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CN115286679A - ganoapplin A和ganoapplin B及其药物组合物和应用 - Google Patents

ganoapplin A和ganoapplin B及其药物组合物和应用 Download PDF

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CN115286679A CN202210994135.9A CN202210994135A CN115286679A CN 115286679 A CN115286679 A CN 115286679A CN 202210994135 A CN202210994135 A CN 202210994135A CN 115286679 A CN115286679 A CN 115286679A
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Abstract

本发明提供ganoapplins A和B及其药物组合物和其制备方法与应用。属于药物技术领域。本发明试验结果显示，本发明的两个三萜新化合物ganoapplin A和ganoapplin B具有通过激活自噬，从而清除病理性微管相关蛋白tau，揭示其在治疗阿尔兹海默症中的价值。

Description

ganoapplin A和ganoapplin B及其药物组合物和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及化合物ganoapplin A和ganoapplin B及其药物组合物和其制备方法与其在制药和食品中的应用。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzhermer’disease,AD)是最常见的神经退行性疾病，世界上4％-8％的老年人患有AD。AD会导致记忆缺失，认知功能紊乱。由β淀粉样蛋白(Aβ)组成的细胞外老年斑，以及以聚集的微管相关蛋白Tau(MAPT/Tau)蛋白为主要成分的神经元内神经纤维缠结(NFTs)是AD的两个主要病理特征。虽然AD的病因尚不完全清楚，但消除Aβ和/或MAPT/tau聚集物是治疗该病最有希望的策略之一。清除Aβ和MAPT/tau聚集物的主要生物学过程是自噬途径，自噬功能障碍与包括AD在内的许多神经退行性疾病的发病机制密切相关。记忆形成对自噬激活的要求进一步强调了它对大脑功能调节的关键重要性。因此，诱导自噬可能成为治疗AD可行的治疗靶点。
灵芝是我国的著名传统中药，早在2000多年前的《神农本草经》中就有对灵芝功效的记载：主胸中郁结，益心气，补中，长智慧，增记性；久食，令人轻身不老，延年成仙。灵芝的粗提物已经被证明能够通过抑制神经炎症和改善线粒体功能紊乱。而申请人前期的研究发现树舌灵芝中的萜类成分具有抗神经炎症，抑制BACE1，CDK5和GSK3β表达和抑制Aβ的产生和tau蛋白磷酸化的作用。因此，本申请人继续对树舌灵芝的萜类成分进行挖掘，并从中分离得到两个结构新颖的灵芝三萜类化合物。目前本申请人对发现的三萜进行了激活自噬并抑制Tau蛋白病理学作用的研究，结果发现ganoapplin A和ganoapplin B都能显著的激活自噬系统，从而清除病理Tau蛋白，提示这两个化合物可以通过激活自噬来发挥治疗AD的作用，而相关研究未见文献报道。
迄今为止，现有技术中未见有化合物ganoapplin A和ganoapplin B及其制备方法以及在制药和食品中的应用的报道，也没有以其为活性成分的药物组合物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供化合物ganoapplin A和ganoapplin B及其制备方法以及在制药和制备食品中的应用，该化合物具有抗AD的作用。同时提供了以该化合物为有效成分的药物组合物，及其制备方法与在制药和食品中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明首先公开了两个化合物，所述化合物名称为ganoapplin A和ganoapplinB，所述化合物为具有下述结构式的灵芝三萜类化合物：
Figure BDA0003804947930000021
所述的化合物是通过从树舌灵芝中提取获得或通过人工合成获得。
本发明第二方面提供了两种新化合物的药物组合物，所述药物组合物包括ganoapplin A和/或ganoapplin B或其药学上可接受的衍生物及其盐类。
进一步地，所述的药物组合物为药物制剂，其是由ganoapplin A和/或ganoapplinB或其药学上可接受的衍生物及其盐类作为活性成分和药学上可接受的载体组成。
药学上可接受的载体包括：固体制剂包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；半固体制剂包括软膏剂、栓剂等；液体制剂包括：溶液剂、注射剂、喷雾剂等；眼用制剂包括：滴眼剂、眼用凝胶剂等。
本发明第三方面还公布了两种三萜化合物或药物组合物的制备方法，方法包括：
取树舌灵芝，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂D-101分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分Fractions A→E；其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水50％→80％为洗脱剂，合并后得到10个部分Fr.D1→Fr.D10；第9个部分再用反相硅胶柱层析分离，甲醇/水35％→100％洗脱，合并得到5个部分Fr.D9-1→Fr.D9-5，Fr.D9-2部分用凝胶LH-20柱层析处理，得到4个部分(Fr.D9-2a→Fr.D9-2d)。其中Fr.D9-2b再用半制备HPLC，乙腈/水＝47：53+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin B(2，10mg,tR＝25.6min)。Fr.D-9-5部分先用凝胶LH-20柱层析处理，甲醇为洗脱剂得到4个部分(5a→5d)。Fr.D-9-5d进一步利用半制备HPLC，乙腈/水＝45：55+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin A(1，1.4mg,tR＝21.7min)。其药物组合物的制备是进一步将化合物，加入药学上可接受的载体；或将化合物进一步制备为药学上可接受的衍生物及其盐类，再加入药学上可接受的载体所制得。
本发明第四方面提供了第一方面所述的新化合物在制备治疗AD的药物中和食品中的应用。
本发明第五方面提供了第二方面所述的新化合物的药物组合物在制备治疗阿尔兹海默症的药物中和食品中的应用。
本发明提供的化合物ganoapplin A和ganoapplin B，从树舌灵芝中提取分离或经人工合成制得，在治疗AD方面有良好得疗效。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
所述的药用载体是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)、口服、滴丸三种形式给药。
与现有技术相比，本发明具备如下的优异性：
1.本发明提供了两个新的化合物ganoapplin A和ganoapplin B；填补了现有技术的空白。
2.本发明提供了制备新的化合物ganoapplin A和ganoapplin B的方法，该方法原料易得，易于操作，收率高，适于工业化生产。
3.本发明提供了新的化合物ganoapplin A和ganoapplin B作为有效成分的药物组合物，为AD的治疗提供了候选药物。
4.本发明的新的化合物ganoapplin A和ganoapplin B可通过激活自噬，清除病理tau蛋白，从而发挥抗AD的作用。
5.新的化合物ganoapplin A和ganoapplin B可作为药物用于治疗阿尔兹海默症等相关的疾病。
附图说明
图1为本发明化合物ganoapplin A和ganoapplin B的结构示意图；
图2为本发明化合物ganoapplin A和ganoapplin B在SH-SY5Y细胞中，促进自噬标志分子LC3-II/LC3-I，以及抑制SQSTM1蛋白的表达；
图3为本发明化合物ganoapplin A和ganoapplin B促进SH-SY5YmCherry-GFP-LC3细胞自噬流；
图4为本发明化合物ganoapplin A和ganoapplin B在SH-SY5Y MAPT细胞中，促进自噬以及抑制病理分子Tau P301S的表达；
图5为本发明化合物ganoapplin A和ganoapplin B在SH-SY5Y MAPT细胞中，通过促进自噬，从而对病理分子Tau P301S进行清除。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。
实施例1：
化合物1和2的分离纯化。
取树舌灵芝39公斤，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂D-101分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分FractionsA→E；其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水50％→80％为洗脱剂，合并后得到10个部分Fr.D1→Fr.D10；第9个部分再用反相硅胶柱层析分离，甲醇/水35％→100％洗脱，合并得到5个部分Fr.D9-1→Fr.D9-5，Fr.D9-2部分用凝胶LH-20柱层析处理，得到4个部分(Fr.D9-2a→Fr.D9-2d)。其中Fr.D9-2b再用半制备HPLC，乙腈/水＝47：53+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin B(2，10mg,tR＝25.6min)。Fr.D-9-5部分先用凝胶LH-20柱层析处理，甲醇为洗脱剂得到4个部分(5a→5d)。Fr.D-9-5d进一步利用半制备HPLC，乙腈/水＝45：55+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin A(1，1.4mg,tR＝21.7min)。化合物结构鉴定如下：
Figure BDA0003804947930000051
化合物ganoapplin A(1)：白色粉末(MeOH)；[α]20.3 D 346.29(c 0.14,MeOH)；UV(MeOH)；λmax(logε)：203(4.18)，235(4.05)，304(4.12)，336(3.78)；IR(KBr)vmax3433，2963，2931，1683，1638，1453，1384，1209，1142cm-1；1H NMR和13C NMR数据见Table 1；HRMS(ESI-TOF)m/z:521.2533[M+H]+(calcd for C31H36O7,521.2533)。
化合物ganoapplin B(2)：白色粉末(MeOH)；[α]28 D 295.73(c 0.156,MeOH)；UV(MeOH)；λmax(logε):253(4.04),234(4.15),and 196(4.23)；IR(KBr)vmax 3435，2956，2929，1680，1625，1443，1376，1206，1138cm-1；1H NMR和13C NMR数据见Table 1；HRMS(ESI-TOF)m/z:505.2239[M-H]-(calcd for C30H34O7,505.2232)。
表1.化合物1和2的1H和13C数据
Figure BDA0003804947930000052
Figure BDA0003804947930000061
实施例2：
取化合物ganoapplin A和ganoapplin B中的任一种或其组合，按常规法加注射用溶媒，精滤，灌封灭菌后可制成注射液。
实施例3：
取化合物ganoapplin A和ganoapplin B中的任一种或其组合作为药物活性成分，使用几种赋型剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例制成每片含有药物成分1-100mg的片剂样品。
实施例4：
取化合物ganoapplin A和ganoapplin B中的任一种或其组合按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂：
含有化合物ganoapplin A和ganoapplin B中的任一种或其组合作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备，使用化合物ganoapplin A和ganoapplin B中的任一种作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊制剂。
实施例5：
取化合物ganoapplin A和ganoapplin B中的任一种或其组合1份，10份植脂末，混匀，按照常规方法制成固体饮料。
实施例6：
化合物ganoapplin A和ganoapplin B的活性评价。
细胞培养和处理。
SH-SY5Y mCherry-GFP-LC3和SH-SY5Y MAPT细胞由中国科学院昆明动物所提供与培养。细胞在添加10％胎牛血清(FBS)，1×MEM非必需氨基酸溶液，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良的培养基(Gbico,11140050)中，置于37℃，5％CO2和95％湿度的湿化培养箱中培养。将细胞接种于6孔板预热过的生长培养基中。将化学药剂直接施于培养基上处理，处理24h后收获细胞。
稳定表达突变型MAPT(p.P301S)基因的SH-SY5Y细胞的构建(SH-SY5YMAPT细胞)。
将mCherry标记的MAPT基因CDS区克隆到lti-xTet-On高级诱导表达系统(Clontech)的PLVX载体中。采用定点诱变PCR法将突变MAPT-p.P301S导入PLVX-MAPT载体。SH-SY5Y细胞在添加10％胎牛血清(Gibco,USA,11875)的DMEM(Gibco,USA,11875)、1×MEM非必需氨基酸溶液(Gibco,11140050)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM(Gibco,USA,11965)中保存，并置于温度为37℃，含有5％CO2在加湿的大气培养箱中培养。HEK293T细胞在含10％热灭活胎牛血清的DMEM中培养。使用lentix Tet-On Advanced Inducibleexpression System(Clontech)软件构建稳定表达突变体MAPT(P301S)的SH-SY5Y细胞。总之，反应慢病毒体系由突变体PLVX-MAPT P301S构建、包装质粒psPAX2(Addgene,England,12260)和包膜质粒PMD2.G(Addgene,England,12259)组成。调控慢病毒系统由PLVX-Tet-On-Advanced载体、psPAX2和PMD2.G组成。从HEK293T细胞制备慢病毒上清，以4:1的比例感染SH-SY5Y细胞，感染应答慢病毒和调节病毒。在含500μg/mL嘌呤霉素的培养基中筛选细胞。
Western blot分析。
利用细胞裂解缓冲液(Beyotime Institute of Biotechnology,P0013)对SH-SY5Y和SH-SY5Y-MAPT细胞进行细胞裂解。蛋白的浓度是利用BCA蛋白分析试剂盒(BeyotimeInstitute of Biotechnology,P0012)进行测定。12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离20μg蛋白质，并转移到PVDF膜(Bio-Rad,L1620177Rev D)上。用5％(w:v)脱脂牛奶在室温下浸泡2h。在4℃条件下，用一抗(GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶[Proteintech,60004-1-Ig]；LC3[Proteintech,14600-1-AP]；SQSTM1[Elabscience,EAP3350]和Tau(D1M9X)[Cell Signaling Technology,46687S])孵育膜过夜。12小时过后，将一抗进行收取后，PVDF膜用含有Tween 20[0.1％；Sigma,P1379])的TBST(Tris-buffered saline[CellSignaling Technology,9997]冲洗三次，每次5min。然后在室温下与过氧化物酶结合的抗小鼠(474-1806)或抗兔(474-1516)IgG(1:500；KPL)的二抗孵育1h。使用ECL Western blot检测试剂盒(Millipore，WBKLS0500)对表位进行可视化。ImageJ软件(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Maryland,USA)用于评价密度测定。GAPDH作为目标蛋白密度测定的参照物。
mCherry-GFP-LC3荧光共聚焦成像分析。
利用串联单体mCherry-GFP标记的LC3(mCherry-GFP-LC3)慢病毒(HANBI，34082725)评估自噬流。根据厂家说明书，使用mCherry-GFP-LC3慢病毒感染SH-SY5Y细胞。在含500μg/mL嘌呤霉素的培养基中筛选细胞，得到稳定表达mCherry-GFP-LC3的SH-SY5Y细胞(SY-SY5Y mCherry-GFP-LC3细胞)。SY-SY5YmCherry-GFP-LC3细胞在添加10％胎牛血清、1×MEM非必需氨基酸溶液(Gibco，11140050)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM中培养。为了评估LC3自噬溶酶体的数量，细胞经化合物处理24小时后，使用OlympusFluoViewTM1000共聚焦显微镜(Olympus，USA)对细胞进行拍照。
实验结果显示，在SH-SY5Y细胞中，化合物1和2处理后，脂化(pe偶联)形式的MAP1LC3/LC3(微管相关蛋白1轻链3；LC3-II)/LC3-I和SQSTM1(sequesto小体1)蛋白水平呈剂量依赖性下降(图2)。我们观察到阳性对照，自噬诱导剂rapamycin处理的SH-SY5YmCherry-GFP-LC3细胞中红色点状体的数量增加(图3)，表明自噬流水平增加。1和2处理对自噬通量增加的影响与rapamycin类似(图3)。综上所述，这些结果表明1和2可促进细胞自噬。
1和2降低了SH-SY5Y MAPT细胞中突变Tau的水平(图4)。本发明利用BAFA1(Bafilomycin A1)，一种可阻断自噬体-溶酶体融合，使得LC3-II积累的自噬抑制剂，进一步证明1和2通过诱导SH-SY5Y MAPT细胞自噬清除MAPT/Tau。
同样，通过1和2，SH-SY5Y MAPT细胞的自噬被激活，表现为LC3-II/LC3-I升高，SQSTM1蛋白水平降低(图5)。与未处理的细胞相比，这种效应与Tau P301S的减少有关(图5)。BAFA1单独处理(20nM)可提高LC3-II/LC3-I水平，但相对于未处理的细胞，对Tau P301S水平没有显著影响(图5)。而添加BAFA1可以逆转1和2诱导的Tau P301S水平下降(图5)。综上所述，化合物1和2可能通过激活自噬介导的Tau P301S清除来对发挥抗AD的作用。

Claims (8)

1.如下结构式所示的化合物ganoapplin A(1)和ganoapplin B(2)，
Figure RE-FDA0003877894270000011
2.根据权利要求1所述的化合物ganoapplin A和ganoapplin B，其特征在于，所述化合物ganoapplin A和ganoapplin B是从树舌灵芝中提取获得或人工合成获得。
3.权利要求1所述的化合物ganoapplin A和ganoapplin B的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：取树舌灵芝，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂D-101分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分Fractions A→E；其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水50％→80％为洗脱剂，合并后得到10个部分Fr.D1→Fr.D10；第9个部分Fr.D9再用反相硅胶柱层析分离，甲醇/水35％→100％洗脱，合并得到5个部分Fr.D9-1→Fr.D9-5，Fr.D9-2部分用凝胶LH-20柱层析处理，得到4个部分Fr.D9-2a→Fr.D9-2d，其中Fr.D9-2b再用半制备HPLC，乙腈/水＝47：53+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin B；Fr.D-9-5部分先用凝胶LH-20柱层析处理，甲醇为洗脱剂得到4个部分Fr.D-9-5a→Fr.D-9-5d，Fr.D-9-5d进一步利用半制备HPLC，乙腈/水＝45：55+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin A。
4.权利要求1所述的化合物ganoapplin A(1)和ganoapplin B(2)在制备治疗阿尔兹海默症的药物或保健食品中的应用。
5.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1中所述的化合物ganoapplin A(1)和/或ganoapplin B(2)或其药学上可接受的载体。
6.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为药物制剂，由ganoapplin A(1)和/或ganoapplin B(2)或其药学上可接受的衍生物及其盐类作为活性成分，和药学上可接受的载体所组成。
7.权利要求5或6所述的药物组合物在制备治疗阿尔兹海默症的药物或保健食品中的应用。
8.权利要求5或6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：取树舌灵芝，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂D-101分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分Fractions A→E；其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水50％→80％为洗脱剂，合并后得到10个部分Fr.D1→Fr.D10；第9个部分Fr.D9再用反相硅胶柱层析分离，甲醇/水35％→100％洗脱，合并得到5个部分Fr.D9-1→Fr.D9-5，Fr.D9-2部分用凝胶LH-20柱层析处理，得到4个部分Fr.D9-2a→Fr.D9-2d，其中Fr.D9-2b再用半制备HPLC，乙腈/水＝47：53+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin B；Fr.D-9-5部分先用凝胶LH-20柱层析处理，甲醇为洗脱剂得到4个部分Fr.D-9-5a→Fr.D-9-5d，Fr.D-9-5d进一步利用半制备HPLC，乙腈/水＝45：55+0.1％CF3COOH纯化得到ganoapplin A，然后加入药学上可接受的载体；或将化合物进一步制备为药学上可接受的衍生物及其盐类，再加入药学上可接受的载体。
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