMS)、MALDI-FTMS、MALDI-离子阱-TOF和ESI-离子阱TOF。以其最基本的水平，质谱法涉及使分子电离和随后测量所得离子的质量。由于分子以公知的方式电离，可以精确地由离子的质量确定分子的分子量。

串联质谱法涉及首先获得所关注的离子的质谱，随后破碎该离子并获得片段的质谱。串联质谱法因此提供分子量信息和破碎谱，其可一起结合分子量信息使用以识别肽或蛋白质或小分子(低于1500道尔顿)的确切序列。

在本发明的实施方案中，通过液质联用法检测样本中代谢标志物含量。液质联用又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动部分相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

作为优选的实施方案，所述产品还包括处理样本的试剂。

在本发明的实施方案中，“样本”包括从个体获得或用其他方式取得的任何物质、生物流体、组织或细胞。其包括血液(包括全血、白血球、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆和血清)、痰液、泪液、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、呼吸样、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑膜液、关节抽吸物、腹水、细胞、细胞提取物和脑脊液。

在本发明的具体实施方案中，所述样本为血液。

本发明提供了一种系统，所述系统包括：

1)用于测定样本中Lysopc 20:4、LysoPE 16:0和/或Prostaglandin B2特征值的工具；

2)比较样本中代谢值特征值的工具；

3)数据存储介质。

本发明中的“系统”涉及彼此有效连接的不同工具。所述工具可落实到单个装置中或可以是彼此有效连接的物理上分离的装置。用于比较代谢物特征值的工具优选基于用于比较的算法而进行运作。数据存储介质优选包含上述数据集合或数据库，其中存储数据组的每一组指示转甲状腺素蛋白淀粉样变性或其易感性。因此，本发明的系统允许鉴定存储在数据存储介质中数据集合是否包含试验数据组。本发明的系统可用作诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性或其易感性的诊断工具。

在本发明中，术语“用于测定代谢物特征值的工具”优选涉及用于测定代谢物的如质谱分析装置、NMR装置，或进行代谢物化学或生物测定的装置。

在本发明中，术语“数据存储介质”包括基于单个物理实体如CD、CD-ROM、硬盘、光存储介质或磁盘的数据存储介质或者云盘。此外，所述术语还包括由物理分离实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供上述数据集合的方式，优选以查询搜索的合适方式彼此有效连接。

本发明中的数据存储介质存储数据集合，术语“数据集合”指在物理上和/或逻辑上集合的数据集合。因此，数据集合可落实到单个数据存储介质中或彼此有效连接的物理上分离的数据存储介质中。优选的，数据集合落实到数据库中。因此，如此处所用的数据库包含在合适的存储介质上的数据集合。此外，数据库优选还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选为基于因特网的分级数据库管理系统或面对对象数据库管理系统。此外，数据库可以是联合数据库或集成数据库。更优选的，数据库将落实为分布式(联合)系统，例如Client-Server-System。更优选的，构造数据库以允许搜索算法来比较试验数据组和包含数据集合的数据组。尤其是，通过使用此类算法，可以搜索数据库(即查询搜索)得到指示转甲状腺素蛋白淀粉样变性或其易感性的相似或相同数据组。因此，如果可以在数据集合中鉴定到相同的或相似的数据组，试验数据组将与转甲状腺素蛋白淀粉样变性或其易感性相关。结果，从数据集合中获得的信息可以基于从受试者获得的试验数据组用于诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性或其易感性。更优选的，数据集合包含上文记载的任何一组包含的所有代谢物的特征值。

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例 转甲状腺素蛋白淀粉样变性相关代谢物的筛选及检测

1、队列招募人群

招募22名健康志愿者和13名在北京协和医院确诊为遗传型转甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTRm)的患者。诊断是通过临床症状、家族史、超声心动图、活检和基因筛查来验证的。所有血液/尿液/骨活检中轻链水平升高或未确认TTR突变的淀粉样蛋白患者均被排除。其他排除标准包括：1)入组前3个月内接受抗生素治疗_≥3天；2)现患器质性消化系统疾病，或1年内接受过消化道手术；3)合并甲亢、糖尿病酮症酸中毒、肾上腺皮质功能不全、妊娠、严重贫血、严重肾功能不全(eGFR_≤15ml/min/1.73m²)、中毒或药物副反应；4)确诊全身性自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)或恶性肿瘤。

健康对照组入组标准：医师问诊、查体及血化验确认为健康人群。

对于参与者，在入院后的第二天早上抽取外周静脉血，并收集新鲜的血清样本，并立即在-80℃下冷冻。所有的临床信息都按照标准程序收集。

本研究得到了北京协和医院伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》的原则执行。所有受试者都提供了参与该研究的书面知情同意书。

2、血液样本的采集与保存

受试者于清晨空腹状态下抽取外周静脉血，使用EDTA-K2抗凝采血管(血浆管)与分离胶促凝管(血清管)各采集1管约5ml样本，获取样本后于1小时内离心(血浆管500g×10分钟，血清管3500rpm×5分钟)，取上清液分装至1.5mleppendorf管，并置于-80℃冰箱中保存。

3、血清非靶向代谢组学检测及差异代谢物筛选

血清代谢组学采用超高效液质联用(UHPLC-MS)分析，期间使用Vanquish超高效液相色谱系统(ThermoFisher，德国)和Orbitrap Q ExactiveTM HF质谱仪(Thermo Fisher，德国)，在Novogene Co.,Ltd.(北京，中国)仪器。首先进行样本代谢物提取，然后LC-MS/MS上机检测分子特征峰，检测过程中使用实验样本等体积混合制成的QC样本进行数据质控。然后，使用CompoundDiscoverer 3.1(CD3.1)软件对下机原始结果进行数据预处理，首先通过保留时间、质荷比等参数简单筛选，对于不同样本根据保留时间偏差和质量偏差(Partper million，ppm)进行峰对齐，使鉴定更准确；随后根据设置的ppm、信噪比(Signal-to-noise ratio，S/N)、加合离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量。然后比对高分辨二级谱图数据库mzCloud和mzVault以及MassList一级数据库检索，进行代谢物鉴定。具体原理为：根据一级质谱中母离子的质荷比(m/z)确定代谢物的分子量，通过ppm以及加合离子等信息进行分子式预测，然后与数据库进行匹配；含有二级谱图的数据库根据实际二级谱图与数据库中每个代谢物的碎片离子、碰撞能等信息进行匹配，实现代谢物的二级鉴定。质量控制(QC)样品中变异系数(CV)值小于30％的特征被过滤后用于下游分析。代谢物使用KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、HMDB数据库(https://hmdb.ca/metabolites)和LIPIDMaps数据库(http://www.lipidmaps.org/)进行注释。获得血清代谢物注释及定量表后，使用SIMCA软件(v14.1，Umetrics，瑞典)进行多变量统计分析OPLS-DA，计算各特征的VIP值，利用Wilcoxon秩和检验计算显著性，最终选取VIP_＞1且P_＜0.05的代谢物为差异代谢物。

4、评估差异代谢物的诊断效能

使用R包pROC计算差异代谢物的获得受试者工作曲线(ROC)，计算曲线下面积(AUC)及最佳Cut-off值，从而获得多个诊断模型。从中筛选出AUC值最优的差异代谢物作为候选的诊断标志物。

5、实验结果

结果发现，ATTRm患者中脂质代谢产物LysoPC20:4，LysoPE16:0和prostaglandinB2明显升高，诊断AUC分别为0.993，0.996和0.982，有较高的诊断预测价值(图1-图3)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.检测样本中代谢标志物的试剂在制备诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性的产品中的应用，其特征在于，所述代谢标志物包括Lysopc 20:4、LysoPE 16:0或Prostaglandin B2的一种或几种，所述样本选自血液。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过靶向或非靶向的核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法、液质联用法检测样本中代谢标志物含量的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片。

5.权利要求1中所述的代谢标志物在构建诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性的计算模型中的应用。

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