CN115305227B - 一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌zj-21及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌ZJ‑21及其应用。所述霍氏肠杆菌ZJ‑21的分类名为Enterobacter hormaechei，已于2022年03月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2022289。霍氏肠杆菌ZJ‑21能够有效降解废弃烟叶并产生氢气，废弃烟叶中尼古丁、果胶、纤维素和半纤维素的降解率分别为44%、30%、46%和28%，最大累积产氢量为109mL/g。

Description

一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌ZJ-21及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌ZJ-21及其应用。

背景技术

氢能是一种清洁、高效、热值高的可再生能源。在诸多的制氢途径中，生物发酵制氢具有条件温和、生产工艺简单、可利用有机物范围广等优点，是目前可再生能源领域中极具发展前景的一个研究方向。

中国是世界上最大的烟草生产国和消费国，卷烟总产量占世界总产量的30%，烟草消费总量占世界的1/3，均居世界首位。在烟草采收及加工过程中会产生大量的废弃烟叶。废弃烟叶中含有丰富的多糖类物质（纤维素、半纤维素和果胶等），是宝贵的生物质资源；同时烟草中含有的尼古丁则具有生物毒性且难以降解。目前我国对废弃烟叶的处理主要是直接填埋或集中焚烧销毁，直接填埋时废弃烟叶中的有害物质尼古丁难以降解，集中焚烧销毁则耗时耗力且产生有害烟气，对环境造成极大的污染。

近年来，采用微生物降解废弃烟叶成为废弃烟叶处理的新方向。例如，公开号为CN106754407A的专利提供了一种米根霉及其用途，该菌株可加快废弃烟叶的分解速度；公开号为CN104686794A的专利提供的利用纤维素酶处理烟草废弃物生产牲畜饲料配料的方法，可利用具有降烟碱作用的芽孢杆菌菌液降解烟叶中的烟碱。但是，上述利用微生物降解废弃烟叶的方法均仅能达到降解废弃烟叶的效果，工业应用的价值有限，如果能将烟叶降解和发酵制氢耦合，在利用微生物降解废弃烟叶的同时获得清洁能源氢气，不仅能提高废弃烟叶降解的工业价值，开拓废弃烟叶综合利用的新途径，同时也可极大地降低制氢成本、保护生态环境。

发明内容

为了解决现有微生物降解废弃烟叶的工业价值较低的问题，本发明公开了一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌ZJ-21及其应用，该菌株能够在降解废弃烟叶的同时产生氢气，显著提高废弃烟叶的工业应用价值。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌ZJ-21，所述霍氏肠杆菌ZJ-21的分类名为Enterobacter hormaechei，已保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2022289，保藏时间为2022年03月18日，地址为中国.武汉.武汉大学。

进一步的，所述霍氏肠杆菌ZJ-21菌体大小为0.5-0.8μm×1.9-3.2μm，呈细杆状，无鞭毛，在平板上为淡黄色圆斑状。

上述霍氏肠杆菌ZJ-21的培养方法，步骤如下：将霍氏肠杆菌ZJ-21接种到种子富集培养基上进行发酵培养，培养至对数生长期后停止发酵，即获得霍氏肠杆菌ZJ-21菌液。

进一步的，所述种子富集培养基的配制方法为将葡萄糖、NH₄HCO₃、NaCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgCl₂、FeSO₄·7H₂O和L-半胱氨酸用去离子水溶解后在121℃温度下灭菌20min。

进一步的，所述菌种发酵培养的条件为：pH 7.0，温度37℃，以转速180r/min振荡培养。

上述的霍氏肠杆菌ZJ-21在降解废弃烟叶并产氢中的应用，步骤为：霍氏肠杆菌ZJ-21菌液按10%的接种量接种到含有废弃烟叶的培养基中，进行发酵培养，并收集气体。

进一步的，所述含有废弃烟叶的培养基的配制方法为：将废弃烟叶、NH₄HCO₃、L-半胱氨酸和营养液的混合液在121℃温度下灭菌20min。

优选的，所述营养液含有以下组分：FeCl₂·4H₂O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO₄·7H2O 0.1g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01g/L、Na₂MO₄·2H₂O 0.01g/L和MnSO₄·7H₂O 0.015g/L。

上述霍氏肠杆菌ZJ-21对废弃烟叶中尼古丁、果胶、纤维素和半纤维素的降解率分别为44%、30%、46%和28%，降解废弃烟叶时最大累积产氢量为109mL/g。

本发明的有益效果：本发明分离得到一种霍氏肠杆菌ZJ-21，能够以废弃烟叶为原料发酵产氢，废弃烟叶中尼古丁降解率为44%、果胶降解率为30%、纤维素降解率为46%以及半纤维素降解率为28%，最大累积产氢量为109mL/g。本发明利用霍氏肠杆菌ZJ-21厌氧发酵降解废弃烟叶，在降解废弃烟叶中的果胶、纤维素、半纤维素及尼古丁的同时，可产生大量氢气，显著提高废弃烟叶的工业应用价值，拓展了废弃烟叶的利用途径，也为氢能的生产提供了参考，对废弃烟叶回收再利用及环境保护均有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明霍氏肠杆菌ZJ-21的菌落形态图（a）和光学显微镜图（b）。

图2为本发明霍氏肠杆菌ZJ-21的系统发育树图。

图3为本发明霍氏肠杆菌ZJ-21发酵废弃烟叶过程中的氢气生成曲线和霍氏肠杆菌ZJ-21生长曲线。

图4为本发明霍氏肠杆菌ZJ-21降解废弃烟叶中尼古丁、果胶、纤维素和半纤维素的过程曲线。

图5为本发明霍氏肠杆菌ZJ-21降解尼古丁过程中的氢气生成曲线和尼古丁降解曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的实施例中所涉及到的液体培养基使用前均用N₂吹扫培养液以排出空气，固体培养基在放入培养箱前均用真空袋抽真空并密封好。

实施例1霍氏肠杆菌ZJ-21的鉴定

（1）霍氏肠杆菌ZJ-21的形态

本发明的霍氏肠杆菌ZJ-21从牛粪堆肥中筛选分离得到，具体步骤为：将微波预处理后的牛粪水混合液用80目筛网过滤，收集滤液，将滤液转移至含种子富集培养基物质的血清瓶中，在37℃、180 r/min、pH 7.0的条件下培养。利用气相色谱仪对发酵体系进行检测，当菌液处于对数生长期时停止发酵培养，得到富集的种子液。将该种子液分别用无菌水稀释10^-1倍、10^-2倍、10^-3倍、10^-4倍、10^-5倍、10^-6倍和10^-7倍，再用分离培养基（成分如下：尼古丁 2g/L、NH₄HCO₃1g/L、L-半胱氨酸 0.5g/L、营养液2mL/L和琼脂1.5%（以分离培养基总质量为基准））进行平板涂布，培养条件为pH 7.0、温度37℃，培养时长48h。48h后，可观察到菌落为淡黄色圆斑状，见图1（a）。在显微镜下菌体为细杆状，无鞭毛，大小为0.5-0.8μm×1.9-3.2μm，见图1（b）。将筛选得到的菌株命名为ZJ-21。

其中，种子富集培养基的配方为：葡萄糖10g/L、NH₄HCO₃1g/L、NaCl 3g/L、K₂HPO₄1g/L、KH₂PO₄1g/L、MgCl₂0.1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.1g/L和L-半胱氨酸0.5g/L；将配方全部组分用去离子水溶解后，在121℃温度下灭菌20min。

（2）菌株ZJ-21的分子生物学鉴定

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株ZJ-21的总DNA，采用细菌16SrDNA的通用引物（由上海生工生物工程股份有限公司合成，其正向引物序列：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，反向引物序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行16S rDNA的PCR扩增。所得PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，对所得序列进行Blast分析，并构建如图2所示的系统发育树，结果表明，菌株ZJ-21与Enterobacter hormaechei（NR126208.1）的相似度达到99.57%，结合菌落形态特征、生理生化特性分析，初步鉴定菌株ZJ-21为霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）属。

实施例2霍氏肠杆菌ZJ-21的活化

挑取实施例1平板上的单菌落，接种到种子富集培养基上进行菌种活化，种子富集培养基的配方同实施例1，培养条件为pH 7.0，温度37℃，以转速180r/min发酵培养，菌株的生长曲线如图3所示，当菌液处于对数生长期时停止发酵，得到活化的霍氏肠杆菌ZJ-21菌液。

实施例3霍氏肠杆菌ZJ-21降解废弃烟叶并产氢

将实施例2活化的霍氏肠杆菌ZJ-21菌液按废弃烟叶发酵培养基体积10%的量接种至废弃烟叶发酵培养基中，废弃烟叶发酵培养基配方为：废弃烟叶 15g/L、NH₄HCO₃1g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、营养液2mL/L（FeCl₂·4H₂O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01g/L、Na₂MO₄·2H₂O 0.01g/L和MnSO₄·7H₂O 0.015g/L），其余组分为去离子水。配制废弃烟叶发酵培养基时，将废弃烟叶粉碎过40目筛后与NH₄HCO₃、L-半胱氨酸和营养液混合，然后用去离子水溶解并于121℃下灭菌20min。培养条件为pH 7.0、温度37℃、转速180r/min，利用气相色谱仪对发酵体系进行检测，检测其产生的氢气浓度，当累积产氢量不再发生变化时停止发酵，记录累积产氢量。如图3所示，最大累积产氢量为109mL/g。

按照YC/T 246-2008《烟草及烟草制品 烟碱的测定 气相色谱法》对尼古丁含量进行测定。如图4所示，发酵结束后，废弃烟叶发酵培养基液体中尼古丁降解率达到44%。

对发酵前后的废弃烟叶发酵培养基进行离心（8000rpm，10min），去除上清，将废弃烟叶发酵培养基沉淀物于80℃下烘干6h，采用国家农业部颁发的标准方法NY/T 2016-2011《水果及其制品中果胶含量测定 分光光度法》对其中果胶的含量进行测定。如图4所示，发酵结束时，果胶的降解率为30%。

纤维素和半纤维素的测定方法按照美国国家可再生能源实验室提供的两步水解法进行组分分析。将发酵前后的废弃烟叶发酵培养基于105℃下烘至恒重，准确称取300mg作为样品，加入3mL 质量分数为72%的H₂SO₄溶液，于30℃条件下水解反应60min，量取84mL蒸馏水将水解液冲洗干净，然后全部转入100mL螺口瓶中，再放入高压蒸汽灭菌锅中，于121℃灭菌60min。待水解液冷却至室温后，用漏斗抽滤，用液相色谱仪分析滤液中的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量分数，再转换成纤维素和半纤维素的质量分数。如图4所示，发酵结束时，纤维素降解率为46%；半纤维素降解率为28%。

实施例4霍氏肠杆菌ZJ-21降解尼古丁并产氢

将实施例2活化的霍氏肠杆菌ZJ-21按尼古丁发酵培养基体积10%的接种量接种至尼古丁发酵培养基中，尼古丁发酵培养基配方为：尼古丁0.5g/L、NH₄HCO₃1g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、营养液2mL/L（FeCl₂·4H₂O 0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01g/L、Na₂MO₄·2H₂O 0.01g/L和MnSO₄·7H₂O 0.015g/L），其余组分为去离子水。配制尼古丁发酵培养基时，先将NH₄HCO₃、L-半胱氨酸和营养液的混合物在121℃温度下灭菌20min，然后加入经0.22μm滤膜过滤的尼古丁。培养条件为pH7.0、温度37℃、转速180r/min，利用气相色谱仪对发酵体系进行检测，检测其产生的氢气浓度，当累积产氢量不再发生变化时停止发酵，记录累积产氢量。如图5所示，发酵结束时，最大累积产氢量为53mL/g。

对上述发酵后的液体培养基进行离心（10000 rpm，10 min），依照国标YC/T 383-2010对发酵过程中尼古丁的含量变化进行测定。如图5所示，发酵结束时，培养基中尼古丁含量由500mg/L降为170mg/L，尼古丁的降解率为66%。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株降解废弃烟叶并产氢的霍氏肠杆菌ZJ-21，其特征在于：所述霍氏肠杆菌ZJ-21分类名为Enterobacter hormaechei，已保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2022289，保藏时间为2022年03月18日，地址为中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述霍氏肠杆菌ZJ-21的培养方法，其特征在于，步骤如下：将霍氏肠杆菌ZJ-21接种至种子富集培养基上，发酵培养至对数生长期后停止发酵，即获得霍氏肠杆菌ZJ-21菌液。

3.根据权利要求2所述的霍氏肠杆菌ZJ-21的培养方法，其特征在于：所述种子富集培养基的配方为葡萄糖10g/L、NH₄HCO₃ 1g/L、NaCl 3g/L、K₂HPO₄ 1g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgCl₂0.1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.1g/L和L-半胱氨酸0.5g/L。

4.根据权利要求3所述的霍氏肠杆菌ZJ-21的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：pH 7.0，温度37℃，以转速180 r/min振荡培养。

5.权利要求1所述的霍氏肠杆菌ZJ-21在降解废弃烟叶并产氢中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤为：霍氏肠杆菌ZJ-21菌液按10%的接种量接种到含有废弃烟叶的培养基中，进行发酵培养，并收集气体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含有废弃烟叶的培养基配方为：废弃烟叶15g/L、NH₄HCO₃ 1g/L、L-半胱氨酸0.5 g/L和营养液2 mL/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述营养液的组分包括：FeCl₂·4H₂O0.005g/L、NaCl 0.01g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01g/L、Na₂MO₄·2H₂O0.01g/L和MnSO₄·7H₂O 0.015g/L。