CN115308342A - 一种表面活性素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种表面活性素的检测方法，所述方法包括：获取含有表面活性素的待测样品；制备表面活性素标准样品，并对标准样品进行HPLC‑MS测定，得到标准曲线；对所述待测样品进行HPLC‑MS测定，根据所述标准曲线确定所述待测样品中表面活性素的含量；其中，HPLC‑MS的液相条件为：流动相为乙腈和三氟乙酸；质谱条件为：流动相为甲醇和三氟乙酸。其中，待测样品为表面活性素发酵液、浓缩表面活性素样品、表面活性素酸沉淀过程中的上清液中的任意一种。通过本发明的方法，能够对表面活性素进行定性、定量检测，具有灵敏度高、快速、准确的优势。

Description

一种表面活性素的检测方法

技术领域

本公开涉及化学检测的技术领域，尤其涉及一种表面活性素的检测方法。

背景技术

表面活性素（Surfactin）于1968年首次在枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的培养液中发现，由一个疏水的脂肪烃链与亲水的氨基酸环构成的环状脂肽组成。表面活性素表现出各种生理活性，包括作为纤维蛋白凝固抑制剂和细胞裂解物。表面活性素具有抗病毒、抗肿瘤作用，还可抗细菌、抗真菌、抗支原体、抗炎，抗菌谱较广，同时具有不易产生耐药性、可被动物消化酶降解、无残留等优点，均显示其应用于医药业的潜力。

目前对于表面活性素的检测，尤其是定性和定量方法上，均存在灵敏度低的缺陷，因此，需要一种灵敏度高的检测方法。

发明内容

本公开提供了一种表面活性素的检测方法，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。

根据本公开的第一方面，提供了一种表面活性素的检测方法，所述方法包括：

获取含有表面活性素的待测样品；

制备表面活性素标准样品，并对标准样品进行HPLC-MS测定，得到标准曲线；

对所述待测样品进行HPLC-MS测定，根据所述标准曲线确定所述待测样品中表面活性素的含量；

其中，HPLC-MS的液相条件为：流动相为乙腈和三氟乙酸的混合物；质谱条件为：流动相为甲醇和三氟乙酸的混合物。

在一可实施方式中，所述液相条件中，所述三氟乙酸的浓度为0.05-0.1%，乙腈与三氟乙酸的体积比为20%-100%：80%-0%，且乙腈的含量先增加后降低。

在一可实施方式中，HPLC开始时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%；50min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为60%：40%；55min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为80%：20%；85min时，流动相中乙腈为100%；90min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%。

在一可实施方式中，所述液相条件中，检测波长为210nm，色谱柱为C18柱，流速为0.8-1.2mL/min。

在一可实施方式中，所述质谱条件中，所述三氟乙酸的浓度为0.05-0.1%，甲醇与三氟乙酸的体积比为20%-100%：80%-0%，且甲醇的含量先增加后降低。

在一可实施方式中，质谱开始时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%；3min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为60%：40%；5min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为90%：10%；15.01min时，流动相中甲醇为100%；35.01min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%。

在一可实施方式中，质谱的一级质谱条件为：分辨率70000，自动增益控制目标3e6，最大循环次数200ms，扫描范围1000-1600m/z。

在一可实施方式中，所述待测样品为表面活性素发酵液、浓缩表面活性素样品、表面活性素酸沉淀过程中的上清液中的任意一种。

在一可实施方式中，由表面活性素发酵液制备浓缩表面活性素样品，包括：

将表面活性素发酵液离心，取上层清液并调节pH至2.0-4.0，过夜沉淀表面活性素；

继续离心分离，取出沉淀并用1mol/L Tris-HCl溶解，并用正丁醇萃取多次，萃取液经过冷冻干燥得到的固体使用甲醇溶解，再用有机相过滤器过滤得到浓缩表面活性素样品。

本公开提供的一种表面活性素的检测方法，通过获取含有表面活性素的待测样品；再制备表面活性素标准样品，并对标准样品进行HPLC-MS测定，得到标准曲线；然后对待测样品进行HPLC-MS测定，根据标准曲线确定待测样品中表面活性素的含量；HPLC-MS的液相条件为：流动相为乙腈和三氟乙酸；质谱条件为：流动相为甲醇和三氟乙酸。通过上述方法，能够对表面活性素进行定性、定量检测，具有灵敏度高、快速、准确的优势。

应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

附图说明

通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：

在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。

图1示出了本公开实施例一种表面活性素的检测方法的流程示意图；

图2示出了本公开实施例不同浓度的标准样品对应的色谱图；

图3示出了本公开实施例不同浓度的标准样品对应的色谱图的局部放大图；

图4示出了本公开实施例标准样品的质谱图；

图5示出了本公开实施例1色谱峰总面积对应的标准曲线；

图6示出了本公开实施例1出峰时间在74.343min对应的标准曲线；

图7示出了本公开实施例1出峰时间在71.673min对应的标准曲线；

图8示出了本公开实施例1出峰时间在70.787min对应的标准曲线；

图9示出了本公开实施例1出峰时间在67.417min对应的标准曲线；

图10示出了本公开实施例1表面活性素发酵液对应的色谱图；

图11为图10中的局部放大图；

图12示出了本公开实施例1表面活性素发酵液对应的质谱图；

图13示出了本公开实施例2浓缩表面活性素样品对应的色谱图；

图14为图13中的局部放大图；

图15示出了本公开实施例2浓缩表面活性素样品对应的质谱图；

图16示出了本公开实施例3表面活性素酸沉淀过程中的上清液对应的色谱图；

图17为图16中的局部放大图；

图18示出了本公开实施例3表面活性素酸沉淀过程中的上清液对应的质谱图。

具体实施方式

为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

如图1示出了本发明一实施例提供的一种表面活性素的检测方法的流程示意图，该方法包括：

S1、获取含有表面活性素的待测样品；

其中待测样品可以是任何含有表面活性素的样品，例如表面活性素发酵液、浓缩表面活性素样品、表面活性素酸沉过程中上清溶液。

S2、制备表面活性素标准样品，并对标准样品进行HPLC-MS测定，得到标准曲线；

通过制备不同浓度梯度的表面活性素标准样品，通过对标准样品进行HPLC-MS测定，色谱峰面积与浓度成正比，以标准样品的杆色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。

S3、对所述待测样品进行HPLC-MS测定，根据所述标准曲线确定所述待测样品中表面活性素的含量；

通过待测样品进行HPLC-MS测定，确定待测样品的色谱峰面积，将待测样品的色谱峰面积代入至标准曲线，即可确定待测样品中表面活性素的含量。

其中，HPLC-MS的液相条件为：流动相为乙腈和三氟乙酸；三氟乙酸的浓度为0.05-0.1%，乙腈与三氟乙酸的体积比为20%-100%：80%-0%，且乙腈的含量先增加后降低。

HPLC开始时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%；50min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为60%：40%；55min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为80%：20%；85min时，流动相中乙腈为100%；90min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%。

HPLC-MS的质谱条件为：流动相为甲醇和三氟乙酸；三氟乙酸的浓度为0.05-0.1%，甲醇与三氟乙酸的体积比为20%-100%：80%-0%，且甲醇的含量先增加后降低。流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%；3min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为60%：40%；5min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为90%：10%；15.01min时，流动相中甲醇为100%；35.01min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%。

质谱的一级质谱条件为：分辨率70000，自动增益控制目标3e6，最大循环次数200ms，扫描范围1000-1600m/z（质荷比）。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

一种表面活性素的检测方法，包括如下步骤：

S11、获取含有表面活性素的待测样品。

其中待测样品为表面活性素发酵液，表面活性素发酵液是由生产菌株进行36h-72h发酵后的发酵液原液，发酵液中含有表面活性素，但浓度很低。

S12、制备表面活性素标准样品，并对标准样品进行HPLC-MS测定，得到标准曲线。

称量表面活性素标准品置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分别配置浓度为0.01g/L、0.078g/L、0.313g/L、0.625g/L、1.25g/L、2.5g/L的标准样品。使用的仪器是Thermo Ultimate 3000，进行HPLC-MS测定，色谱柱为Symmetry，C18，4.6×250mm，5μm，进样体积15μL。HPLC流动相条件如下表1所示，MS流动相条件如表2所示。

表1 HPLC流动相条件

表2 MS流动相条件

质谱条件：毛细管电压：4.5kv，干燥气温度：350℃，干燥气流量：11L/min，雾化气压力：15psi，反应气N2,采集方式：多反应监测模式。质谱的一级质谱条件为：分辨率70000，自动增益控制目标（AGC taget）3e6，最大循环次数200ms，扫描范围（scan range）1000-1600m/z。

不同浓度的标准样品对应的色谱图（HPLC）如图2所示，由于市面上出售的标准品都是通过纯化细菌发酵液而来，因此该标准品并不是单一物质，而是许多表面活性素的同系物，结果看出，出峰时间在70min左右，对该部分色谱图进行局部放大，如图3所示。图中可以看出主要出峰在67.417,70.787,71.673,74.343四个时间，并且峰面积与浓度成比例。

对标准样品进行质谱图分析，如图4所示，结果可见有两个明显的大峰，其质谱结果可以看出质合比都为1036.69，这正是表面活性素的分子质量。

然后对HPLC的色谱峰面积进行积分，对单独每一个峰绘制标准曲线，如图6-9所示，结果可见线性较好，R²达到0.99-0.999，把四种峰面积加起来绘制标准曲线得到y =69.609x-1.7684，R²= 0.999，标准曲线如图5所示。

S13、对表面活性素发酵液进行HPLC-MS测定，如图10-11所示，该样品在70min左右出来的峰与标准样品相吻合，对它们的面积进行积分计算出了表面活性素含量。

计算得到，总面积为56.842，代入标准曲线，表面活性素含量为0.842g/L。

该样品的质谱结果如图12所示，根据质谱结果看出，发酵液的组成成分比较复杂，对应到标准样品的质谱图中，可以看到表面活性素的峰面积较大，而且质谱结果显示质合比为1036.69，这正是表面活性素的分子量，且相对丰度为100。该质谱图中其它的峰，为细菌发酵产生的其他的物质。

实施例2

一种表面活性素的检测方法，与实施例1的区别在于，含有表面活性素的待测样品为实施例1发酵液的浓缩样品。

浓缩表面活性素样品：浓缩表面活性素样品是进行了酸沉淀的步骤，浓缩富集了表面活性素。发酵结束发酵液8000rpm离心20min，取上层清液，使用HCL调节pH到3.0，过夜沉淀表面活性素；过夜后，继续在 8000rpm离心10min，弃上层清液，沉淀用1mol/L Tris-HCl(pH7.4)溶解，并用正丁醇萃取三次，萃取液经过冷冻干燥得到的固体使用甲醇溶解，最后用0.22μm有机相过滤器过滤得到，该样品表面活性素浓度较高。

对浓缩表面活性素进行HPLC-MS测定，如图13-14所示，该样品在70min左右出来的峰与标准品相吻合，对它们的面积进行积分计算出了表面活性素含量。

计算得到，总面积为287.911，代入标准曲线，表面活性素含量为4.162g/L。

该样品的质谱结果如图15所示，根据质谱结果可以看出，经过酸沉淀后质谱峰图出峰相对较少，对应到表面活性素标准样品出峰的时间，其质谱结果为1036.69，与表面活性素的分子量相吻合。

实施例3

一种表面活性素的检测方法，与实施例1的区别在于，含有表面活性素的待测样品为表面活性素酸沉过程中上清溶液。

表面活性素酸沉过程中上清溶液：由于表面活性素有两亲性，在水溶液中也有一定的含量，因此在表面活性素酸沉过程中上清溶液中也含有少量的表面活性素。发酵结束后，发酵液在8000rpm离心20min，取上层清液，用HCL调pH到3.0，过夜沉淀表面活性素；过夜后，再8000rpm离心10min，取上层清液用于HPLC-MS分析。

对表面活性素酸沉过程中上清溶液进行HPLC-MS测定，如图16-17所示，该样品在70min左右出来的峰与标准品相吻合，对它们的面积进行积分计算出了面活性素含量。

出峰时间	67.417	70.787	71.673	74.343
					峰面积	0.346	0.589	1.288	4.803
表面活性素含量	0.030	0.034	0.044	0.094

计算得到，总面积为7.026，代入标准曲线，表面活性素含量为0.126g/L。

该样品的质谱结果如图18所示，根据质谱结果可以看出，经过酸沉淀后质谱峰图出峰相对较少，对应到表面活性素标准样品出峰的时间，其质谱结果为1036.69，与表面活性素的分子量相吻合。

本发明的表面活性素基于HPLC-MS方法进行定性、定量分析，可以适用于各种不同种类的表面活性素样品，并且能跟较准确的计算出表面活性素的含量。

应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本公开公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种表面活性素的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

获取含有表面活性素的待测样品；

制备表面活性素标准样品，并对标准样品进行HPLC-MS测定，得到标准曲线；

对所述待测样品进行HPLC-MS测定，根据所述标准曲线确定所述待测样品中表面活性素的含量；

其中，HPLC-MS的液相条件为：流动相为乙腈和三氟乙酸；质谱条件为：流动相为甲醇和三氟乙酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相条件中，所述三氟乙酸的浓度为0.05-0.1%，乙腈与三氟乙酸的体积比为20%-100%：80%-0%，且乙腈的含量先增加后降低。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，HPLC开始时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%；50min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为60%：40%；55min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为80%：20%；85min时，流动相中乙腈为100%；90min时，流动相中乙腈与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液相条件中，检测波长为210nm，色谱柱为C18柱，流速为0.8-1.2mL/min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述质谱条件中，所述三氟乙酸的浓度为0.05-0.1%，甲醇与三氟乙酸的体积比为20%-100%：80%-0%，且甲醇的含量先增加后降低。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，质谱开始时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%；3min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为60%：40%；5min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为90%：10%；15.01min时，流动相中甲醇为100%；35.01min时，流动相中甲醇与0.05%三氟乙酸的体积比为20%：80%。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，质谱的一级质谱条件为：分辨率70000，自动增益控制目标3e6，最大循环次数200ms，扫描范围1000-1600m/z。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为表面活性素发酵液、浓缩表面活性素样品、表面活性素酸沉淀过程中的上清液中的任意一种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，由表面活性素发酵液制备浓缩表面活性素样品，包括：

将表面活性素发酵液离心，取上层清液并调节pH至2.0-4.0，过夜沉淀表面活性素；

继续离心分离，取出沉淀并用1mol/L Tris-HCl溶解，并用正丁醇萃取多次，萃取液经过冷冻干燥得到的固体使用甲醇溶解，再用有机相过滤器过滤得到浓缩表面活性素样品。

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