CN115247149B

CN115247149B - 适用于nk细胞的培养基组合物及培养方法

Info

Publication number: CN115247149B
Application number: CN202211004571.3A
Authority: CN
Inventors: 牟春琳; 王秀娥; 秦臻; 李政楠; 张雅楠; 武嘉钊
Original assignee: Huayu Life Technology Tianjin Co ltd; Tianjin Huayu Pharmaceutical Co ltd; Huayu Biotechnology Tianjin Co ltd
Current assignee: Huayu Life Technology Tianjin Co ltd; Tianjin Huayu Pharmaceutical Co ltd; Huayu Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority date: 2022-08-22
Filing date: 2022-08-22
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-08-22
Also published as: CN115247149A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种适用于NK细胞的培养基组合物及培养方法。该培养基组合物包含基础培养基、3v/v％～10v/v％的血清、IL2、IL18和非细胞因子类促炎因子。

Description

适用于NK细胞的培养基组合物及培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种适用于NK细胞的培养基组合物及培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是重要的淋巴细胞亚群，在人体的先天免疫系统中起着重要的作用，人成熟NK纸胞的主要来源是外周血。早在70年代，科研人员就对它们进行了描述，但直到最近的15年，人们才逐渐了解NK细胞在帮助抗击癌症和其它疾病方面的复杂性和治疗潜力。由于NK细胞仅占外周血单个核细胞的5％～10％，因此NK细胞的纯化及体外扩增是对NK细胞基础与临床研究的重要方法学基础。

但是由于来源于外周血的NK细胞难以在体外大量扩增，而且从外周血中分离纯化NK细胞有一定的技术难度，难以避免淋巴细胞的污染，无法获取大量均一的NK细胞并达到临床所需的标准，故NK细胞还不能广泛应用于临床；另外，在有些病例中，NK细胞介导的抗肿瘤反应弱，可能与NK细胞杀伤能力、在体内存活能力差或向肿瘤部位迁移受限等因素有关。

因此，总得来说，目前NK细胞的纯化培养效果仍不够理想，不能满足实际应用。

发明内容

本发明提供一种适用于NK细胞的培养基组合物，包含基础培养基、3v/v％～10v/v％的血清、IL2、IL18和非细胞因子类促炎因子。

根据本发明的再一方面，还提供一种适用于NK细胞的培养基组合套件，其包括如上所述的适用于NK细胞的培养基组合物以及CD3抗体。

根据本发明的再一方面，还提供一种NK细胞培养方法，其包括如下步骤：

a)将单个核细胞接种含CD3抗体的容器中，并使用如上所述的NK细胞的培养基组合物培养3～5天；

b)在不含CD3抗体的容器中，使用如上所述的NK细胞的培养基组合物培养9～11天。

本发明所提供的培养基组合物，成分简单明确，培养得到的NK细胞纯度更高，且具有更快的增殖效率与很强的细胞杀伤能力，特别是本发明意外发现，添加了血清淀粉样蛋白A的组别能够显著提高NK细胞的杀伤能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为NK细胞培养的光镜代表图；A为实施例1；B为实施例2；C为对比例；

图2为本发明实施例1的流式细胞分析结果；

图3为本发明实施例2的流式细胞分析结果；

图4为对比例的流式细胞分析结果；

图5为不同实施方式所对应的细胞增殖曲线；

图6为不同实施方式所对应的NK细胞的杀伤能力检测。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中所述的符号“％”，如未特别指明，对于总物料是固体时，一般是指重量/重量的百分比；对于总物料是液体时，一般是指重量/体积的百分比。当然，对于总物料是液体并且溶质是液体时，表征该液态溶质的百分比一般是指体积/体积的百分比。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明的第一方面涉及适用于NK细胞的培养基组合物，其包含基础培养基、3v/v％～10v/v％的血清、IL2、IL18和非细胞因子类促炎因子。

本发明首次发现在NK细胞培养过程中，添加非细胞因子类促炎因子(特别是LPS和SSA)配合IL2、IL18和CD3抗体，能显著提升NK细胞的纯度和增殖能力，并提升NK细胞的杀伤能力。

在本发明中，培养基组合物可以以溶液的方式进行包装，也可以干粉组合物(例如冻干粉或喷雾干燥粉)的形式进行包装，使用时再进行溶解。当其为溶液时，组合物或溶液中各成分的配比满足配制为工作浓度时满足既定的浓度。通常以工作浓度或母液的形式被包装。在本发明中，“工作浓度”用于限定所述培养基组合物在培养NK细胞时主要活性组分的比例，所述培养基组合物中主要活性组分的浓度可以为工作浓度，也可以为能够稀释为该浓度的母液(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍浓缩的母液)。

可以理解，对于IL2、IL18，或者CD3抗体、SSA等成分，其可以包括全长组分或者保持其活性的变体。变体相对于野生型蛋白可以包含一个或多个氨基酸的替换、缺失、增加或修饰等。它们的来源可以是重组表达，原始来源优选与被培养的NK细胞相同，例如是人源的。

本申请并不排除与其他培养基配合使用，或者在本申请的培养基中额外添加一些常规的营养补充剂，例如盐类、抗生素、维生素和氨基酸等，氨基酸补充剂可以包括任何氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸。抗生素例如庆大霉素、青霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等等。

本申请的培养基中也可以含有缓冲剂，其类型并不做特定限制，可以为本领域技术人员熟知的类型。“缓冲剂”是通过其酸-碱共轭物组分的作用抵抗pH变化的溶液。可以根据例如缓冲剂的期望pH(以及微生物生长和代谢特性、微生物培养物培养系统、pH控制和使用的培养基)采用的各种缓冲剂描述于Buffers.AGuide for the Preparation and Useof Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,编辑Calbiochem Corporation(1975)中。在一个实施方案中，所述缓冲剂具有约2至约9、或者约3至约8、或者约4至约7、或者约5至约7的范围内的pH。将控制该范围内的pH的缓冲剂的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲剂，以及这些的组合。在一些实施方案中，所述缓冲剂选自3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)游离酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)Na、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和碳酸氢钠。

在本发明中，若非特别限定，则细胞的培养环境均在约为5％的CO₂及约37℃的条件下进行。

在一些实施方式中，培养基中亦可添加一些配制助剂，例如消泡剂。在一些实施方案中，所述培养基制剂的消泡剂包含离子或非离子表面活性剂。

在一些实施方式中，所述非细胞因子类促炎因子包括脂多糖和/或血清淀粉样蛋白A(SSA)。

在一些实施方式中，所述非细胞因子类促炎因子的添加量为0.1～1μg/mL，例如0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL。

在一些实施方式中，所述IL2的添加量为500～1000U/mL，例如600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL。

在一些实施方式中，所述IL18的添加量为200～600U/mL，例如300U/mL、400U/mL、500U/mL。

容易理解，所述基础培养基为利于NK细胞培养的培养基，在一些实施方式中，所述基础培养基选自X VIVO-15、RPMI1640、AIM-V、α-MEM培养基。

血清的浓度可以为4v/v％、5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％。在一些实施方式中，所述血清为自体血清。

本发明的第二方面涉及适用于NK细胞的培养基组合套件，其包括如上所述的适用于NK细胞的培养基组合物以及CD3抗体。

本发明的第三方面涉及NK细胞培养方法，其包括如下步骤：

在一些实施方式中，所述CD3抗体包被于所述容器中。

在一些实施方式中，所述CD3抗体以游离形式添加到所述容器中。

CD3抗体以NK细胞培养时的常规量使用，在一些实施方式中，所述CD3抗体的添加量为50～500ng/mL，例如100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL。

在一些实施方式中，所述外周血单个核细胞的接种密度为(1～5)×10⁶个/mL，例如2×10⁶个/mL、3×10⁶个/mL、4×10⁶个/mL。

在一些实施方式中，步骤b)细胞在培养第2～4天后传代一次。

在一些实施方式中，步骤b)细胞在培养第2～4天后补充IL2、IL18和非细胞因子类促炎因子至约为步骤b)的初始浓度。

单个核细胞可以来自外周血或脐带血。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

下述实施例中：

人重组血清淀粉样蛋白A(SSA)从Peprotech(Rocky Hill，NJ，USA)购买。

脂多糖(LPS)从北京索莱宝科技有限公司Solarbio购买。

NK细胞无血清培养基XVIVO-15为美国Lonza公司产品。

重组人IL-2和组人IL-18购自北京同立海源生物科技有限公司。

抗人CD3抗体为申请人自行纯化。

实施例1

1.脐带血单个核细胞(PBMC)的分离

通过血细胞分离机采集患者PBMC，将采集的血样转至离心管，700g离心10min，吸取上层血浆培养时备用；用生理盐水将血样标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficol1分离液上，900g离心20min；吸取分液界面乳白色单个核细胞层，用0.9％生理盐水洗涤离心2次；用无血清培养基将PBMC重悬。

2.NK细胞培养

将PBMC细胞浓度调整至1×10⁶个/mL，向己经抗体铺板的培养瓶中加入含5％自体血浆、重组人IL-2 700U/mL，重组人IL18 400U/mL、SSA 0.5μg/mL、抗人CD3 mAb 200ng/mL的X VIVO-15培养基，置于5％CO₂及37℃连续培养4天。在第5天进行换液，替换为不含CD3抗体，其余成分与之前相同的培养基进行培养。培养期间根据培养基颜色和NK集落大小半量补液(补充细胞因子和SSA)或换液(3天换液一次)，连续培养10天(即共培养14天)。

实施例2

同实施例1，区别仅在于将SSA替换为LPS

对比例

同实施例1，区别仅在于不添加SSA。

实验例

1.NK细胞培养结果

实施例1、实施例2和对比例在培养14天得到的细胞图片如图1所示。各组总体上均为NK细胞的典型形态，部分细胞变形，形成凸起或粗长的伪足。

对各组培养14天得到的细胞进行流式细胞分析，以检测细胞表面的分子表达，结果如表1、图2～图4所示。

表1

从结果可知，添加炎性因子的实施例组，NK细胞的纯度均出现显著升高，可达到95％以上。

2.在培养的第6、8、10、12、14天检测各组的细胞数目，结果如图5所示。可见实施例1和实施例2相比对比例在扩增速度上显著提升。其中实施例1组最终扩增倍数为674倍，实施例2组最终扩增倍数为512倍，对比例组最终扩增倍数为310倍。

3.NK细胞杀伤活性比较

杀伤实验方法：

检测对象为培养第14天的细胞。白色不透底96孔板，按效靶比(E/T ratio)为1:1、5:1、10:1、20:1，分别加入不同组的NK细胞和肿瘤细胞(K562-Luc)，肿瘤细胞数每孔固定为5000个，即NK细胞数分别为5000、25000、50000、100000，同时设置相应数量的肿瘤细胞空白组和NK细胞空白组，每组细胞设置三个重复孔，调整每孔细胞体积为100uL，细胞混匀后静置培养24小时。

Bright-Lumi按1：1体积比加入白色96孔板的培养基中，酶标仪直接读取Luminescent发光值。

按化学发光值计算细胞杀伤效率，计数公式如下：

1-(混合组发光值-空白NK组发光值)/空白肿瘤组发光值×100％

三组细胞的杀伤效率如图6所示。从结果可知，三组细胞的杀伤活性均较高，令人意外的是，SSA组相比于添加了LPS的实施例组，显著提升了NK细胞的杀伤活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.适用于NK细胞的培养基组合物，其特征在于，包含基础培养基、3v/v%~10 v/v %的血清、500U/mL~1000U/mL IL2、200U/mL~600U/mL IL18和0.1~1μg/mL 血清淀粉样蛋白A。

2.根据权利要求1所述的适用于NK细胞的培养基组合物，其特征在于，所述基础培养基选自X VIVO-15、RPMI1640、AIM-V、α-MEM培养基。

3.根据权利要求1或2所述的适用于NK细胞的培养基组合物，所述血清为自体血清。

4.适用于NK细胞的培养基组合套件，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的适用于NK细胞的培养基组合物以及CD3抗体。

5.NK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

a) 将外周血单个核细胞接种含CD3抗体的容器中，并使用权利要求1~3任一项所述的NK细胞的培养基组合物培养3~5天；

b) 在不含CD3抗体的容器中，使用权利要求1~3任一项所述的NK细胞的培养基组合物培养9~11天。

6.根据权利要求5所述的NK细胞培养方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞的接种密度为（1~5）×10⁶个/mL。

7.根据权利要求5所述的NK细胞培养方法，其特征在于，所述CD3抗体包被于所述容器中，或所述CD3抗体以游离形式添加到所述容器中。

8.根据权利要求7所述的NK细胞培养方法，其特征在于，所述CD3抗体的添加量为50ng/mL~500ng/mL。