CN115335503A - 用于增强芽孢杆菌属细胞中蛋白质产生的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开总体上涉及用于构建和获得具有增强的蛋白质产生表型的芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)宿主细胞(菌株)的组合物和方法。因此，本公开的某些实施例涉及衍生自(获自)亲本芽孢杆菌属物种细胞(例如像表达/产生目的蛋白的亲本芽孢杆菌属细胞)的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞。因此，某些实施例涉及表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitMOP操纵子的遗传修饰、yitMOP操纵子和sdpABC操纵子的组合遗传修饰、yitM基因的遗传修饰等，其中相对于衍生出这些经修饰的芽孢杆菌属物种细胞的亲本细胞，这些经修饰的芽孢杆菌属物种细胞产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。

Description

用于增强芽孢杆菌属细胞中蛋白质产生的组合物和方法

技术领域

本公开总体上涉及细菌学、微生物学、遗传学、分子生物学、酶学、工业蛋白质生产等领域。更具体地，本公开涉及用于获得具有增加的蛋白质产生能力的芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)细胞的组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月11日提交的美国临时专利申请号62/933,536的权益，将该临时专利申请通过引用以其全文并入本文。

序列表的引用

名为“NB41375-WO-PCT_SequenceListing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2020年10月23日，并且大小为36KB，将该序列表通过引用以其全文特此并入。

背景技术

革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)由于其优异的发酵特性和高产率(例如，高达25克/升培养物；Van Dijl和Hecker,2013)经常被用作微生物工厂，用于产生工业相关蛋白质。例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)因其产生食品、纺织、洗衣、医疗器械清洁、制药工业等所必需的α-淀粉酶(Jensen等人,2000；Raul等人,2014)和蛋白酶(Brode等人,1996)而被熟知(Westers等人,2004)。由于这些非致病性革兰氏阳性细菌产生完全不含毒性副产物(例如，脂多糖；LPS，也称为内毒素)的蛋白质，因此它们已获得了欧洲食品安全局(European Food Safety Authority)的“安全资格认定”(QPS)状态，并且其许多产品获得了美国食品和药品管理局(US Food and Drug Administration)的“通常认为安全”(GRAS)状态(Olempska-Beer等人,2006；Earl等人,2008；Caspers等人,2010)。

因此，微生物宿主细胞中蛋白质(例如，酶、抗体、受体等)的产生在生物技术领域中是特别有意义的。同样，用于产生和分泌一种或多种目的蛋白的芽孢杆菌属物种宿主细胞的优化具有高度相关性，特别是在如下工业生物技术环境中，其中当蛋白质以大的工业产量产生时该蛋白质产率的微小改善具有重大意义。因此，修饰和工程化芽孢杆菌属物种宿主细胞以增强蛋白质产生的能力在本领域中是非常需要的。如下文所述，本公开解决了本领域中的此类需求。更具体地，如本文所呈现、描述和例示的，本公开的某些实施例涉及用于构建能够产生增加量的目的蛋白的芽孢杆菌属物种宿主细胞的方法和组合物。

发明内容

本公开总体上涉及用于构建具有增强的蛋白质产生表型的芽孢杆菌属物种细胞的组合物和方法。本公开的某些实施例涉及衍生自(获自)亲本芽孢杆菌属物种细胞(例如像表达/产生目的蛋白的亲本芽孢杆菌属细胞)的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞。例如，在某些实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitMOP操纵子的遗传修饰，并且相对于衍生出该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞的亲本细胞，产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。在某些其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自(获自)表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitMOP操纵子和sdpABC操纵子的组合遗传修饰，其中相对于该亲本细胞，该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。在其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitM基因的遗传修饰，其中相对于该亲本细胞，该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。在又其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitM基因和sdpABC操纵子的组合遗传修饰，其中相对于该亲本细胞，该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。

附图说明

图1示出了天然枯草芽孢杆菌yitMOP操纵子的核酸序列和所编码的氨基酸序列。更具体地，图1A呈现了编码yitM多肽(SEQ D NO:2)的yitM可读框(ORF；SEQ ID NO:1)和编码yitO多肽(SEQ D NO:4)的yitO可读框(ORF；SEQ ID NO:3)的核酸序列，并且图1B呈现了编码yitP多肽(SEQ D NO:6)的yitP可读框(ORF；SEQ ID NO:5)的核酸序列。

图2示出了在包含yitMOP和sdpABC同类相食(cannibalism)操纵子的组合缺失(ΔyitMOP+ΔsdpABC)的经修饰的枯草芽孢杆菌菌株(JL77)的大规模发酵期间，对蛋白质产生的有益作用。更具体地，如图2所呈现的，在相同的标准条件下在发酵罐中测试JL77菌株和CB24-12菌株的细胞，其中相对于CB24-12菌株在发酵结束时产生的V42蛋白酶的量，JL77菌株在发酵结束时V42蛋白酶产量的平均增加是增加大约10％。

生物序列说明

SEQ ID NO:1是编码SEQ ID NO:2的天然YitM多肽的枯草芽孢杆菌可读框(ORF)核酸序列。

SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1编码的枯草芽孢杆菌YitM多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是编码SEQ ID NO:4的天然YitO多肽的枯草芽孢杆菌ORF序列。

SEQ ID NO:4是由SEQ ID NO:3编码的枯草芽孢杆菌YitO多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是编码SEQ ID NO:6的天然YitP多肽的枯草芽孢杆菌ORF序列。

SEQ ID NO:6是由SEQ ID NO:5编码的枯草芽孢杆菌YitP多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是引物oJKL228的核酸序列。

SEQ ID NO:8是引物oJKL229的核酸序列。

SEQ ID NO:9是引物oJKL232的核酸序列。

SEQ ID NO:10是引物oJKL223的核酸序列。

SEQ ID NO:11是引物oJKL230的核酸序列。

SEQ ID NO:12是引物oJKL231的核酸序列。

SEQ ID NO:13是引物oJKL226的核酸序列。

SEQ ID NO:14是引物oJKL227的核酸序列。

SEQ ID NO:15是引物M13F的核酸序列。

SEQ ID NO:16是引物M13R的核酸序列。

SEQ ID NO:17是引物oJKL246的核酸序列。

SEQ ID NO:18是引物5′spec out的核酸序列。

SEQ ID NO:19是引物oJKL247的核酸序列。

SEQ ID NO:20是引物3′spec out的核酸序列。

SEQ ID NO:21是引物oJKL220的核酸序列。

SEQ ID NO:22是引物oJKL221的核酸序列。

SEQ ID NO:23是引物oJKL224的核酸序列。

SEQ ID NO:24是引物oJKL225的核酸序列。

SEQ ID NO:25是引物oJKL222的核酸序列。

SEQ ID NO:26是引物oJKL223的核酸序列。

SEQ ID NO:27是引物oJKL218的核酸序列。

SEQ ID NO:28是引物oJKL2195的核酸序列。

SEQ ID NO:29是引物oJKL238的核酸序列。

SEQ ID NO:30是引物tet 3′out的核酸序列。

SEQ ID NO:31是引物oJKL229的核酸序列。

SEQ ID NO:32是引物tet 5′out的核酸序列。

SEQ ID NO:33是编码SEQ ID NO:34的天然YitP多肽的解淀粉芽孢杆菌可读框(ORF)核酸序列。

SEQ ID NO:34是由SEQ ID NO:33编码的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)YitP多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:35是编码SEQ ID NO:36的天然YitO多肽的解淀粉芽孢杆菌ORF序列。

SEQ ID NO:36是由SEQ ID NO:35编码的解淀粉芽孢杆菌YitO多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:37是编码SEQ ID NO:38的天然YitM多肽的解淀粉芽孢杆菌ORF序列。

SEQ ID NO:38是由SEQ ID NO:37编码的解淀粉芽孢杆菌YitM多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:39是解淀粉芽孢杆菌yitMOP操纵子的启动子区DNA序列。

SEQ ID NO:40是枯草芽孢杆菌yitMOP操纵子的启动子区DNA序列。

SEQ ID NO:41是枯草芽孢杆菌sdpABC操纵子的启动子区DNA序列。

SEQ ID NO:42是编码SEQ ID NO:43的天然SdpA多肽的枯草芽孢杆菌可读框(ORF)核酸序列。

SEQ ID NO:43是由SEQ ID NO:42编码的枯草芽孢杆菌SdpA多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:44是编码SEQ ID NO:45的天然SdpB多肽的枯草芽孢杆菌可读框(ORF)核酸序列。

SEQ ID NO:45是由SEQ ID NO:44编码的枯草芽孢杆菌SdpB多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:46是编码SEQ ID NO:47的天然SdpC多肽的枯草芽孢杆菌可读框(ORF)核酸序列。

SEQ ID NO:47是由SEQ ID NO:46编码的枯草芽孢杆菌SdpC多肽的氨基酸序列。

具体实施方式

本公开总体上涉及用于构建和获得具有增强的蛋白质产生表型的芽孢杆菌属物种细胞的组合物和方法。因此，本公开的某些实施例涉及衍生自(获自)亲本芽孢杆菌属物种细胞(例如像表达/产生目的蛋白的亲本芽孢杆菌属细胞)的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞。在某些实施例中，亲本芽孢杆菌属物种细胞包含编码目的蛋白(POI)的内源基因。在某些实施例中，该内源基因编码蛋白酶或淀粉酶。在某些其他实施例中，亲本芽孢杆菌属物种细胞包含编码异源目的蛋白(POI)的表达盒。例如，在某些实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitMOP操纵子的遗传修饰，并且相对于该亲本细胞，产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。在某些其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitMOP操纵子和sdpABC操纵子的组合遗传修饰，其中相对于该亲本细胞，该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。在又其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitM基因的遗传修饰，并且相对于该亲本细胞，产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。在其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞衍生自表达/产生内源目的蛋白或异源目的蛋白的亲本芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含yitMOP操纵子(或yitM基因)和sdpABC操纵子的组合遗传修饰，其中相对于该亲本细胞，该经修饰的芽孢杆菌属物种细胞产生增加量的该POI(即，当在相同条件下生长/培养/发酵时)。

I.定义

鉴于本文所述的本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞及其方法，定义了以下术语和短语。本文未定义的术语应当符合如本领域使用的其常规含义。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明组合物和方法应用的领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明组合物和方法的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述代表性的说明性方法和材料。

将本文引用的所有出版物和专利都通过引用以其全文而并入。

应进一步注意，可以撰写权利要求书以排除任何任选的要素。因此，此陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”、“排除”、“不包括”等或使用“否定型”限定的前提基础(或其条件)。

在阅读本公开后，如将对于本领域技术人员应显而易见的，本文描述和说明的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与其他若干个实施例中的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

如本文使用的，短语“宿主细胞”是指具有作为新引入的DNA序列的宿主或表达媒介物的能力的细胞。因此，在本公开的某些实施例中，宿主细胞是例如芽孢杆菌属物种细胞或大肠杆菌(E.coli)细胞。

如本文使用的，术语“野生型”和“天然”可互换地使用，并且是指如在自然界中发现的基因、启动子、蛋白质、蛋白质混合物、细胞或菌株。

如本文使用的，“芽孢杆菌属”或“芽孢杆菌属物种”细胞包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(其现在名为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)等的生物体。

如本文使用的，“经修饰的细胞”是指包含至少一个遗传修饰的重组(宿主)细胞，该遗传修饰不存在于衍生出经修饰的细胞的“亲本”宿主细胞中。例如，在某些实施例中，“亲本”细胞被改变(例如，经由引入亲本细胞中的一个或多个遗传修饰)以产生其“经修饰的”(子代(daughter))细胞。在某些实施例中，亲本细胞可以被称为“对照细胞”，特别是当与“经修饰的”芽孢杆菌属物种(子代)细胞进行比较或相对于“经修饰的”芽孢杆菌属物种(子代)细胞时。

如本文使用的，当将“未经修饰的”(亲本)细胞中目的蛋白(POI)的表达和/或产生与“经修饰的”(子代)细胞中相同POI的表达和/产生相比较时，应理解，在相同条件(例如，相同条件如培养基、温度、pH等)下生长/培养/发酵“经修饰的”和“未经修饰的”细胞。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“yitMOP操纵子”编码“YitM多肽”、“YitO多肽”和“YitP多肽”。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“yitM”核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的野生型枯草芽孢杆菌“YitM”多肽。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“yitO”核酸序列编码包含SEQ ID NO:4的野生型枯草芽孢杆菌“YitO”多肽。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“yitP”核酸序列编码包含SEQ ID NO:6的野生型枯草芽孢杆菌“YitP”多肽。

如本文使用的，野生型解淀粉芽孢杆菌“yitMOP操纵子”编码“YitM多肽”、“YitO多肽”和“YitP多肽”。

如本文使用的，野生型解淀粉芽孢杆菌“yitM”核酸序列编码包含SEQ ID NO:38的野生型解淀粉芽孢杆菌“YitM”多肽。

如本文使用的，野生型解淀粉芽孢杆菌“yitO”核酸序列编码包含SEQ ID NO:36的野生型解淀粉芽孢杆菌“YitO”多肽。

如本文使用的，野生型解淀粉芽孢杆菌“yitP”核酸序列编码包含SEQ ID NO:34的野生型解淀粉芽孢杆菌“YitP”多肽。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“sdpA”核酸序列(SEQ ID NO:42)编码包含SEQ ID NO:43的野生型枯草芽孢杆菌“SdpA”多肽。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“sdpB”核酸序列(SEQ ID NO:44)编码包含SEQ ID NO:45的野生型枯草芽孢杆菌“SdpB”多肽。

如本文使用的，野生型枯草芽孢杆菌“sdpC”核酸序列(SEQ ID NO:46)编码包含SEQ ID NO:47的野生型枯草芽孢杆菌“SdpC”多肽。

如本文使用的，短语如“功能性YitM蛋白产生不足”、“功能性YitO蛋白产生不足”、“功能性YitP蛋白产生不足”等涵盖产生不可检测量的功能性YitM蛋白、YitO蛋白和/或YitM蛋白(即，相对于亲本细胞，当在相同条件下生长/培养/发酵时)，或者在替代方案中，产生至少少约5％到少约99％的一种或多种功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白(即，相对于亲本细胞，当在相同条件下培养/发酵时)的经修饰的(突变型)芽孢杆菌属物种细胞。例如，在某些实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含使yitMOP操纵子的调节区缺失、破坏、失活等，从而使得经修饰的细胞中功能基因产物(即，YitM、YitO和/或YitP蛋白)产生不足的遗传修饰。因此，在某些实施例中，解淀粉芽孢杆菌yitMOP操纵子的启动子区序列包含SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列，枯草芽孢杆菌yitMOP操纵子的启动子区序列包含SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列，并且枯草芽孢杆菌sdpABC操纵子的启动子区序列包含SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列。

在某些其他实施例中，经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含使yitM基因的调节区(例如，启动子区序列；SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40)缺失、破坏、失活或受干扰，从而使得经修饰的细胞中功能性YitM蛋白产生不足的遗传修饰。

如本文使用的，名为“pUCyitMOP:spec”的质粒包含侧翼为loxP位点的壮观霉素抗性(specR)标记基因。更具体地，构建质粒pUCyitMOP:spec以将枯草芽孢杆菌中的整个yitMOP操纵子用壮观霉素抗性(specR)标记替代。

如本文使用的，“Topo-specR载体”包含壮观霉素腺苷酸转移酶基因(specR)及其天然启动子和终止子元件。

如本文使用的，名为“pUCsdp::tet”的质粒包含侧翼为loxP位点的将枯草芽孢杆菌中的整个sdpABC操纵子用四环素(tetR)标记替代的上游(5′)和下游(3′)DNA序列(在本文中，“loxP-tetR-loxP盒”)，其中四环素标记的去除导致sdpABC操纵子的缺失。

如本文使用的，“loxP-tetR-loxP盒”包含loxP重组序列(Sauer,1987，Sauer和Henderson 1988)，在该盒已用于选择染色体整合后，该重组序列有助于随后环出四环素抗性盒。

如本文使用的，名为“pUCLlacA-ganAB::tet”的质粒用于使枯草芽孢杆菌的ganAB基因缺失，该质粒包含ganAB上游(5′)和下游(3′)的同源区和loxP-tetR-loxP盒。

如本文使用的，“ME-3蛋白酶”是衍生自解纤维素喜热裂孢菌(Thermobifidacellulosilytica)的热稳定丝氨酸蛋白酶。例如，解纤维素喜热裂孢菌(T.cellulosilytica)ME-3蛋白酶及其变体描述于PCT公开号WO2018/118815(通过引用以其全文并入本文)中。

如本文使用的，名为“ZM207”的枯草芽孢杆菌菌株包含被缺失的丙氨酸消旋酶基因(ΔalrA)和经引入的编码ME-3蛋白酶的表达盒。更具体地，经引入的表达盒包含位于编码ME-3蛋白酶的可读框(ORF)上游(5′)并且可操作地连接到编码ME-3蛋白酶的可读框(ORF)的启动子序列(“P”)，该编码ME-3蛋白酶的可读框(ORF)在编码丙氨酸消旋酶(alrA)的ORF上游(5′)并且可操作地连接到编码丙氨酸消旋酶(alrA)的ORF，其中将盒整合到枯草芽孢杆菌aprE基因座中(aprE::P-ME-3-alrA)。

如本文使用的，名为“ZM336”的经遗传修饰的枯草芽孢杆菌菌株包含经引入的ME-3蛋白酶表达盒和被缺失的yitMOP操纵子(ΔyitMOP)，其中被缺失的yitMOP操纵子(即，ΔyitMOP)被壮观霉素抗性(specR)标记基因替代。因此，通过将被缺失的yitMOP操纵子(ΔyitMOP)引入亲本ZM207菌株中来构建ZM336菌株。

如本文使用的，名为“ZM268”的经遗传修饰的枯草芽孢杆菌菌株包含yitMOP操纵子的缺失(ΔyitMOP)和sdpABC操纵子的缺失(ΔsdpABC)。在丙氨酸消旋酶缺失(ΔalrA)的菌株中使yitMOP和sdpABC操纵子缺失后，引入编码ME-3蛋白酶的表达盒(aprE::P-ME-3-alrA)以获得ZM268菌株。

如本文使用的，名为“ZM334”的经遗传修饰的枯草芽孢杆菌菌株包含sdpABC操纵子的缺失(ΔsdpABC)，其中被缺失的sdpABC操纵子(即，ΔsdpABC)被四环素抗性(tetR)标记基因替代。因此，通过将被缺失的sdpABC操纵子(ΔsdpABC)引入亲本ZM207菌株中来构建ZM334菌株。

如本文使用的，名为“ZM434”的经遗传修饰的枯草芽孢杆菌菌株包含ΔyitM基因的缺失(ΔyitM)，其中被缺失的yitM操纵子(即，ΔyitM)被红霉素抗性(ermC)标记基因替代。因此，通过将被缺失的yitM(ΔyitM)引入亲本ZM207菌株中来构建ZM434菌株。

如本文使用的，“V42蛋白酶”是衍生自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶BPN′的丝氨酸蛋白酶。例如，V42蛋白酶及其变体描述于PCT公开号WO 2011/072099(通过引用以其全文并入本文)中。

如本文使用的，名为“CB24-12”的亲本枯草芽孢杆菌菌株包含被缺失的丙氨酸消旋酶基因(ΔalrA)和经引入的编码V42蛋白酶的表达盒。更具体地，经引入的表达盒包含位于编码V42蛋白酶的可读框(ORF)上游(5′)并且可操作地连接到编码V42蛋白酶的可读框(ORF)的启动子序列(“P4”)，该编码V42蛋白酶的可读框(ORF)在编码丙氨酸消旋酶(alrA)的ORF上游(5′)并且可操作地连接到编码丙氨酸消旋酶(alrA)的ORF，其中将盒整合到枯草芽孢杆菌aprE基因座中(aprE::P4-V42-alrA)。

如本文使用的，名为“JL77”的经遗传修饰的枯草芽孢杆菌菌株(即，衍生自CB24-12亲本菌株)包含编码V42蛋白酶的相同表达盒、被缺失的yitMOP操纵子(ΔyitMOP)和被缺失的sdpABC操纵子(ΔsdpABC)。例如，通过与含有抗生素抗性标记的盒同源重组来使JL77菌株的yitMOP和sdpABC操纵子缺失。yitMOP操纵子被侧翼为loxP序列的壮观霉素盒替代。spdABC操纵子被侧翼为loxP序列的四环素盒替代。用含有用于表达Cre重组酶的盒的质粒转化可以从基因组中切除抗生素抗性标记，留下一个loxP序列。

如本文使用的，术语“等效位置”意指在与指定多肽序列比对后的氨基酸残基位置，或与指定多核苷酸序列比对后的核苷酸位置。

术语“修饰”和“遗传修饰”可互换地使用，并且包括：(a)引入、取代或去除基因(或其ORF)中的一个或多个核苷酸，或者引入、取代或去除基因或其ORF的转录或翻译所需的调节元件中的一个或多个核苷酸，(b)基因破坏，(c)基因转换，(d)基因缺失，(e)基因下调，(f)特异性诱变，和/或(g)随机诱变本文公开的任何一个或多个基因。

如本文使用的，“基因的破坏”、“基因破坏”、“基因的失活”和“基因失活”可互换地使用，并且广泛地是指基本上防止宿主细胞产生功能性基因产物(例如，YitM蛋白、YitO蛋白、YitP蛋白等)的任何遗传修饰。基因破坏的示例性方法包括基因的任何部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一种调节元件)的完全或部分缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其任何组合和变化，这些诱变使一个或多个靶基因破坏/失活并且基本上减少或防止功能性基因产物(即，蛋白质)的产生。

如本文使用的，组合术语“表达/产生”，如在短语如“相对于亲本细胞，经修饰的细胞表达/产生增加量的目的蛋白”中使用的，术语“表达/产生”意在包括涉及在本公开的宿主细胞中表达和产生目的蛋白的任何步骤。

如本文使用的，短语如“增强蛋白质产生”或“增加蛋白质产生”是指由本公开的宿主细胞产生的增加量的内源蛋白或异源蛋白。在某些实施例中，目的蛋白在宿主细胞内产生，或者被分泌(或被转运)到培养基中。在某些实施例中，目的蛋白被产生(被分泌)到培养基中。与亲本宿主细胞相比，增加的蛋白质产生可以被检测为例如蛋白质或酶活性(例如像蛋白酶活性、淀粉酶活性、纤维素酶活性、半纤维素酶活性等)或者所产生的总细胞外蛋白的更高的最大水平。

如本文使用的，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA、cDNA和RNA，它们可以是双链或单链的，无论代表有义链还是反义链。应理解，由于遗传密码的简并性，许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。

应理解，本文所述的多核苷酸(或核酸分子)包括“基因”、“载体”和“质粒”。

因此，术语“基因”是指编码氨基酸的特定序列的多核苷酸，其包含所有或部分蛋白质编码序列，并且可以包括决定例如基因在其下表达的条件的调节(非转录的)DNA序列，如启动子序列。基因的转录区可以包括非翻译区(UTR)(包括内含子、5'-非翻译区(UTR)和3'-UTR)以及编码序列。

如本文使用的，术语“编码序列”是指直接指定其(所编码的)蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由通常以ATG起始密码子开始的可读框(在下文质，“ORF”)决定。编码序列典型地包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。

如本文使用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核酸序列。通常，编码序列位于启动子序列3'(下游)。启动子可以全部衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成核酸片段。本领域技术人员应理解，不同启动子可以指导基因在不同细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境或生理条件而表达。使基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。应进一步认识到，由于在大多数情况下，尚未完全界定调节序列的确切边界，因此不同长度的DNA片段可以具有相同启动子活性。

如本文使用的术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一者的功能受到另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列(例如，ORF)的表达时，该启动子可操作地连接到该编码序列(即，该编码序列处于该启动子的转录控制下)。编码序列可以在有义或反义方向上可操作地连接到调节序列。

当核酸被放置成与另一个核酸序列具有功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“可操作地连接”。例如，如果编码分泌性前导序列(即，信号肽)的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该编码分泌性前导序列(即，信号肽)的DNA可操作地连接到该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接到该序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果此类位点不存在，则按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文使用的，“控制目的基因(或其可读框)的表达的与目的基因的蛋白质编码序列连接的功能性启动子序列”是指控制编码序列在芽孢杆菌属中的转录和翻译的启动子序列。例如，在某些实施例中，本公开涉及包含5′启动子(或5′启动子区、或串联5′启动子等)的多核苷酸，其中启动子区可操作地连接到编码本公开的蛋白质的核酸序列。因此，在某些实施例中，功能性启动子序列控制编码本文公开的蛋白质的基因的表达。在其他实施例中，功能性启动子序列控制编码目的蛋白的异源基因(或内源基因)在芽孢杆菌属物种细胞中的表达。

如本文定义的，“合适的调节序列”是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

如本文定义的，如短语如“向细菌细胞中引入”或“向芽孢杆菌属物种细胞中引入”至少一种多核苷酸可读框(ORF)、或其基因、或其载体中使用的，术语“引入”包括本领域已知的用于将多核苷酸引入细胞中的方法，这些方法包括但不限于原生质体融合、自然或人工转化(例如，氯化钙、电穿孔)、转导、转染、缀合等(例如，参见Ferrari等人,1989)。

如本文使用的，“转化的”或“转化”意指通过使用重组DNA技术转化的细胞。转化典型地通过将一个或多个核苷酸序列(例如，多核苷酸、ORF或基因)插入细胞中而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即，在待转化的细胞中不是天然存在的序列)。例如，在本公开的某些实施例中，通过向亲本细胞中引入多核苷酸构建体(其包含可操作地连接到编码目的蛋白的核酸序列的启动子)来修饰(例如，转化)亲本芽孢杆菌属物种细胞，从而产生衍生自亲本细胞的经修饰的芽孢杆菌属物种(子代)宿主细胞。

如本文使用的，“转化”是指将外源DNA引入宿主细胞中，使得DNA保持为染色体整合体或自我复制的染色体外载体。如本文使用的，“转化DNA”、“转化序列”和“DNA构建体”是指用于将序列引入宿主细胞或生物体中的DNA。转化DNA是用于将序列引入宿主细胞或生物体中的DNA。可以通过PCR或任何其他合适的技术在体外产生DNA。在一些实施例中，转化DNA包含输入序列，而在其他实施例中，它进一步包含侧翼为同源盒的输入序列。在又进一步的实施例中，转化DNA包含添加到末端的其他非同源序列(即，填充序列或侧翼)。末端可以闭合，使得转化DNA形成闭环，例如像插入载体中。

如本文使用的，在将核酸序列引入细胞中的背景下，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。用于引入的此类方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、缀合和转导(参见例如，Ferrari等人,1989)。

如本文使用的，“输入序列”是指引入芽孢杆菌属染色体中的DNA序列。在一些实施例中，输入序列是DNA构建体的一部分。在其他实施例中，输入序列编码一种或多种目的蛋白。在一些实施例中，输入序列包含可以已经或可以不存在于待转化的细胞的基因组中的序列(即，它可以是同源或异源序列)。在一些实施例中，输入序列编码一种或多种目的蛋白、基因和/或经突变的或经修饰的基因。在可替代的实施例中，输入序列编码功能性野生型基因或操纵子、功能性突变型基因或操纵子或者非功能性基因或操纵子。在一些实施例中，可以将非功能性序列插入基因中以破坏基因的功能。在另一个实施例中，输入序列包括选择性标记。在进一步的实施例中，输入序列包括两个同源盒。

如本文使用的，“同源盒”是指与芽孢杆菌属染色体中的序列同源的核酸序列。更具体地，根据本发明，同源盒是上游或下游区，该上游或下游区与被缺失、破坏、失活、下调等的基因或基因的一部分的紧密侧翼编码区具有约80％与100％之间的序列同一性、约90％与100％之间的序列同一性或约95％与100％之间的序列同一性。这些序列指导在芽孢杆菌属染色体中DNA构建体的整合位置，并且指导芽孢杆菌属染色体的哪部分被输入序列替代。虽然不意在限制本公开，但同源盒可以包括约1个碱基对(bp)至200千碱基(kb)之间。优选地，同源盒包括约1bp与10.0kb之间；1bp与5.0kb之间；1bp与2.5kb之间；1bp与1.0kb之间；以及0.25kb与2.5kb之间。同源盒还可以包括约10.0kb、5.0kb、2.5kb、2.0kb、1.5kb、1.0kb、0.5kb、0.25kb和0.1kb。在一些实施例中，选择性标记的5'和3'端的侧翼为同源盒，其中同源盒包含紧密侧翼基因的编码区的核酸序列。

如本文使用的，短语“可选择性标记基因”或“编码可选择性标记的核苷酸序列”是指这样的核苷酸序列，该核苷酸序列能够在宿主细胞中表达并且其中可选择性标记的表达赋予含有所表达的基因的细胞在存在对应的选择性试剂或缺乏必需营养素的情况下生长的能力。此类可选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂。因此，可选择性标记是指提供宿主细胞已摄取输入目的DNA或者已发生一些其他反应的指示的基因。典型地，可选择性标记是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势的基因，以允许在转化期间将含有外源DNA的细胞与未接受任何外源序列的细胞区分开来。

“驻留可选择性标记(residing selectable marker)”是位于待转化微生物的染色体上的标记。驻留可选择性标记编码与转化DNA构建体上的可选择性标记不同的基因。选择性标记是本领域技术人员熟知的。如上文所指示，标记可以是抗微生物抗性标记(例如，ampR、phleoR、specR、kanR、eryR、tetR、cmpR和neoR)(参见例如，Guerot-Fleury,1995；Palmeros等人,2000；和Trieu-Cuot等人,1983)。在一些实施例中，本发明提供了氯霉素抗性基因(例如，存在于pC194上的基因，以及存在于芽孢杆菌属物种基因组中的抗性基因)。此抗性基因在本发明中以及涉及染色体整合的盒和整合质粒的染色体扩增的实施例中特别有用(参见例如，Albertini和Galizzi,1985；Stahl和Ferrari,1984)。根据本发明有用的其他标记包括但不限于营养缺陷型标记，如丝氨酸、赖氨酸、色氨酸；以及检测标记，如β-半乳糖苷酶或荧光蛋白。

如本文定义的，宿主细胞“基因组”、细菌细胞“基因组”或芽孢杆菌属物种“基因组”包括染色体基因和染色体外基因。

如本文使用的，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外元件，其通常携带典型地不是细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常呈环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已接合或重组至独特的构建体中，该构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列以及适当的3'非翻译序列引入细胞中。

如本文使用的，“转化盒”是指包含基因(或其ORF)并且除了外源基因之外还具有促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。

如本文使用的，术语“载体”是指可以在细胞中复制(传播)并且可以携带新基因或DNA区段到细胞中的任何核酸。因此，该术语是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。载体包括作为“附加体”(即，其自主复制或可以整合到宿主生物体的染色体中)的病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子以及人工染色体(如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、PLAC(植物人工染色体))等。

“表达载体”是指具有在细胞中掺入并且表达异源DNA能力的载体。许多原核和真核表达载体可商购获得并且是本领域技术人员已知的。适当的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。

如本文使用的，术语“表达盒”是指重组或合成产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件(即，这些是载体或载体元件，如上文所述)的核酸构建体。可以将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括(除了其他序列之外)待转录的核酸序列和启动子。在一些实施例中，DNA构建体还包括允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。在某些实施例中，本公开的DNA构建体包含如本文定义的选择性标记和失活染色体或基因或DNA区段。

如本文使用的，“靶向载体”是这样的载体，该载体包括与该靶向载体转化至其中的宿主细胞的染色体中的区同源的多核苷酸序列，并且该载体可以驱动在该区处的同源重组。例如，靶向载体可用于通过同源重组将突变引入宿主细胞的染色体中。在一些实施例中，靶向载体包含例如添加到末端的其他非同源序列(即，填充序列或侧翼序列)。在一些实施例中，靶向载体包括用来增加与染色体的同源重组的元件，包括但不限于RNA指导的核酸内切酶、DNA指导的核酸内切酶和重组酶。末端可以闭合，使得靶向载体形成闭环，例如像插入载体中。

如本文使用的，术语“质粒”是指用作克隆载体，并且在许多细菌和一些真核生物中形成染色体外自我复制遗传元件的环状双链(ds)DNA构建体。在一些实施例中，将质粒掺入宿主细胞的基因组中。

如本文使用的，术语“目的蛋白”(缩写为“POI”)是指希望在芽孢杆菌属物种宿主细胞中表达的目的蛋白。因此，如本文使用的，POI可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、受体蛋白等。在某些实施例中，相对于亲本细胞，本公开的经修饰的细胞产生增加量的异源POI或增加量的内源POI。在特定的实施例中，由本公开的经修饰的细胞产生的POI的增加量是相对于亲本细胞增加至少0.5％、增加至少1.0％、增加至少5.0％或增加超过5.0％。

类似地，如本文定义的，“目的基因”(缩写为“GOI”)是指编码POI的核酸序列(例如，多核苷酸、基因或ORF)。编码“目的蛋白”的“目的基因”可以是天然存在的基因、经突变的基因或合成基因。

如本文使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。在本文中使用氨基酸残基的常规单(1)字母或三(3)字母代码。多肽可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。术语多肽还涵盖已天然地或通过干预(例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合)修饰的氨基酸聚合物。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

在某些实施例中，本公开的基因编码商业上相关的工业目的蛋白，如酶(例如，乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合)。

如本文使用的，“变体”多肽是指典型地通过重组DNA技术，通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸，衍生自亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽与亲本多肽可以相差小数量的氨基酸残基，并且可以通过它们与亲本(参考)多肽的一级氨基酸序列同源性/同一性的水平来定义。

优选地，变体多肽与亲本(参考)多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％氨基酸序列同一性。如本文使用的，“变体”多核苷酸是指编码变体多肽的多核苷酸，其中“变体多核苷酸”与亲本多核苷酸具有指定程度的序列同源性/同一性，或者与亲本多核苷酸(或其互补序列)在严格杂交条件下杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本(参考)多核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％核苷酸序列同一性。

如本文使用的，“突变”是指核酸序列中的任何变化或改变。存在几种类型的突变，包括点突变、缺失突变、沉默突变、移码突变、剪接突变等。突变可以特异性地(例如，经由定点诱变)或随机地(例如，经由化学试剂、通过修复减去(minus)细菌菌株传代)进行。

如本文使用的，在多肽或其序列的背景下，术语“取代”意指一个氨基酸被另一个氨基酸替代(即，取代)。

如本文定义的，“内源基因”是指位于生物体基因组的其天然位置中的基因。

如本文定义的，“异源”基因、“非内源”基因或“外源”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但是通过基因转移引入宿主生物体中的基因(或ORF)。如本文使用的，术语一个或多个“外源”基因包括插入非天然生物体中的天然基因(或ORF)和/或插入天然或非天然生物体中的嵌合基因。

如本文定义的，“异源”核酸构建体或“异源”核酸序列具有如下序列的一部分，该序列对于其被表达的细胞不是天然的。

如本文定义的，“异源控制序列”是指在自然界中不起调节(控制)目的基因表达的作用的基因表达控制序列(例如，启动子或增强子)。通常，异源核酸序列对于它们存在的细胞或基因组的一部分而言不是内源(天然)的，并且已通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加到细胞中。“异源”核酸构建体可以含有与在天然宿主细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码(ORF)序列组合。

如本文使用的，术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与成熟蛋白或蛋白质的前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基的序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中通常不存在信号序列。典型地，在蛋白质被转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质上切割下来。

术语“衍生的”涵盖术语“起源的”、“获得的”“可获得的”和“产生的”，并且通常指示一种指定的材料或组合物在另一种指定的材料或组合物中找到它的起源，或者具有可以参考另一种指定的材料或组合物描述的特征。

如本文使用的，术语“同源性”涉及同源多核苷酸或多肽。如果两个或更多个多核苷酸或者两个或更多个多肽是同源的，则这意味着同源多核苷酸或多肽具有至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少85％、仍更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％的“同一性程度”。两个多核苷酸或多肽序列是否具有如本文定义的同源程度足够高的同一性，可以通过使用本领域已知的计算机程序比对两个序列来适当地研究，该计算机程序如GCG程序包中提供的“GAP”(威斯康星程序包手册(Program Manual for theWisconsin Package),第8版,1994年8月,遗传学计算机集团(Genetics Computer Group),科学大道575号(575Science Drive),麦迪逊,威斯康星州,美国53711)(Needleman和Wunsch,(1970))。使用具有以下设置的GAP进行DNA序列比较：GAP产生罚分5.0和GAP扩展罚分0.3。

如本文使用的，术语“百分比(％)同一性”是指当使用序列比对程序进行比对时，编码多肽的核酸序列或多肽的氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。

如本文使用的，“比生产力”是在给定时间段内产生的蛋白质的总量/细胞/时间。

如本文定义的，术语“纯化的”、“分离的”或“富集的”意指生物分子(例如，多肽或多核苷酸)通过将其与它在自然界中相关联的天然存在的成分中的一些或所有分离而被从其天然状态改变。这样的分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术如离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白盐沉淀、离心、尺寸排阻色谱法、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离完成，以去除最终组合物中所不希望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白或酶。然后可以进一步向纯化的或分离的生物分子组合物中添加提供另外益处的成分，例如活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或者其他酶或化学品。

如本文使用的，“同源基因”是指来自不同的，但是通常相关的物种的基因对，这些基因彼此对应并且彼此相同或非常相似。该术语涵盖通过物种形成(即，新物种的发育)分离的基因(例如，直系同源基因)以及已通过遗传重复分离的基因(例如，旁系同源基因)。

如本文使用的，“直系同源物”和“直系同源基因”是指通过物种形成已从共同祖先基因(即，同源基因)演化的不同物种中的基因。典型地，直系同源物在进化过程期间保持相同功能。直系同源物的鉴定可用于新测序基因组中基因功能的可靠预测。

如本文使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指与基因组内重复相关的基因。虽然直系同源物在进化过程中保持相同功能，但旁系同源物进化出新功能，即使一些功能通常与原始功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，上述酶都是丝氨酸蛋白酶并且在同一物种内一起出现。

如本文使用的，“同源性”是指序列相似性或同一性，同一性优先。使用本领域已知的标准技术确定这种同源性(参见例如，Smith和Waterman,1981；Needleman和Wunsch,1970；Pearson和Lipman,1988；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)(遗传学计算机集团(Genetics Computer Group),麦迪逊,威斯康星州))中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人,1984)。

如本文使用的，术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程，如本领域已知的。如果两个序列在中至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为核酸序列与参考核酸序列“可选择性杂交”。杂交条件是基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格”典型地发生在约Tm-5℃(比探针的Tm低5°)；“高严格”发生在低于Tm约5℃-10℃；“中等严格”发生在比探针的Tm低约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于Tm约20℃-25℃。

在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的序列；而中或低严格杂交可以用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。中和高严格杂交条件是本领域熟知的。高严格条件的实例包括如下杂交：在约42℃下在50％甲酰胺、5XSSC、5X登哈特溶液(Denhardt's solution)、0.5％SDS和100pg/ml变性载剂DNA中进行，随后在室温(RT)下在2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并且在42℃下在0.1X SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。中严格条件的实例包括在37℃下在包含20％甲酰胺、5 x SSC(150mM NaCI、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中过夜孵育，随后在约37℃-50℃下在1x SSC中洗涤滤器。如果需要，本领域技术人员知道如何调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的因素。

如本文使用的，“重组体”包括提及细胞或载体，其已通过引入异源核酸序列而被修饰，或者该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在细胞的天然(非重组)形式内发现的相同形式的基因，或者表达以其他方式异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因(由于故意的人为干预)。“重组(recombination)”、“重组(recombining)”或产生“重组的(recombined)”核酸是两个或更多个核酸片段的组装，其中组装产生嵌合基因。

如本文使用的，“侧翼序列”是指正在讨论的序列上游(5′)或下游(3′)的任何序列(例如，对于基因A-B-C，基因B的侧翼为A和C基因序列)。在某些实施例中，输入序列在每侧的侧翼为同源盒。在另一个实施例中，输入序列和同源盒包含在每侧的侧翼为填充序列的单元。在一些实施例中，侧翼序列仅存在于单侧(3'或5')，但是在优选的实施例中，它在被侧翼的序列的每侧。每个同源盒的序列与芽孢杆菌属染色体中的序列同源。这些序列指导在芽孢杆菌属染色体中新构建体的整合位置以及芽孢杆菌属染色体的哪部分将被输入序列替代。在其他实施例中，选择性标记的5'和3'端的侧翼为包含失活染色体区段的部分的多核苷酸序列。在一些实施例中，侧翼序列仅存在于单侧(3'或5')，而在其他实施例中，它存在于被侧翼的序列的每侧。在一些实施例中，同源盒直接在彼此的侧翼，并且缺乏间插序列(例如，对于基因D-E-F，构建体为D-F)，使得如果构建体在基因组内重组，则将从基因组中去除基因E。

II.同类相食细胞应激反应

在其天然环境中，微生物必须不断地争夺营养素。为了保护其栖息地免受入侵物种的侵害，许多细菌产生并分泌抗微生物肽(AMP)，这些抗微生物肽干扰细胞包膜的完整性和/或生物合成(例如，AMP的作用导致细胞生长停滞并且经常导致细胞裂解(Silver,2003；Silver,2006))。因此，为了防御此类抗微生物肽(AMP)攻击，许多细菌诱导复杂的细胞包膜应激反应。例如，当面临碳源限制时，枯草芽孢杆菌启动一种称为孢子形成的存活策略，从而形成高度抗性的内生孢子，其允许枯草芽孢杆菌在长时间段的饥饿中存活。为了避免投入这种耗能且不可逆转的过程，枯草芽孢杆菌采用另一种称为“同类相食”的策略来尽可能长时间地延迟孢子形成(Gonzalez-Pastor等人,2003)。枯草芽孢杆菌中的同类相食通常涉及两种已知的同类相食毒素(AMP)(孢子形成延迟蛋白(SDP)和孢子形成杀伤因子(SKF))的产生和分泌，这些同类相食毒素蛋白能够裂解敏感性同胞(sibling)。因此，认为被裂解的同胞细胞然后为同类相食者提供营养素，以减缓或甚至阻止它们进入孢子形成。

例如，如通过Gonzalez-Pastor等人(2003)一般性描述的，枯草芽孢杆菌skf操纵子包含八(8)个基因(即，skfABCDEFGH)，其中skfA基因编码AMP毒素SKF；并且枯草芽孢杆菌sdp操纵子包含三(3)个基因(即，sdpABC)，其中sdpC基因编码AMP毒素SPD。Perez Morales等人(2013)对spdABC操纵子的最近研究表明，所编码的SdpA和SdpB蛋白对于将未成熟的SpdC蛋白翻译后加工成成熟且有活性的SDP毒素蛋白(其在细胞外分泌)至关重要。Wang等人(2014)研究了枯草芽孢杆菌中某些细胞裂解基因(即，skfA、sdpC、xpf或lytC)的单一和组合缺失的影响，其中在四突变体(ΔlytCΔsdpCΔxpfΔskfA)的培养物中检测到最高数量的完整细胞。如Wang等人(2014)得出的结论，通过使编码主要PG水解酶的lytC、原噬菌体编码的xpf以及同类相食因子skfA和sdpC缺失，细胞内和所分泌的重组蛋白(分别为纳豆激酶和β-半乳糖苷酶)的产生在四突变体LM2531(ΔlytCΔsdpCΔxpfΔskfA)的培养物中显著升高。

如本文所述和下文实例部分中所呈现的，申请人已在枯草芽孢杆菌中鉴定出一种新型同类相食操纵子，名为yitMOP，该操纵子编码YitM蛋白(SEQ ID NO:2)、YitO蛋白(SEQID NO:4)和YitP蛋白(SEQ ID NO:6)。更具体地，申请人将新型yitMOP操纵子鉴定为在表达FNA蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株的转录组分析中高度表达的转录物。

因此，如下文实例3中进一步描述的，申请人构建了包含经引入的蛋白酶(ME-3)表达盒的名为ZM207的亲本枯草芽孢杆菌细胞(菌株)以及名为ZM334、ZM336和ZM434的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(菌株)；其中ZM334细胞包含相同的蛋白酶(ME-3)表达盒和被缺失的sdpABC操纵子(ΔsdpABC)，ZM336细胞包含ME-3蛋白酶表达盒和被缺失的yitMOP操纵子(ΔyitMOP)，并且ZM434细胞包含ME-3蛋白酶表达盒和yitM基因的缺失(ΔyitM)。ZM268细胞包含ME-3蛋白酶表达盒、被缺失的yitMOP操纵子(ΔyitMOP)和被缺失的sdpABC操纵子(ΔsdpABC)，并且通过将蛋白酶(ME-3)表达盒引入具有yitMOP操纵子的缺失(ΔyitMOP)、被缺失的sdpABC操纵子(ΔsdpABC)和丙氨酸消旋酶基因的缺失(ΔalrA)的宿主构建而来。

如实例3中所呈现的，使亲本(ZM207；对照)和经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(ZM334、ZM336、ZM268和ZM434)在42℃下在Grant's II培养基中在相同条件下在摇瓶中发酵四十(40)小时。随后，取发酵上清液并且测量ME-3蛋白酶活性(表15)。例如，如表15所示，相对于ZM207(对照)菌株，ZM334(ΔsdpABC)菌株和ZM336(ΔyitMOP)菌株二者都产生增加量的ME-3蛋白酶。类似地，相对于ZM207亲本菌株、ZM334菌株(ΔsdpABC)和ZM336菌株(ΔyitMOP)，包含yitMOP和sdpABC操纵子的组合缺失(即，ΔyitMOP+ΔsdpABC)的ZM268菌株(表15)产生增加量的蛋白酶。此外，出乎意料地观察到(表15)仅yitM ORF的破坏或缺失足以引发增加的蛋白质产生的有益表型，因为ZM434(ΔyitM)菌株产生的ME-3蛋白酶略多于ZM336(ΔyitMOP)菌株。

同样，如下文实例4中所呈现和描述的，申请人进一步构建了包含经引入的蛋白酶(V42)表达盒的名为CB24-12的亲本枯草芽孢杆菌细胞(菌株)以及包含相同的V42蛋白酶表达盒和yitMOP操纵子和sdpABC操纵子的组合缺失(ΔyitMOP+ΔsdpABC)的名为JL77的经修饰的枯草芽孢杆菌子代细胞。如实例4所述，评价枯草芽孢杆菌CB24-12和JL77菌株在大规模发酵条件下的V42蛋白酶产量。例如，如图2所呈现的，在相同的标准条件下在发酵罐中测试CB24-12和L77菌株，其中每种菌株一式两份地运行，并且示出了在发酵结束时V42蛋白酶产量的平均改善。因此，如图2所示，相对于CB24-12菌株在发酵结束时产生的V42蛋白酶的量，JL77菌株在发酵结束时V42蛋白酶产量的平均增加是增加大约10％。

这些发现证明，相对于亲本芽孢杆菌属物种细胞(即，包含天然yitMOP操纵子)，芽孢杆菌属物种细胞中yitMOP操纵子的遗传修饰导致增强的蛋白质生产力表型。此外，这些发现证明，相对于仅包含yitMOP操纵子的遗传修饰的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞，芽孢杆菌属物种细胞中yitMOP操纵子和sdpABC操纵子的组合遗传修饰进一步增强观察到的蛋白质生产力表型(参见实例3，表15和实例4，图2)。

同样，在本文中出乎意料地观察到，相对于包含yitMOP和sdpABC操纵子的组合修饰(ΔyitMOP+ΔsdpABC；实例3，表15)的芽孢杆菌属物种细胞，仅包含yitM基因的遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞展示出增强的蛋白质生产力表型。

III.分子生物学

如上文所阐述，本公开的某些实施例涉及衍生自包含天然yitMOP操纵子的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞。在特定的实施例中，经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含经修饰的yitMOP操纵子。在某些其他实施例中，经修饰的芽孢杆菌属物种细胞包含被破坏或缺失的yitM基因。在某些其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞进一步包含被缺失的spdABC操纵子。某些实施例涉及用于对亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰从而从其中产生经修饰的地衣芽孢杆菌(子代)细胞的组合物和方法。

因此，本公开的某些实施例涉及用于对芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰的方法，该遗传修饰包括但不限于(a)引入、取代或去除基因(或其ORF)中的一个或多个核苷酸，或者引入、取代或去除基因(或其ORF)的转录或翻译所需的调节元件中的一个或多个核苷酸，(b)基因破坏，(c)基因转换，(d)基因缺失，(e)下调基因，(f)位点特异性诱变，和/或(g)随机诱变。例如，如本文使用的，遗传修饰包括但不限于对来自芽孢杆菌属物种细胞的一个或多个基因(例如，yitMOP操纵子和/或spdABC操纵子的一个或多个基因)的修饰。

因此，在某些实施例中，通过使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)减少或消除基因的表达来构建本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞。待修饰或失活的基因的部分可以是例如编码区或编码区表达所需的调节元件。

此种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分(即，足以影响核酸序列表达的部分)。用于修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子、转录激活子等。

在某些其他实施例中，通过基因缺失构建经修饰的芽孢杆菌属物种细胞以消除或减少本公开的至少一个前述基因的表达。基因缺失技术使得能够部分或完全去除一个或多个基因，从而消除它们的表达，或者表达非功能性(或活性降低的)蛋白质产物。在此类方法中，一个或多个基因的缺失可以通过使用已构建为连续含有侧翼于该基因的5'和3'区的质粒进行同源重组来完成。可以将连续的5'和3'区引入芽孢杆菌属细胞中，例如在温度敏感的质粒(如pE194)上，在允许温度下与第二可选择性标记缔和以允许质粒在细胞中建立。然后将细胞移至非允许温度，以选择在同源侧翼区之一处具有整合到染色体中的质粒的细胞。通过选择第二可选择性标记来实现质粒整合的选择。在整合后，通过将细胞移至允许温度持续几代而不进行选择来刺激第二同源侧翼区处的重组事件。将细胞铺板以获得单菌落，并且检查菌落是否丢失两种可选择性标记(参见例如，Perego,1993)。因此，本领域技术人员(例如，通过参考yitM、yitO和yitP(核酸)序列及其所编码的YitM、YitO和YitP蛋白序列)可以容易地在适合于完全或部分缺失的基因的编码序列和/或基因的非编码序列中鉴定核苷酸区。

在其他实施例中，通过在基因或者其转录或翻译所需的调节元件中引入、取代或去除一个或多个核苷酸来构建本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞。例如，可以插入或去除核苷酸，以便导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或可读框的移码。此种修饰可以根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成(例如，参见Botstein和Shortle,1985；Lo等人,1985；Higuchi等人,1988；Shimada,1996；Ho等人,1989；Horton等人,1989；以及Sarkar和Sommer,1990)。因此，在某些实施例中，通过完全或部分缺失使本公开的基因失活。

在另一个实施例中，通过基因转换的过程构建经修饰的芽孢杆菌属细胞(例如，参见Iglesias和Trautner,1983)。例如，在基因转换方法中，将对应于一个或多个基因的核酸序列在体外诱变以产生缺陷核酸序列，然后将该缺陷核酸序列转化到亲本芽孢杆菌属细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷核酸序列替代内源基因。可能期望的是，缺陷基因或基因片段也编码可以用于选择含有缺陷基因的转化体的标记。例如，可以将缺陷基因与可选择性标记缔合引入非复制或温度敏感的质粒上。通过在不允许质粒复制的条件下选择标记来实现质粒整合的选择。通过检查菌落是否丢失可选择性标记和是否获得经突变的基因来实现导致基因替代的第二重组事件的选择(Perego,1993)。可替代地，缺陷核酸序列可以含有基因的一个或多个核苷酸的插入、取代或缺失，如下文所述。

在其他实施例中，通过确立已久的反义技术使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来构建经修饰的芽孢杆菌属细胞(Parish和Stoker,1997)。更具体地，可以通过引入与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来减少(下调)或消除芽孢杆菌属细胞的基因的表达，该核苷酸序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此降低或消除所翻译的蛋白质的量。此类反义方法包括但不限于RNA干扰(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸等，所有这些都是熟练技术人员熟知的。

在其他实施例中，经由CRISPR-Cas9编辑产生/构建经修饰的芽孢杆菌属细胞。例如，可以借助核酸指导的核酸内切酶破坏(或缺失或下调)编码YitM蛋白的基因，这些核酸指导的核酸内切酶通过结合指导RNA(例如，Cas9)和Cpfl或指导DNA(例如，NgAgo)发现其靶DNA，这将核酸内切酶募集到DNA上的靶序列上，其中核酸内切酶可以在DNA中产生单链或双链断裂。此靶向DNA断裂成为DNA修复的底物，并且可以与所提供的编辑模板重组以使基因破坏或缺失。例如，编码核酸指导的核酸内切酶(出于此目的，来自化脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9)的基因或编码Cas9核酸酶的经密码子优化的基因可操作地连接到在芽孢杆菌属细胞中有活性的启动子和在芽孢杆菌属细胞中有活性的终止子，从而产生芽孢杆菌Cas9表达盒。同样，本领域技术人员容易地鉴定目的基因特有的一个或多个靶位点。例如，为了使用化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9构造编码gRNA的针对目的基因内的靶位点的DNA构建体，可变靶向(VT)结构域将包含在(PAM)原间隔子邻近基序(NGG)5'的靶位点的核苷酸，这些核苷酸与编码化脓链球菌Cas9的Cas9核酸内切酶识别结构域(CER)的DNA融合。将编码VT结构域的DNA和编码CER结构域的DNA组合，从而产生编码gRNA的DNA。因此，通过将编码gRNA的DNA可操作地连接到在芽孢杆菌属细胞中有活性的启动子和在芽孢杆菌属细胞中有活性的终止子来产生gRNA的芽孢杆菌属表达盒。

在某些实施例中，将由核酸内切酶诱导的DNA断裂用输入序列修复/替代。例如，为了精确修复由上述Cas9表达盒和gRNA表达盒产生的DNA断裂，提供了核苷酸编辑模板，使得细胞的DNA修复机器可以利用编辑模板。例如，靶向基因5'的约500-bp可以与靶向基因3'的约500-bp融合以产生编辑模板，该模板由芽孢杆菌属宿主的机器用于修复由RGEN产生的DNA断裂。

可以使用许多不同的方法将Cas9表达盒、gRNA表达盒和编辑模板共同递送至细胞。通过用正向和反向引物扩增基因座，通过PCR扩增靶基因座来筛选经转化的细胞。这些引物可以扩增野生型基因座或已由RGEN编辑的经修饰的基因座。然后使用测序引物对这些片段进行测序以鉴定经编辑的菌落。

在又其他实施例中，使用本领域熟知的方法(包括但不限于化学诱变(参见例如，Hopwood,1970)和转座(参见例如，Youngman等人,1983))，通过随机或特异性诱变构建经修饰的芽孢杆菌属细胞。可以通过使亲本细胞经受诱变并且筛选基因表达已减少或消除的突变型细胞来进行基因的修饰。可以例如通过使用合适的物理或化学诱变剂、使用合适的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行可以是特异性的或随机的诱变。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)辐照、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，典型地通过如下方式来进行诱变：在合适的条件下在选择的诱变剂的存在下孵育待诱变的亲本细胞，并且选择展现出基因的表达降低或无表达的突变型细胞。

国际PCT公开号WO2003/083125公开了用于对芽孢杆菌属细胞进行修饰的方法，如使用PCR融合来产生芽孢杆菌属缺失菌株和DNA构建体以绕过大肠杆菌。PCT公开号WO2002/14490公开了用于对芽孢杆菌属细胞进行修饰的方法，包括(1)构建和转化整合质粒(pComK)，(2)随机诱变编码序列、信号序列和前肽序列，(3)同源重组，(4)通过向转化DNA中添加非同源侧翼提高转化效率，(5)优化双交叉整合，(6)定向诱变和(7)无标记缺失。

本领域技术人员熟知用于将多核苷酸序列引入细菌细胞(例如，大肠杆菌和芽孢杆菌属物种)中的合适方法(例如，Ferrari等人,1989；Saunders等人,1984；Hoch等人,1967；Mann等人,1986；Holubova,1985；Chang等人,1979；Vorobjeva等人,1980；Smith等人,1986；Fisher等人,1981；以及McDonald,1984)。实际上，包括原生质体转化和中板集合、转导和原生质体融合在内的诸如转化等的方法是已知的并且适合用于本公开。转化方法特别优选地用于将本公开的DNA构建体引入宿主细胞中。

除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞中之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体)。将DNA构建体引入宿主细胞中包括本领域已知的将DNA引入宿主细胞中而不插入质粒或载体中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，将DNA构建体与质粒一起共转化而不插入该质粒中。在进一步的实施例中，通过本领域已知的方法，将选择性标记从经修饰的芽孢杆菌属菌株中缺失或基本上切除(例如，Stahl等人,1984；Palmeros等人,2000)。在一些实施例中，载体从宿主染色体上分解下来，将侧翼区留在染色体上，而将固有的染色体区去除。

用于在芽孢杆菌属细胞中表达基因、其可读框(ORF)和/或其变体序列的启动子和启动子序列区通常是本领域技术人员已知的。通常选择本公开的启动子序列，使得它们在芽孢杆菌属细胞中起作用。某些示例性芽孢杆菌属启动子序列包括但不限于枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)启动子、枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子、解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子、来自枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶(nprE)启动子、突变型aprE启动子(例如，PCT公开号WO 2001/51643)或来自地衣芽孢杆菌或其他相关的芽孢杆菌属的任何其他启动子。在PCT公开号WO 2003/089604中描述了用于在芽孢杆菌属细胞中筛选和产生具有一系列活性(启动子强度)的启动子文库的方法。

IV.培养用于产生目的蛋白的经修饰的细胞

如上文一般性描述的，某些实施例涉及用于构建和获得具有增加的蛋白质产生表型的芽孢杆菌属细胞的组合物和方法。因此，某些实施例涉及通过在合适的培养基中发酵细胞而在芽孢杆菌属细胞中产生目的蛋白的方法。本领域熟知的发酵方法可以用于发酵本公开的亲本和经修饰的(子代)芽孢杆菌属细胞。

在一些实施例中，将细胞在分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，将培养基用一种或多种所希望的生物体接种。在这种方法中，允许发酵发生而不向系统中添加任何组分。典型地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格，并且经常对控制因素(如pH和氧浓度)进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在典型分批培养中，细胞可以通过静态停滞期进展到高生长对数期，并且最后进入生长速率减小或停止的静止期。如果不经处理，处于静止期的细胞最终死亡。通常，处于对数期的细胞负责产物的大量生产。

标准分批系统的合适变体是“补料分批”发酵系统。在典型分批系统的这种变体中，随着发酵的进展，以增量添加底物。当分解代谢物阻遏可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中期望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的并且因此基于可测量因素(如pH、溶解氧和废气(如CO₂)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵在本领域中是常用并且已知的。

连续发酵是开放的系统，其中将确定的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对影响细胞生长和/或产物浓度的一种或多种因素进行调节。例如，在一个实施例中，将限制营养素(如碳源或氮源)保持在固定的速率，并且允许调控所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳态生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及用于最大化产物形成速率的技术是工业微生物学领域中熟知的。

在某些实施例中，可以通过常规程序从培养基中回收由本公开的芽孢杆菌属细胞表达/产生的目的蛋白，这些常规程序包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，或者如果需要，破坏细胞并从细胞部分和碎片中去除上清液。典型地，在澄清后，将上清液或滤液的蛋白质组分借助盐(例如，硫酸铵)沉淀。然后将沉淀出的蛋白质溶解，并且可以通过各种色谱程序(例如，离子交换色谱法、凝胶过滤)进行纯化。

在一些实施例中，将细胞在分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，将培养基用一种或多种所希望的生物体接种。在这种方法中，允许发酵发生而不向系统中添加任何组分。典型地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格，并且经常对控制因素(如pH和氧浓度)进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在典型分批培养中，细胞可以通过静态停滞期进展到高生长对数期，并且最后进入生长速率减小或停止的静止期。如果不经处理，处于静止期的细胞最终死亡。通常，处于对数期的细胞负责产物的大量生产。

标准分批系统的合适变体是“补料分批”发酵系统。在典型分批系统的这种变体中，随着发酵的进展，以增量添加底物。当分解代谢物阻遏可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中期望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的并且因此基于可测量因素(如pH、溶解氧和废气(如CO₂)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵在本领域中是常用并且已知的。

连续发酵是开放的系统，其中将确定的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对影响细胞生长和/或产物浓度的一种或多种因素进行调节。例如，在一个实施例中，将限制营养素(如碳源或氮源)保持在固定的速率，并且允许调控所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳态生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及用于最大化产物形成速率的技术是工业微生物学领域中熟知的。

在某些实施例中，可以通过常规程序从培养基中回收由本公开的芽孢杆菌属细胞表达/产生的目的蛋白，这些常规程序包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，或者如果需要，破坏细胞并从细胞部分和碎片中去除上清液。典型地，在澄清后，将上清液或滤液的蛋白质组分借助盐(例如，硫酸铵)沉淀。然后将沉淀出的蛋白质溶解，并且可以通过各种色谱程序(例如，离子交换色谱法、凝胶过滤)进行纯化。

V.目的蛋白

本公开的目的蛋白(POI)可以是任何内源或异源蛋白，并且它可以是此种POI的变体。蛋白质可以含有一个或多个二硫桥，或者是其功能形式为单体或多聚体的蛋白质，即蛋白质具有四级结构并且由多个相同的(同源的)或不相同的(异源的)亚基构成，其中POI或其变体POI优选地是具有目的特性的POI。

例如，在某些实施例中，相对于其未经修饰的(亲本)细胞，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞产生多至少约0.1％、多至少约0.5％、多至少约1％、多至少约5％、多至少约6％、多至少约7％、多至少约8％、多至少约9％或多至少约10％或更多的POI。

在某些实施例中，相对于(未经修饰的)亲本细胞，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞展现出POI的增加的比生产力(Qp)。例如，比生产力(Qp)的检测是用于评价蛋白质产生的合适方法。比生产力(Qp)可以使用以下等式确定：

“Qp＝gP/gDCW·hr”

其中，“gP”是罐中产生的蛋白质的克数；“gDCW”是罐中的干细胞重量(DCW)的克数；并且“hr”是从接种时间开始的以小时计的发酵时间，其包括生产时间以及生长时间。

因此，在某些其他实施例中，相对于未经修饰的(亲本)细胞，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞包含至少约0.1％、至少约1％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％或至少约10％或更多的比生产力(Qp)增加。

在某些实施例中，POI或其变体POI选自由以下组成的组：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

因此，在某些实施例中，POI或其变体POI是选自酶学委员会(EC)编号EC 1、EC 2、EC 3、EC 4、EC 5或EC 6的酶。

在某些其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞包含编码淀粉酶的表达构建体。多种淀粉酶及其变体是本领域技术人员已知的。例如，国际PCT公开号WO 2006/037484和WO 2006/037483描述了具有改善的溶剂稳定性的变体α-淀粉酶，PCT公开号WO1994/18314公开了氧化稳定的α-淀粉酶变体，PCT公开号WO 1999/19467、WO 2000/29560和WO 2000/60059公开了拖麦米尔(Termamyl)样α-淀粉酶变体，PCT公开号WO 2008/112459公开了衍生自芽孢杆菌属物种编号707的α-淀粉酶变体，PCT公开号WO 1999/43794公开了生麦芽的α-淀粉酶变体，PCT公开号WO 1990/11352公开了超热稳定的α-淀粉酶变体，PCT公开号WO 2006/089107公开了具有颗粒淀粉水解活性的α-淀粉酶变体，等等。

存在本领域普通技术人员已知的用于检测和测量细胞内和细胞外表达的蛋白质的活性的各种测定。

PCT公开号WO 2014/164777公开了可用于检测本文所述的淀粉酶活性的Ceralphaα-淀粉酶活性测定。

V.示例性实施例

本公开的非限制性实施例包括但不限于：

1.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitMOP操纵子缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

2.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitMOP操纵子和sdpABC操纵子缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种进行遗传修饰，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

3.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitMOP操纵子的调节区缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰，从而使得该经修饰的细胞中功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白产生不足，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

4.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitM基因破坏或缺失对该亲本细胞进行遗传修饰，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

5.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitM基因的调节区缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰，从而使得该经修饰的细胞中功能性YitM蛋白产生不足，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

6.如实施例1-5中任一项所述的方法，其中该芽孢杆菌属物种细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

7.如实施例6所述的方法，其中该芽孢杆菌属物种细胞是枯草芽孢杆菌。

8.如实施例6所述的方法，其中该芽孢杆菌属物种细胞是解淀粉芽孢杆菌。

9.如实施例1-5中任一项所述的方法，其中该POI是酶。

10.如实施例7所述的方法，其中该酶是蛋白酶或淀粉酶。

11.如实施例1-3中任一项所述的方法，其中该yitMOP操纵子编码包含与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:38的至少60％至约99％序列同一性的YitM多肽、包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:36的至少60％至约99％序列同一性的YitO多肽以及包含与SEQ ID NO:6或SEQID NO:34的至少60％至约99％序列同一性的YitP多肽。

12.如实施例4或实施例5所述的方法，其中该yitM基因包含与SEQ ID NO:1或SEQID NO:37的yitM基因的至少60％至约99％序列同一性。

13.如实施例4或实施例5所述的方法，其中该yitM基因编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:38的YitM多肽的至少60％至约99％序列同一性的YitM多肽。

14.如实施例3-5中任一项所述的方法，其中该经修饰的细胞进一步包含该sdpABC操纵子的缺失或破坏。

15.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)构建包含经引入的编码异源POI的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitMOP操纵子缺失或破坏对该亲本细胞进行遗传修饰，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该异源POI。

16.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)构建包含经引入的编码异源POI的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitMOP操纵子和sdpABC操纵子缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种进行遗传修饰，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该异源POI。

17.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)构建包含经引入的编码异源POI的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitMOP操纵子的调节区缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰，从而使得该经修饰的细胞中功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白产生不足，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该异源POI。

18.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)构建包含经引入的编码异源POI的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitM基因破坏或缺失对该亲本细胞进行遗传修饰，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该异源POI。

19.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，该方法包括(a)构建包含经引入的编码异源POI的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞，(b)通过使yitM基因的调节区缺失或破坏对该亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰，从而使得该经修饰的细胞中功能性YitM蛋白产生不足，以及(c)在用于产生该POI的合适条件下发酵该经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该异源POI。

20.如实施例15-19中任一项所述的方法，其中同时进行步骤(a)和(b)。

21.如实施例15-19中任一项所述的方法，其中该芽孢杆菌属物种细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

22.如实施例21所述的方法，其中该芽孢杆菌属物种细胞是枯草芽孢杆菌。

23.如实施例21所述的方法，其中该芽孢杆菌属物种细胞是解淀粉芽孢杆菌。

24.如实施例15-19中任一项所述的方法，其中该异源POI是酶。

25.如实施例24所述的方法，其中该酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。

26.如实施例15-17中任一项所述的方法，其中该yitMOP操纵子编码包含与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:38的至少80％序列同一性的YitM多肽、包含与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:36的至少80％序列同一性的YitO多肽以及包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:34的至少80％序列同一性的YitP多肽。

27.如实施例18或实施例19所述的方法，其中该yitM基因包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:37的yitM基因的至少60％至约99％序列同一性。

28.如实施例18或实施例19所述的方法，其中该yitM基因编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:38的YitM多肽的至少60％至约99％序列同一性的YitM多肽。

29.如实施例17-19中任一项所述的方法，其中该经修饰的细胞进一步包含该sdpABC操纵子的缺失或破坏。

30.一种根据实施例1-5中任一项所述的方法产生的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，或一种根据实施例15-19中任一项所述的方法产生的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞。

31.一种衍生自产生内源目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含被缺失或破坏的yitMOP操纵子，其中当在用于产生该POI的相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

32.一种衍生自产生内源目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含被缺失或破坏的yitMOP操纵子和被缺失或破坏的sdpABC操纵子，其中当在用于产生该POI的相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

33.一种衍生自产生内源目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含yitMOP操纵子的被缺失或破坏的调节区，使得该经修饰的细胞中功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白产生不足，其中当在用于产生该POI的相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

34.一种衍生自产生内源目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含被缺失或破坏的yitM基因，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

35.一种衍生自产生内源目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含yitM基因的被缺失或破坏的调节区，使得该经修饰的细胞中功能性YitM蛋白产生不足，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

36.如实施例31-35中任一项所述的经修饰的细胞，其中该芽孢杆菌属物种细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

37.如实施例36所述的经修饰的细胞，其中该芽孢杆菌属物种细胞是枯草芽孢杆菌。

38.如实施例36所述的经修饰的细胞，其中该芽孢杆菌属物种细胞是解淀粉芽孢杆菌。

39.如实施例29-33中任一项所述的经修饰的细胞，其中该POI是酶。

40.如实施例39所述的经修饰的细胞，其中该酶是蛋白酶或淀粉酶。

41.如实施例31-33中任一项所述的经修饰的细胞，其中该yitMOP操纵子编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:38的至少60％至约99％序列同一性的YitM多肽、包含与SEQID NO:4或SEQ ID NO:36的至少60％至约99％序列同一性的YitO多肽以及包含与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:34的至少60％至约99％序列同一性的YitP多肽。

42.如实施例34或实施例35所述的经修饰的细胞，其中该yitM基因包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:37的yitM基因的至少60％至约99％序列同一性。

43.如实施例34或实施例35所述的经修饰的细胞，其中该yitM基因编码包含与SEQID NO:2或SEQ ID NO:38的YitM多肽的至少60％至约99％序列同一性的YitM多肽。

44.如实施例33-35中任一项所述的经修饰的细胞，其中该经修饰的细胞进一步包含该sdpABC操纵子的缺失或破坏。

45.一种衍生自包含经引入的编码异源目的蛋白(POI)的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含被缺失或破坏的yitMOP操纵子，其中当在用于产生该POI的相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该异源POI。

46.一种衍生自包含经引入的编码异源目的蛋白(POI)的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含被缺失或破坏的yitMOP操纵子和被缺失或破坏的sdpABC操纵子，其中当在用于产生该POI的相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

47.一种衍生自包含经引入的编码异源目的蛋白(POI)的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含yitMOP操纵子的被缺失或破坏的调节区，使得该经修饰的细胞中功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白产生不足，其中当在用于产生该POI的相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

48.一种衍生自包含经引入的编码异源目的蛋白(POI)的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含被缺失或破坏的yitM基因，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

49.一种衍生自包含经引入的编码异源目的蛋白(POI)的表达盒的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中该经修饰的细胞包含yitM基因的被缺失或破坏的调节区，使得该经修饰的细胞中功能性YitM蛋白产生不足，其中当在相同条件下发酵时，相对于该亲本细胞，该经修饰的细胞产生增加量的该内源POI。

50.如实施例45-49中任一项所述的经修饰的细胞，其中该芽孢杆菌属物种细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

51.如实施例50所述的经修饰的细胞，其中该芽孢杆菌属物种细胞是枯草芽孢杆菌。

52.如实施例50所述的经修饰的细胞，其中该芽孢杆菌属物种细胞是解淀粉芽孢杆菌。

53.如实施例45-49中任一项所述的经修饰的细胞，其中该POI是酶。

54.如实施例53所述的经修饰的细胞，其中该其中该酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。

55.如实施例45-47中任一项所述的经修饰的细胞，其中该yitMOP操纵子编码包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:38的至少60％至约99％序列同一性的YitM多肽、包含与SEQID NO:4或SEQ ID NO:36的至少60％至约99％％序列同一性的YitO多肽以及包含与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:34的至少60％至约99％序列同一性的YitP多肽。

56.如实施例48或实施例49所述的经修饰的细胞，其中该yitM基因包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:37的yitM基因的至少80％序列同一性。

57.如实施例48或实施例49所述的经修饰的细胞，其中该yitM基因编码包含与SEQID NO:2或SEQ ID NO:38的YitM多肽的至少80％序列同一性的YitM多肽。

58.如实施例47-49中任一项所述的经修饰的细胞，其中该经修饰的细胞进一步包含该sdpABC操纵子的缺失或破坏。

59.如实施例3、5、17或19中任一项所述的方法，其中该被缺失或破坏的调节区是启动子序列。

60.如实施例59所述的方法，其中该启动子序列包含与选自SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:39和SEQ ID NO:40的核苷酸序列的至少60％至约99％序列同一性。

61.如实施例33、35、47或49中任一项所述的经修饰的细胞，其中该被缺失或破坏的调节区是启动子序列。

62.如实施例61所述的经修饰的细胞，其中该启动子序列包含与选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的核苷酸序列的至少60％至约99％序列同一性。

实例

根据以下实例可以进一步理解本公开的某些方面，这些实例不应当被解释为限制性的。对材料和方法的修改对于本领域技术人员而言应是显而易见的。

实例1

芽孢杆菌属细胞中yitMOP操纵子的缺失

总体上如上文所阐述和描述的，经由对表达FNA蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株的转录组分析，将名为yitMOP的新型枯草芽孢杆菌同类相食操纵子鉴定为高度表达的转录物。更具体地，如图1A和图1B所呈现的，枯草芽孢杆菌yitMOP操纵子编码YitM蛋白(SEQ ID NO:2)、YitO蛋白(SEQ ID NO:4)和YitP蛋白(SEQ ID NO:6)。本实例描述了亲本枯草芽孢杆菌细胞中yitMOP操纵子的缺失。例如，为了产生经修饰的枯草芽孢杆菌(子代)细胞，构建名为“pUCyitMOP:spec”的质粒以使枯草芽孢杆菌中的yitMOP操纵子缺失。例如，构造pUCyitMOP:spec质粒以将枯草芽孢杆菌中的整个yitMOP操纵子用侧翼为loxP位点的壮观霉素抗性(specR)标记基因(在本文中，“loxP-specR-loxP盒”)替代。因此，使用下表1中所阐述的oJKL228(SEQ ID NO:7)和oJKL229(SEQ ID NO:8)引物，从枯草芽孢杆菌(菌株168)基因组DNA(gDNA)扩增上游(5′)序列。

表1

寡核苷酸引物

oJKL228	CTCGGTACGACACCTGCAAACAT	SEQ ID NO:7
			oJKL229	ACCGTCGATCGACTGCTCCTTTTAAC	SEQ ID NO:8

使用下表2中所阐述的oJKL232(SEQ ID NO:9)和oJKL233(SEQ ID NO:10)引物，从枯草芽孢杆菌(菌株168)gDNA扩增下游(3′)同源序列。

表2

寡核苷酸引物

oJKL232	CCTAGGCACATAAAAAAACGGCTCGCTCCGC	SEQ ID NO:9
			oJKL233	TGCATGCCGAACAGGAAGGACGAT	SEQ ID NO:10

使用下表3中所阐述的oJKL230(SEQ ID NO:11)和oJKL231(SEQ ID NO:12)从Topo-specR载体扩增loxP-specR-loxP盒。Topo-specR载体包含具有天然启动子和终止子元件的壮观霉素腺苷酸转移酶基因(specR)，将该基因克隆到Invitrogen Topo载体平端中并且用于转化大肠杆菌TOP10细胞。

表3

寡核苷酸引物

oJKL230	GCAGTCGATCGACGGTATCGATAAGCTG	SEQ ID NO:11
			oJKL231	TTTTATGTGCCTAGGATGCATATGGCG	SEQ ID NO:12

使用下表4中所阐述的oJKL226(SEQ ID NO:13)和oJKL227(SEQ ID NO:14)引物，根据制造商的说明书，从获自GeneArt Seamless克隆试剂盒的pUCL片段扩增pUC载体骨架。

表4

寡核苷酸引物

oJKL226	TCCTGTTCGGCATGCAAGCTTGGCGTA	SEQ ID NO:13
			oJKL227	CAGGTGTCGTACCGAGCTCGAATTCAC	SEQ ID NO:14

使用Gibson克隆试剂盒组装载体片段并且将其用于转化大肠杆菌。使用下表5中所阐述的正向(M13F；SEQ ID NO:15)和反向(M13R；SEQ ID NO:16)引物，对载体的上游(5′)和下游(3′)同源部分进行序列验证。

表5

寡核苷酸引物

M13F	AGGCGATTAAGTTGGGT	SEQ ID NO:15
			M13R	TCACACAGGAAACAGCTATGA	SEQ ID NO:16

分离序列已确认的载体并且使用AatII线性化，其中然后将该线性化的载体用于转化枯草芽孢杆菌细胞。然后使用PCR验证缺失，其中使用下表6中所阐述的oJKL246(SEQID NO:17)和5′spec out(SEQ ID NO:18)引物确认上游(5′)整合连接。

表6

寡核苷酸引物

oJKL246	GATAAACCGCACCGACTCG	SEQ ID NO:17
			5’spec out	AGTCCACTCTCAACTCCTGATCC	SEQ ID NO:18

使用下表7中所阐述的oJKL247(SEQ ID NO:19)和3′spec out(SEQ ID NO:20)引物确认下游整合连接。

表7

寡核苷酸引物

oJKL247	CAGCACATCTTTCAGCTGGC	SEQ ID NO:19
			3’spec out	AAATTGAAAAAATGGTGGAAACAC	SEQ ID NO:20

实例2

sdpABC操纵子的缺失

本实例描述了名为“pUCsdp::tet”的质粒的构建并且将其引入枯草芽孢杆菌细胞中。更具体地，构建包含上游(5′)和下游(3′)DNA序列的pUCsdp::tet质粒以将枯草芽孢杆菌细胞中的整个sdpABC操纵子用侧翼为loxP位点的四环素(tetR)标记(在本文中，“loxP-tetR-loxP盒”)替代，其中四环素标记的去除导致sdpABC操纵子的缺失。

因此，使用下表8中所阐述的oJKL220(SEQ ID NO:21)和oJKL221(SEQ ID NO:22)引物，从枯草芽孢杆菌gDNA扩增上游(5′)sdpABC序列。

表8

寡核苷酸引物

oJKL220	CTCGGTACCCCGCATTGACGTGT	SEQ ID NO:21
			oJKL221	TATCAGGATACAGTAATAATTCCCTTTTTTTTTGATG	SEQ ID NO:22

使用下表9中所阐述的oJKL224(SEQ ID NO:23)和oJKL225(SEQ ID NO:24)引物，从枯草芽孢杆菌gDNA扩增下游(3′)序列。

表9

寡核苷酸引物

oJKL224	CTGGAGGATCCATTATAATTGAGTGTCTTGC	SEQ ID NO:23
			oJKL225	TGCATGCCGGATATGACTGCGGGAGAT	SEQ ID NO:24

使用下表10中所阐述的oJKL222(SEQ ID NO:25)和oJKL223(SEQ ID NO:26)引物，从质粒pUCLlacA-ganAB::tet扩增loxP-tetR-loxP盒。

表10

寡核苷酸引物

oJKL222	TTACTGTATCCTGATACCGGGAG	SEQ ID NO:25
			oJKL223	ATAATGGATCCTCCAGAATGTCAGA	SEQ ID NO:26

使用下表11中所阐述的oJKL218(SEQ ID NO:27)和oJKL219(SEQ ID NO:28)引物，根据制造商的说明书，从来自生命技术公司(Life Technologies)的GeneArt LinearpUC19L载体扩增pUC19载体骨架。

表11

寡核苷酸引物

oJKL218	TCATATCCGGCATGCAAGCTTGG	SEQ ID NO:27
			oJKL219	AATGCGGGGTACCGAGCTCGAATT	SEQ ID NO:28

根据制造商的说明书，使用NEB Gibson试剂盒，将上游、下游、loxP-tetR-loxP和pUC19扩增子融合在一起。然后将经测序验证的质粒使用AatII线性化并且用于转化枯草芽孢杆菌细胞。使用cPCR确认基因组sdp操纵子缺失(Δsdp:loxP-tetR-loxP)，其中使用下表12中所阐述的oJKL 238(SEQ ID NO:29)和tet 3′out(SEQ ID NO:30)引物检查上游整合位点。

表12

寡核苷酸引物

oJKL238	CAGACAATTGAATGCTTCCC	SEQ ID NO:29
			tet 3′out	TCATTGTCATTAGTTGGCTGGTTACC	SEQ ID NO:30

使用下表13中所阐述的oJKL 239(SEQ ID NO:31)和tet 5′out(SEQ ID NO:32)引物检查下游位点。

表13

寡核苷酸引物

oJKL239	CAAAGCTATATCAGATCCAACA	SEQ ID NO:31
			tet 5′out	ACGCTTCCCTCTTTTAATTGAACCC	SEQ ID NO:32

下表14阐述了本文构建的枯草芽孢杆菌细胞(菌株)的菌株名称和简要描述，并且在下文实例3中进一步描述。

表14

菌株描述

实例3

经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的异源蛋白酶产生

本实例描述了枯草芽孢杆菌细胞中异源目的蛋白(POI)的产生。更具体地，将在上文实例1和2中构建和描述的亲本(ZM207)和经修饰的枯草芽孢杆菌菌株(例如，参见表14)在42℃下在Grant’s II培养基中在相同条件下在摇瓶中发酵四十(40)小时。通过将获自芽孢杆菌属遗传储存中心(Bacillus Genetic Stock Center)的菌株BKE11040(trpC2yitM::erm)的基因组DNA转化到亲本菌株(ZM207)中来构建名为ZM434的枯草芽孢杆菌子代菌株(ΔyitM)。

随后，取发酵上清液，并且使用AAPF测定确定ME-3蛋白酶活性(例如，参见PCT公开号WO2018/118815，通过引用以其全文并入本文)并且通过405nm处吸光度的变化监测该酶活性。吸光度变化的斜率(mOD/min)反映了ME-3蛋白酶活性并且在本文中报告用于比较。更具体地，下表15呈现了多个(n≥3)生物重复的平均ME-3效价和标准误差。

表15

ME-3蛋白酶效价

例如，如表15所示，相对于ZM207亲本菌株，ZM334(ΔsdpABC)子代菌株和ZM336(ΔyitMOP)子代菌株二者都产生增加量的蛋白酶。类似地，相对于ZM207(对照)菌株、ZM334菌株(ΔsdpABC)和ZM336菌株(ΔyitMOP)，包含yitMOP和sdpABC操纵子的组合缺失(即，ΔyitMOP+ΔsdpABC)的经修饰的ZM268菌株(表15)产生增加量的ME-3蛋白酶。

此外，出乎意料地观察到(表15)仅yitM ORF的破坏或缺失足以引发增加的蛋白质产生的有益作用，因为ZM434(ΔyitM)子代菌株产生的ME-3蛋白酶略多于ZM336(ΔyitMOP)子代菌株。

实例4

经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的异源蛋白酶产生

本实例描述了在大规模发酵条件下亲本和经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中异源蛋白酶(V42)的产生。更具体地，如本文所述，名为CB24-12的枯草芽孢杆菌菌株包含经引入的表达盒，该表达盒包含位于编码V42蛋白酶的可读框(ORF)上游(5′)并且可操作地连接到编码V42蛋白酶的可读框(ORF)的启动子序列“P4”，该编码V42蛋白酶的可读框(ORF)在编码丙氨酸消旋酶基因(alrA)的ORF上游(5′)并且可操作地连接到编码丙氨酸消旋酶基因(alrA)的ORF，其中将盒整合到枯草芽孢杆菌aprE基因座中(aprE::P4-V42-alrA)。同样，名为“JL77”的枯草芽孢杆菌菌株包含编码V42蛋白酶的经引入的表达盒(aprE::P4-V42-alrA)以及yitMOP操纵子和sdpABC操纵子的组合缺失(ΔyitMOP+ΔsdpABC)。

因此，如图2所阐述的，在标准条件下在大规模发酵罐中测试JL77菌株和CB24-12菌株的细胞，其中每种菌株一式两份地运行，并且示出了在发酵结束时(EOF)V42蛋白酶产量的平均改善。例如，如图2所呈现的，相对于CB24-12菌株在发酵结束时产生的V42蛋白酶的量，JL77菌株在发酵结束时V42蛋白酶产量的平均增加是大约10％。

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序列表

<110> 丹尼斯科美国公司（DANISCO US INC.）

<120> 用于增强芽孢杆菌属细胞中蛋白质产生的组合物和方法

<130> NB41375-WO-PCT

<150> US 62/933,536

<151> 2019-11-11

<160> 47

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 1

ttgaagaagg cgtttctagt atttttgtcg gttgtattgg tgacgactgt gtttttggtg 60

aagcagcaag aaagtgtggc acaggcaaag cagcttgagt attcaggtga ggaaattttt 120

aaaggctttg tgtttgccca aggggaagtt ggcaaacagc ttccagaggt ctttaataaa 180

gcgatgacag acaaactcaa cacaaaacag gcaaaggctt ttgccaatca ggttgtcgct 240

gatattaaaa aagaggatgc tgactttttt gataacctga agaaagctgt ttacagcaaa 300

gatgcattga aagtggatga actgctgaaa aaagcaggtc aaatcgttga agaaaaagta 360

gaagctgcaa aggaaatcgc cgcttctaag gatgatacat ccagagttca ggccgagctt 420

gtcaacactg ttgataccgc taactatttc tattatgttt cttatgttgc tgcagcaggt 480

gccctgattc tgatcattct cgccattgat attacgccga ttgcgatttc agacaatgtg 540

gatcgcgaaa tggcaatcag aacgctggtt gatgaattaa actag 585

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 2

Met Lys Lys Ala Phe Leu Val Phe Leu Ser Val Val Leu Val Thr Thr

1 5 10 15

Val Phe Leu Val Lys Gln Gln Glu Ser Val Ala Gln Ala Lys Gln Leu

20 25 30

Glu Tyr Ser Gly Glu Glu Ile Phe Lys Gly Phe Val Phe Ala Gln Gly

35 40 45

Glu Val Gly Lys Gln Leu Pro Glu Val Phe Asn Lys Ala Met Thr Asp

50 55 60

Lys Leu Asn Thr Lys Gln Ala Lys Ala Phe Ala Asn Gln Val Val Ala

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Glu Asp Ala Asp Phe Phe Asp Asn Leu Lys Lys Ala

85 90 95

Val Tyr Ser Lys Asp Ala Leu Lys Val Asp Glu Leu Leu Lys Lys Ala

100 105 110

Gly Gln Ile Val Glu Glu Lys Val Glu Ala Ala Lys Glu Ile Ala Ala

115 120 125

Ser Lys Asp Asp Thr Ser Arg Val Gln Ala Glu Leu Val Asn Thr Val

130 135 140

Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Tyr Tyr Val Ser Tyr Val Ala Ala Ala Gly

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Ala Leu Ile Leu Ile Ile Leu Ala Ile Asp Ile Thr Pro Ile Ala Ile

165 170 175

Ser Asp Asn Val Asp Arg Glu Met Ala Ile Arg Thr Leu Val Asp Glu

180 185 190

Leu Asn

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 3

atgctcgaaa acataaaaca gaccatcacc agatgggacg aaagaaaccc gtggacaaat 60

gtatatggcc tcgcgcgaag catcattgcg ctatccagcc tgctgacgct gctcatcaat 120

cacccgagcc tcattatgaa gccagccagc gggatcagca gctatccagc ttgtaaaatg 180

aatctcagtc tcttttgtct cggcgaaaat aactatatga tgttaaatct tttcagatgg 240

gtctgcattg ccattctggt gcttgttgtc attggctggc gccccagaat caccggggtt 300

ctgcattggt atgtcagtta cagcctgcag tcatcgctga tcgtcatcga cggaggcgag 360

caggcagcag cagtcatgac ctttttattg cttcccatca cgctgaccga tccgagaaaa 420

tggcattgga gtacgagacc tatagagggc aaaagaacac ttggaaaaat aacagctttt 480

atttcttatt ttgtgatcag aatccaagtg gcggtgcttt attttcactc taccgtcgct 540

aagctatctc agcaggaatg ggtggacgga acggccgtct attatttcgc ccaggaaaaa 600

accattggct tcaacggctt ttttcaggcg ttaacgaagc caattgtaac aagtccgttc 660

gtggtgattc cgacatgggg gacgctgctg gttcaaattg tcatcttcgc ggcactgttt 720

gcgccgaaga agcattggag attgattttg atcatcgctg tttttatgca tgagattttt 780

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ctcactccta tcgattccac gattcaattt acatatattc gcagactgtt gtggaataaa 900

aaacacaaga agggagaggt ttcagtttga 930

<210> 4

<211> 309

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 4

Met Leu Glu Asn Ile Lys Gln Thr Ile Thr Arg Trp Asp Glu Arg Asn

1 5 10 15

Pro Trp Thr Asn Val Tyr Gly Leu Ala Arg Ser Ile Ile Ala Leu Ser

20 25 30

Ser Leu Leu Thr Leu Leu Ile Asn His Pro Ser Leu Ile Met Lys Pro

35 40 45

Ala Ser Gly Ile Ser Ser Tyr Pro Ala Cys Lys Met Asn Leu Ser Leu

50 55 60

Phe Cys Leu Gly Glu Asn Asn Tyr Met Met Leu Asn Leu Phe Arg Trp

65 70 75 80

Val Cys Ile Ala Ile Leu Val Leu Val Val Ile Gly Trp Arg Pro Arg

85 90 95

Ile Thr Gly Val Leu His Trp Tyr Val Ser Tyr Ser Leu Gln Ser Ser

100 105 110

Leu Ile Val Ile Asp Gly Gly Glu Gln Ala Ala Ala Val Met Thr Phe

115 120 125

Leu Leu Leu Pro Ile Thr Leu Thr Asp Pro Arg Lys Trp His Trp Ser

130 135 140

Thr Arg Pro Ile Glu Gly Lys Arg Thr Leu Gly Lys Ile Thr Ala Phe

145 150 155 160

Ile Ser Tyr Phe Val Ile Arg Ile Gln Val Ala Val Leu Tyr Phe His

165 170 175

Ser Thr Val Ala Lys Leu Ser Gln Gln Glu Trp Val Asp Gly Thr Ala

180 185 190

Val Tyr Tyr Phe Ala Gln Glu Lys Thr Ile Gly Phe Asn Gly Phe Phe

195 200 205

Gln Ala Leu Thr Lys Pro Ile Val Thr Ser Pro Phe Val Val Ile Pro

210 215 220

Thr Trp Gly Thr Leu Leu Val Gln Ile Val Ile Phe Ala Ala Leu Phe

225 230 235 240

Ala Pro Lys Lys His Trp Arg Leu Ile Leu Ile Ile Ala Val Phe Met

245 250 255

His Glu Ile Phe Ala Val Met Leu Gly Leu Ile Ser Phe Ser Ile Ile

260 265 270

Met Ala Gly Ile Leu Ile Leu Tyr Leu Thr Pro Ile Asp Ser Thr Ile

275 280 285

Gln Phe Thr Tyr Ile Arg Arg Leu Leu Trp Asn Lys Lys His Lys Lys

290 295 300

Gly Glu Val Ser Val

305

<210> 5

<211> 537

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 5

atgcagaaat cgatatcatt ttttgtcatt ttttcaatcc tttggggttc gctatttctg 60

ttttctatta ttggcagctt agggacaacc ccgattccgc tgacaaagga ctccaaattt 120

ctcatgtcca gcatcctccc tcagggctgg ggctttttta gcaaaaatcc gcgtgatact 180

gcaatcggct tatatgaggc tgaaaatgcc agcgccaagg tcagatggcc caatatgagg 240

gctgacaacc tattcggcct gtatcggtat gggcggtcac aaggcgttga aatgggcgtg 300

atctacagcc aagtcggcaa ggaacagtgg acagcatgta aagaaaagga cctcggcgca 360

tgcaaaagca aagccaaaac cgtgcaatta aaaacacccg ctccccgccc gctgctttgt 420

ggcagctact atttgacgaa agaggatatt gttccttgga gctattctaa atatacccct 480

tcgtcttatc aggtaaaaag catagtcaag gttgtgatct catgctcgaa aacataa 537

<210> 6

<211> 178

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 6

Met Gln Lys Ser Ile Ser Phe Phe Val Ile Phe Ser Ile Leu Trp Gly

1 5 10 15

Ser Leu Phe Leu Phe Ser Ile Ile Gly Ser Leu Gly Thr Thr Pro Ile

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Pro Leu Thr Lys Asp Ser Lys Phe Leu Met Ser Ser Ile Leu Pro Gln

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Gly Trp Gly Phe Phe Ser Lys Asn Pro Arg Asp Thr Ala Ile Gly Leu

50 55 60

Tyr Glu Ala Glu Asn Ala Ser Ala Lys Val Arg Trp Pro Asn Met Arg

65 70 75 80

Ala Asp Asn Leu Phe Gly Leu Tyr Arg Tyr Gly Arg Ser Gln Gly Val

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Glu Met Gly Val Ile Tyr Ser Gln Val Gly Lys Glu Gln Trp Thr Ala

100 105 110

Cys Lys Glu Lys Asp Leu Gly Ala Cys Lys Ser Lys Ala Lys Thr Val

115 120 125

Gln Leu Lys Thr Pro Ala Pro Arg Pro Leu Leu Cys Gly Ser Tyr Tyr

130 135 140

Leu Thr Lys Glu Asp Ile Val Pro Trp Ser Tyr Ser Lys Tyr Thr Pro

145 150 155 160

Ser Ser Tyr Gln Val Lys Ser Ile Val Lys Val Val Ile Ser Cys Ser

165 170 175

Lys Thr

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ctcggtacga cacctgcaaa cat 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

accgtcgatc gactgctcct tttaac 26

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

cctaggcaca taaaaaaacg gctcgctccg c 31

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

tgcatgccga acaggaagga cgat 24

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gcagtcgatc gacggtatcg ataagctg 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ttttatgtgc ctaggatgca tatggcg 27

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

tcctgttcgg catgcaagct tggcgta 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

caggtgtcgt accgagctcg aattcac 27

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

aggcgattaa gttgggt 17

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

tcacacagga aacagctatg a 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gataaaccgc accgactcg 19

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

agtccactct caactcctga tcc 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

cagcacatct ttcagctggc 20

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

aaattgaaaa aatggtggaa acac 24

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ctcggtaccc cgcattgacg tgt 23

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tatcaggata cagtaataat tccctttttt tttgatg 37

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

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<220>

<223> 引物

<400> 23

ctggaggatc cattataatt gagtgtcttg c 31

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

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<220>

<223> 引物

<400> 24

tgcatgccgg atatgactgc gggagat 27

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ttactgtatc ctgataccgg gag 23

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

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<220>

<223> 引物

<400> 26

ataatggatc ctccagaatg tcaga 25

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

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<220>

<223> 引物

<400> 27

tcatatccgg catgcaagct tgg 23

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

aatgcggggt accgagctcg aatt 24

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

cagacaattg aatgcttccc 20

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

tcattgtcat tagttggctg gttacc 26

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

caaagctata tcagatccaa ca 22

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

acgcttccct cttttaattg aaccc 25

<210> 33

<211> 531

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 33

ttgactgaca agagacaaaa cagcatgttt tcattctttc tttttataat ggccgcctgg 60

atcatcgttt tgtttttaac cgtcatcgcg gcactgccaa gctccgccat ccaattaacc 120

aagcatcaat ccaaaaccgt ttccatgatt tatccgcaaa gctggggatt tttcagtaaa 180

gatccgagag aagacagtct gaacatctat ctccttgatg gcgatgaaaa gctcagatgg 240

ccgaataatt cactgaaaaa tgtgatcggc ttaaaccgat acgggcggac gcaagggata 300

gagctcggcc ttatgctgga aaagctgcct tccaaagaga agtggcacga tttcacggct 360

ggccaggact ttaagaatac catatttttg aaaatgaaaa atgagtcgcc ctccccaagg 420

ctgaaaggga aaatgatcat tacatatgaa cgcattaccc catgggcatg gagcaaacat 480

accgaaacga aacgaaccgt taaaaaatac atcggagtgg atgtcaattg a 531

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<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 34

Met Thr Asp Lys Arg Gln Asn Ser Met Phe Ser Phe Phe Leu Phe Ile

1 5 10 15

Met Ala Ala Trp Ile Ile Val Leu Phe Leu Thr Val Ile Ala Ala Leu

20 25 30

Pro Ser Ser Ala Ile Gln Leu Thr Lys His Gln Ser Lys Thr Val Ser

35 40 45

Met Ile Tyr Pro Gln Ser Trp Gly Phe Phe Ser Lys Asp Pro Arg Glu

50 55 60

Asp Ser Leu Asn Ile Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Lys Leu Arg Trp

65 70 75 80

Pro Asn Asn Ser Leu Lys Asn Val Ile Gly Leu Asn Arg Tyr Gly Arg

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Thr Gln Gly Ile Glu Leu Gly Leu Met Leu Glu Lys Leu Pro Ser Lys

100 105 110

Glu Lys Trp His Asp Phe Thr Ala Gly Gln Asp Phe Lys Asn Thr Ile

115 120 125

Phe Leu Lys Met Lys Asn Glu Ser Pro Ser Pro Arg Leu Lys Gly Lys

130 135 140

Met Ile Ile Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Pro Trp Ala Trp Ser Lys His

145 150 155 160

Thr Glu Thr Lys Arg Thr Val Lys Lys Tyr Ile Gly Val Asp Val Asn

165 170 175

<210> 35

<211> 945

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 35

ttgattcagg atgcaaaaaa gcagctcact ttatggatga tgcagaatcc gccttggaca 60

aatgtgtacg ggcttgccag aagcttaatc gcgctcggca cgctgctgac attgcttttc 120

aatccggcgt ctgtcttctt caaaacgcaa aatcaaatgc tcagcttttc cgacacgttc 180

agtttgtttt tgctgtttcc cgatttccgt tacattgaga tcgtcaaagc cgtttgtatc 240

tgtattttaa ttctggttgt cattggctgg cggccccgcc tcaccggttt ttttcattgg 300

tggatttcgt acagcttcca aaactccgcc gttactcttg acggaggaga tcaggtggct 360

gctgttttta cgctgctgct gcttccgctg acattgactg atccgcggaa atggcactgg 420

tctccgtacg aggcgtcttt tgagaagagg ccgcttgagc cttactaccg ttcgttatgc 480

tgggcgacgc tgacgatcat cagaatacag gtcgcgatgc tgtactttaa ctccgtcatt 540

gccaagctga tggaagaaga atggcagaac ggaaccgccg tttattacta tttgaacgat 600

ccgatgctgg ggctgccgga tgcgcttcac agtctgtttg actttatcct gcagtcaaag 660

cttgtcatca tcccgacttg gggcacgctc attgtgcaaa ccattatgtt ctgcgctttg 720

ttcgctccga aaaaatattg gcgtctgata ttgtttatat ccattttcat gcatgaaatc 780

tttgctgtta tgctggggct tacctcgttc tccattacgg tagctggtat tttagacctg 840

tttttggtac cggcagagaa aacagtagct ttgaaccatt acaatccgct ttttatcaga 900

tacaattttc tcaataaaag gaaaaggagg aaattatatg gttaa 945

<210> 36

<211> 314

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 36

Met Ile Gln Asp Ala Lys Lys Gln Leu Thr Leu Trp Met Met Gln Asn

1 5 10 15

Pro Pro Trp Thr Asn Val Tyr Gly Leu Ala Arg Ser Leu Ile Ala Leu

20 25 30

Gly Thr Leu Leu Thr Leu Leu Phe Asn Pro Ala Ser Val Phe Phe Lys

35 40 45

Thr Gln Asn Gln Met Leu Ser Phe Ser Asp Thr Phe Ser Leu Phe Leu

50 55 60

Leu Phe Pro Asp Phe Arg Tyr Ile Glu Ile Val Lys Ala Val Cys Ile

65 70 75 80

Cys Ile Leu Ile Leu Val Val Ile Gly Trp Arg Pro Arg Leu Thr Gly

85 90 95

Phe Phe His Trp Trp Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Asn Ser Ala Val Thr

100 105 110

Leu Asp Gly Gly Asp Gln Val Ala Ala Val Phe Thr Leu Leu Leu Leu

115 120 125

Pro Leu Thr Leu Thr Asp Pro Arg Lys Trp His Trp Ser Pro Tyr Glu

130 135 140

Ala Ser Phe Glu Lys Arg Pro Leu Glu Pro Tyr Tyr Arg Ser Leu Cys

145 150 155 160

Trp Ala Thr Leu Thr Ile Ile Arg Ile Gln Val Ala Met Leu Tyr Phe

165 170 175

Asn Ser Val Ile Ala Lys Leu Met Glu Glu Glu Trp Gln Asn Gly Thr

180 185 190

Ala Val Tyr Tyr Tyr Leu Asn Asp Pro Met Leu Gly Leu Pro Asp Ala

195 200 205

Leu His Ser Leu Phe Asp Phe Ile Leu Gln Ser Lys Leu Val Ile Ile

210 215 220

Pro Thr Trp Gly Thr Leu Ile Val Gln Thr Ile Met Phe Cys Ala Leu

225 230 235 240

Phe Ala Pro Lys Lys Tyr Trp Arg Leu Ile Leu Phe Ile Ser Ile Phe

245 250 255

Met His Glu Ile Phe Ala Val Met Leu Gly Leu Thr Ser Phe Ser Ile

260 265 270

Thr Val Ala Gly Ile Leu Asp Leu Phe Leu Val Pro Ala Glu Lys Thr

275 280 285

Val Ala Leu Asn His Tyr Asn Pro Leu Phe Ile Arg Tyr Asn Phe Leu

290 295 300

Asn Lys Arg Lys Arg Arg Lys Leu Tyr Gly

305 310

<210> 37

<211> 591

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 37

atggttaaaa gcaaaaaatc cgctgccgcc atgatgctgg tgtttgtttt aatgatcgca 60

ttagtcggcc cgcatgccac agcgaaaact gaggcatccg tctcttattc gggtgaagac 120

attttttccg gcatcttttt cggacaaggt gaggtcgcaa agcttcttcc tgaagtatgg 180

gatacgaaag ccgtcaaaaa gattaatcag gatgaattaa agcaagtttc cgatcaggtg 240

atcgctgata ttaaaaagtc atcgccggat tattttaaga agttaaaagc ggcggtctac 300

agcggcgatt atgagaaagt gaacagcgtc atcgatcaag gctcacagat tatggcgaaa 360

gtgctgaaag aagagtttga caaaaaaagc atggacaaag gaaaatcaac ggccatcgga 420

caatgcgcaa cggctgtatg ggtattttta aacgcggcgg ctgccataga gacgatcgct 480

cttgccgtag cggccatcat tttgacggta gcaagcgttg acgaagattc cgacttagga 540

aaagagcagc tcatcgcaaa tgtcgttgac cgcattaatg cgcagcactg a 591

<210> 38

<211> 196

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 38

Met Val Lys Ser Lys Lys Ser Ala Ala Ala Met Met Leu Val Phe Val

1 5 10 15

Leu Met Ile Ala Leu Val Gly Pro His Ala Thr Ala Lys Thr Glu Ala

20 25 30

Ser Val Ser Tyr Ser Gly Glu Asp Ile Phe Ser Gly Ile Phe Phe Gly

35 40 45

Gln Gly Glu Val Ala Lys Leu Leu Pro Glu Val Trp Asp Thr Lys Ala

50 55 60

Val Lys Lys Ile Asn Gln Asp Glu Leu Lys Gln Val Ser Asp Gln Val

65 70 75 80

Ile Ala Asp Ile Lys Lys Ser Ser Pro Asp Tyr Phe Lys Lys Leu Lys

85 90 95

Ala Ala Val Tyr Ser Gly Asp Tyr Glu Lys Val Asn Ser Val Ile Asp

100 105 110

Gln Gly Ser Gln Ile Met Ala Lys Val Leu Lys Glu Glu Phe Asp Lys

115 120 125

Lys Ser Met Asp Lys Gly Lys Ser Thr Ala Ile Gly Gln Cys Ala Thr

130 135 140

Ala Val Trp Val Phe Leu Asn Ala Ala Ala Ala Ile Glu Thr Ile Ala

145 150 155 160

Leu Ala Val Ala Ala Ile Ile Leu Thr Val Ala Ser Val Asp Glu Asp

165 170 175

Ser Asp Leu Gly Lys Glu Gln Leu Ile Ala Asn Val Val Asp Arg Ile

180 185 190

Asn Ala Gln His

195

<210> 39

<211> 122

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 39

atgaacactc ctttttacat ataatagtat attagtccaa aaaatctaat ttctcaatat 60

tttacctgtt gaatggtgta taatcatgtc aatgaaatgt ccattcgata ggagggtttc 120

aa 122

<210> 40

<211> 177

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 40

ggtttaaata tatcgaaaaa aacactatat atcaatcaca tatagaagtg taaaatgtcc 60

tgtttttcct tttaacaaaa atggaatttc tcatactttt taaccttttt attacataaa 120

tgtttttata ttatgaaaag tgtaaaaacg attcttcagg ttaaaaggag cagtcga 177

<210> 41

<211> 221

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 41

aaagttccca aattcaattc tgggaacttt tttaagtcca atccaaatgg ttgaatatca 60

aacttcaaga aaacaaacaa aataatgcat aatttacatt aatttattaa ttatccattt 120

tttgttgatt attctgacta gctattatat aatctttttg aaatgattat attagcttag 180

aggaggtaat ctacatcaaa aaaaagggaa ttattactgt a 221

<210> 42

<211> 477

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 42

atgactatat gtttcctatt attttcttct tattacttta gcaatatttc acctcagaat 60

ccactgttca aaaaaaattt tttgcaacaa ttgtctcccc aaggctttgg cttttatagt 120

aaaagcccta cagaagaaaa catttcattt cacacaaaag aaaatttaaa gttacctaat 180

gcacttccca ataatttttt tgggataaaa agagaaggaa gagttcaggc aatagaatta 240

ggcaaaattg tagagaatat cgatccaaag aattggaaaa cttgtgaaaa caacaactcc 300

tgcacaaatt tagagaaaca aataaagcct attaaggtta taaaaaatga agattatata 360

catcttagca aaggagaata cctaatatat cgccaaaaac cactctcatg gtattggata 420

gactttaagc aaactacctc ttttgaaaga aaggtgctaa aaataaaaat agtatga 477

<210> 43

<211> 158

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 43

Met Thr Ile Cys Phe Leu Leu Phe Ser Ser Tyr Tyr Phe Ser Asn Ile

1 5 10 15

Ser Pro Gln Asn Pro Leu Phe Lys Lys Asn Phe Leu Gln Gln Leu Ser

20 25 30

Pro Gln Gly Phe Gly Phe Tyr Ser Lys Ser Pro Thr Glu Glu Asn Ile

35 40 45

Ser Phe His Thr Lys Glu Asn Leu Lys Leu Pro Asn Ala Leu Pro Asn

50 55 60

Asn Phe Phe Gly Ile Lys Arg Glu Gly Arg Val Gln Ala Ile Glu Leu

65 70 75 80

Gly Lys Ile Val Glu Asn Ile Asp Pro Lys Asn Trp Lys Thr Cys Glu

85 90 95

Asn Asn Asn Ser Cys Thr Asn Leu Glu Lys Gln Ile Lys Pro Ile Lys

100 105 110

Val Ile Lys Asn Glu Asp Tyr Ile His Leu Ser Lys Gly Glu Tyr Leu

115 120 125

Ile Tyr Arg Gln Lys Pro Leu Ser Trp Tyr Trp Ile Asp Phe Lys Gln

130 135 140

Thr Thr Ser Phe Glu Arg Lys Val Leu Lys Ile Lys Ile Val

145 150 155

<210> 44

<211> 972

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 44

atgaagatat taaatagttt agaaggttat attgacacct ataatccatg gaaaaataca 60

tatgcacttt ttagaagttt acttggtttc tcaacattac tagtactatt attcaatagt 120

actgatattt tatttagtta tagtgcaaat aatgtcacat gtgaaaatgt ctatatccct 180

accgcttttt gttttgctaa agaatatagt atcaattttg agattataag atacttaatg 240

atttttatat taaccttagt ggttataggg tggagaccta gatttaccgg tttatttcac 300

tggtatattt gctatagtat tcaaacttca gctttaacta tcgatggtgg agagcaaatt 360

gcaactgttc tttcttttct tatattacct gttacattat tagattcaag gcgaaatcat 420

tggaatataa agaaaaacaa taatgaatct ttcacaaaga agacagtatt gttttatata 480

atgacaataa ttaaaattca agtttttatc atttatttaa acgcagcttt agagcgattg 540

aaaaataaag agtgggcaga aggaacagca atttactatt tcttttctga tccggtgttt 600

ggattacctg aatatcaact taacttaatg aatccactac ttgaaagcaa ttttattgtt 660

gtcatcactt ggttagtaac tatttttgag ttgttcttag cagcaagcat aatttcaaat 720

atcagaataa agagaattgc ccttgttttg ggaatattat ttcatattgg gataatattc 780

agcattggta ttgtaagttt tggcttgatc atgatatcag cattaattat atatctgcat 840

cctgtacaac aaaatatcac tatgaattgg tgttctcctt tatttaaata tatatatgta 900

aaaggaaaga gaaatttcaa aagaatagga ggtgaatcag tcaagtttct tacaaaattg 960

tttcatagct aa 972

<210> 45

<211> 323

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 45

Met Lys Ile Leu Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ile Asp Thr Tyr Asn Pro

1 5 10 15

Trp Lys Asn Thr Tyr Ala Leu Phe Arg Ser Leu Leu Gly Phe Ser Thr

20 25 30

Leu Leu Val Leu Leu Phe Asn Ser Thr Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Ser

35 40 45

Ala Asn Asn Val Thr Cys Glu Asn Val Tyr Ile Pro Thr Ala Phe Cys

50 55 60

Phe Ala Lys Glu Tyr Ser Ile Asn Phe Glu Ile Ile Arg Tyr Leu Met

65 70 75 80

Ile Phe Ile Leu Thr Leu Val Val Ile Gly Trp Arg Pro Arg Phe Thr

85 90 95

Gly Leu Phe His Trp Tyr Ile Cys Tyr Ser Ile Gln Thr Ser Ala Leu

100 105 110

Thr Ile Asp Gly Gly Glu Gln Ile Ala Thr Val Leu Ser Phe Leu Ile

115 120 125

Leu Pro Val Thr Leu Leu Asp Ser Arg Arg Asn His Trp Asn Ile Lys

130 135 140

Lys Asn Asn Asn Glu Ser Phe Thr Lys Lys Thr Val Leu Phe Tyr Ile

145 150 155 160

Met Thr Ile Ile Lys Ile Gln Val Phe Ile Ile Tyr Leu Asn Ala Ala

165 170 175

Leu Glu Arg Leu Lys Asn Lys Glu Trp Ala Glu Gly Thr Ala Ile Tyr

180 185 190

Tyr Phe Phe Ser Asp Pro Val Phe Gly Leu Pro Glu Tyr Gln Leu Asn

195 200 205

Leu Met Asn Pro Leu Leu Glu Ser Asn Phe Ile Val Val Ile Thr Trp

210 215 220

Leu Val Thr Ile Phe Glu Leu Phe Leu Ala Ala Ser Ile Ile Ser Asn

225 230 235 240

Ile Arg Ile Lys Arg Ile Ala Leu Val Leu Gly Ile Leu Phe His Ile

245 250 255

Gly Ile Ile Phe Ser Ile Gly Ile Val Ser Phe Gly Leu Ile Met Ile

260 265 270

Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Leu His Pro Val Gln Gln Asn Ile Thr Met

275 280 285

Asn Trp Cys Ser Pro Leu Phe Lys Tyr Ile Tyr Val Lys Gly Lys Arg

290 295 300

Asn Phe Lys Arg Ile Gly Gly Glu Ser Val Lys Phe Leu Thr Lys Leu

305 310 315 320

Phe His Ser

<210> 46

<211> 612

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 46

ttgaaaagta aattacttag gctattgatt gtttccatgg taacgatatt ggttttttca 60

ttagtaggac tctctaagga gtcaagtaca tctgctaaag aaaaccatac attttctgga 120

gaagattact ttagaggact tttatttgga caaggggaag ttggtaaatt aatttcaaac 180

gatttggacc ctaaactcgt aaaagaggca aatagtacag aaggtaaaaa gttagtaaat 240

gatgtagtca aatttataaa aaaagatcaa ccacaatata tggatgaatt gaaacaatcg 300

attgacagca aagaccctaa aaaactcatt gaaaatatga ccaaagcaga ccaacttatc 360

caaaaatatg ctaagaaaaa tgaaaacgta aaatactctt ctaataaagt tactccatct 420

tgtgggcttt atgccgtctg tgtagcagct ggatatttat atgttgtggg cgttaacgca 480

gttgcattac aaacggctgc cgcagtaaca actgcagtgt ggaaatacgt tgccaaatat 540

tcctcttcag cttctaataa ttctgattta gaagcggctg ctgcaaaaac cctaaaattg 600

attcatcaat aa 612

<210> 47

<211> 203

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 47

Met Lys Ser Lys Leu Leu Arg Leu Leu Ile Val Ser Met Val Thr Ile

1 5 10 15

Leu Val Phe Ser Leu Val Gly Leu Ser Lys Glu Ser Ser Thr Ser Ala

20 25 30

Lys Glu Asn His Thr Phe Ser Gly Glu Asp Tyr Phe Arg Gly Leu Leu

35 40 45

Phe Gly Gln Gly Glu Val Gly Lys Leu Ile Ser Asn Asp Leu Asp Pro

50 55 60

Lys Leu Val Lys Glu Ala Asn Ser Thr Glu Gly Lys Lys Leu Val Asn

65 70 75 80

Asp Val Val Lys Phe Ile Lys Lys Asp Gln Pro Gln Tyr Met Asp Glu

85 90 95

Leu Lys Gln Ser Ile Asp Ser Lys Asp Pro Lys Lys Leu Ile Glu Asn

100 105 110

Met Thr Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Lys Tyr Ala Lys Lys Asn Glu

115 120 125

Asn Val Lys Tyr Ser Ser Asn Lys Val Thr Pro Ser Cys Gly Leu Tyr

130 135 140

Ala Val Cys Val Ala Ala Gly Tyr Leu Tyr Val Val Gly Val Asn Ala

145 150 155 160

Val Ala Leu Gln Thr Ala Ala Ala Val Thr Thr Ala Val Trp Lys Tyr

165 170 175

Val Ala Lys Tyr Ser Ser Ser Ala Ser Asn Asn Ser Asp Leu Glu Ala

180 185 190

Ala Ala Ala Lys Thr Leu Lys Leu Ile His Gln

195 200

Claims (15)

1.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)细胞中产生增加量的目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：

(a)获得产生POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，

(b)通过使yitMOP操纵子破坏或缺失对所述亲本细胞进行遗传修饰，以及

(c)在用于产生所述POI的合适条件下发酵所述经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于所述亲本细胞，所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。

2.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：

(a)获得产生POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，

(b)通过使yitMOP操纵子的调节区破坏或缺失对所述亲本芽孢杆菌属物种细胞进行遗传修饰，从而使得所述经修饰的细胞中功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白产生不足，以及

(c)在用于产生所述POI的合适条件下发酵所述经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于所述亲本细胞，所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。

3.一种用于在经修饰的芽孢杆菌属物种细胞中产生增加量的目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：

(a)获得产生POI的亲本芽孢杆菌属物种细胞，

(b)通过使yitM基因破坏或缺失对所述亲本细胞进行遗传修饰，以及

(c)在用于产生所述POI的合适条件下发酵所述经修饰的细胞，其中当在相同条件下发酵时，相对于所述亲本细胞，所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种细胞进一步包含sdpABC操纵子的破坏或缺失。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述POI是酶。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。

8.一种根据权利要求1-4中任一项所述的方法产生的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞。

9.一种衍生自产生目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述经修饰的细胞包含被破坏或缺失的yitMOP操纵子，并且当在相同条件下发酵时，相对于所述亲本细胞，产生增加量的所述POI。

10.一种衍生自产生目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述经修饰的细胞包含yitMOP操纵子的被破坏或缺失的调节区，使得所述经修饰的细胞中功能性YitM、YitO和/或YitP蛋白产生不足，其中当在相同的条件下发酵时，相对于所述亲本细胞，所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。

11.一种衍生自产生目的蛋白(POI)的亲本芽孢杆菌属物种细胞的经遗传修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述经修饰的细胞包含被破坏或缺失的yitM基因，其中当在相同条件下发酵时，相对于所述亲本细胞，所述经修饰的细胞产生增加量的所述POI。

12.如权利要求9-11中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述芽孢杆菌属物种细胞进一步包含sdpABC操纵子的破坏或缺失。

13.如权利要求9-12中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述芽孢杆菌属物种细胞选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。

14.如权利要求9-12中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述POI是酶。

15.如权利要求14所述的经修饰的细胞，其中所述酶选自由以下组成的组：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶和己糖氧化酶。

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