CN115364060A - 一种冻干药物制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冻干药物制剂及其用途。本发明还涉及冻干形式的药物制剂，其包含作为活性成分的药理学有效量的干扰素β‑1a，作为增量剂的二糖，和非离子表面活性剂。重构后，组合物可静脉内给药。

Description

一种冻干药物制剂及其用途

本申请是申请日为2017年2月28日的中国专利申请201780002738.3“一种冻干药物制剂及其用途”的分案申请。

技术领域

本发明涉及干扰素β-1a的冻干药物制剂和该制剂的用途。

背景技术

干扰素β-1a是干扰素β1激动剂，能够上调CD73，该分子产生抗炎腺苷，其增强内皮屏障功能，并导致预防血管渗漏(ARDS中主要的病理生理事件)。ARDS中的血管渗漏使血浆渗入肺泡空间，导致潜在的危及生命的低氧血症。干扰素β-1a具有通过减少血管渗漏来减少ARDS的影响的潜力，但不限于这个实例。

与所有基于蛋白质的药物一样，使用干扰素β(IFN-β)作为治疗剂必须克服的一个主要障碍是可能由于其在药物制剂中的不稳定而导致的药物效用损失。威胁药物制剂中多肽活性和效果的物理不稳定性包括变性和形成不溶性聚集体，而化学不稳定性包括例如水解、氧化和脱酰胺。已知这些变化中的一些导致所关注的蛋白质的药物生物活性的丧失或降低。当给予少量的激素肽时，保证患者接受适当剂量也是至关重要的。由于IFN-β中亲脂性氨基酸残基含量高，它粘附在容器表面并形成聚集体，导致活性药物成分的损失。

另一个要求(特别是对于用于ARDS治疗的药品)是药品必须在紧急情况下可用。因此，需要包含IFN-β 1a的稳定的冻干药物制剂，其具有长的保质期并且保留其药用性，特别是如果冷冻干燥，需要仔细控制剂量给药以及在给药期间的使用稳定性。这些要求对于静脉内给药的化合物是必要的，因为患者立即暴露于药物。

发明内容

本发明的目的是提供包含干扰素β-1a的冻干形式的稳定的药物制剂。

本发明的目的尤其是提供冻干形式的药物制剂，其包含干扰素β-1a，该制剂能够在重构后良好地回收干扰素β-1a。

本发明的另一个目的是提供用于静脉内给药以预防和治疗人血管内皮疾病的药物制剂。特别是，本发明的目的是提供药物制剂，用作预防急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血管渗漏的治疗，但不限于此病症。

为了实现诸如以上提出的目的，本发明的特征在于所附独立权利要求中提出的内容。

冻干形式的根据本发明的典型药物制剂包含作为活性成分的单剂量形式中2.0-15μg的量的干扰素β-1a，作为增量剂的二糖，和非离子表面活性剂。

根据本发明，可以将干扰素β-1a配制成冻干物，其可以被重构以得到含有药理学有效和正确量的干扰素β-1a的水溶液以递送给患者。因此，本发明还提供了通过重构冻干制剂而获得的水性药物组合物。

具有药理学有效量的干扰素β-1a的本发明水性组合物特别适用于静脉内给药。

本发明还涉及包含本发明的水性药物组合物的递送装置。

本发明还涉及包含本发明的水性药物组合物的预填充注射器。

本发明进一步涉及根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物，用于预防和/或治疗人血管内皮疾病。

更具体地说，本发明涉及根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物，用于静脉内给药以预防和/或治疗人血管内皮疾病，其中干扰素β-1a以2.0-15µg/剂量给予患者。

本发明进一步涉及根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物，用于预防急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身炎症反应综合征(SIRS)和其它创伤性病症中的血管渗漏。

本发明进一步涉及根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物，用于预防和/或治疗血管或心脏手术和器官移植中的缺血-再灌注损伤，或用于主要血管或心脏手术和器官移植前的缺血预调节。

本发明还涉及根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物，用于预防和/或治疗急性胰腺炎和急性肾损伤。

根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物也适用于严重危及生命的病毒感染，例如EBOLA、MERS、流感(例如禽流感)以及导致全身炎症反应综合征(SIRS)和中枢器官功能障碍的其它类似病症。

本发明还涉及根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物，用于预防和/或治疗MOF。此外，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官衰竭(MOF)的严重细菌性肺炎和败血症。

附图说明

图1-4显示了重构的INF-β1a冻干物的非还原性SDS-PAGE。参见实验部分的制剂研究A，

图5显示了冻干物重构后INF-β1a的定量。参见实验部分的制剂研究A，

图6显示了在制剂研究A的稳定性研究期间在40℃储存过程中表示氧化的INF-β1a种类增加的亲水性峰的相对峰面积的进展。

图7显示了表示在40℃储存期间指示蛋白质折叠变化的INF-β1a种类增加的疏水性峰的相对峰面积的进展。参见实验部分的制剂研究A。

图8显示了在40℃储存12周之后制剂的重构冻干物的非还原性SDS-PAGE。见制剂研究A。

图9显示了在40℃储存12周后，制剂的重构冻干物的还原性SDS-PAGE。参见制剂研究A。

图10显示了由于在不同材料的表面上的吸附而导致的INF-β1a的损失。参见制剂研究A的最后部分。

图11显示在从一个瓶到另一个瓶的样品转移过程中INF-β1a的回收率。参见制剂研究B。

图12显示了重复塞接触后INF-β1a的回收率。见制剂研究B。

图13显示了根据冷冻干燥研究的冻干试验(lyo-trial)的数字数据采集。

图14显示了冻干物的垂直截面。参见冷冻干燥研究。

图15显示了来自冻干物的边缘侧的透射光图像。参见冷冻干燥研究。

图16-20显示了稳定性研究结果的汇编。

图21显示了生物效果研究的MxA浓度图。

本发明的详细描述

术语和定义

在本申请中，术语“干扰素beta-1a”，“INF-beta 1a”和“INF-β1a”是可互换的，并且它们被用作彼此的同义词。

表述“药理学有效量”意欲包括足以实现所需治疗结果的干扰素β-1a的任何量。

术语“治疗”或“治疗的”应理解为包括疾病的完全治愈以及所述疾病的改善或减轻。

术语“预防”应理解为包括完全预防、防止所述疾病或失调以及降低个体患上所述疾病或失调的风险。

术语“患者”或“个体”是指人。

关于本发明的药物制剂的术语“冻干”旨在指制剂的水溶液的冷冻干燥。术语“冻干物”是指冻干产物。术语“重构”是指溶解冻干物以获得水溶液。

术语“静脉内”或“IV”给药是指在血管或淋巴管内给药。

本发明的实施方案

本发明涉及干扰素β-1a药物制剂，其具有提高的稳定性和重构后干扰素β-1a的基本完全的回收。根据本发明的冻干形式的药物制剂至少包含药理学有效量的作为活性成分的干扰素β-1a，作为增量剂的一种或多种二糖，和非离子表面活性剂。

已经观察到，为了在冷冻干燥和重构之后基本上完全回收干扰素β-1a以及在储存过程中稳定干扰素β-1a防止冷冻干燥状态下的降解，需要作为增量剂的二糖和非离子表面活性剂例如聚山梨醇酯或聚乙二醇(PEG)的组合。根据本发明的冻干制剂在2-8℃的温度下稳定至少24个月，优选至少30个月，更优选甚至36个月。还观察到冻干制剂的干扰素β-1a甚至在室温(25-30℃±2℃)下储存时仍保持其活性。因此，根据本发明的冻干制剂在室温下具有至少六个月，优选至少12个月，更优选甚至24个月的储存稳定性。

非离子表面活性剂如聚山梨醇酯或聚乙二醇(PEG)既用于防止表面吸附又用作抗蛋白质聚集的稳定剂。特别需要表面活性剂以防止冷冻干燥和重构期间INF-β1a的损失。通过使用聚山梨醇酯或PEG作为表面活性剂，可以获得冷冻干燥和重构后INF-β1a基本上完全的回收。冻干物重构后，干扰素β-1a内含物的回收率可以超过85%，优选超过90%，甚至更优选95%。重构后基本上完全的回收是重要的，因为给予患者的干扰素β-1a的单次静脉内剂量小，因此保证患者接受适当剂量至关重要。

根据本发明的一个实施方案，非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯或PEG。根据本发明的一个优选实施方案，表面活性剂是聚山梨醇酯。聚山梨醇酯可以是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80或任何其它聚山梨醇酯。在本发明的优选实施方案中，聚山梨醇酯可以是聚山梨醇酯20，也称为吐温20。根据本发明的一个实施方案，冻干制剂包含0.9-2重量%，优选1-1.5重量%，更优选1.1-1.3重量%的表面活性剂，如聚山梨醇酯或PEG/瓶，基于冻干制剂的总重量。

在本申请中制剂组分的量按每个瓶呈现；单个瓶包括冻干形式的单剂量的本发明的药物制剂。

在本发明的优选实施方案中，二糖选自海藻糖、蔗糖及其组合。已经观察到，海藻糖二水合物或蔗糖是用于向制剂提供增量和稳定INF-β1a以防止在储存过程中冷冻干燥状态下降解的最合适的增量剂。根据一个优选的实施方案，海藻糖二水合物被用作增量剂。根据本发明的一个实施方案，基于冻干制剂的总重量，冻干制剂包含50-80重量%，优选60-75重量%，更优选63-67重量%的二糖/瓶。

根据本发明的一个优选实施方案，冻干制剂包含药理学有效量的作为活性成分的干扰素β-1a，作为增量剂的二糖，非离子表面活性剂，用于在冻干物重构后维持约5.5至7.5的pH的缓冲剂，和优选抗氧化剂。

根据本发明的一个实施方案，冻干制剂进一步包含合适的缓冲剂，用于维持冻干物重构后约5.5至7.5，优选约6.0至7.0，更优选约6.3至6.7的pH。根据本发明的制剂的缓冲剂可以选自磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、柠檬酸三钠二水合物或其组合。可以基于目标pH来选择制剂中的缓冲剂，并且可以改变各单独试剂的组合和比例。

根据本发明的一个实施方案，冻干制剂还包含抗氧化剂。根据本发明的一个优选实施方案，冻干制剂包含蛋氨酸作为抗氧化剂以保护制剂免于氧化。蛋氨酸可以是DL-蛋氨酸或L-蛋氨酸。根据本发明的实施方案，蛋氨酸可已经被包括在干扰素β-1a药物中。

根据本发明的一个实施方案，冻干形式的药物制剂包含：

-至少药理学有效量的干扰素β-1a作为活性成分，

-0.5至1.0mg/瓶，优选0.6至0.8mg/瓶的非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯或PEG，

-30至50mg/瓶，优选35-40mg/瓶海藻糖二水合物或蔗糖，

-15至28mg/瓶，优选18至22mg/瓶的缓冲剂的组合，和

-0.1至0.3mg/瓶，优选0.17-0.23mg/瓶的抗氧化剂。

根据本发明的制剂包含药理学有效量的干扰素β-1a。干扰素β-1a优选是重组人干扰素β-1a。重组产生的IFN-β-1a是指具有与成熟天然IFN-β1a相当的生物学活性并且已经通过重组DNA技术制备的IFN-β1a。根据本发明的一个实施方案，干扰素β-1a药物可以含有不溶性聚集体，并且在混合该制剂之前纯化药物以去除这些存在的不溶性聚集体。根据本发明的一个优选实施方案，95-100%的IFN-β1a将为单体形式，以提供干扰素β-1a的生物学活性和在重构过程中良好的溶解度。干扰素β-1a的生物活性(效价)应高于150MIU/mg(MIU=百万国际单位)。根据本发明的实施方案，根据本发明的制剂在单一静脉内剂型中包含2.0-15μg量的具有至少150MIU/mg的生物活性的干扰素-β1a作为活性成分。

在本发明所涵盖的制剂中，干扰素β-1a在单一静脉内剂型中的量优选在约2.0μg至15μg之间变化。可以将单一静脉内剂型中超过15μg的干扰素β-1a的量(例如15-20μg或甚至高达25μg)给予患者，但观察到显著增加的副作用。在单一静脉内剂型中低于2.0μg的干扰素β-1a的量不足以产生任何可观察到的效果。根据本发明的一个实施方案，干扰素β-1a在单一静脉内剂型中的量为约10μg。干扰素β-1a的生物学活性因此通常可以在1.5-3.4MIU/10μg剂型的范围内。

为了促进冻干制剂的储存稳定性，根据本发明的冻干制剂的残留水分含量可以不超过5重量%。根据一个实施方案，残留水分含量在约1-5重量%，优选约1-4重量%的范围内。为了达到所要求的游离残留水含量限度而不使蛋白质变性，冻干循环必须进行优化。根据本发明的实施方案，已经观察到，如实验部分所示，约30-35小时，优选约31小时的冷冻干燥循环对于本发明的制剂是最佳的。

根据本发明的一个实施方案，冻干制剂包含：

-干扰素β-1a作为活性成分，

-海藻糖二水合物或蔗糖作为增量剂，

-磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、柠檬酸三钠二水合物及其任意组合作为缓冲剂，

-聚山梨醇酯或聚乙二醇作为表面活性剂，和

-蛋氨酸作为抗氧化剂。

更具体地说，根据一个优选实施方案的冻干制剂包含：

-干扰素β-1a，优选重组人干扰素β-1a作为活性成分，

-海藻糖二水合物作为增量剂，

-磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物和柠檬酸三钠二水合物的组合作为缓冲剂，

-聚山梨醇酯20作为表面活性剂，和

-蛋氨酸作为抗氧化剂。

典型地，根据本发明的冻干制剂由具有5.5-7.5的pH的水溶液制备，并且所述水溶液包含药理学有效量的干扰素β-1a作为活性成分，作为增量剂的二糖，和非离子表面活性剂。在本发明的优选实施方案中，根据本发明的冻干制剂由pH为5.5-7.5，优选6.0-7.0的水溶液制备，并且所述水溶液包含

-药理学有效量的干扰素β-1a，优选重组人干扰素β-1a作为活性成分，

-海藻糖二水合物或蔗糖作为增量剂，

-聚山梨醇酯或PEG作为表面活性剂，

-磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、柠檬酸三钠水合物及其任意组合作为缓冲剂，和

-蛋氨酸作为抗氧化剂。

根据本发明的实施方案，根据本发明的冻干制剂由包含0.05-0.15%(w/v)聚山梨醇酯或PEG，优选聚山梨醇酯，和2-6%(w/v)海藻糖二水合物或蔗糖的水溶液制备。根据本发明的一个优选实施方案，冻干制剂由包含约0.1%(w/v)聚山梨醇酯或PEG，优选聚山梨醇酯，和约5%(w/v)海藻糖二水合物的水溶液制备。

制备根据本发明的冻干物的方法包括以下步骤：制备至少包含干扰素β-1a作为活性成分，作为增量剂的二糖，和非离子表面活性剂例如聚山梨醇酯或PEG的水溶液，以及冻干水溶液。执行上述冻干的冻干机是市售的，并且可由本领域技术人员容易地操作。冻干过程通常包括三个阶段：冷冻，初级干燥和二级干燥，如实验部分中更详细描述的。典型地，将水溶液在瓶中冻干，其中每个瓶含有单位剂量的本发明的干扰素β-1a制剂。因此，瓶内的冻干物是根据本发明的单一剂型。根据本发明的本制剂提供了在冷冻干燥过程中可溶性聚集体的形成。

含有冻干制剂的容器如瓶优选由可灭菌和惰性材料制成。合适的材料是例如聚丙烯、环烯烃共聚物、I型标准玻璃和I型硅化玻璃。优选地，使用I型硅化玻璃瓶作为包装材料用于避免干扰素β-1a的初始损失。通过玻璃表面的内表面的硅化可以防止INF-β1a的吸收。根据本发明的优选实施方案，将容器(例如瓶)的内表面硅化，以避免冷冻干燥后INF-β1a的初始损失。使用聚山梨醇酯作为表面活性剂也可以保护蛋白质免于在硅化玻璃表面上的吸附。

在冻干物可以给予患者之前，应该用水性重构剂将其重构。该步骤允许冻干物中的干扰素β-1a和其它组分重新溶解，从而得到适合静脉内注射给患者的水性药物组合物。通常，注射用水被用来重构冻干物。典型地，重构的水性组合物的体积在0.9至1.1mL之间，优选1mL。

在重构的水性组合物中，干扰素β-1a以2µg/mL至15 µg/mL的浓度存在。根据本发明的一个实施方案的重构水性组合物进一步包含

-0.5至1.0mg/mL，优选0.6-0.8mg/mL作为表面活性剂的聚山梨醇酯或PEG，

-30至50mg/mL，优选35-40mg/mL作为增量剂的海藻糖或蔗糖，

-15至28mg/mL，优选18至22mg/mL的缓冲剂组合，所述组合包含磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物和柠檬酸三钠二水合物，以及

-0.1至0.3mg/mL，优选0.17-0.23mg/mL作为抗氧化剂的蛋氨酸，

并且所述水性组合物的pH在5.5和7.5之间，优选在6.0和7.0之间。

当干扰素β-1a制剂用于递送给人时，水溶液的等渗性也是考虑因素。因此，在本发明的一个实施方案中，用于静脉内给药的水溶液将提供与患者血清或体液相同或相似的等渗性。重构的水性组合物的渗透度可以在250至350mOsmol/kg的范围内。

本发明的水性药物组合物可以被给予患者。根据本发明的优选实施方案，所述水性药物组合物适用于静脉内给药。给药通常将通过注射器。因此，本发明还提供包含本发明的水性药物组合物的递送装置和预填充注射器。根据本发明的优选实施方案，递送装置或预填充注射器的内表面被硅化以防止INF-β1a被吸收到递送装置或预填充注射器的表面，因此本发明提供了当静脉内给予患者时干扰素β-1a的精确剂量给药。合适的材料与前面提到的瓶材料相同。通常，使用1mL注射器重构冻干物。干扰素β-1a向患者的精确剂量给药可以通过使用根据本发明的制剂和硅化递送装置或注射器的组合来实现。在重构和递送给患者期间观察到的干扰素β-1a的损失仅为约1μg/剂量，优选低于1μg/剂量。因此，本发明提供了以干扰素β-1a的损失最多为1µg/剂量的方式向患者给予干扰素β-1a的方法。

患者将接受有效量的干扰素β-1a作为主要活性成分，即足以治疗、改善或预防所述疾病或失调的量。干扰素β-1a对于任何特定受试者的最佳有效量和浓度将取决于多种因素，包括患者的年龄、身材、健康和/或性别、病症的性质和程度，以及与干扰素β-1a组合给予的任何可能的其它治疗(一种或多种)。针对特定情况递送的有效量可以由临床医生的判断来确定。为了本发明的目的，可以以2-15μg/剂量将干扰素β-1a给予患者，用于通过静脉内给药预防和/或治疗血管内皮疾病。根据本发明的实施方案，可以将干扰素β-1a给予患者，例如，以7.5-12.5µg/剂量，用于通过静脉内给药预防和/或治疗成人患者的血管内皮疾病。根据本发明的另一个实施方案，干扰素β-1a可以以2.0-12.5μg/剂量给药，用于通过静脉内给药预防和/或治疗患者的血管内皮疾病，例如如果患者是儿童。因此，本发明还涉及将药理学有效量的干扰素β-1a递送给患者的方法，其包括向患者给予本发明的水性药物组合物的步骤。本发明还涉及使用递送装置或预填充的注射器以精确剂量给予患者干扰素β。

本发明的制剂可用于治疗人类的一系列血管内皮疾病。CD73是能产生局部腺苷的内皮细胞外酶，是维持内皮屏障和肺功能的关键分子。干扰素-β增加CD73的表达，导致局部腺苷增加。已知许多炎性病症会导致炎症/损伤的内皮细胞表面的CD73损失，因此降低可用的腺苷含量。腺苷的抗炎特性在文献中是众所周知的，并且任何已知由局部腺苷作用丧失引起的病症都将从CD73表达的上调受益。如果需要长期的帮助，CD73的上调应该是基于从头合成。

因此，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于预防和/或治疗人类的血管内皮疾病。更具体地说，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于静脉内给药以预防和/或治疗患者的血管内皮疾病，其中干扰素β-1a以2.0-15µg/剂量给予患者。根据本发明的实施方案，将干扰素β-1a以7.5-12.5µg/剂量或以2.0-12.5µg/剂量给予患者。

根据本发明的实施方案，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于预防和/或治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身炎症反应综合征(SIRS)和其它创伤性病症中的血管渗漏。

根据本发明的另一个实施方案，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于预防和/或治疗血管或心脏手术和器官移植中的缺血-再灌注损伤，或用于主要血管或心脏手术和器官移植前的缺血预调节。另外，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于预防和/或治疗心肌梗塞和中风中的缺血-再灌注损伤。

根据本发明的另一个实施方案，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于预防和/或治疗急性胰腺炎和急性肾损伤，但不限于这些实例。

根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物也适用于严重危及生命的病毒感染，例如EBOLA、MERS、流感(例如禽流感)以及导致全身炎症反应综合征(SIRS)和中枢器官功能障碍的其它类似病症。

此外，根据本发明的冻干制剂或水性药物组合物适用于导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官衰竭(MOF)的严重细菌性肺炎和败血症。根据本发明的实施方案，冻干制剂或水性药物组合物用于预防和/或治疗MOF。

治疗患者的方法包括至少以下步骤

-提供根据本发明的冻干制剂，

-重构冻干制剂，和

-将重构的水性组合物给予患者。

在本文所述的治疗患者的方法的一个实施方案中，患者具有血管内皮疾病或本申请中描述的任何其它病症。IFN-β1a的给药应该在疾病诊断后尽可能早地开始，并且应当持续至少六天，并且每天给予所需的剂量。根据本发明的实施方案，每日向患者给予包含2.0-15μg量的干扰素β-1a的至少一个剂量，并且给药应持续至少6天。

具体实施方式

本发明还涉及以下实施方案：

1. 冻干形式的药物制剂，其包含作为活性成分的单静脉内剂量形式中2.0-15μg的量的干扰素β-1a，作为增量剂的二糖，和非离子表面活性剂。

2. 根据实施方案1所述的制剂，其中所述干扰素β-1a的生物学活性为至少150MIU/mg。

3. 根据实施方案1或2所述的制剂，所述制剂进一步包含用于在冻干制剂重构后维持约5.5至7.5的pH的缓冲剂，和优选抗氧化剂。

4. 根据前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述二糖选自海藻糖二水合物和蔗糖。

5. 根据前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或聚乙二醇(PEG)。

6. 根据前述实施方案3至5中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、柠檬酸三钠二水合物或其组合作为缓冲剂。

7. 根据前述实施方案3至6中任一项所述的制剂，其中所述抗氧化剂是蛋氨酸。

8. 根据前述实施方案中任一项所述的制剂，其中干扰素β-1a是重组人干扰素β-1a。

9. 根据前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述冻干制剂的残留水分含量不超过5重量%，优选1-5%。

10. 根据前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂由pH为5.5-7.5的水溶液制备并包含

(i)重组人干扰素β-1a作为活性成分，

(ii)海藻糖二水合物或蔗糖作为增量剂，

(iii)聚山梨醇酯或聚乙二醇作为表面活性剂，

(iv)磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物和柠檬酸三钠二水合物的组合作为缓冲剂，和

(v)蛋氨酸作为抗氧化剂。

11. 根据实施方案10所述的制剂，其中所述水溶液包含0.05-0.15%(w/v)聚山梨醇酯或聚乙二醇，优选聚山梨醇酯，和2-6%(w/v)海藻糖二水合物或蔗糖。

12. 水性药物组合物，其通过重构前述实施方案1至11中任一项的冻干制剂而获得。

13. 实施方案12的水性药物组合物，该水性药物组合物用于静脉内给药。

14. 包括实施方案12的水性药物组合物的递送装置。

15. 包括实施方案12的水性药物组合物的预填充注射器。

16. 实施方案14所述的递送装置或实施方案15所述的预填充注射器，其中递送装置或预填充注射器的内表面被硅化。

17. 实施方案1至11中任一项的冻干制剂或实施方案12的水性药物组合物，其用于预防和/或治疗选自以下的疾病或失调：

-血管内皮疾病，

-急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或全身炎症反应综合征(SIRS)中的血管渗漏，

-血管或心脏手术和器官移植中的缺血-再灌注损伤，

-主要血管或心脏手术和器官移植前的缺血预调节，

-急性胰腺炎或急性肾损伤，和

-多器官衰竭(MOF)。

下面的实施例是以说明而非限制的方式提供的。

实验部分

在下面的实验中更详细地描述本发明。本申请的实验部分分为不同的部分。第一部分“制剂研究A”着重于比较用于稳定INF-β1a的不同赋形剂。稳定性研究考虑了冻干溶液的组成，以确保在40℃冷冻干燥状态下INF-β1a稳定4周。基于制剂研究A的结果的第二部分“制剂研究B”和所选的制剂被包括在进一步的研究中以确定赋形剂的有效比例。第三部分“冷冻干燥研究”着重于适用于根据本发明的制剂的冻干循环。第四部分“稳定性研究”研究根据本发明的冻干制剂与用于重构和临床应用的装置和预填充WFI注射器的相容性。第五部分“生物效果研究”确定了干扰素β-1a冻干产物的效果。

1.制剂研究A

分析不同制剂在重构后干扰素β-1a的回收率和冷冻干燥过程中可溶性聚集体的形成。制剂是基于可行性研究而组成的。另外，样品在40℃储存12周，在固定的时间点分析干扰素β-1a的含量以确定储存期间最稳定的制剂。

INF β-1a冻干溶液的制剂

在混合开始之前，通过离心(10分钟，4000rpm)和无菌过滤(0.2μm)纯化INF β-1a药物(由Rentschler Biotechnologie GmbH提供)以除去存在的不溶性聚集体。通过UV光谱(280nm；UV-光谱仪Carry 50，Varian)测量所得的干扰素β-1a浓度，在三种不同纯化程序后得到285µg/ml。INF β-1a浓度的计算基于消光系数(1.351 mL*µg^-1*cm^-1)。

根据相应的目标浓度将赋形剂加入用作液体制剂的柠檬酸盐缓冲液中。表1列出了使用的不同制剂。增量剂选自二糖、氨基酸和糖醇的化学类别，并且其中两种(蔗糖和甘露醇)另外组合。所有赋形剂另外与吐温20组合。将这些储备溶液与纯化的INF β-1a药物以一定比例混合以获得30µg/ml的INF-β1a浓度。

表1. INF β-1a冻干溶液的不同制剂。值为冻干溶液的% (w/v)

无菌过滤后，将1ml相应的冻干溶液装入10R I型玻璃瓶中。

冻干

将填充的瓶装入冷冻干燥机并防热辐射。表2中列出的冷冻干燥循环用于制备样品。

表2：用于制备用于可行性研究和稳定性研究的样品的冷冻干燥循环的步骤。

冻干物的重构

将1ml WFI(注射用水)加入到冻干物中以重构它们。完全溶解后，通过上下移液3次使溶液均匀化并转移到反应管中。根据制造商的操作程序，使用RP-HPLC方法分析重构后干扰素β-1a的含量。

表3：重构后每个瓶的INF-β1a的量；目标量是30µg/瓶。

所有不含吐温20的制剂在重构后仅产生施用的INF-β1a的少量回收，仅为目标量的三分之一。含吐温20的制剂显示完全相反的情况。重构后的回收产生独立于所用赋形剂的目标量。因此，显然需要洗涤剂如吐温20等，其实现了数个INF-β1a分子的空间分离，以防止在冷冻干燥和重构过程中INF-β1a的损失。

平行地，根据制造商的操作程序对重构的冻干物进行非还原SDS-PAGE方法。为了达到非还原条件，用蒸馏水代替还原剂。每孔的加入量保持恒定在6µg。没有进行定量。图1至图4显示了获得的凝胶。图中的白色数字标记线，而黑色数字表示分子量。

图1：线1+9：MW-标记；线2+3：5%蔗糖；线4+5：5%海藻糖；线6+7：5%精氨酸磷酸盐；线8：药物；线10：参考物质。

图2：线1+2：5%甘氨酸；线3+9：MW-标记；线4+5：5%甘露醇；线6+7：2.5%蔗糖+2.5%甘露醇；线8：药物；线10：参考物质。

图3：线1+2：5%蔗糖+0.1%吐温20；线3+4：5%海藻糖+0.1%吐温20；线5+9：MW-标记；线6+7：5%精氨酸磷酸盐+0.1%吐温20；线8：药物；线10：参考物质。

图4：线1+6：MW-标记；线2+3：5%甘氨酸+0.1%吐温20；线4+5：5%甘露醇+0.1%吐温20；线7+8：2.5%蔗糖+2.5%甘露醇+0.1%吐温20；线9：药物；线10：参考物质。

将凝胶1(参见图1)和凝胶2(图2)加载缺乏吐温20的制剂。由于INF-β1a的回收率不同(见表3)，各个样品的带强度不同。凝胶1(蔗糖、海藻糖和精氨酸磷酸盐)上的制剂显示出弱的带，除INF-β1a主要带外，其显示出二聚体INF-β1a的分子量。该带也出现在药物中(见图1中的线8)。因此，在冷冻干燥期间在这些赋形剂的存在下没有进一步产生可溶性聚集体。在凝胶2上看到了类似的情况。含有甘氨酸和蔗糖与甘露醇混合物的制剂仅显示少量二聚体带(参见图2中的线1+2和6+7)。然而，这可能归因于这些线中由于INF-β1a差的回收率导致的低蛋白质负载。甘露醇制剂显示二聚体带。其强度与药物的强度相当(见图2中的线4+5)。因此，在冷冻干燥过程中，在这些赋形剂的存在下也没有进一步产生可溶性聚集体。

凝胶3(见图3)和凝胶4(见图4)负载含吐温20的制剂。由于INF-β1a完全回收，所有样品的带强度是恒定的。在凝胶3和凝胶4上的所有制剂均显示二聚体带，其强度与药物的二聚体带相当。在冷冻干燥过程中，在这些制剂中也没有产生可溶性聚集体。

冻干物的稳定性

基于上述冷冻干燥可行性研究的结果，使用与之前相同的冷冻干燥循环(描述于表2)制备表4中列出的制剂。

表4：制造的用于第一稳定性研究的不同制剂。数值是冻干溶液的%(w/v)。

蔗糖和海藻糖代表二糖类，精氨酸磷酸盐和甘氨酸是常用的氨基酸，甘露醇是糖醇类中经常使用的赋形剂。来自这些化学类别的物质能够通过氢键稳定冻干饼中的蛋白质。所有制剂含有吐温20或吐温80。也存在于INF-β1a液体制剂中的蛋氨酸浓度保持恒定以维持抗氧化的保护。

在40℃稳定性研究期间INF-β1a的RP-HPLC分析

在稳定性研究期间，将RP-HPLC和SDS-PAGE方法用于分析INF-β1a。RP-HPLC方法允许定量INF-β1a以及测定降解产物，包括氧化产物、聚集产物和蛋白质折叠的变化。在冷冻干燥和在40℃下2周、4周、8周和12周的储存期后分析样品。

图5显示冻干物重构后INF-β1a的定量。基于包括降解产物的总峰面积进行定量。黑色线表示在冷冻干燥之前，冻干溶液的上限和下限值，代表100%限值。

刚刚冷冻干燥后大多数制剂的可溶解的INF-β1a含量为约80%回收率(损失6µg)。用蔗糖/吐温20和蔗糖/甘露醇/吐温80制剂获得最佳的回收率(约90%回收率)。包含海藻糖/吐温20、精氨酸磷酸盐/吐温20、甘氨酸/吐温20和甘露醇/吐温20以及蔗糖/甘露醇/吐温20制剂的制剂组产生第二好的回收率，回收率值为约80%。用精氨酸磷酸盐/吐温80和蔗糖/精氨酸磷酸盐/吐温20制剂获得最差的回收率(小于70%)。

在40℃储存1周后，各制剂的回收率开始显著不同。蔗糖/吐温20制剂的回收率保持恒定在90%。海藻糖/吐温20和甘氨酸/吐温20也显示与其起点相当的回收率值。所有其它制剂的回收率或多或少地下降。观察到精氨酸磷酸盐/吐温20(约50%)和精氨酸磷酸盐/吐温80(小于40%)制剂的显著损失。所有其它制剂的回收率约为65%。

储存2周后，情况几乎保持不变。此外，蔗糖/吐温20和海藻糖/吐温20制剂显示出恒定的回收率，只是现在甘氨酸/吐温20制剂的回收率开始下降(与之前的时间点相比下降约5%)。所有其它制剂的回收率下降约10%。

在40℃储存12周后，蔗糖/吐温20和海藻糖/吐温20制剂以仍然恒定的值清楚地显示出最佳的回收率。因此，在40℃12周的储存期间，在这些制剂中没有观察到活性剂的损失。所有其它制剂表现出回收的INF-β1a的或多或少的降低。

图6显示了代表在40℃储存期间氧化的INF-β1a种类增加的亲水性峰的相对峰面积的进展。黑线表示参考物质色谱图中亲水性峰相对峰面积的上限和下限。

在参考物质的水平，在刚刚冷冻干燥后在所有制剂中氧化的INF-β1a的相对峰面积保持恒定。因此，冷冻干燥制造步骤不诱导INF-β1a氧化。

在储存期间，这些降解产物的相对峰面积根据存在的赋形剂或多或少地增加。在40℃储存2周后，精氨酸磷酸盐/吐温20、蔗糖/甘露醇/吐温20、精氨酸磷酸盐/吐温80和蔗糖/精氨酸磷酸盐/吐温20制剂显示相对峰面积的明显增加(约8%)。其它制剂的相对亲水性峰面积保持恒定。2周储存期后，除了蔗糖/甘露醇/吐温80制剂(其表现出亲水性的降解产物的相对峰面积稳定增加直至在40℃下储存8周)外，在任何制剂中没有观察到氧化种类的相对峰面积的进一步增加。这种情况维持直到达到12周的时间点。因此，可以推定具有蔗糖/吐温20、海藻糖/吐温20、甘氨酸/吐温20和甘露醇/吐温20的制剂能够保护INF-β1a免于氧化直至在40℃的12周储存期。此外，抗氧化的主要稳定作用归因于存在的蛋氨酸。但是由于所有制剂含有相同量的蛋氨酸，一些赋形剂似乎增加了蛋氨酸的稳定作用。

图7显示了表示在40℃储存期间指示蛋白质折叠变化的INF-β1a种类增加的疏水性峰的相对峰面积的进展。黑线表示参考物质色谱图中疏水性峰的相对峰面积的上限和下限。

在稳定性研究期间仅观察到疏水性降解产物，这可归因于具有改变的折叠状态的INF-β1a种类。在任何样品中均未观察到可溶性聚集体的形成。因此，问题不是INF-β1a的聚集。没有一种制剂在刚刚冷冻干燥后显示出疏水性降解产物的任何增加。因此，单独的冷冻干燥没有引起INF-β1a折叠的改变。具有蔗糖/吐温20和海藻糖/吐温20的两种制剂在储存过程中表现出对抗这种降解产物的最好的稳定效果。在整个12周的稳定性研究中，所有其它制剂表现出这些降解产物的或多或少的增加。在蔗糖/甘露醇/吐温20和蔗糖/甘露醇/吐温80制剂中观察到疏水性降解产物的显著增加。

RP-HPLC分析显示蔗糖和海藻糖是冷冻干燥状态下稳定INF-β1a的最适合的赋形剂。

在40℃稳定性研究期间INF-β1a的SDS-PAGE分析

在稳定性研究的每个时间点用SDS-PAGE获得凝胶。在所有时间点保持非还原的条件，而还原的条件仅在8周和12周的时间点使用。8周后，没有分析具有精氨酸磷酸盐/吐温20和精氨酸磷酸盐/吐温80的制剂，因为这些制剂的回收率如RP-HPLC测量结果所示不令人满意。

与INF-β1a药物或参考物质相比，在刚刚冷冻干燥之后以及储存的前4周内任何样品都没有发生带图案的变化。一些样品在一个凝胶上比在下一个凝胶上显示更弱的二聚体带，但是在持续的存储持续时间中没有观察到增加二聚体带强度的趋势。在40℃下储存8周后，甘露醇/吐温20、蔗糖/甘露醇/吐温20、蔗糖/精氨酸磷酸盐/吐温20和蔗糖/甘露醇/吐温80的制剂显示在非还原条件下二聚体带增加。所有其它制剂的带图案都没有显示变化。在40℃下储存12周后，与在40℃储存8周后的峰图案相比，在任何制剂中没有观察到峰图案的进一步变化。

图8显示了在40℃下储存12周后，表4的制剂1、2、4、5、7、8和9的重构冻干物的非还原SDS-PAGE。白色数字标记线，而黑色数字表示分子量。线1+9：MW标记；线2：5%蔗糖+0.1%吐温20；线3：5%海藻糖+0.1%吐温20；线4：线5：5%甘氨酸+0.1%吐温20；线5：5%甘露醇+1%吐温20；线6：2.5%蔗糖+2.5%甘露醇+0.1%吐温20；线7：1%蔗糖+4%精氨酸磷酸盐+0.1%吐温20；线8：2.5%蔗糖+2.5%甘露醇+0.1%吐温80；线10：药物。

图9显示了在40℃下储存12周后，表4的制剂1、2、4、5、7、8和10的重构冻干物的还原SDS-PAGE。白色数字标记线，而黑色数字表示分子量。线1+10：MW标记；线2：5%蔗糖+0.1%吐温20；线3：5%海藻糖+0.1%吐温20；线4：线5：5%甘氨酸+0.1%吐温20；线5：5%甘露醇+1%吐温20；线6：2.5%蔗糖+2.5%甘露醇+0.1%吐温20；线7：1%蔗糖+4%精氨酸磷酸盐+0.1%吐温20；线8：2.5%蔗糖+2.5%甘露醇+0.1%吐温80；线9：药物。

总之，SDS-PAGE结果表明，用海藻糖/吐温20和蔗糖/吐温20制剂获得了INF-β1a最稳定的峰图案。

吸收到玻璃表面上

该实验旨在研究INF-β1a在液态下对不同材料表面的吸附量。用作冷冻干燥产品的初级包装材料的瓶材料的选择是有限的，因为材料必须是可灭菌的和惰性的。基于这些先决条件，以下材料是合适的：聚丙烯(PP)、环烯烃共聚物(COC)、1型标准玻璃和1型硅化玻璃。在某些情况下，1型玻璃的热处理也会影响蛋白质在表面上的吸附行为。因此，在下一个实验中使用未处理的玻璃瓶和加热灭菌的玻璃瓶。在仅吐温存在下测量吸附量。结果如图10所示。

填充到COC瓶、PP瓶以及1型硅化玻璃瓶中的样品的回收率经最多四个容器更换后保持恒定。填充到未经处理和加热灭菌的1型玻璃瓶中的样品表现出约10%的回收率下降(参见图10)。该实验清楚地表明，在吐温存在下，INF-β1a的吸附可以用更疏水的表面消除。因此，建议使用1型硅化玻璃瓶作为初级包装材料。

2.制剂研究B

该制剂研究基于制剂研究A的结果，并且所选制剂被包括在另外的研究中以确定赋形剂的有效比率。

INF-β1a冻干溶液的混合

通过离心(10分钟，4000rpm)和无菌过滤(0.2μm)纯化INF-β1a药物(由RentschlerBiotechnologie GmbH提供)，以在混合开始之前除去存在的不溶性聚集体。通过UV光谱(280nm；UV光谱仪Carry 50，Varian)测量得到的INF-β1a浓度。INF-β1a浓度的计算基于消光系数(1.351 mL*µg^-1*cm^-1)。

将赋形剂以及缓冲剂组分以相应的比例溶解在WFI(注射用水)中。研究B的不同制剂列于表5中。表6中列出了每种制剂的一个瓶的确切含量。加入纯化的INF-β1a药物以达到在最终的冻干溶液中约24µg/mL的INF-β1a浓度。最后，将不同的冻干溶液用WFI填充至目标重量，其是基于冻干溶液的密度计算的。

表5.研究B的不同制剂。这些值代表冻干溶液的%(w/v)。

表6：每种制剂的一个瓶的确切含量(mg)

无菌过滤后，将1mL相应的冻干溶液填充到硅化的10R 1型玻璃瓶中。

含有5%蔗糖和5%海藻糖的冻干溶液在25℃时的密度为1.034g/ml，而含有7.5%蔗糖和7.5%海藻糖的冻干溶液在25℃时的测得密度为1.043g/ml。

冻干

将填充的瓶装入冷冻干燥机并防热辐射。表7中列出的冷冻干燥循环用于制备样品。

表7.所用的冷冻干燥循环的步骤

所有获得的冻干物显示出良好的宏观外观，没有任何缺陷或塌陷。

冻干物的重构

将1ml WFI添加到冻干物重构它们。完全溶解后，通过上下移液3次使溶液均匀化并转移至HPLC瓶中。使用RP-HPLC确定INF-β1a含量。根据制造商的操作程序进行RP-HPLC方法。

冻干溶液和冻干物的INF-β1a含量

冷冻干燥后立即使用RP-HPLC测量冻干溶液和重构的冻干物的INF-β1a含量。表8显示了冻干溶液的INF-β1a含量。

表8：冻干溶液的INF-β1a含量；目标含量为24μg/ml。

冷冻干燥后立即测定冻干物重构后INF-β1a的回收率。结果列于表9中。所有制剂显示冻干溶液的标准偏差内INF-β1a的完全回收。

表9：刚刚冷冻干燥后冻干物重构后INF-β1a的回收率

冻干物的残留水含量

为了促进冻干物的最佳储存稳定性，通过Karl Fischer滴定法测量了冻干饼的残留(这里：仅游离的，未结合的)水的含量。表10中列出了刚刚冷冻干燥后在冻干物中测定的游离残留水含量值。所有制剂含有约1%的游离残留水。

在Karl Fisher滴定中，将封闭的瓶转移到Karl Fischer库仑计的炉(80℃)中，其中以注射针穿透塞。使用干燥氮气将在80℃产生的水蒸气直接通过注射针转移到KarlFischer库仑计的滴定室中。残留水含量的计算基于冻干饼的理论重量。

表10.冷冻干燥后各个制剂的游离水含量。

INF-β1a对硅化玻璃瓶和塞的吸附

本研究使用两种来自不同供应商(Gerresheimer AG, Schott AG)的硅化玻璃瓶。对两个供应商的瓶进行关于从水溶液中吸附INF-β1a的测试。

使用含有吐温20的柠檬酸盐缓冲液将纯化的INF-β1a DS稀释至浓度为30µg/ml。吐温20浓度设定为0.1%(w/v)。该溶液被填充到来自不同制造商的硅化瓶中。短时间保温后取样，剩下的溶液转移到相应类型的新瓶中。这个过程重复了四次。使用RP-HPLC分析样品的INF-β1a含量。图11显示了该研究的结果。INF-β1a的浓度在所有四个转移步骤中保持恒定，与所用的瓶无关。因此，在这两种情况下，可以忽略INF-β1a对玻璃表面的吸附。

与对硅化玻璃瓶的研究同样的方式检查了INF-β1a对塞(单出口冻干塞20mm；WestPharmaceutical Services)的吸附。将溶液填充入硅化瓶中，并使用两种不同类型的塞封闭瓶。将封闭的瓶倒置以实现液体与塞的直接接触。短时间保温后倒转瓶，取样。这个过程重复了四次。使用RP-HPLC分析样品的INF-β1a含量。结果如图12所示。重复接触两种塞后，INF-β1a的浓度保持不变。因此，通过使用硅化的塞，可以防止INF-β1a对塞的吸附。

3.冷冻干燥研究

在这项研究中，验证了冻干溶液制剂约31小时冷冻干燥循环的可行性。

冻干溶液的制剂

通过离心(10分钟，4000rpm)和无菌过滤(0.2μm)纯化INF-β1a药物(由RentschlerBiotechnologie GmbH提供)，以在混合开始之前除去存在的不溶性聚集体。通过紫外光谱(280nm)测量所得的INF-β1a浓度。INF-β1a浓度的计算基于消光系数(1.351 mL*µg^-1*cm^-1)。将赋形剂、洗涤剂以及缓冲剂组分以相应的比例溶解在WFI中(参见表11)。加入纯化的INF-β1a药物以在最终的冻干溶液中达到约17.5µg/mL的INF-β1a浓度。最后，将冻干溶液用WFI填充至目标重量，其是基于冻干溶液的密度(1.034g/mL)计算的。用亲水性PVDF膜无菌过滤后，将0.65 resp. 0.725 mL的冻干溶液填充到手工硅化2R 1型玻璃瓶中。

表11.冻干溶液的组成。

冻干循环

使用表12中所示的冻干循环将冻干溶液冷冻干燥。将退火和未退火的样品相互比较。在退火步骤之后，加载没有退火的样品。

表12.冻干循环。在步骤5后加载没有退火的样品。

图13显示了冻干循环的主要冻干参数的数字数据采集。

搁板温度和室压数据证明冻干期间的条件符合预设的规定。在冷冻和退火过程中，产品温度跟随搁板温度，表明热处理的条件良好地确定。在整个冷冻干燥过程中，退火和未退火的样品的产品温度的进展是相当的。初级干燥的结束通过电容传感器测量的压力升高来指示，其在初级干燥(没有坡道)约4.2小时之后结束。

成像

将玻璃瓶破碎，将冻干物与玻璃碎片分离。使用小刀垂直切割冻干物用于冻干物内部成像。拍摄冻干物的顶面、底面和切面的照片。此外，制作透射光图像以识别冻干物的塌陷结构而不破坏它。

图14中退火(右)和未退火(左)的样品的垂直截面没有显示出塌陷迹象。两种样品的晶体结构非常均匀和致密。

图15中退火(左)的样品的透射光图像和没有退火(右)的样品的透射光图像都没有显示出任何塌陷迹象。

冻干物的热分析

表13比较了退火样品和未退火样品的玻璃化转变温度。

表13：样品的玻璃化转变温度。

	退火的冻干物	未退火的冻干物
			玻璃化转变温度[℃]	110	96.6

退火的冻干物表现出玻璃化转变温度比未退火的冻干物高约10℃。退火步骤增加了冻干饼的孔隙率。因此，二级干燥过程中吸附水更容易被去除。由于水作为增塑剂通常会降低玻璃化转变温度，因此残留水会降低玻璃化转变温度。

溶解测试

冻干物使用1mL注射器重构。测量冻干物完全溶解所需的时间。表14显示了退火和未退火的冻干物的溶解时间。

表14.冻干物的溶解时间。

重构性能通过退火步骤被明显优化。与未退火的样品相比，退火的样品的平均溶解时间快约20秒。

这个31小时的冻干循环的冷冻和初级干燥的参数显示了根据本发明的冻干物的冷冻干燥的最佳设置。

4.稳定性研究

稳定性研究研究了根据先前的制剂研究B的冻干制剂与用于重构和临床应用的装置和预填充WFI注射器的相容性。

在相容性研究中，将MIXJECT^TM转移装置和预填充的WFI注射器用于重构2R瓶中提供的冻干药物产品。该研究提供了重构药物产品与瓶、与应用的MIXJECT^TM转移装置和与预填充WFI注射器的相容性数据。重构的药物产品的稳定性的研究在室温(RT)下，没有光保护的情况下，在存储在瓶中0和24小时之后以及在存储在瓶和注射器中24小时之后进行。另外，确定药物产品溶液的体积和密度，以评估从药物产品的重构直到从注射器给予药物溶液是否存在IFN β-1a的损失。

表15中列出了初级包装材料，表16中描述了用于重构和临床应用的材料。

表15.容器封闭系统

材料	材料号(SAP)
		DIN 2R硅化瓶	2000344
塞13mm 1356 4023/50 Flurotec，B2-TR	2000188
		翻离盖，浅蓝色<sup>#1</sup>	2000156

^#1二次包装材料

表16.相容性研究材料

材料	制造商	材料号
			WFI注射器1.0mL		55003229
MIXJECT<sup>TM</sup>转移装置		9070120

通过以下分析得到相容性数据：澄清度、颜色、可见颗粒、肽图谱、RP-HPLC、生物测定、SE-HPLC、脱酰胺、pH值、渗透度、显微可见(sub-visible)颗粒以及在不同的时间点重构药物产品的密度和体积。药物产品的接受标准列于表17。

表17：相容性测试的接受标准。

分析方法	接受标准
		外观和描述
澄清度(仪器)	澄清(≤Ref.1)
		颜色(b-标度，Ph.Eur.)	报告结果(目标：无色(≤B9))
颜色(y-标度，Ph.Eur.)	报告结果(目标：无色(<Y7))
		可见颗粒	没有或基本没有可见颗粒
同一性
		肽图谱Lys-C	与标准对应
含量
		IFN β-1a蛋白质RP-HPLC含量	报告结果(目标：12.3±2.3µg/mL)
活性/效价
		生物测定效价	≥150MIU/mg
纯度和杂质
		SE-HPLC HMWS	报告结果(目标：≤2面积%)
氧化的IFN β-1a肽图谱	报告结果(目标：≤6面积%)
		脱酰胺	报告结果
一般测试
		pH	报告结果(目标：6.5±0.2)
渗透度	报告结果(目标：340±50mOsmol/kg)
		显微可见颗粒≥10µm	≤6000个颗粒/容器
显微可见颗粒≥25µm	≤600个颗粒/容器

图16至18所示的表格显示了在室温下在瓶中0小时和24小时以及在注射器中24小时和在注射器中另外24小时后(48小时值)存储的分析结果汇编。

如图16至18的表格所示，相容性研究的结果满足所有接受标准。在存储时间段内，澄清度、颜色和可见颗粒的接受标准和目标值被满足。应用肽图谱证实了药物产品与相应的参考标准相比的同一性。洗脱曲线在整个储存期内对应于参考标准的洗脱曲线。通过RP-HPLC分析的药物产品的蛋白质含量和通过生物测定分析的效价满足目标值和接受标准。通过SE-HPLC分析，聚集体的相对峰面积被确定为<0.8%(低于报告水平)。通过肽图谱测定的药物产品中氧化的IFNβ-1a的程度在整个研究期间符合目标值。通过脱酰胺分析显示，药物产品中脱酰胺的IFN β-1a的程度从41.2面积%增加到48.7面积%。pH、渗透度的结果满足目标值。显微可见颗粒的结果也满足接受标准。

总之，相容性研究显示，根据本发明的冻干制剂在用WFI重构之后在初级包装材料中在室温(RT)下稳定长达48小时，并且已经使用MIXJECT^TM转移装置和预填充的WFI注射器，在使用的初级包装材料中在室温下长达24小时和在注射器中再长达24小时。

重构期间溶液体积的确定

在重构的三个不同步骤中测量溶液体积的意图是确定在临床应用过程中蛋白质的损失[µg](从重构药物产品到由注射器递送溶液的损失)。重构过程中的损失是通过对满容器和空容器进行差重测量来确定的。与溶液的密度结果一起，计算相应的体积。这些结果总结在图19和20所示的表中。重构药物产品的体积和密度测定在用和不用MIXJECT^TM转移装置的情况下进行。

在应用期间溶液体积的确定得到以下值：1.020mL WFI(密度：0.9981g/mL)从预填充注射器递送。重构后样品溶液的总体积为1.026mL(密度：1.0266g/mL)。1.011 mL(密度：1.0247g/mL)重构药物产品在不使用MIXJECT^TM转移装置的情况下从注射器递送，并且在使用MIXJECT^TM转移装置时递送0.989mL(密度：1.0252g/mL)。连同这些值和确定的含量值，确定从药物产品重构的时间点到由注射器递送溶液损失1μg的IFN β-1a。

5.生物效果研究

该研究的目的是确定干扰素β-1a的冻干产品当通过至少28天的静脉内快速浓注给予食蟹猴时的生物效果，并提供数据以支持在人中使用干扰素β-1a的冻干产品。研究设计见表18。

表18.^c FP-1201，即根据本发明的干扰素β-1a的冻干产品用1.068mL注射用水稀释，得到标称浓度为12.6μg的溶液。每个瓶设计为以2.3MIU递送最少10µg/mL。

使用注射用水作为对照品。

在本研究中评估了以下参数和终点：FP-1201在不同剂量下的药效学活性、临床迹象、体重、体重变化、眼科学、心电图、体温、临床病理学参数(血液学、凝血、临床化学和尿分析)、免疫原性分析、总体尸检结果、器官重量和组织病理学检查。

没有临床观察结果归因于治疗。

没有与治疗有关的眼科结果，没有心电图或体温变化。

没有归因于治疗的尿液成分的变化。

粘病毒抗性蛋白A(MxA)是IFN β生物活性的最佳标志物之一，并已广泛用于临床环境中检测多发性硬化患者中IFN-β治疗的效果。因此，在治疗的动物中跟踪MxA。如所预期的，用IFN β-1治疗的所有动物均诱导了MxA浓度。所有三种IFN β-1剂量水平均以剂量响应方式引起了数倍的MxA诱导。如图21(组1(菱形)，组2(正方形)，组3(三角形)和组4(圆形))中所示，MxA浓度从第6天到第16天保持高水平，然后逐渐下降。这种逐渐下降很可能是由于在这些动物中产生了IFN β-1中和抗体。IFN-β中和抗体的产生也在几个月或几年的多发性硬化的IFN-β治疗后在人中被观察到。对照动物未显示任何MxA诱导，并且数值在整个治疗期间均保持在基线浓度。尽管更高的IFN β-1剂量诱导更强的MxA表达水平，但使用最低剂量也观察到了清楚的生物学响应。

没有器官重量改变，或没有尸检或组织病理学发现归因于治疗。

总之，对食蟹猴以0.25、1.0或3.0 MIU/kg/天的剂量水平每日静脉内给予FP-1201(根据本发明的干扰素β-1a制剂)28天与预期的MxA诱导的增加相关，并且良好地耐受。在治疗完成时，特别是在3.0MIU/kg/天的剂量水平下，观察到血液学和临床化学参数的微小变化和增加的中和抗体活性。

Claims (13)

1.药物制剂在制备通过静脉内施用用于预防和/或治疗疾病或失调的药物中的用途，其中所述药物制剂通过重构冻干制剂来获得，所述药物制剂包含：

- 作为活性成分的单静脉内剂量形式中2.0-15μg的量的干扰素β-1a，

- 作为增量剂的二糖，基于所述冻干制剂的总重量，

- 非离子表面活性剂，和

- 维持冻干物重构后5.5-7.5内的pH的缓冲剂，

其中所述二糖为海藻糖二水合物或海藻糖二水合物和蔗糖的组合，并且所述干扰素β-1a的生物学活性为至少150MIU/mg，且

其中所述疾病或失调选自：

-血管内皮疾病，

-急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或全身炎症反应综合征(SIRS)中的血管渗漏，

-血管或心脏手术和器官移植中的缺血-再灌注损伤，

-主要血管或心脏手术和器官移植前的缺血预调节，

-急性胰腺炎或急性肾损伤，

-多器官衰竭(MOF)，

-严重危及生命的病毒感染至全身炎症反应综合征(SIRS)，和

-导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官衰竭(MOF)的严重细菌性肺炎和败血症。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述制剂包含维持冻干物重构后6.0-7.0内的pH的缓冲剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述制剂包含维持冻干物重构后6.3-6.7内的pH的缓冲剂。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述二糖为海藻糖二水合物。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述制剂包含基于所述冻干制剂的总重量50-80重量%、优选60-75重量%、且更优选63-67重量%的二糖。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或聚乙二醇(PEG)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述制剂包含磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、柠檬酸三钠二水合物或其组合作为缓冲剂。

8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述制剂进一步包含抗氧化剂。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述抗氧化剂是蛋氨酸。

10.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中干扰素β-1a是重组人干扰素β-1a。

11.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述冻干制剂的残留水分含量不超过5重量%，优选在1-5%的范围内。

12.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述制剂由水溶液制备，所述水溶液pH为5.5-7.5并包含

(i)重组人干扰素β-1a作为活性成分，

(ii)海藻糖二水合物作为增量剂，

(iii)聚山梨醇酯20作为表面活性剂，

(iv)磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物和柠檬酸三钠二水合物的组合作为缓冲剂，和

(v)蛋氨酸作为抗氧化剂。

13.根据权利要求10所述的用途，其中所述水溶液包含0.05-0.15%(w/v)聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯，和2-6%(w/v)海藻糖二水合物。

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