CN115244085A

CN115244085A - 用于溶酶体贮积病的蛋白质组学筛查

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Publication number: CN115244085A
Application number: CN202180019589.8A
Authority: CN
Inventors: S·韩; C·柯林斯; R·达尤哈; F·易
Original assignee: Seattle Childrens Hospital
Current assignee: Seattle Childrens Hospital
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2022-10-25
Also published as: EP4126966A4; EP4126966A1; US20210302435A1; US20240248096A1; WO2021202807A1; JP2023519969A; US11940448B2

Abstract

对包括I型粘多糖贮积症(MPS I)和庞贝病在内的溶酶体贮积病(LSD)的早期检测能够大大改善患者结果，因为一旦出现症状，每种疾病都可能是致命的。描述了使用包括干血斑(DBS)、口腔拭子、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞(WBC)在内的生物样品筛查MPS I和庞贝病。所公开的方法和测定提供用于筛查新生儿的LSD的可靠方式。所公开的方法和测定还能够允许快速预测患有LSD的患者是否将对酶替代疗法(ERT)产生免疫应答，从而改进对于患有LSD的患者的治疗。所公开的方法和测定还能够进一步减少由LSD如MPS I和庞贝病的假性缺陷病例引起的假阳性的数量。

Description

用于溶酶体贮积病的蛋白质组学筛查

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年3月31日提交的美国临时专利申请号63/002,992的优先权，所述专利申请如同在本文中完全阐述一样以引用的方式整体并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明根据美国国立卫生研究院授予的HD098180和AI123135在政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是2GT6083_ST25.txt。文本文件是74KB，于2021年3月31日创建，并且经由EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

本公开提供用于溶酶体贮积病(LSD)，包括I型粘多糖贮积症(MPS I或赫尔勒综合征(Hurler Syndrome))和庞贝病的临床诊断和新生儿筛查。所公开的方法和测定还可允许快速预测患有LSD的患者是否将对酶替代疗法(ERT)产生免疫应答，从而改进对于患有LSD的患者的治疗。所公开的方法和测定可进一步减少由LSD的假性缺陷病例引起的假阳性的数量。

发明背景

存在许多具有有效治疗的疾病。然而，对于许多这些疾病，一旦出现症状，疾病就已经致命或导致不可逆转的损伤。此类病症的实例包括代谢病症，如溶酶体贮积病(LSD)。这些包括I型粘多糖贮积症(MPS I)和庞贝病。

LSD包括一组超过50种由溶酶体功能缺陷引起的罕见遗传代谢病症。溶酶体是充满酶的细胞内区室，所述酶负责分解大分子并将分解片段传递至细胞的其它部分进行再循环。这个过程需要几种关键酶，并且这些酶中的一者或多者的缺陷可导致大分子在细胞内累积，从而最终杀死细胞。患有LSD的患者可具有骨骼肌、骨骼和神经系统的损伤。

用于LSD的治疗包括在酶替代疗法(ERT)中提供功能性外源酶(例如，以药物的形式)。然而，一些患者将对ERT产生免疫介导的抑制反应，包括中和抗体。可进行免疫调节以对抗患者的这种免疫应答，但在ERT之前起始时最有效。因此，在开始治疗之前了解患有LSD的患者是否将对ERT产生免疫反应可能至关重要。目前，预测哪些患者将产生此类免疫反应的分子分析是缓慢且劳动密集型的，需要数月来完成。在此期间，患者可能已经产生了ERT中和抗体。尽管如此，目前还没有能够可靠地帮助预测对ERT的免疫反应的具有快速周转时间的标准临床测试。

新生儿筛查(NBS)是针对美国每年出生的400万婴儿常规进行的标准公共预防性强制性筛查测试。NBS通常涉及在出生后24至48小时进行的血液测试。筛查通常使用沉积在滤纸上的几滴来自新生儿脚后跟的血液。含有干血斑(DBS)的纸张可储存，直到进行测试为止。

为了进行NBS评估，从DBS取出干血冲孔，并且进行实验室测试以检测血液中是否存在特定物质(称为标志物或生物标志物)，所述物质指示出生时不明显但在以后的生活中导致严重健康问题的病症。尽管所筛查的病症因州而异，但大多数州筛查苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病。NBS已被证明在改善患者结果和避免受影响个体的长期残疾方面非常有效，同时降低医疗费用。

用于几种LSD(包括MPS I和庞贝病)的NBS已在许多州获得批准。筛查涉及测量DBS中的溶酶体酶活性，通常通过串联质谱法或数字微流体荧光测定法。酶活性测定值低于预定截断值的新生儿被认为对LSD呈阳性。然而，缺乏分析精确度可能需要额外的第二级测试来确认筛查阳性结果。酶测定依赖于合成底物，所述合成底物与天然底物不同；因此，酶对那些人工底物的行为将有所不同，并可能导致误诊。此外，酶测定要求相关酶的功能和结构保持完整，这在来自全国各地或各州的NBS样品的运输和储存过程中将难以控制。

因此，需要稳健且简单的方法和测定以较低假阳性率和较高阳性预测率来筛查LSD，并且同时允许快速预测患者是否将对ERT产生免疫反应。

发明内容

本公开描述了可用于筛查受试者的LSD，包括I型粘多糖贮积症(MPS I；赫尔勒综合征)和庞贝病的多重测定的开发。通过在毁灭性的和经常致命性的临床症状出现之前可靠地诊断这些病症，所述测定可显著改善受影响个体的结果。所述测定可使用DBS以及其它生物样品来源检测与这些病症相关的标志物的存在或不存在。在特定实施方案中，所述受试者是新生儿并且所述DBS已经作为现有NBS程序的一部分而常规收集。在特定实施方案中，所述样品可包括在临床中收集的口腔拭子、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞(WBC)，以用于在来自NBS的推定阳性结果后进行后续确认。在特定实施方案中，所述测定可预测受试者是否将对ERT产生免疫反应并将酶假性缺陷病例与确诊的LSD患者区分开来。

本公开描述了与所述病症中的每一种相关的肽，所述肽可使用与选择性反应监测质谱结合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM)来可靠地检测和定量。本公开还提供了可用于富集所指示肽的高亲和力抗体。

在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:5的CDR1、SEQ ID NO:6的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的CDR1、SEQ ID NO:9的CDR2和SEQ ID NO:10的CDR3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:13中所示的VH结构域和如SEQ ID NO:16中所示的VL结构域。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:17的CDR1、SEQ ID NO:18的CDR2和SEQ ID NO:19的CDR3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQID NO:20的CDR1、SEQ ID NO:21的CDR2和SEQ ID NO:22的CDR3。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:25中所示的VH结构域和如SEQ ID NO:28中所示的VL结构域。在特定实施方案中，本公开提供了包括本文所述的抗体或其抗原结合片段的测定和试剂盒。在特定实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。

特定实施方案包括使用本公开的抗体或其抗原结合片段来筛查新生儿以及还有高风险受试者中的MPS I和/或庞贝病。在特定实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可用于确定真阳性病例，消除假性缺陷，并确定一种或多种治疗在正针对MPS I和/或庞贝病进行治疗的受试者中的功效。特定实施方案包括使用本公开的抗体或其抗原结合片段来检测一种或多种生物样品中的MPS I和/或庞贝病的一种或多种特征肽。本公开还提供了一种用于预测受试者是否将对用于MPS I和/或庞贝病的酶替代疗法(ERT)产生免疫应答的方法。

附图说明

本文提交的一些图可能在彩色情况下更好理解。申请人将附图的彩色版本视为原始提交的一部分，并且保留在以后的诉讼中呈递附图的彩色图像的权利。

图1.列出用于针对I型粘多糖贮积症(MPS I；赫尔勒综合征)和庞贝病的与选择性反应监测质谱结合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM-MS)的蛋白质靶标和肽序列的表。还示出总质量、母离子质量、子y-离子质量和子b-离子质量。

图2.说明免疫-SRM-MS的过程的示意图。

图3A-3D.对11名MPS I疾病患者的研究(9名治疗前患者，包括2名具有治疗后样品：2名减弱形式；4名严重形式；以及3名未知形式。两名治疗后患者)(ERT：酶替代疗法；BMT：骨髓移植；LOD：检测下限)。(图3A)100名正常对照和11名MPS I患者中的IDUA 218肽生物标志物水平(虚线表示IDUA 218的截断值)。(图3B)图3A的放大版本，其中焦点从0至10pmol/L(虚线表示IDUA 218的LOD)。(图3C)100名正常对照和11名MPS I患者中的IDUA462肽生物标志物水平(虚线表示IDUA 462的截断值)。(图3D)图3C的放大版本，其中焦点从0至5pmol/L(虚线表示IDUA 462的LOD)。

图4A，4B.当内部标准物掺入干血斑(DBS)基质时，IDUA肽的线性响应(虚线表示在正常群组中发现的最低水肽平)。

图5A，5B.DBS和外周血单核细胞(PBMC)样品中的IDUA肽浓度。(DBS：五个3mm冲孔；PBMC：250μg的蛋白质)。

图6A，6B.DBS和口腔拭子样品中的IDUA肽浓度。(DBS：五个3mm冲孔)。

图7A，7B.100名正常对照(NC)、9名MPS I患者(MPS I pt)和4名MPS I假性缺陷病例(MPS I假性)中IDUA 218肽生物标志物(图7A)和IDUA 462肽生物标志物(图7B)的IDUA浓度的比较。

图8A，图8B.在来自经免疫兔的血清抗体捕获肽后，来自纯化肽(左)和DBS样品(右)的GAA肽的多反应监测(MRM)迹线。(图8A)GAA 332MRM迹线；(图8B)GAA 855MRM迹线。

图9.在来自分离的浆细胞的上清液抗体捕获肽后，来自PBMC样品的GAA 855的内源性多反应监测(MRM)迹线。

图10A，10B.在来自经免疫兔的血清抗体捕获肽后，来自纯化肽(I)、DBS样品(II)和口腔拭子样品(III)的GAA肽的多反应监测(MRM)迹线。(图10A)GAA 155MRM迹线，TTPTFFPK(SEQ ID NO:3)，母离子质量469.7527++；(FIG.10B)GAA 376MRM迹线，WGYSSTAITR(SEQ ID NO:5)，母离子质量571.2855++。

图11.三名正常对照(NC1、NC2、NC3)、三名真阳性庞贝患者(PD1、PD2、PD3)和两名假性缺陷病例(假性1和假性2)中DBS中的GAA 376肽生物标志物(WGYSSTAITR(SEQ ID NO:5)，母离子质量571.2855++)的GAA浓度的比较。

图12.本公开的示例性序列，包括

具体实施方式

存在许多具有有效治疗的疾病。然而，对于许多这些疾病，一旦出现症状，疾病就已经致命或导致不可逆转的损伤。将受益于早期诊断的病症的实例包括代谢病症，如溶酶体贮积病(LSD)，包括I型粘多糖贮积症(MPS I)和庞贝病。

LSD包括一组超过50种由溶酶体功能缺陷引起的罕见遗传代谢病症。溶酶体是充满酶的细胞内区室，所述酶负责分解大分子并将分解片段传递至细胞的其它部分进行再循环。这个过程需要几种关键酶。这些酶中的一者或多者的缺陷可导致大分子在细胞内累积，从而最终杀死细胞。

I型粘多糖贮积症(MPS I；赫尔勒综合征)是属于粘多糖贮积症组的一种罕见LSD。MPS I可进一步分为严重型和减弱型。MPS I的严重形式也称为赫尔勒综合征。MPS I的严重形式和减弱形式具有类似的症状和并发症；然而，MPS I的减弱形式显示较慢的疾病进展和/或较晚的症状发作年龄。在特定实施方案中，患有减弱的MPS I的受试者未表现出早期发育迟缓和/或未经历心智能力的进行性下降。在特定实施方案中，症状和并发症的发作对于患有减弱的MPS I的个体在3岁与10岁之间发生。在特定实施方案中，对于患有减弱的MPSI的个体，疾病严重程度的范围很广，包括导致在他们二十多岁至三十多岁死亡的危及生命的并发症，到伴有严重关节问题和心肺疾病的正常寿命。在特定实施方案中，在患有严重MPS I的个体中，线性生长到3岁时减少。在特定实施方案中，在患有严重MPS I的个体中，精神残疾是进行性的且严重的。在特定的实施方案中，对于患有严重MPS I的个体，死亡在生命的前十年内发生。在特定实施方案中，根据临床和实验室发现对患有严重MPS I与减弱MPS I的个体进行诊断。患有MPS I的个体可具有巨头畸形、脑部积液、心脏瓣膜异常、独特面部特征、身材矮小、关节畸形、肝脏和脾脏肿大以及巨舌。由于气道狭窄，可能会发生上呼吸道感染和睡眠呼吸暂停。患有MPS I的患者经常出现角膜混浊、具有听力损失并且可以反复耳部感染。患有严重MPS I的儿童通常具有缩短的寿命，有时只能活到童年晚期。心脏病和气道阻塞是患有严重和减弱MPS I的人中的主要死亡原因。MPS I是由IDUA基因的变异引起的，所述基因编码分解在体内产生的称为糖胺聚糖(或粘多糖)的复杂碳水化合物所需的α-L-艾杜糖醛酸酶。IDUA酶的缺乏导致所有细胞的溶酶体中糖胺聚糖的累积和组织的进行性损伤。用于MPS I的疗法包括：在酶替代疗法(ERT)中提供缺乏或缺失的α-L-艾杜糖醛酸酶；造血干细胞移植(HSCT)；骨髓移植；以及减轻疾病的症状。

庞贝病(PD)是可使心脏和骨骼肌丧失功能的罕见遗传性溶酶体贮积症。PD可包括婴儿期发作型和迟发型。婴儿期发作型PD可进一步表征为经典或非经典。在特定实施方案中，对于患有经典形式的婴儿期发作型PD的婴儿，症状可在出生后几个月内出现。在特定实施方案中，患有经典形式的婴儿期发作型PD的婴儿可具有以下症状：肌肉无力；肌张力差；肝脏肿大；心脏缺陷；未能以预期速度增加体重和生长；和/或呼吸问题。在特定实施方案中，患有经典形式的婴儿期发作型PD的婴儿在生命的第一年死于心力衰竭。在特定实施方案中，对于患有非经典形式的婴儿期发作型PD的婴儿，症状可到1岁时出现。在特定实施方案中，患有非经典形式的婴儿期发作型PD的婴儿可具有以下症状：运动技能延迟和进行性肌肉无力；异常大的心脏；和/或严重呼吸问题。在特定实施方案中，患有非经典婴儿期发作型庞贝病的儿童只能活到幼儿期。迟发型PD在儿童期、青春期或成年期晚期出现，并且通常比婴儿期发作型形式更轻。在特定实施方案中，迟发型PD不太可能包括心脏问题。在特定实施方案中，具有迟发型PD经历的个体可具有进行性肌肉无力，尤其是在腿部、躯干和控制呼吸的肌肉中。在特定实施方案中，患有迟发型PD的个体可患有呼吸衰竭。PD是由编码酸性α-葡萄糖苷酶的GAA基因中的突变引起的。GAA酶在溶酶体中发挥作用以将糖原分解为葡萄糖，葡萄糖是为肌肉提供能量的糖。因此，缺乏GAA酶导致体内各处的过量溶酶体糖原累积，但心脏和骨骼肌细胞受到的影响最为严重。已鉴定了导致PD症状的GAA基因中的多达300种突变，所述症状在发病年龄和严重程度方面差异很大。用于PD的治疗包括ERT。FDA批准的称为阿葡糖苷酶α

的药物可用于治疗患有PD的婴儿和儿童。另一种阿葡糖苷酶α药物

已被批准用于治疗迟发型(非婴儿)庞贝病。

用于几种LSD(包括PD和MPS I)的新生儿筛查(NBS)已在许多州获得批准。筛查涉及通过串联质谱法(MS/MS)或数字微流体荧光测定法(DMF-F)测量DBS中的溶酶体酶活性(Gelb等人,Int J Neonatal Screen.5(1):1,2019)。酶测定依赖于合成底物，所述合成底物与天然底物不同；因此，酶对那些人工底物的行为将有所不同，并可能导致误诊。此外，酶测定要求相关酶的功能和结构保持完整，这在来自全国各地或各个州的NBS样品的运输和储存过程中将难以控制。目前的筛查方法存在高假阳性率和低阳性预测率。此外，目前的筛查方法不能确定患者是否将对ERT产生免疫应答。

ERT在例如以下方面是有效的：延长存活期和保护患有婴儿型PD的患者的认知发育；改善肺功能，使疾病进展稳定，以及降低患有MPS I的患者的生化参数。然而，一些患者将对ERT产生免疫介导的抑制反应(中和抗体)。目前，分子分析和交叉反应免疫物质(CRIM)分析用于预测哪些患有PD的患者将对ERT产生免疫介导的抑制反应。CRIM阴性状态是PD的不良预后因素。高达25％的患有PD的患者为CRIM阴性且不产生GAA蛋白，从而导致对ERT产生持续的高抗体滴度和无效的治疗。对ERT的免疫介导的抑制反应也在MPS I中发生。90％的患有MPS I的患者将在治疗的最初几个月内对拉罗尼酶(Laronidase)ERT产生抗药物IgG抗体应答。较高的抗药物IgG抗体水平损害靶组织中的酶摄取，并导致组织糖胺聚糖清除率降低和免疫介导的超敏反应。

当在ERT之前开始时，减少ERT中和抗体的产生的免疫调节是最有效的。因此，在开始ERT之前确定CRIM状态可能至关重要，特别是对于与破坏性早发性心肌病相关的婴儿PD而言。然而，CRIM状态通常使用培养的皮肤成纤维细胞通过蛋白质印迹法确定，这一过程需要数月时间。在此期间，患者可能已经产生了ERT中和抗体。目前还没有能够可靠地帮助预测对ERT的免疫反应的具有快速周转时间的标准临床测试。本文中公开的测定、组合物和方法通过测量相关蛋白质的丰度来确定LSD患者的状态，这不仅避免人工底物和酶功能波动的问题，而且允许快速预测患者是否将对ERT产生免疫反应。

所公开的组合物和方法还可用于减少由NBS中MPS I和庞贝病的假性缺陷病例引起的假阳性的数量。与LSD相关的基因的假性缺陷等位基因包括在所述基因的一个拷贝中的一种或多种突变(与相应的野生型基因相比)，所述假性缺陷等位基因编码改变的蛋白质或改变基因的表达、但不引起疾病。具有假性缺陷等位基因的个体显示出酶活性大大降低，但他们是健康的。在特定实施方案中，具有与LSD相关的基因的假性缺陷等位基因的临床健康受试者在体外显示出由所述基因编码的酶的活性降低。在特定实施方案中，具有与LSD相关的基因的假性缺陷等位基因的临床健康受试者在体外显示出由所述基因编码的酶的活性降低，但在体内表现出相同酶的功能活性。在特定实施方案中，临床上健康的受试者可具有假性缺陷等位基因的一个或两个拷贝。在特定实施方案中，当测试结果为阳性但在所述测试的受试者中不存在疾病或发病率，或者在所测试的受试者中以亚临床水平存在疾病时，酶测定测试中出现假阳性结果。在特定实施方案中，健康受试者不表现出疾病症状或表现出非常少的疾病症状。在特定实施方案中，健康受试者不需要治疗疾病。在特定实施方案中，具有与LSD相关的假性缺陷等位基因的健康受试者不表现出LSD症状或表现出极少LSD症状。在特定实施方案中，具有与LSD相关的假性缺陷等位基因的健康受试者不需要针对LSD的治疗。

所公开的组合物和方法可进一步用于鉴定作为导致LSD的基因的致病性变体的携带者的个体。大多数LSD以常染色体隐性遗传方式遗传。因此，如果个体具有与导致疾病的LSD相关的基因(等位基因)的型式的两个拷贝(隐性)或两种不同的等位基因(致病性变体)，则所述个体表现出LSD的症状和并发症，而携带者仅具有导致LSD的基因的致病性变体的一个拷贝，但不会出现疾病。在特定实施方案中，携带者具有导致LSD的基因的致病性变体的一个拷贝和相应基因的一个野生型拷贝。在特定实施方案中，携带者具有导致LSD的基因的致病性变体的一个拷贝和相应基因的一种假性缺陷等位基因。在特定实施方案中，导致LSD的基因的致病性变体的携带者不表现出LSD症状或表现出极少LSD症状。在特定实施方案中，导致LSD的基因的致病性变体的携带者不需要针对LSD的治疗。

为了进行NBS评估，从DBS取出干血冲孔，并且进行实验室测试以检测血液中是否存在特定物质(称为标志物或生物标志物)，所述物质指示出生时不明显但在以后的生活中导致严重健康问题的病症。尽管所筛查的病症因州而异，但大多数州筛查苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病。NBS已被证明在改善患者结果和避免受影响个体的长期残疾方面非常有效，同时降低医疗费用。不幸的是，检测通常受限于血细胞中极低的蛋白质浓度和DBS中存在的有限血量。

串联质谱(MS/MS)于二十世纪九十年代首次应用于NBS，从而为快速筛查多种代谢物以及由此从出生时收集的DBS样品中筛查多种疾病铺平道路(Chace,J MassSpectrom.Wiley-Blackwell；2009；44:163-170；Millington等人,J.Inherit.Metab.Dis.1990；13:321-324；Sweetman等人Pediatrics.2006；117:S308-S314；Almannai等人,Curr.Opin.Pediatr.2016；28:694-699；Watson等人,Genet.Med.Nature Publishing Group；2006.第1S-252S页；Chace等人,Clin.Chem.1993；39:66-71)。在三重四极质谱仪上进行的选择性反应监测质谱(SRM-MS)进一步实现了对特定生物标志物的精确、高通量和分析上稳健的定量；因此，它现在已成为全球临床NBS实验室的护理标准(Chace,J Mass Spectrom.Wiley-Blackwell；2009；44:163-170；Chace和Kalas,Clinical Biochemistry.2005；38:296-309；Dott等人,American Journal ofMedical Genetics Part A.Wiley Subscription Services,Inc.,A Wiley Company；2006；140:837-842)。

先前的研究表明，用于定量来自PBMC的胰蛋白酶消化物的BTK、WASP和T细胞标志物CD3ε的特征肽的基于MS的方法可分别用于筛查X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)和SCID(Kerfoot等人,Proteomics Clin Appl,2012.6(7-8):第394-402页)。CD3ε被选择作为T细胞数量的一般表示，因为尽管遗传异质性，但所有SCID患者都存在T细胞淋巴细胞减少症。盲法研究中的每个患者都缺乏对他们的各自疾病具有特异性的特征肽(即，缺乏布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的XLA患者和缺失WAS蛋白(WASP)的WAS患者等)。

SRM-MS利用蛋白水解生成的特征肽作为目标蛋白的化学计量替代物。反过来，这可用于估计样品中表达所述蛋白质的特定细胞类型的数量(即对CD3ε进行定量以指示血液中CD3+T细胞的数量)。MS对每种特征肽的高特异性由三种物理化学性质赋予-它的质量、在高效液相色谱(HPLC)分离时的保留时间以及所得的靶标特异性片段化模式(Kennedy等人Nat.Methods.2014；11:149-155)。尽管取得了这些进展，但典型的定量极限范围是100至1000ng蛋白质/mL，使用复杂的基质(如血液或血浆)通常排除通过基于SRM-MS的测定对低丰度靶标的精确定量。

与SRM-MS结合的肽免疫亲和富集(免疫-SRM)是能够精确定量低丰度标志物的方法。免疫-SRM通常涉及以下步骤：(i)选择指示存在或不存在病症的靶蛋白质；(ii)用酶处理将包含靶蛋白质(如果存在)的生物样品，以将所述生物样品中的所有蛋白质消化为称为肽的较小片段；(iii)富集源自所述靶蛋白质的选定肽标志物；以及(iv)在质谱仪中分析和定量所富集的目标肽。

免疫-SRM(也称为稳定同位素标准物和被抗肽抗体捕获(SISCAPA))通过在SRM-MS分析之前利用抗肽抗体来纯化和富集来自复杂生物样品的目标肽来提高SRM-MS测定的灵敏度(Zhao等人J Vis Exp.2011；53:2812；Whiteaker等人Mol.Cell Proteomics.AmericanSociety for Biochemistry and Molecular Biology；2010；9:184-196；Whiteaker等人Mol.Cell Proteomics.American Society for Biochemistry and Molecular Biology；2012；11:M111.015347；Kuhn等人Clin.Chem.2009；55:1108-1117；Anderson等人JProteome Res.2004；3(2):235-244；Collins等人,Frontiers in Immunology,2018.9(2756)；Collins等人,Frontiers in Immunology,2020；11:464；Jung等人,J ProteomeRes,2017.16(2):第862-871页；Collins等人,Gastroenterology,2021:2月25日；S0016-5085(21)00457-1)。代表性的免疫SRM过程如图2所示。

使用抗肽抗体对特征肽生物标志物进行免疫亲和富集可从复杂生物基质中分离目标肽。这简化样品基质、降低背景并浓缩分析物，以增强液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定的灵敏度(Anderson等人,J Proteome Res,2004.3(2):第235-44页；Anderson和Hunter,Mol Cell Proteomics,2006.5(4):第573-88页)。Immuno-SRM允许以高重现性对血液中低皮摩尔浓度的蛋白质进行定量(Whiteaker等人,Mol Cell Proteomics,2010.9(1):第184-96页；Whiteaker等人,J Proteome Res,2014.13(4):第2187-96页；Hoofnagle等人,Clin Chem,2008.54(11):第1796-804页；Hoofnagle等人,Clin Chem,2016.62(1):第48-69页；Kuhn等人,Mol Cell Proteomics,2012.11(6):第M111.013854页)。使用这种方法，在82个样品(42个患者样品与40个正常对照)的盲法筛选中，所有样品的相应肽和诊断截断值均显著降低，允许对XLA(n＝26)、WAS(n＝11)和3例SCID中的2例的每个分子确认的病例进行阳性鉴定(PCT/US2019/054856；Collins等人,Frontiers in Immunology,2018.9(2756))。

特征肽标志物和与其结合的抗体也已被开发用于使用免疫SRM诊断原发性免疫缺陷，如X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)、X连锁淋巴组织增生综合征(XLP1；SH2D1A缺乏症)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症2(FHL2)、共济失调毛细血管扩张症(AT)、常见变异型免疫缺陷病(CVID；B细胞功能障碍)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症和胞质分裂作用因子8(DOCK8)缺乏症(PCT/US2021/020679)，以及用于检测血小板(CD42)和自然杀伤细胞(CD56)的细胞特异性标志物(PCT/US2021/020679)。

在代表X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(WAS)、X-CGD、DOCK8缺乏症和ADA缺乏症的来自28名原发性免疫缺陷疾病(PIDD)患者(包括两名携带者)的样品中，代表每种疾病的肽相对于正常对照显著减少，并且患者识别与临床和分子诊断具有极好的一致性。多重组中还包括血小板(CD42)和自然杀伤细胞(CD56)的细胞特异性标志物。在患有WAS的患者中，发现CD42水平显著降低，与特征性血小板减少症一致。在骨髓移植之前和之后进行分析的患有WAS的患者显示，治疗后WAS蛋白和血小板CD42正常化，从而突出了免疫-SRM监测PIDD治疗效果的能力。(Collins等人,Frontiers in Immunology,2020.11(464))。

免疫-SRM测定的许多方面取决于所诊断的病症、每种病症可用的生物标志物、开发可富集目标肽的分子实体的能力以及每种目标肽在质谱仪中的行为。所有这些方面以及更多方面都需要仔细考虑和实验，以实现能够在临床症状出现之前使用DBS可靠地检测NBS组中的病症的可靠测定。

本公开提供了一种多重免疫-SRM方法，以可靠地诊断LSD，包括MPS I和PD。本文公开的多重免疫-SRM测定可利用针对在MPS I和PD中减少或不存在的蛋白质的肽产生的抗肽抗体。所公开的方法和测定可允许快速预测患有LSD的患者是否将对酶替代疗法(ERT)产生免疫应答。所公开的方法和测定可进一步减少由LSD的假性缺陷病例引起的假阳性的数量。

现在更详细地描述本公开的以下方面：(I)生物样品的收集和加工；(II)MPS I和庞贝病的肽标志物；(III)生物样品中蛋白质的酶消化；(IV)用于富集肽标志物的抗体；(V)变体；(VI)肽的富集策略；(VII)液相色谱(LC)；(VIII)质谱(MS)；(IX)使用方法；(X)试剂盒；(XI)示例性实施方案；(XII)实验性实施例；以及(XIII)结束段落。

(I)生物样品的收集和加工。在特定实施方案中，可用于本公开的方法中的生物样品包括源自血液或细胞的样品。在特定实施方案中，在本公开的方法中使用的样品是DBS。在特定实施方案中，可通过将血液置于滤纸卡上并使血液干燥来制备来自受试者的全血。

在特定实施方案中，可将来自受试者的全血收集在任何抗凝剂中。在特定实施方案中，可将来自受试者的全血收集在肝素中。可通过将50-100μL(例如，70μL)血液/斑吸移到滤纸卡(例如，Protein Saver^TM

卡，Whatman Inc,Piscataway,NJ)上且使其在室温下干燥来制备DBS。在特定实施方案中，使血液在滤纸卡上干燥过夜。可将DBS例如在-80℃下储存在密封塑料袋中直到使用。在特定实施方案中，整个DBS可用于本公开的免疫-SRM测定中。在特定实施方案中，来自DBS的一个或多个3mm冲孔可用于本公开的免疫-SRM测定中。在特定实施方案中，可用50mM碳酸氢铵中的0.1％Triton X-100溶解DBS。

在特定实施方案中，用于本公开的方法中的样品包括从口腔拭子或粘膜样品获得的细胞。在特定实施方案中，粘膜样品包括口腔、鼻腔、生殖器和直肠样品(Espinosa-deAquino等人(2017)Methods in Ecology and Evolution 8:370-378)。在特定实施方案中，口腔拭子样品包括来自脸颊或口腔的细胞。在特定实施方案中，口腔拭子样品可按照以下中描述的方案从受试者获得：CHLA.(2016年，4月4日)。口腔拭子收集程序。CHLA-ClinicalPathology；(2016年，7月27日)。口腔DNA收集说明。Pathway Genomics；(2017年，12月14日)。口腔拭子样品收集说明。Otogenetics；PDXL PDXL.(2017年，11月28日).口腔拭子收集程序–PersonalizedDx Labs[视频].YouTube。在万维网上在youtu.be/3ftvHkfM71o？t＝146；and Centers of Disease Control and Prevention(CDC).(2020年，7月8日)用于收集、处理和测试Covid-19的临床试样的临时指南。在万维网上在cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/guidelines-clinical-specimens.html。

在特定实施方案中，口腔拭子样品可通过以下方案从受试者获得。在样品收集之前，患者至少30分钟不吸烟、不吃、不喝、不嚼口香糖或刷牙。小心地从包装中取出拭子，确保尖端不会接触任何物体或表面。将拭子插入颊腔，颊腔位于脸颊、牙齿和上龈之间口腔的一侧。将拭子的尖端压在一侧脸颊内侧，并以圆周运动的方式来回上下摩擦。在摩擦过程中旋转手柄，以用来自脸颊的细胞覆盖整个尖端。在收集过程中，尖端不允许接触牙齿、牙龈和嘴唇。拭子不允许被唾液过度饱和。收集后，将拭子从口腔中取出，不接触牙齿、牙龈或嘴唇。使拭子在室温下风干至少30分钟。可将去除手柄的拭子储存在低温小瓶中。可用第二拭子在另一侧脸颊上重复所述步骤。口腔拭子样品可在收集后在2℃-8℃下储存至多72小时，或者如果超过72小时则储存在-80℃或更低的冰箱中。在特定实施方案中，用口腔拭子收集细胞可持续至少30秒。在特定实施方案中，用口腔拭子收集细胞可从最大粘膜表面收集。在特定实施方案中，每个受试者可收集一至五个口腔拭子样品。在特定实施方案中，口腔拭子样品可在无菌表面上风干至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟或更长时间。在特定实施方案中，受试者可在样品收集之前用清水冲洗他们的口腔。在特定实施方案中，可使用单独拭子用盐水润湿样品收集区域。在特定实施方案中，口腔拭子样品可储存在25℃、20℃、15℃、10℃、5℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃或更低温度下。在特定实施方案中，口腔拭子样品可在-20℃下储存一至两周。在特定实施方案中，可从水和/或漱口水而不是拭子收集口腔样品(Michalczyk等人(2004)BioTechniques37(2):262-269)。

在特定实施方案中，可用50mM碳酸氢铵中的0.1％Triton X-100溶解来自口腔拭子样品的细胞。在特定实施方案中，可按照Espinosa-de Aquino等人(2017)中描述的方案从口腔拭子样品中分离蛋白质。在特定实施方案中，可用适当的缓冲液如TRIzol(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)提取来自口腔拭子样品的细胞，并且核酸沉淀后的上清液可用于蛋白质提取。在特定实施方案中，可用丙酮沉淀蛋白质，可将蛋白质团块重悬于适当的缓冲液(例如，补充有2.5％甘油的95％乙醇中的盐酸胍)中，可通过超声处理使团块分散，可将团块离心并洗涤，可干燥团块，并且可将团块溶解于适当的缓冲液(例如，PBS和十二烷基硫酸钠)中。在特定实施方案中，可将溶解的团块在100℃下加热，然后离心以获得上清液以供使用。

在特定实施方案中，在本公开的方法中使用的样品包括外周血单核细胞(PBMC)。PBMC来自外周血并且源自驻留于骨髓中的造血干细胞(HSC)。PBMC是具有圆形细胞核的血细胞，并且可包括许多类型的细胞，包括单核细胞、淋巴细胞(包括T细胞、B细胞和NK细胞)、树突细胞和干细胞。PBMC可通过本领域已知的任何技术，包括密度离心(例如，使用Ficoll-Paque)分离。密度梯度离心根据细胞密度分离细胞。在特定实施方案中，全血或血沉棕黄层可在密度介质之上或之下分层，而不混合两个层，然后离心。在特定实施方案中，PBMC在血浆与密度梯度介质之间的界面处显示为薄的白色层。在特定实施方案中，可使用含有Ficoll-Hypaque和使Ficoll溶液与待抽取血液分离的凝胶塞的

采血管(细胞制备管CPT^TM,BD Biosciences,San Jose,CA；Puleo等人(2017)Bio-protocol 7(2):e2103)。在特定实施方案中，可使用设计有插入物以防止密度梯度介质和样品在离心之前混合的SepMate^TM管(STEMCELL^TM Technologies,Vancouver,CA)(Kerfoot等人,ProteomicsClin Appl,2012.6(7-8):394-402；Grievink等人,Biopreserv Biobank.2016年10月；14(5):410-415；Corkum等人(2015)BMC Immunol.16:48；Jia等人(2018)Biopreserv Biobank16(2):82-91)。在特定实施方案中，PBMC可通过白细胞去除术分离。白细胞去除术机器是一种自动化设备，它从供体采集全血并使用高速离心分离出靶PBMC级分，同时将血液的剩余部分，包括血浆、红细胞和粒细胞返回供体。在特定实施方案中，可用50mM碳酸氢铵中的0.1％Triton X-100溶解分离的PBMC。

在特定实施方案中，用于本公开的方法中的样品包括白细胞(WBC；白细胞)。WBC是免疫系统的一部分，并且可保护身体免受感染和外来侵入物。在特定实施方案中，WBC包括粒细胞(多形核细胞)、淋巴细胞(单核细胞(mononuclear cell))和单核细胞(monocyte)(单核细胞(mononuclear cell))。在特定实施方案中，WBC包括淋巴细胞和单核细胞，但不包括粒细胞。可通过本领域已知的任何技术分离和任选地富集WBC，包括：密度梯度离心(Boyum(1968)Isolation of mononuclear cells and granulocytes from humanblood.Isolation of mononuclear cells by one centrifugation and ofgranulocytes by combining centrifugation and sedimentation at1g.Scand.J.Clin.Lab Invest.Suppl.97:77；Boyum(1977)Lymphology,10(2):71-76)；通过渗透压休克溶解红细胞(Morgensen and Cantrell(1977)Pharm Therap.1:369-383)；RosetteSep^TM(STEMCELL^TM Technologies,Vancouver,CA)，包括抗体介导的不想要的细胞与红细胞的结合以及通过密度梯度分离除去(Beeton和Chandy(2007)J Vis Exp.(8):326)；用于细胞富集或耗减的磁珠(Brocks等人(2006)In vivo 20(2):239)；补体介导的裂解以富集B和/或NK细胞(Faguet和Agee(1993)J Imm Meth 165(2):217)；以及淘选以除去不想要的细胞，包括通过粘附至抗体包被的板上来富集或耗减细胞(Brousso等人(1997)Immunol Let 59(2):85)。关于WBC的分离和富集方案的综述，参见Dagur和McCoy(2015)Curr Protoc Cytom.73:5.1.1-5.1.16。

(II)MPS I和庞贝病的肽标志物。存在许多来自靶蛋白的理论蛋白水解肽。这些可能是单克隆抗体产生的潜在候选物。尽管如此，在通过MS/MS筛查了它们的特征之后，选择了最佳的潜在候选肽。选择具有最高灵敏度和特异性的那些特征肽以开发相应的单克隆抗体，并使用临床样品进行验证。在特定实施方案中，多种肽和抗体可包括在多重分析中以增加免疫-SRM测定的通量并减少测定所需的成本和时间。

通常，选择一种或两种特征蛋白水解肽以化学计量地表示目标蛋白质，所述特征蛋白水解肽是目标蛋白质所特有的并且在MS实验中始终观察到(Mallick等人NatBiotechnol 2007；25:125-131)。可通过在先前的MS实验中进行检测，使用计算工具来预测最有可能通过MS观察到的肽或两者的组合来选择特征肽。在特定实施方案中，可选择具有中等疏水性的长度为5-22个氨基酸的胰蛋白酶肽。由于HPLC中的保留时间变化和表面的损失，非常亲水性和非常疏水性的肽可能不稳定。在特定实施方案中，甲硫氨酸残基(氧化)、N末端谷氨酰胺(环化)、天冬酰胺随后是甘氨酸或脯氨酸(易于脱酰胺)和二元末端(例如相邻的赖氨酸或精氨酸残基，如KK、KR、RR、RK具有可变消化效率的潜力)可能是不希望的(Whiteaker和Paulovich,Clin Lab Med.2011；31(3):385-396)。较短的肽和含有脯氨酸残基的那些肽可能是SRM的更好靶标(Lange等人,Molecular Systems Biology 2008；4:222)。

在特定实施方案中，肽包括IDUA和/或GAA的部分。在特定实施方案中，肽包括SEQID NO:1-9。在特定实施方案中，本公开的肽包括在表1A-1C和图1中描述的那些。

在特定实施方案中，本公开的抗体的示例性CDR序列显示在表1A中。在特定实施方案中，本公开的抗体的示例性可变重(VH)和可变轻(VL)结构域序列显示在表1B中。在特定实施方案中，本公开的示例性肽和抗体的SEQ ID NO显示在表1C中。

表1A.本公开的抗体的示例性CDR序列

表1B.本公开的抗体的示例性可变重(VH)和可变轻(VL)结构域序列

表1C.本公开的示例性肽和抗体的SEQ ID NO

*加下划线的SEQ ID NO表示核苷酸序列。未加下划线的SEQ ID NO表示氨基酸序列。

^重链和轻链SEQ ID NO在括号中。

(III)生物样品中蛋白质的酶消化。可对生物样品中的蛋白质进行蛋白水解以产生肽，可在通过LC-SRM-MS分析之前通过免疫亲和纯化进一步选择所述肽。在特定实施方案中，生物样品包括DBS、来自口腔拭子样品的细胞、PBMC或WBC。可使用位点特异性内切蛋白酶，如胃蛋白酶、arg-C蛋白酶、asp-N肽链内切酶、BNPS-粪臭素、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶(梭状杆菌肽酶B)、肠激酶、因子Xa、谷氨酰肽链内切酶、颗粒酶B、lysC、脯氨酸肽链内切酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶和胰蛋白酶来完成蛋白水解。也可使用特异性地裂解位点的化学物质。酶和/或化学物质的组合可用于获得所需的分析物。

在特定实施方案中，可用胰蛋白酶将生物样品中的蛋白质消化为肽。胰蛋白酶仅裂解精氨酸和赖氨酸残基的C末端，并且可以是产生肽的优选选择，因为所产生的肽的质量与大多数质谱仪的检测能力(高达3000m/z)相容，并且因为有高效的算法可用于生成理论胰蛋白酶产生的肽的数据库。高裂解特异性、可用性和低成本是胰蛋白酶的其他优点。通过用胰蛋白酶处理蛋白质而形成的肽被称为胰蛋白酶肽。

(IV)用于富集肽标志物的抗体。抗体包含基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其功能片段编码的多肽配体，无论是天然的还是部分或全部合成产生的。抗体特异性地(或选择性地)结合并识别表位(例如，抗原)。抗体可包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。抗体制剂可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE等。识别的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链的包含一个或多个重链恒定区结构域CH1、CH2和CH3、但不包括重链可变区的部分。

完整抗体可包括通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH或V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL或V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。

给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可使用许多众所周知的方案中的任一种容易地确定，包括以下描述的那些方案：Kabat等人(1991)"Sequences of Proteins ofImmunological Interest,"第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)J Mol Biol 273:927-948(Chothia编号方案)；Maccallum等人(1996)J Mol Biol 262:732-745(Contact编号方案)；Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.,86:9268-9272(AbM编号方案)；Lefranc M P等人(2003)Dev Comp Immunol 27(1):55-77(IMGT编号方案)；以及Honegger和Pluckthun(2001)J Mol Biol 309(3):657-670("Aho"编号方案)。给定CDR或FR的边界可根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案两者的编号均是基于最常见的抗体区域序列长度，并通过插入字母(例如“30a”)调节插入，并且一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。在特定实施方案中，本文公开的抗体CDR序列是根据Kabat编号。

抗体片段包括抗体的小于全长的任何衍生物或部分。在特定实施方案中，抗体片段保留全长抗体作为结合配偶体的特异性结合能力的至少大部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、Fab'-SH、F(ab′)₂、单链可变片段(scFv)、Fv、dsFv双抗体和Fd片段和/或免疫球蛋白的与本文所述的表位特异性地结合的任何生物学有效片段。抗体或抗体片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体和线性抗体的全部或一部分。

单链可变片段(scFv)是用短接头肽连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的融合蛋白。Fv片段包括抗体的单臂的VL和VH结构域。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但其可使用例如重组方法通过合成接头加以接合，所述合成接头使其能够以单一蛋白链形式制得，在所述单一蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(单链Fv(scFv))。有关Fv和scFv的另外信息，参见例如，Bird等人,Science 242(1988)423-426；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Plueckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编),Springer-Verlag,New York),(1994)269-315；WO1993/16185；美国专利号5,571,894；以及美国专利号5,587,458。

Fab片段是包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价抗体片段。F(ab')₂片段是包含通过铰链区处的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。对于具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双抗体包含两个可以是二价的表位结合位点。参见例如，EP 0404097；WO1993/01161；以及Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。也可使用双重亲和力重靶向抗体(DART^TM；基于双抗体形式，但具有C末端二硫桥键以获得额外的稳定(Moore等人,Blood 117,4542-51(2011))。抗体片段也可包括分离的CDR。对于抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9(2003)129-134。

可通过任何方式产生抗体片段。例如，抗体片段可通过完整抗体的片段化酶促或化学产生，或者它可从编码部分抗体序列的基因重组产生。或者，抗体片段可全部或部分合成产生。抗体片段可包括单链抗体片段。在另一个实施方案中，片段可包含例如通过二硫键联连接在一起的多个链。片段还可包含多分子复合物。功能性抗体片段通常可包含至少50个氨基酸，并且更通常将包含至少200个氨基酸。

在特定实施方案中，可产生重组免疫球蛋白。参见，Cabilly,美国专利号4,816,567和Queen等人,Proc Natl Acad Sci USA,86:10029-10033(1989)。

如所指出的，在特定实施方案中，工程化的抗体或抗原结合片段的结合结构域可通过接头连接。接头是氨基酸序列，其可为工程化的抗体或抗原结合片段的结合结构域之间的构象运动提供柔性和空间。可使用任何适当的接头。接头的实例可在Chen等人,AdvDrug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10):1357-1369中找到。接头可以是柔性的、刚性的或半刚性的，取决于对靶标的所需功能结构域呈递。常用的柔性接头包括Gly-Ser接头，如GGSGGGSGGSG(SEQ ID NO:34),GGSGGGSGSG(SEQ ID NO:35)和GGSGGGSG(SEQ ID NO:36)。另外的实例包括：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:37)；GGGSGGGS(SEQ ID NO:38)；和GGSGGS(SEQ IDNO:39)。也可使用包含一个或多个抗体铰链区和/或免疫球蛋白重链恒定区的接头，如单独的CH3或CH2CH3序列。

在一些情况下，柔性接头可能不能维持特定用途所需的结合结构域的距离或定位。在这些情况下，刚性或半刚性接头可能是有用的。刚性或半刚性接头的实例包括富含脯氨酸的接头。在特定实施方案中，富含脯氨酸的接头是比仅基于偶然性所预期的具有更多脯氨酸残基的肽序列。在特定实施方案中，富含脯氨酸的接头是具有至少30％、至少35％、至少36％、至少39％、至少40％、至少48％、至少50％或至少51％脯氨酸残基的接头。富含脯氨酸的接头的具体实例包括富含脯氨酸的唾液蛋白(PRP)的片段(Carlson,Biochimie 70(11):1689-1695,1988)。

本领域普通技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。

单克隆抗体包括从大致上均质抗体群体获得的抗体，即除在产生单克隆抗体期间可出现的可能变体(此类变体一般以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。这种类型的抗体是由单个产生抗体的杂交瘤的子细胞产生的。单克隆抗体通常对与其结合的任何表位展现单一结合亲和力。

修饰语“单克隆”指示从均质抗体群体获得的抗体的特性并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体仅识别一种类型的抗原。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述一条或多条链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源。用于产生抗体的技术在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Harlow和Lane“Antibodies,ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988；Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999；Tickle等人JALA:Journal of the Association for LaboratoryAutomation.2009；14(5):303-307；Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996；93:7843-7848；以及美国专利号5,627,052中。

在特定实施方案中，“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与肽)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(K_D)或缔合常数(K_A)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法来测量。

在特定实施方案中，“结合”是指抗体的结合结构域与其靶肽缔合的解离常数(K_D)为10^-8M或更低、在特定实施方案中为10^-5M至10^-13M、在特定实施方案中10^-5M至10^-10M、在特定实施方案中10^-5M至10^-7M、在特定实施方案至10^-8M至10^-13M或在特定实施方案中10^-9M至10^-13M。所述术语可进一步用于指示结合结构域不结合至存在的其他生物分子(例如，它以10^-4M或更高、在特定实施方案中10^-4M至1M的解离常数(K_D)结合至其他生物分子)。

在特定实施方案中，“结合”是指抗体的结合结构域与其靶肽缔合的亲和常数(即，缔合常数，K_A)为10⁷M^-1或更高、在特定实施方案中10⁵M^-1至10¹³M^-1、在特定实施方案中10⁵M^-1至10¹⁰M^-1、在特定实施方案中10⁵M^-1至10⁸M^-1、在特定实施方案中10⁷M^-1至10¹³M^-1或在特定实施方案中10⁷M^-1至10⁸M^-1。所述术语可进一步用于指示结合结构域不结合至存在的其他生物分子(例如，它以10⁴M^-1或更低、在特定实施方案中10⁴M^-1至1M^-1的缔合常数(K_A)结合至其他生物分子)。

本公开的抗体可用于在SRM测定中检测的本文所述的肽的免疫亲和富集，以用于诊断MPS I和庞贝病。高亲和力抗体的特定实施方案包括抗IDUA 218、抗IDUA 462、抗GAA155、抗GAA 332、抗GAA 376、抗GAA 601、抗GAA 855、抗GAA 882和抗GAA 892。

在特定实施方案中，示例性抗体包括表1A-1C和图12中呈现的VH CDR、VH结构域、重链、LH CDR、VL结构域和轻链的SEQ ID NO。

在特定实施方案中，示例性抗体包含具有前导序列的重链或轻链编码序列。在特定实施方案中，示例性抗体包含具有前导序列的可变重结构域或可变轻结构域编码序列。在特定实施方案中，示例性抗体包含具有前导肽的重链或轻链氨基酸序列。在特定实施方案中，示例性抗体包含无前导肽的重链或轻链氨基酸序列。在特定实施方案中，示例性抗体包含具有前导肽的可变重结构域或可变轻结构域氨基酸序列。在特定实施方案中，示例性抗体包含无前导肽的可变重结构域或可变轻结构域氨基酸序列。

(V)变体。还包括本文公开和引用的序列的变体。功能变体包含实质上不影响蛋白质的生理作用的一个或多个残基添加或取代。功能片段包含实质上不影响蛋白质的生理作用的一个或多个缺失或截短。可通过在结合研究中观察实验上可比较的结果来确认实质性影响的缺乏。结合结构域的功能变体和功能片段以与野生型参考相当的水平结合它们的同源抗原或配体。

确定在不消除生物活性的情况下哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失的指导可使用本领域熟知的计算机程序如DNASTAR^TM(Madison,Wisconsin)软件发现。优选地，本文公开的蛋白质变体中的氨基酸变化是保守性氨基酸变化，即，类似地带电或不带电氨基酸的取代。保守性氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族之一的取代。

在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守性取代是本领域技术人员已知的，并且通常可在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如，Watson等人Molecular Biology of the Gene,第4版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页)。天然存在的氨基酸通常分为以下保守性取代家族：第1组：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)；第2组：(酸性)：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)；第3组：(酸性；也分类为极性带负电的残基及其酰胺)：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、Asp和Glu；第4组：Gln和Asn；第5组：(碱性；也分类为极性带正电的残基)：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；第6组(大的脂族非极性残基)：异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)和半胱氨酸(Cys)；第7组(不带电的极性)：酪氨酸(Tyr)、Gly、Asn、Gln、Cys、Ser和Thr、第8组(大的芳族残基)：苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和Tyr；第9组(非极性)：脯氨酸(Pro)、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met和Trp；第11组(脂族)：Gly、Ala、Val、Leu和Ile；第10组(小的脂族非极性或弱极性残基)：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；以及第12组(含硫)：Met和Cys。另外的信息可见于Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。

在进行此类变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。本领域中通常了解亲水性氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用性生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157(1),105-32)。已基于各氨基酸的疏水性和电荷特征对其指定亲水性指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值是：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；Gln(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。

本领域中已知某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或分数的其他氨基酸取代且仍然产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物功能上等效的蛋白质。在进行此类变化中，其亲水性指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在±0.5内的那些是甚至更特别优选的。在本领域中还应了解，可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。

如美国专利号4,554,101中所详述，以下亲水性值已指定给氨基酸残基：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Thr(-0.4)；Pro(-0.5±1)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；Trp(-3.4)。应理解，氨基酸可被取代成具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等效的且特别是免疫学上等效的蛋白质。在此类变化中，其亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在±0.5内的那些是甚至更特别优选的。

如上所述，氨基酸取代可基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。

在特定实施方案中，结合结构域VH区可源自或基于已知抗体或本文公开的抗体的VH，并且当与已知抗体或本文公开的抗体的VH相比时可任选地含有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可在VH区中的任何位置，包括在此区域的氨基末端或羧基末端或两端，条件是每个CDR包括零个变化或至多一个、两个或三个变化，并且条件是含有经修饰的VH区的结合结构域仍然能够以类似于野生型结合结构域的亲和力特异性地结合其靶标。

在特定实施方案中，结合结构域中的VL区源自或基于已知抗体或本文公开的抗体的VL，并且当与已知抗体或本文公开的抗体的VL相比时任选地含有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)插入、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)缺失、一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可在VL区中的任何位置，包括在此区域的氨基末端或羧基末端或两端，条件是每个CDR包括零个变化或至多一个、两个或三个变化，并且条件是含有经修饰的VL区的结合结构域仍然能够以类似于野生型结合结构域的亲和力特异性地结合其靶标。

如在别处指出的，基因序列的变体可包括密码子优化的变体、序列多态性、剪接变体和/或在统计学上不显著影响所编码产物的功能的突变。

蛋白质、核酸和基因序列的变体还包括与本文公开的蛋白质、核酸或基因序列具有至少70％序列同一性、80％序列同一性、85％序列同一性、90％序列同一性、95％序列同一性、96％序列同一性、97％序列同一性、98％序列同一性或99％序列同一性的序列。

“序列同一性％”是指如通过比较序列所确定的两种或更多种序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指如通过此类序列串之间的匹配所确定的蛋白质、核酸或基因序列之间的序列相关性程度。“同一性”(经常称为“相似性”)可通过已知方法来容易地计算，所述方法包括(但不限于)在以下中描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,编辑)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects(Smith,D.W.,编辑)Academic Press,NY(1994)；Computer Analysis ofSequence Data,Part I(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑)Humana Press,NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(Von Heijne,G.,编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑)OxfordUniversity Press,NY(1992)。设计确定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最佳匹配。可公开获得的计算机程序中编纂了确定同一性和相似性的方法。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)的Megalign程序来执行。序列的多重比对还可使用Clustal比对方法(Higgins和SharpCABIOS,5,151-153(1989))以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)来执行。相关程序还包括GCG程序套件(威斯康星软件包9.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))；DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)；以及并入Smith-Waterman算法的FASTA程序(Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),会议日期1992,111-20.编辑：Suhai,Sandor.出版商：Plenum,New York,N.Y.。在本公开的上下文内，将了解在将序列分析软件用于分析的情况下，分析的结果是基于所引用的程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将意指在首次初始化时用软件最初加载的值或参数的任何集合。

(VI)肽的富集策略。SRM之前所需肽靶标的富集可通过本领域已知的任何方式来完成。可使用许多富集程序，包括来自样品的丰富蛋白质种类的基于免疫吸附的耗减、沉淀、色谱、电泳、溶剂分配、免疫沉淀、免疫电泳和免疫色谱。在特定实施方案中，可使用SISCAPA方法用于来自样品的消化物的单独胰蛋白酶肽的基于特异性抗体的捕获(Anderson等人，J.Proteome Research 2004；3:235-244；美国专利号7,632,686)。

在特定实施方案中，结合肽标志物的抗体(如本文公开的抗体)可连接至固体载体。特定实施方案使用亲和柱，其中抗体与色谱介质共价偶联。在特定实施方案中，POROS(Applied Biosystems,Foster City,CA)纳米柱可用于SISCAPA富集中，并且特征是高结合能力、允许快速富集靶肽的相对较高的抗体浓度以及制备具有多种官能化基团的色谱柱的能力。或者，抗体可连接至珠粒、磁珠或其他固体颗粒上。一种连接方式是抗体与包被在珠粒上的蛋白质的缀合。例如，蛋白G包被的颗粒以优选的取向提供抗体的结合。可使用其他连接方式，如用抗体直接包被珠粒。磁性颗粒具有广泛的化学性质，从而允许与抗体偶联。连接至颗粒上的抗体的富集可允许样品的并行加工。磁性颗粒加工已在用于SISCAPA富集步骤的96孔板中自动化，在所述板中具有洗脱液用于通过质谱进行分析。其他特定实施方案使用新颖的珠粒捕集装置，所述装置被开发来执行与纳流色谱系统一致的珠粒处理步骤(Anderson等人Mol Cell Proteomics 2009；8(5):995-1005)。这样可使洗脱与分析步骤之间肽在容器中的损失最小化。也可通过将抗肽抗体固定在移液管尖端中来实现肽富集(Nelson等人Anal Chem.1995；67(7):1153-1158)。将抗体结合的肽与游离肽分离后，可洗脱结合的肽。可使用任何洗脱方法。已发现有效的一种洗脱方式是5％乙酸/3％乙腈。对于特定的肽有效的是，可使用其他洗脱方式，包括其他酸和其他浓度的乙酸。

(VII)液相色谱(LC)。在特定实施方案中，在SRM-MS之前进行一个或多个LC纯化步骤。可使富集肽的混合物(流动相)通过填充有材料(固定相)的色谱柱，以基于肽的重量和对柱的流动相和固定相的亲和力来使所述肽分离。传统的LC分析依赖于样品组分与色谱柱填充材料之间的化学相互作用，其中样品通过柱的层流是从测试样品中分离出目标分析物的基础。熟练技术人员将理解，在这种柱中的分离是扩散过程。多种柱填充材料可用于样品的色谱分离，并且适当分离方案的选择是取决于样品特性、目标分析物、存在的干扰物质及其特性等的经验过程。可根据需要(例如，所纯化的化合物的结构、极性和溶解性)使用各种填充化学物质。在特定实施方案中，所述柱是极性柱、离子交换柱(阳离子和阴离子两者)、疏水相互作用柱、苯基柱、C-2柱、C-8柱、C-18柱、多孔聚合物上的极性涂层或可商购的其他柱。在色谱过程中，材料的分离受变量如洗脱液(也称为“流动相”)的选择、梯度洗脱的选择以及梯度条件、温度等的影响。在特定实施方案中，分析物可通过在柱填充材料可逆地保留目标分析物而不保留一种或多种其他材料的条件下，将样品施加到柱上来进行纯化。在这些实施方案中，可使用第一流动相条件，在所述第一流动相条件下目标分析物被柱保留，并且一旦将未保留的材料洗涤通过，就可随后使用第二流动相条件从柱中除去所保留的材料。或者，可通过在流动相条件下将样品施加到柱上来纯化分析物，在所述流动相条件下，与一种或多种其他材料相比，目标分析物以不同的速率洗脱。如上所述，相对于样品的一种或多种其他组分，此类程序可富集一种或多种目标分析物的量。在特定实施方案中，LC是微流LC(microLC)。在微流LC中，色谱分离是使用每分钟低微升范围内的流速进行的。在特定实施方案中，LC是纳流LC(nanoLC)。在纳流LC(nanoLC)中，色谱分离是使用每分钟300纳升的流速进行的。缓慢流速导致由于这种类型的色谱提供的高浓缩效率所致的高分析灵敏度(Cutillas,Current Nanoscience,2005；1:65-71)。

(VIII)质谱(MS)。质谱仪包括测量可转换为气相离子的质荷(m/z)比的参数的气相离子谱仪。质谱法是指使用质谱仪检测气相离子。质谱仪通常包括离子源和质量分析仪。质谱仪的实例是飞行时间(TOF)、磁性扇区、四极过滤器、离子阱、离子回旋共振、静电扇区分析仪以及这些的杂合体。激光解吸质谱仪包括使用激光能量作为解吸、挥发和电离分析物的手段的质谱仪。串联质谱仪包括能够执行两个连续阶段的基于m/z的离子(包括离子混合物中的离子)辨别或测量的任何质谱仪。所述短语包括具有两个质量分析仪的质谱仪，所述质量分析仪能够执行两个连续阶段的基于m/z的空间串联离子辨别或测量。所述短语还包括具有单个质量分析仪的质谱仪，所述质量分析仪能够执行两个连续阶段的基于m/z的时间串联离子辨别或测量。因此，所述短语明确地包括Qq-TOF质谱仪、离子阱质谱仪、离子阱-TOF质谱仪、TOF-TOF质谱仪、傅立叶变换离子回旋共振质谱仪、静电扇区-磁性扇区质谱仪、三重四极质谱仪以及它们的组合。

质谱中的电离包括将样品中的分析物电离的过程。此类分析物可能变成用于进一步分析的带电分子。例如，样品电离可通过电喷射电离(ESI)、激光喷射电离(LSI)、大气压化学电离(APCI)、光致电离、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液相次级电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场解吸、热喷射/等离子体喷射电离以及粒子束电离来进行。熟练技术人员将理解可基于待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正负模式的选择等确定电离方法的选择。

质量分析仪包括质谱仪的部件，所述部件吸收离子化的质量，并根据m/z比将它们分离，并且将它们输出至检测器，在检测器中对它们进行检测，然后转换为数字输出。用于确定m/z比的合适质量分析仪包括四极质量分析仪、飞行时间(TOF)质量分析仪、磁性或静电扇区质量分析仪和离子阱(例如离子回旋共振)质量分析仪。

选择性反应监测(SRM)-MS测定针对给定的目标蛋白质靶向一组预定肽。SRM是串联质谱模式，其中在串联质谱的第一阶段中选择特定质量的离子(母离子或前体离子)，然后在第二质谱检测阶段中选择前体离子的片段化反应的离子产物。与选定的前体离子和碎片离子相关的特定对的m/z值称为跃迁。对于每种特征肽，鉴定提供最佳信号强度并将目标肽与样品中存在的其他种类区分开的那些碎片离子。优化的跃迁有助于有效的SRM测定。随时间推移监测几个这样的跃迁(前体/碎片离子对)，从而生成一组色谱迹线，其中特定跃迁的保留时间和信号强度作为坐标。特征肽的SRM-MS分析通常在三重四极质谱仪(QQQ-MS)上进行，所述质谱仪是能够选择性地分离对应于特征肽的m/z的前体离子并选择性地监测肽特异性碎片离子的仪器。在SRM分析中，特异性取决于多个质量分析仪(质量过滤器)。第一个四极用于选择所需的母离子或前体离子。第三个四极用于监测(一种或多种)碎片离子。碎片离子是通过第二个四极中的碰撞诱导解离产生的。两个级别的质量选择允许高选择性，因为共洗脱背景离子非常有效地被滤出。与调查样品中的所有分析物的常规串联质谱(MS/MS)实验不同，SRM分析选择性地靶向(过滤)特定分析物，与常规的“全扫描”技术相比，其转化为灵敏度提高一个或两个数量级。此外，SRM在高达五个数量级的宽动态范围内提供线性响应。这样使得能够检测高度复杂混合物中的低丰度蛋白质。因此，SRM是具有低背景干扰的高度特异性检测/监测方法。当在单次MS运行中监测多种母离子时，这种类型的分析被称为多反应监测(MRM)。使用MRM分析，可在单次质谱运行中监测多种蛋白质和蛋白质的多个区域(特征肽)。选择性反应监测/多反应监测质谱(SRM/MRM-MS)描述于例如US 8,383,417、WO 2013/106603和US 2013/105684中。

在特定实施方案中，以下参数可用于指定在特定LC-SRM-MS系统下蛋白质的LC-SRM-MS测定：(1)富集给定蛋白质的胰蛋白酶肽；(2)肽在LC柱上的保留时间(RT)；(3)肽前体离子的m/z值；(4)用于使前体离子电离的去簇电位；(5)由肽前体离子产生的碎片离子的m/z值；以及(6)用于使针对特定肽而优化的肽前体离子碎裂的碰撞能量(CE)。RT包括分析物的注入与洗脱之间经过的时间。去簇电位(DP)包括溶解和解离离子簇的电压电位。取决于制造商，它也被称为“碎裂电压”或“离子转移毛细管偏移电压”。碰撞能量(CE)包括前体离子在它们加速进入碰撞池时所接收的能量的量。

为了通过本文公开的方法促进肽的准确定量，可将已知量的一组目标同位素标记的合成型式的肽添加到样品中，以用作内部标准物。由于同位素标记的肽具有与相应的替代肽相同的物理和化学性质，因此它们从色谱柱共洗脱，并容易在所得质谱图中鉴别(Gerber等人Proc.Natl.Asso.Sci.2003；100:6940-6945；Kirkpatrick等人Methods2005；35:265-273)。可用来标记给定肽中的氨基酸的同位素包括¹³C、²H、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O和³⁴S。在特定实施方案中，用¹³C和/或¹⁵N重同位素标记肽。标记的标准物的添加可在蛋白水解消化之前或之后进行。在特定实施方案中，在蛋白水解消化之后添加标记的内部标准肽。合成同位素标记的肽的方法将是本领域技术人员已知的。因此，在特定实施方案中，实验样品含有内部标准肽。在特定实施方案中，内部标准肽包括参考特征肽。在特定实施方案中，可通过组合以下来确定特征肽浓度：(i)通过比较特征肽的峰面积与从LC-MRM-MS测定获得的其相应的参考特征肽的峰面积而计算的比率，和(ii)参考特征肽的已知浓度。被选择作为参考标准并适合定量的肽有时被称为quantotypic肽(Q-肽)。Q-肽不仅具有蛋白水解肽的所有特征，而且对可构成参考肽的残基施加了限制以消除人工修饰和/或不完全裂解(Holman等人Bioanalysis 2012；4(14):1763-1786)。

一种或多种给定蛋白质的绝对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，其中将一种生物样品中来自给定蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与已知量的“加标”内部标准物的SRM/MRM特征峰面积进行比较。在特定实施方案中，所述内部标准物是合成型式的相同的精确肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成此类同位素标记的内部标准物，由此质谱分析产生与天然肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰的可预测且一致的SRM/MRM特征峰。因此，当将内部标准物以已知量掺入到生物样品的蛋白质制剂中并通过质谱分析时，将天然肽的特征峰面积与内部标准肽的特征峰面积进行比较，并且这种数值比较指示存在于来自生物样品的原始蛋白质制剂中的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样品中所分析的蛋白质的量来显示。绝对定量可对于许多肽进行，并且因此同时定量在单一样品中的多种蛋白质；和/或对于多种样品进行，以获得对于在单个生物样品中和/或在整组的单个样品中绝对蛋白质量的了解。

肽绝对定量的另一种策略是通过均衡肽的等摩尔性。这种方法包括化学合成呈二肽形式的目标同位素标记的Q-肽。常见的氨基酸序列位于Q-肽的N末端，并且被称为均衡肽。在溶解和蛋白水解消化后，可通过参考单个光标记的肽来准确地确定Q-肽的量。然后可将适当量的每种标准肽添加到目标样品中(预先消化或在蛋白水解之前)，以促进绝对定量(Holzmann等人Anal.Chem.2009；81:10254-10261)。绝对定量也可使用定量多联体(QconCAT)蛋白质(Beynon等人Nat.Methods 2005；2:587-589；Johnson等人J.Am.Soc.MassSpectrom.2009；20:2211-2220；Ding等人J.Proteome Res.2011；10:3652-3659；Carroll等人Molecular&Cellular Proteomics 2011；9月19日:mcp-M111)。在这种策略中，在稳定的同位素富集培养基中生长的大肠杆菌中异源产生了重组人工蛋白质，所述蛋白质是来自几种目标蛋白质的标准肽的亲和标记的级联。然后将QconCAT蛋白亲和纯化并与样品共消化，从而产生组成其的所有“重”Q-肽的化学计量混合物，并且随后分析来自天然蛋白和内部标准物的蛋白水解肽。QconCAT方法的一种变型，称为肽级联标准物(PCS)，在人工蛋白质序列中的Q肽之间使用反映它们的内源环境的侧翼区(Kito等人J.Proteome Res.2007；6:792-800)。其他特定实施方案使用用于绝对定量的蛋白质标准物(PSAQ)(Brun等人Mol.Cell.Proteomics 2007；6:2139-2149)。PSAQ使用重组蛋白，而不是来自几种蛋白质的肽的级联，待定量的整个蛋白质以稳定的同位素标记形式表达。然后可将一种或几种PSAQ添加到样品的预消化物中以有助于定量。

特定实施方案使用无标记的策略进行蛋白质定量，如基于强度的测量(America和Cordewener,Proteomics 2008；8:731-749)或光谱计数(Lundgren等人ExpertRev.Proteomics 2010；7:39-53)。

为了获得给定肽的相对定量水平，可将一种生物样品中来自给定蛋白质的单个肽或多个肽的质谱分析得出的特征峰面积(或峰高，如果峰被充分解析)与使用相同SRM/MRM方法针对一种或多种另外且不同的生物样品中来自相同蛋白质的相同的一种或多种肽确定的特征峰面积进行比较。以此方式，在相同的实验条件下，相对于两种或更多种生物样品中来自相同蛋白质的相同的一种或多种肽，确定了来自给定蛋白质的特定的一种或多种肽的量。另外，相对定量可通过比较通过SRM/MRM方法得到的一种或多种给定肽的特征峰面积与来自在来自生物样品的相同蛋白质制剂内的不同蛋白质的一种或多种另外不同的肽的特征峰面积而对于来自在单一样品内的单一蛋白质的所述一种或多种给定肽来确定。以这种方式，相对于同一样品中的另一种蛋白质，确定了来自给定蛋白质的特定肽的量，并且因此确定了给定蛋白质的量。这些方法产生来自给定蛋白质的单个肽或多个肽的定量，以及样品之间和样品内来自相同蛋白质或来自不同蛋白质的另一种或多种肽的量，其中如由特征峰面积确定的量是相对于彼此而言，不管来自生物样品的蛋白质制剂中肽的绝对重量/体积或重量/重量的量。有关不同样品之间各个特征峰面积的相对定量数据可标准化为每种样品所分析的蛋白质的量。可在单个样品中同时跨多个肽和/或跨多个样品进行相对定量，以了解相对蛋白质的量。

特征肽水平可以浓度单位(例如，pmol/L)表示。在特定实施方案中，可将源自针对MPS I和/或庞贝病进行筛查的受试者的测试样品中的特征肽的平均浓度与正常对照样品中的相应肽的平均浓度进行比较。在特定实施方案中，正常对照样品可源自一个或多个正常对照受试者或源自正常对照受试者群体。在特定实施方案中，正常对照受试者包括未患有或未知患有MPS I和/或庞贝病的受试者。

在特定实施方案中，正常对照受试者包括不具有与MPS I或庞贝病相关的基因突变的受试者。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中IDUA 218特征肽的平均浓度包括在10pmol/L至350pmol/L的范围内、在15pmol/L至300pmol/L的范围内和在20pmol/L至250pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中IDUA218特征肽的平均浓度包括10pmol/L、15pmol/L、20pmol/L、25pmol/L、30pmol/L、35pmol/L、40pmol/L、45pmol/L、50pmol/L、55pmol/L、60pmol/L、65pmol/L、70pmol/L、75pmol/L、80pmol/L、85pmol/L、90pmol/L、95pmol/L、100pmol/L、110pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、140pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、170pmol/L、180pmol/L、190pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L、260pmol/L、270pmol/L、280pmol/L、290pmol/L、300pmol/L、310pmol/L、320pmol/L、330pmol/L、340pmol/L、350pmol/L或更高的浓度。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的PBMC中IDUA 218特征肽的平均浓度包括在300pmol/L至1000pmol/L的范围内、在350pmol/L至800pmol/L的范围内和在400pmol/L至700pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的PBMC中IDUA 218特征肽的平均浓度包括300pmol/L、310pmol/L、320pmol/L、330pmol/L、340pmol/L、350pmol/L、360pmol/L、370pmol/L、380pmol/L、390pmol/L、400pmol/L、410pmol/L、420pmol/L、430pmol/L、440pmol/L、450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、560pmol/L、570pmol/L、580pmol/L、590pmol/L、600pmol/L、610pmol/L、620pmol/L、630pmol/L、640pmol/L、650pmol/L、660pmol/L、670pmol/L、680pmol/L、690pmol/L、700pmol/L、710pmol/L、720pmol/L、730pmol/L、740pmol/L、750pmol/L、760pmol/L、770pmol/L、780pmol/L、790pmol/L、800pmol/L、810pmol/L、820pmol/L、830pmol/L、840pmol/L、850pmol/L、860pmol/L、870pmol/L、880pmol/L、890pmol/L、900pmol/L、910pmol/L、920pmol/L、930pmol/L、940pmol/L、950pmol/L、960pmol/L、970pmol/L、980pmol/L、990pmol/L、1000pmol/L或更高的浓度。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 218特征肽的平均浓度包括在100pmol/L至1000pmol/L的范围内、在100pmol/L至900pmol/L的范围内和在100pmol/L至800pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 218特征肽的平均浓度包括100pmol/L、125pmol/L、150pmol/L、175pmol/L、200pmol/L、225pmol/L、250pmol/L、275pmol/L、300pmol/L、325pmol/L、350pmol/L、375pmol/L、400pmol/L、425pmol/L、450pmol/L、475pmol/L、500pmol/L、525pmol/L、550pmol/L、575pmol/L、600pmol/L、625pmol/L、650pmol/L、675pmol/L、700pmol/L、725pmol/L、750pmol/L、775pmol/L、800pmol/L、825pmol/L、850pmol/L、875pmol/L、900pmol/L、925pmol/L、950pmol/L、975pmol/L、1000pmol/L或更高的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 218特征肽的平均浓度包括在30pmol/g蛋白质至85pmol/g蛋白质的范围内、在30pmol/g蛋白质至80pmol/g蛋白质的范围内和在30pmol/g蛋白质至70pmol/g蛋白质的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 218特征肽的平均浓度包括30pmol/g蛋白质、35pmol/g蛋白质、40pmol/g蛋白质、45pmol/g蛋白质、50pmol/g蛋白质、55pmol/g蛋白质、60pmol/g蛋白质、65pmol/g蛋白质、70pmol/g蛋白质、75pmol/g蛋白质、80pmol/g蛋白质、85pmol/g蛋白质或更高的浓度。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中IDUA 462特征肽的平均浓度包括在10pmol/L至250pmol/L的范围内、在10pmol/L至200pmol/L的范围内和在20pmol/L至150pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中IDUA462特征肽的平均浓度包括10pmol/L、15pmol/L、20pmol/L、25pmol/L、30pmol/L、35pmol/L、40pmol/L、45pmol/L、50pmol/L、55pmol/L、60pmol/L、65pmol/L、70pmol/L、75pmol/L、80pmol/L、85pmol/L、90pmol/L、95pmol/L、100pmol/L、110pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、140pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、170pmol/L、180pmol/L、190pmol/L、200pmol/L、210pmol/L、220pmol/L、230pmol/L、240pmol/L、250pmol/L或更高的浓度。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的PBMC中IDUA 462特征肽的平均浓度包括在350pmol/L至1000pmol/L的范围内、在400pmol/L至900pmol/L的范围内和在450pmol/L至850pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的PBMC中IDUA 462特征肽的平均浓度包括350pmol/L、360pmol/L、370pmol/L、380pmol/L、390pmol/L、400pmol/L、410pmol/L、420pmol/L、430pmol/L、440pmol/L、450pmol/L、460pmol/L、470pmol/L、480pmol/L、490pmol/L、500pmol/L、510pmol/L、520pmol/L、530pmol/L、540pmol/L、550pmol/L、560pmol/L、570pmol/L、580pmol/L、590pmol/L、600pmol/L、610pmol/L、620pmol/L、630pmol/L、640pmol/L、650pmol/L、660pmol/L、670pmol/L、680pmol/L、690pmol/L、700pmol/L、710pmol/L、720pmol/L、730pmol/L、740pmol/L、750pmol/L、760pmol/L、770pmol/L、780pmol/L、790pmol/L、800pmol/L、810pmol/L、820pmol/L、830pmol/L、840pmol/L、850pmol/L、860pmol/L、870pmol/L、880pmol/L、890pmol/L、900pmol/L、910pmol/L、920pmol/L、930pmol/L、940pmol/L、950pmol/L、960pmol/L、970pmol/L、980pmol/L、990pmol/L、1000pmol/L或更高的浓度。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 462特征肽的平均浓度包括在100pmol/L至1000pmol/L的范围内、在100pmol/L至900pmol/L的范围内和在150pmol/L至850pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 462特征肽的平均浓度包括100pmol/L、125pmol/L、150pmol/L、175pmol/L、200pmol/L、225pmol/L、250pmol/L、275pmol/L、300pmol/L、325pmol/L、350pmol/L、375pmol/L、400pmol/L、425pmol/L、450pmol/L、475pmol/L、500pmol/L、525pmol/L、550pmol/L、575pmol/L、600pmol/L、625pmol/L、650pmol/L、675pmol/L、700pmol/L、725pmol/L、750pmol/L、775pmol/L、800pmol/L、825pmol/L、850pmol/L、875pmol/L、900pmol/L、925pmol/L、950pmol/L、975pmol/L、1000pmol/L或更高的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA462特征肽的平均浓度包括在30pmol/g蛋白质至80pmol/g蛋白质的范围内、在30pmol/g蛋白质至75pmol/g蛋白质的范围内和在30pmol/g蛋白质至70pmol/g蛋白质的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的口腔拭子样品中IDUA 462特征肽的平均浓度包括30pmol/g蛋白质、35pmol/g蛋白质、40pmol/g蛋白质、45pmol/g蛋白质、50pmol/g蛋白质、55pmol/g蛋白质、60pmol/g蛋白质、65pmol/g蛋白质、70pmol/g蛋白质、75pmol/g蛋白质、80pmol/g蛋白质或更高的浓度。

在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中GAA 376特征肽的平均浓度包括在25pmol/L至200pmol/L的范围内、在30pmol/L至180pmol/L的范围内和在35pmol/L至160pmol/L的范围内的浓度。在特定实施方案中，来自正常对照受试者群体的DBS中GAA 376特征肽的平均浓度包括25pmol/L、30pmol/L、35pmol/L、40pmol/L、45pmol/L、50pmol/L、55pmol/L、60pmol/L、65pmol/L、70pmol/L、75pmol/L、80pmol/L、85pmol/L、90pmol/L、95pmol/L、100pmol/L、110pmol/L、120pmol/L、130pmol/L、140pmol/L、150pmol/L、160pmol/L、170pmol/L、180pmol/L、190pmol/L、200pmol/L或更高的浓度。

可通过相关领域中已知的任何方法来合成一种或多种标准肽。此类合成肽还可包含具有一种或多种天然修饰的氨基酸。此类天然修饰可包括谷氨酰胺和天冬酰胺的脱氨基、胺化、氧化和羟基化。

(IX)使用方法。本公开的方法包括鉴定患有MPS I和/或庞贝病的个体。在特定实施方案中，例如，作为NBS的一部分，或在个体的病症症状明显之前，早期诊断患有MPS I和/或庞贝病的个体。在特定实施方案中，本公开的方法包括鉴定患有严重形式的MPS I的个体。在特定实施方案中，本公开的方法包括鉴定患有减弱形式的MPS I的个体。在特定实施方案中，本公开的方法包括将患有严重形式的MPS I的个体与患有减弱形式的MPS I的个体区分开来。在特定实施方案中，本公开的方法包括鉴定患有婴儿期发作型庞贝病的个体。在特定实施方案中，本公开的方法包括鉴定患有迟发型庞贝病的个体。在特定实施方案中，本公开的方法包括将患有婴儿期发作型庞贝病的个体与患有迟发型庞贝病的个体区分开来。

本公开的方法包括获得DBS、口腔拭子、PBMC或WBC样品。在特定实施方案中，根据本文所述的方法获得DBS、口腔拭子、PBMC或WBC样品。在特定实施方案中，从储存DBS、口腔拭子、PBMC或WBC样品以供将来测试的DBS、口腔拭子、PBMC或WBC储库或实验室获得DBS、口腔拭子、PBMC或WBC样品。

本公开的方法包括用消化酶消化生物样品中的蛋白质。在特定实施方案中，生物样品包括DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC。在特定实施方案中，可在适当的缓冲液中溶解DBS的一个或多个冲孔、整个DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC，并且可添加本文所述的适当的消化酶以将存在于DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC中的蛋白质消化成肽片段。在特定实施方案中，可用50mM碳酸氢铵中的0.1％Triton X-100溶解DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC并用胰蛋白酶消化。

本公开的方法包括富集用于筛查MPS I和/或庞贝病的特征肽。特征肽包括：对于MPS I的IDUA 218；对于MPS I的IDUA 462；对于庞贝病的GAA 155；对于庞贝病的GAA 332；对于庞贝病的GAA 376；对于庞贝病的GAA 601；对于庞贝病的GAA 855；对于庞贝病的GAA882；和对于庞贝病的GAA 892。在特定实施方案中，富集特征肽包括使来自消化的生物样品的肽片段的混合物与识别所述特征肽的一种或多种结合实体接触。在特定实施方案中，生物样品包括DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC。在特定实施方案中，结合实体是抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述抗体包括表1A-1C和图12中公开的那些。在特定实施方案中，本公开的抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO:10-15、17、18、20、21、22-27、29、30、32、33、44-49、54-57、62-71、76-79和84-87。在特定实施方案中，本公开的抗体的编码序列包括SEQ ID NO:16、19、28、31、40-43、50-53、58-61、72-75和80-83。在特定实施方案中，所述抗体包括结合以下的抗体：IDUA 218、IDUA 462、GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA 882和GAA 892。在特定实施方案中，包含SEQ ID NO:10-15、17、18、20和21的抗体用于富集包含SEQ ID NO:1的IDUA肽。在特定实施方案中，包含SEQ ID NO:22-27、29、30、32和33的抗体用于富集包含SEQ ID NO:2的IDUA肽。在特定实施方案中，包含SEQ IDNO:44-49、54-57和62-65的抗体用于富集包含SEQ ID NO:3的GAA肽。在特定实施方案中，包含SEQ ID NO:66-71、76-79和84-87的抗体用于富集包含SEQ ID NO:5的GAA肽。

在特定实施方案中，抗体用于富集包含SEQ ID NO:4的GAA肽。在特定实施方案中，抗体用于富集包含SEQ ID NO:6的GAA肽。在特定实施方案中，抗体用于富集包含SEQ IDNO:7的GAA肽。在特定实施方案中，抗体用于富集包含SEQ ID NO:8的GAA肽。在特定实施方案中，抗体用于富集包含SEQ ID NO:9的GAA肽。

在特定实施方案中，表1A-1C和图12中公开的结合它们的同源特征肽的一种或多种抗体的任何组合可用于筛查MPS I。在特定实施方案中，表1A-1C和图12中公开的结合它们的同源特征肽的一种或多种抗体的任何组合可用于筛查MPS I群体。在特定实施方案中，表1A-1C和图12中公开的结合它们的同源特征肽的一种或多种抗体的任何组合可用于筛查庞贝病。在特定实施方案中，表1A-1C和图12中公开的结合它们的同源特征肽的一种或多种抗体的任何组合可用于筛查庞贝病群体。

本公开的方法包括在MS分析之前任选地对免疫亲和富集的肽进行液相色谱以使肽分离。液相色谱可基于肽的重量和对柱的流动相和固定相的亲和力来使肽分离。

本公开的方法包括对免疫亲和富集的肽进行SRM-MS或MRM-MS以定量给定特征肽的量。在特定实施方案中，如本文所述执行SRM-MS或MRM-MS。在特定实施方案中，特征肽的定量包括使用以已知量引入测定中的参考肽。在特定实施方案中，参考肽在各个方面可与特征肽相同，不同之处在于所述参考肽已经例如用一种或多种重同位素进行了差异标记，以将参考肽与特征肽区分开。

在特定实施方案中，SRM-MS或MRM-MS检测IDUA肽的减少或不存在。在特定实施方案中，IDUA肽包含SEQ ID NO:1。在特定实施方案中，IDUA肽包含SEQ ID NO:2。

在特定实施方案中，SRM-MS或MRM-MS检测GAA肽的减少或不存在。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:3。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:4。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:5。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:6。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:7。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:8。在特定实施方案中，GAA肽包含SEQ ID NO:9。

特定实施方案包括使用如本文所述的免疫-SRM在一段时间内监测受试者的特征肽水平。在特定实施方案中，根据本文公开的系统和方法选择受试者用于监测，因为所述受试者表现出如本文所述的MPS I和/或庞贝病的体征或症状或正在进行针对MPS I和/或庞贝病的治疗。

本文公开的特定实施方案包括确定治疗在正针对MPS I和/或庞贝病进行治疗的受试者中的功效，包括在一种或多种治疗之前以及在一种或多种治疗期间和/或之后获得源自所述受试者的生物样品；在所述治疗之前使用本文所述的免疫-SRM检测所述受试者中的特征肽水平；在所述一种或多种治疗期间或之后使用本文所述的免疫-SRM的检测所述受试者中的特征肽水平；并且如果在所述治疗期间或之后的特征肽水平高于在所述治疗之前的特征肽水平，则确定所述治疗有效，或者如果在所述治疗期间或之后的特征肽水平等于或低于在所述治疗之前的特征肽水平，则确定所述治疗无效。在特定实施方案中，生物样品包括DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC。

在特定实施方案中，确定治疗在正针对MPS I和/或庞贝病进行治疗的受试者中的功效可指导一种或多种治疗是否应该继续或停止，或者是否应该实施新的治疗。在特定实施方案中，如果在一种或多种治疗期间或之后受试者中的特征肽水平高于在所述一种或多种治疗之前所述受试者中的特征肽水平，则可继续一种或多种治疗。在特定实施方案中，如果在一种或多种治疗期间或之后受试者中的特征肽水平是在正常对照受试者或未受MPS I和/或庞贝病影响的对照受试者中测量的特征肽水平的大于1％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％或更多，则可停止所述一种或多种治疗。在特定实施方案中，如果在治疗期间或之后受试者中的特征肽水平等于或低于在所述治疗之前所述受试者中的特征肽水平或者如果特征肽不存在，则可实施新的治疗。

在特定实施方案中，特征肽水平的“稳定的”测量值是相对于同一受试者中的先前比较评估的测量值，并且表示自上次测量以来没有显著变化的特征肽水平(如通过本领域已知的统计测量，如t检验或p值，例如p值>0.05所确定)。在特定实施方案中，“稳定的”测量值是相对于同一患者的先前比较评估的测量值，并且表示自先前测量的集合或平均组(例如，最后3、4或5次测量)没有显著变化的特征肽水平(如通过本领域已知的统计测量，例如t检验或p值，例如p值>0.05所确定)。

特征肽水平的“未改变的”测量值是相对于同一患者的先前比较评估的测量值，并且表示未能在特定受试者中实现得分朝向或远离参考特征肽水平的统计学显著变化。在特定实施方案中，“未改变的”测量值是相对于同一患者的先前比较或自先前测量的集合或平均组(例如，最后3、4或5次测量)评估的测量值。

在溶酶体贮积病(LSD)的特定实施方案中，随着越来越多的婴儿通过NBS接受早期诊断，预测哪些患者可能对酶替代疗法(ERT)产生免疫应答的能力变得越来越重要。在特定实施方案中，输注的酶药物可被受试者识别为外来的，从而触发免疫应答。在特定实施方案中，产生免疫应答包括产生针对所提供的外源酶药物的中和抗药物抗体。在特定实施方案中，针对用于MPS I和/或庞贝病的ERT的免疫应答可通过定量生物样品中的ERT-初始酶浓度来预测。在特定实施方案中，生物样品包括DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC。在特定实施方案中，当IDUA 218和/或IDUA 462不存在时，发生针对用于MPS I的ERT的免疫应答。在特定实施方案中，当GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA 882、GAA 892或它们的组合不存在时，发生针对用于庞贝病的ERT的免疫应答。

当在受试者中预测或鉴定出针对用于MPS I和/或庞贝病的ERT的免疫应答时，可通知受试者或受试者的家庭，并且可实施预防或治疗免疫应答的计划。在特定实施方案中，用于治疗针对ERT的免疫应答的策略可包括预防ERT初始患者中抗药物抗体的形成和现有抗药物抗体的急性减少。在特定实施方案中，在ERT初始患者中预防抗药物抗体形成可包括B细胞耗减、免疫抑制、mTOR(雷帕霉素的机械靶标)抑制和/或免疫调节。在特定实施方案中，在ERT初始患者中预防抗药物抗体形成可包括在ERT开始之前或在ERT期间施用甲氨蝶呤(MTX)、利妥昔单抗和/或静脉内免疫球蛋白(IVIG)。在特定实施方案中，现有抗药物抗体的急性减少可包括抑制叶酸代谢(阻断从头DNA合成)、DNA烷基化(阻断DNA复制)、抗体介导的特异性B细胞耗减、B细胞/浆细胞耗减和/或免疫抑制蛋白酶体抑制。在特定实施方案中，现有抗药物抗体的急性减少可包括施用吗替麦考酚酯、MTX、IVIG、利妥昔单抗、硼替佐米、环磷酰胺和/或血浆置换。

在特定实施方案中，所公开的测定和方法允许减少由LSD中的假性缺陷病例引起的测定中的假阳性结果的数量。在特定实施方案中，所公开的测定和方法允许增加筛查LSD的阳性预测率(即，阳性预测值)。在特定实施方案中，所述方法允许使用所公开的免疫-SRM测定作为一级或二级测定以减少在LSD筛查中获得的假阳性的数量。在特定实施方案中，所公开的测定和方法将酶假性缺陷病例与确认的LSD病例区分开来，因为所公开的测定和方法可测量酶假性缺陷病例和确认的LSD病例之间的特征肽浓度差异。在特定实施方案中，当正在筛查疾病的受试者的测定结果为阳性(即，表明受试者患有疾病)、但受试者为健康时，出现假阳性结果。在特定实施方案中，健康受试者不表现出疾病症状或表现出非常少的疾病症状。在特定实施方案中，健康受试者不需要治疗疾病。在特定实施方案中，阳性预测率(即，阳性预测值)是指具有阳性筛查试验的受试者真正患有疾病的概率。在特定实施方案中，具有假性缺陷等位基因的患者显示出酶活性大大降低，但他们是健康的。在特定实施方案中，与正常对照相比，具有LSD假性酶缺陷的患者显示出降低的酶活性，并且显示出与确认患有LSD的患者(“真阳性”患者)相似的酶活性。在特定实施方案中，通过针对与LSD相关的基因的相同或不同致病性变体的两个拷贝的存在对受试者进行分子遗传学测试来确认受试者患有LSD。在特定实施方案中，通过分子遗传学测试确认受试者具有LSD假性缺陷。分子遗传学测试可包括可检测基因中的突变、缺失和/或插入的测定，包括测序、荧光原位杂交、单核苷酸多态性微阵列和聚合酶链式反应(PCR)。

如图7A和7B所示，免疫-SRM测定允许区分具有LSD假性缺陷等位基因的受试者与患有LSD的受试者。在特定实施方案中，当受试者具有与LSD相关的基因的相同或不同致病性变体的两个拷贝时，受试者患有LSD。在特定实施方案中，患有LSD的受试者被认为是“真阳性”。在特定实施方案中，当测量的特征肽浓度低于所述测量的特征肽的预定阈值浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为LSD真阳性。如本文所述，可从来自正常对照受试者群体的相应生物样品中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差计算预定阈值浓度。在特定实施方案中，当测量的特征肽浓度低于所述特征肽的检测下限(LOD)浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为LSD真阳性。在特定实施方案中，具有LSD假性缺陷的受试者具有高于对LSD为真阳性或确认患有LSD的受试者的相应平均特征肽浓度的测量的特征肽浓度。在特定实施方案中，具有LSD假性缺陷的受试者具有在来自正常对照受试者群体的相应特征肽浓度范围内的测量的特征肽浓度。本公开的特征肽的LOD包括可使用免疫-SRM测定可靠地检测到的特征肽的最低浓度。在特定实施方案中，特征肽的LOD包括可在统计学上区别于不包括特征肽的阴性对照样品的特征肽的最低浓度。计算LOD是本领域技术人员已知的。例如，不包括特征肽的阴性对照样品可在免疫-SRM测定中测定20次，并计算结果的平均值和标准偏差。在特定实施方案中，LOD被认为是高于阴性对照的平均值2个标准偏差或3个标准偏差。

在特定实施方案中，IDUA 218特征肽的LOD包括10pmol/L或更低、9pmol/L或更低、8pmol/L或更低、7pmol/L或更低、6pmol/L或更低、5pmol/L或更低、4pmol/L或更低、3pmol/L或更低、2pmol/L或更低、1pmol/L或更低、或更低。在特定实施方案中，IDUA 218特征肽的LOD包括3.5pmol/L或更低。

在特定实施方案中，IDUA 462特征肽的LOD包括10pmol/L或更低、9pmol/L或更低、8pmol/L或更低、7pmol/L或更低、6pmol/L或更低、5pmol/L或更低、4pmol/L或更低、3pmol/L或更低、2pmol/L或更低、1pmol/L或更低、或更低。在特定实施方案中，IDUA 462肽的LOD包括2.1pmol/L或更低。

在特定实施方案中，GAA 155特征肽的LOD包括10pmol/L或更低、9pmol/L或更低、8pmol/L或更低、7pmol/L或更低、6pmol/L或更低、5pmol/L或更低、4pmol/L或更低、3pmol/L或更低、2pmol/L或更低、1pmol/L或更低、或更低。

在特定实施方案中，GAA 376特征肽的LOD包括10pmol/L或更低、9pmol/L或更低、8pmol/L或更低、7pmol/L或更低、6pmol/L或更低、5pmol/L或更低、4pmol/L或更低、3pmol/L或更低、2pmol/L或更低、1pmol/L或更低、或更低。

在特定实施方案中，当测量的IDUA 218、IDUA 462或它们的组合的特征肽浓度低于相应特征肽的预定阈值浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有MPS I(即受试者对MPS I为真阳性)。如本文所述，可从来自正常对照受试者群体的相应生物样品中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差计算预定阈值浓度。在特定实施方案中，当测量的IDUA 218、IDUA 462或它们的组合的特征肽浓度低于相应特征肽的LOD浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有MPS I(即受试者对MPS I为真阳性)。在特定实施方案中，具有MPS I假性缺陷的受试者具有高于来自被确认患有MPS I或对MPS I为真阳性的受试者或受试者群体的样品的相应平均IDUA肽浓度的测量的IDUA 218、IDUA 462或它们的组合的特征肽浓度。在特定实施方案中，具有MPS I假性缺陷的受试者具有在来自正常对照受试者群体的相应IDUA肽浓度范围内的测量的IDUA 218、IDUA 462或它们的组合的特征肽浓度。在特定实施方案中，通过针对IDUA基因的相同或不同致病性变体的两个拷贝的存在对受试者进行分子遗传学测试来确认受试者患有MPS I。在特定实施方案中，通过分子遗传学测试确认受试者具有MPS I的假性缺陷等位基因。在特定实施方案中，正常对照受试者不表现出MPS I症状或表现出非常少MPS I的症状。在特定实施方案中，正常对照受试者不患有MPS I。

在特定实施方案中，当测量的GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA882、GAA 892或它们的组合的特征肽浓度低于相应特征肽的预定阈值浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有庞贝病(即受试者对庞贝病为真阳性)。如本文所述，可从来自正常对照受试者群体的相应生物样品中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差计算预定阈值浓度。在特定实施方案中，当测量的GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA882、GAA 892或它们的组合的特征肽浓度低于相应特征肽的LOD浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有庞贝病(即受试者对庞贝病为真阳性)。在特定实施方案中，具有庞贝病假性缺陷的受试者具有高于来自被确认患有庞贝病或对庞贝病为真阳性的受试者或受试者群体的样品的相应平均GAA肽浓度的测量的GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA855、GAA 882、GAA 892或它们的组合的特征肽浓度。在特定实施方案中，具有庞贝病假性缺陷的受试者具有在来自正常对照受试者群体的相应GAA肽浓度范围内的测量的GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA 882、GAA 892或它们的组合的特征肽浓度。在特定实施方案中，通过针对GAA基因的相同或不同致病性变体的两个拷贝的存在对受试者进行分子遗传学测试来确认受试者患有庞贝病。在特定实施方案中，通过分子遗传学测试确认受试者具有庞贝病的假性缺陷等位基因。在特定实施方案中，正常对照受试者不表现出庞贝病症状或表现出非常少的庞贝病症状。在特定实施方案中，正常对照受试者不患有庞贝病。

在特定实施方案中，所公开的测定和方法将患有严重形式的MPS I的个体与患有减弱形式的MPS I的个体区分开来。在特定实施方案中，当IDUA 218和/或IDUA 462的肽浓度低于来自源自健康受试者群体的对照样品的相应平均IDUA肽浓度并且高于来自被确认患有严重形式的MPS I的受试者或受试者群体的样品的相应平均IDUA肽浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有减弱形式的MPS I。在特定实施方案中，当IDUA 218和/或IDUA462的肽浓度低于来自健康受试者群体的对照样品的相应平均IDUA肽浓度且低于来自被确认患有减弱形式的MPS I的受试者或受试者群体的样品的相应平均IDUA肽浓度，或不存在时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有严重形式的MPS I。在特定实施方案中，通过临床和实验室发现来确认受试者患有减弱或严重形式的MPS I，所述临床和实验室发现包括：MPS I症状的观察结构和/或测量值；患者和家族史；IDUA酶活性水平的测量值；糖胺聚糖水平的测量值；和/或分子遗传学检测以鉴定IDUA基因变体。在特定实施方案中，如在免疫-SRM测定中所测量，IDUA 218和/或IDUA 462肽存在于来自患有减弱MPS I的受试者的生物样品中，并且在来自患有严重MPS I的受试者的相应生物样品中不存在。在特定实施方案中，健康受试者不表现出MPS I症状或表现出非常少的MPS I症状。在特定实施方案中，健康受试者不患有MPS I。在特定实施方案中，生物样品包括来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC。

在特定实施方案中，所公开的测定和方法将患有婴儿期发作型庞贝病(PD)的个体与患有迟发型PD的个体区分开来。在特定实施方案中，当GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA601、GAA 855、GAA 882、GAA 892肽或它们的组合的肽浓度低于来自源自健康受试者群体的对照样品的相应平均GAA肽浓度且高于来自被确认患有婴儿期发作型PD的受试者或受试者群体的样品的相应平均GAA肽浓度时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有迟发型PD。在特定实施方案中，当GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA 882、GAA 892肽或它们的组合的肽浓度低于来自源自健康受试者群体的对照样品的相应平均GAA肽浓度且低于来自被确认患有迟发型PD的受试者群体的样品的相应平均GAA肽浓度，或不存在时，通过免疫-SRM测定将受试者鉴定为患有婴儿期发作型PD。在特定实施方案中，通过临床和实验室发现来确认受试者患有婴儿期发作型PD或迟发型PD，所述临床和实验室发现包括：测量PD症状的测试如睡眠研究、肺功能测试、肌肉功能测试(例如，磁图像共振)、心脏功能测试(例如，胸部x光片、心电图、超声心动图)；患者和家族史；GAA酶活性水平的测量值；和/或分子遗传学测试以鉴定GAA基因变体。在特定实施方案中，如在免疫-SRM测定中所测量，GAA155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA 882和/或GAA 892肽存在于来自患有迟发型PD的受试者的生物样品中，并且来自患有婴儿期发作型PD的受试者的相应生物样品中不存在。在特定实施方案中，健康受试者不表现出PD症状或表现出非常少的PD症状。在特定实施方案中，健康受试者不患有PD。在特定实施方案中，生物样品包括来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC。

在特定实施方案中，本公开的抗体也可用于补充临床测试中，以诊断生化结果不明确的那些患者以及携带来自遗传测试的意义未知的变体(VUS)的患者的MPS I和/或庞贝病。在特定实施方案中，在编码本文公开的MPS I的IDUA和/或庞贝病的GAA的基因中具有VUS的受试者可用本公开的免疫-SRM测定进行测试以确定所述VUS是否影响这些受试者中的相应特征肽水平。

在特定实施方案中，预定的截断值用作给定特征肽的阈值。给定特征肽的浓度高于阈值表明所测定的生物样品(例如，DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC)来自未罹患MPS I或庞贝病的个体。给定特征肽的浓度低于阈值或不存在表明所测定的生物样品(例如，DBS、来自口腔拭子的细胞、PBMC或WBC)来自罹患MPS I或庞贝病的个体。在特定实施方案中，可通过分析正常对照群体和计算此群体中给定特征肽的浓度的标准偏差(SD)来确定阈值。可根据给定特征肽的平均浓度将阈值设置为某个SD。在特定实施方案中，阈值是从给定特征肽的平均浓度-1SD、-1.1SD、-1.2SD、-1.3SD、-1.4SD、-1.5SD、-1.6SD、-1.7SD、-1.8SD、-1.9SD、-2.0SD、-2.1SD、-2.2SD、-2.3SD、-2.4SD、-2.5SD、-2.6SD、-2.7SD、-2.8SD、-2.9SD、-3.0SD或更高SD。在特定实施方案中，为了诊断或筛查MPS I或庞贝病，可通过分析正常对照群体并计算此群体中给定特征肽的浓度与内源性ATP7B浓度之比的标准偏差(SD)来确定阈值。可将每种LSD的肽浓度截断值设置为源自每种特征肽的平均浓度或给定特征肽的浓度与内源性ATP7B浓度之比的某个SD。

在特定实施方案中，本公开的特征肽的阈值浓度包括从正常对照群体中相应特征肽的平均浓度-1.0SD、-1.25SD、-1.3SD、-1.35SD、-1.4SD、-1.45SD、-1.5SD、-1.55SD、-1.6SD、-1.65SD、-1.7SD、-1.75SD、-1.8SD、-1.85SD、-1.9SD、-1.95SD、-2.0SD、-2.25SD、-2.3SD、-2.35SD、-2.4SD、-2.45SD、-2.5SD、-2.55SD、-2.6SD、-2.65SD、-2.7SD、-2.75SD、-2.8SD、-2.85SD、-2.9SD、-2.95SD、-3.0SD或更多。

在特定实施方案中，DBS中IDUA 218肽的阈值浓度包括35pmol/L或更低、34pmol/L或更低、33pmol/L或更低、32pmol/L或更低、31pmol/L或更低、30pmol/L或更低、29pmol/L或更低、28pmol/L或更低、27pmol/L或更低、26pmol/L或更低、25pmol/L或更低、24pmol/L或更低、23pmol/L或更低、22pmol/L或更低、21pmol/L或更低、20pmol/L或更低、19.5pmol/L或更低、19pmol/L或更低、18.5pmol/L或更低、18pmol/L或更低、17.5pmol/L或更低、17pmol/L或更低、16.5pmol/L或更低、16pmol/L或更低、15.5pmol/L或更低、15pmol/L或更低、14.5pmol/L或更低、14pmol/L或更低、13.5pmol/L或更低、13pmol/L或更低、12.5pmol/L或更低、12pmol/L或更低、11.5pmol/L或更低、11pmol/L或更低、10.5pmol/L或更低、10pmol/L或更低。

在特定实施方案中，DBS中IDUA 462肽的阈值浓度包括25pmol/L或更低、24pmol/L或更低、23pmol/L或更低、22pmol/L或更低、21pmol/L或更低、20pmol/L或更低、19.5pmol/L或更低、19pmol/L或更低、18.5pmol/L或更低、18pmol/L或更低、17.5pmol/L或更低、17pmol/L或更低、16.5pmol/L或更低、16pmol/L或更低、15.5pmol/L或更低、15pmol/L或更低、14.5pmol/L或更低、14pmol/L或更低、13.5pmol/L或更低、13pmol/L或更低、12.5pmol/L或更低、12pmol/L或更低、11.5pmol/L或更低、11pmol/L或更低、10.5pmol/L或更低、10pmol/L或更低、9.5pmol/L或更低、9pmol/L或更低、8.5pmol/L或更低、8pmol/L或更低、7.5pmol/L或更低、7pmol/L或更低、6.5pmol/L或更低、6pmol/L或更低、5.5pmol/L或更低、5pmol/L或更低。

在特定实施方案中，DBS中GAA 376肽的阈值浓度包括30pmol/L或更低、29pmol/L或更低、28pmol/L或更低、27pmol/L或更低、26pmol/L或更低、25pmol/L或更低、24pmol/L或更低、23pmol/L或更低、22pmol/L或更低、21pmol/L或更低、20pmol/L或更低、19.5pmol/L或更低、19pmol/L或更低、18.5pmol/L或更低、18pmol/L或更低、17.5pmol/L或更低、17pmol/L或更低、16.5pmol/L或更低、16pmol/L或更低、15.5pmol/L或更低、15pmol/L或更低、14.5pmol/L或更低、14pmol/L或更低、13.5pmol/L或更低、13pmol/L或更低、12.5pmol/L或更低、12pmol/L或更低、11.5pmol/L或更低、11pmol/L或更低、10.5pmol/L或更低、10pmol/L或更低、9.5pmol/L或更低、9pmol/L或更低、8.5pmol/L或更低、8pmol/L或更低、7.5pmol/L或更低、7pmol/L或更低、6.5pmol/L或更低、6pmol/L或更低、5.5pmol/L或更低、5pmol/L或更低。

在特定实施方案中，特征肽可被认为是用于诊断或筛查给定疾病的主要生物标志物。主要特征肽可包括首先用于诊断或筛查给定疾病的肽。在特定实施方案中，主要标志物可从相应蛋白质的消化中可再现地获得，具有用于免疫亲和富集的高亲和力抗体，和/或可在独立的液相色谱柱和/或质谱仪器上再现。在特定实施方案中，特征肽可被认为是用于诊断或筛查给定疾病的次要标志物。次要特征肽可包括第二用于确认具有主要标志物的给定疾病的诊断或筛查的肽。在特定实施方案中，IDUA肽可用作筛查患有MPS I的受试者的主要生物标志物。在特定实施方案中，IDUA肽可用作确认受试者患有MPS I的次要生物标志物。在特定实施方案中，GAA肽可用作筛查患有庞贝病的受试者的主要生物标志物。在特定实施方案中，GAA肽可用作确认受试者患有庞贝病的次要生物标志物。

本文公开的方法包括基于用本文公开的组合物和方法筛查MPS I和/或庞贝病的结果来治疗受试者(例如人)。治疗受试者包括递送治疗有效量。治疗有效量包括提供有效量、防治性治疗和/或治疗性治疗的那些。

“有效量”是引起受试者的所需生理变化所必需的组合物的量。例如，对于MPS I和/或庞贝病，有效量可提供症状减轻、症状消除或治愈。通常施用有效量用于研究目的。本文公开的有效量可在动物模型或体外测定中引起与评估疾病的发生、进展和/或消退有关的统计学显著效果。

特定实施方案可包括作为“防治性治疗”施用组合物。防治性治疗包括施用至不展示MPS I和/或庞贝病的体征或症状或仅展示MPS I和/或庞贝病的早期体征或症状的受试者，以使得施用治疗是为了减轻所述病症或降低发展所述病症的风险。因此，防治性治疗用作针对MPS I和/或庞贝病的预防性治疗。

在特定实施方案中，防治性治疗可预防MPS I和/或庞贝病，延迟或减少MPS I和/或庞贝病的发作。在特定实施方案中，防治性治疗可预防MPS I和/或庞贝病，或降低与MPSI和/或庞贝病相关的症状或并发症的严重程度。

MPS I的症状和并发症包括体重减轻、充血、反复呕吐、返流和/或皮疹。庞贝病的症状和并发症包括肌肉无力、肝脏肿大、发育迟缓、呼吸困难、喂养问题、呼吸道感染和/或听力问题。

“治疗性治疗”包括施用至展示MPS I和/或庞贝病的症状或体征的受试者的治疗，并且施用至受试者是为了减轻或消除MPS I和/或庞贝病的那些体征或症状。在特定实施方案中，治疗性治疗可减少罹患MPS I的受试者的细胞中的溶酶体糖胺聚糖。在特定实施方案中，治疗性治疗可减少罹患庞贝病的受试者的细胞中的溶酶体糖原。在特定实施方案中，治疗性治疗可减轻、控制或消除MPS I和/或庞贝病的症状和并发症，如上述那些。

防治性治疗和治疗性治疗不必相互排斥，并且在特定实施方案中，所施用的剂量可达成多于一种治疗类型。在特定实施方案中，治疗方法包括用于MPS I和/或庞贝病的酶疗法。

在特定实施方案中，治疗有效量防止糖胺聚糖在被诊断患有MPS I的受试者的细胞的溶酶体中累积。在特定实施方案中，治疗方法包括提供用于MPS I的拉罗尼酶。在特定实施方案中，提供拉罗尼酶减轻或消除如上所述的MPS I症状。

在特定实施方案中，治疗有效量防止糖原在被诊断患有庞贝病的受试者的细胞的溶酶体中累积。在特定实施方案中，治疗方法包括提供用于庞贝病的阿葡糖苷酶α酶。在特定实施方案中，提供阿葡糖苷酶α减轻或消除如上所述的庞贝病的症状。

在特定实施方案中，治疗性组合物的施用可伴随单独佐剂的施用。佐剂的实例包括明矾、膨润土、胶乳和丙烯酸颗粒；不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂；基于铝的盐，如氢氧化铝；基于钙的盐；二氧化硅或任何TLR生物配体；Sigma佐剂系统(SAS)；和Ribi佐剂。

对于施用，可基于体外测定和/或动物模型研究的结果初始估计治疗有效量(本文中也称为剂量)。此类信息可用于更准确地确定目标受试者的可用剂量。施用至特定受试者的实际剂量的量可由医师、兽医或研究人员在考虑诸如包括受试者的目标、体重、疾患的严重程度、先前或同时的治疗干预、特发性疾病在内的身体和生理因素以及施用途径的参数的情况下确定。

细胞的治疗有效量可在10⁴4个细胞/kg至10⁹个细胞/kg的范围内。在特定实施方案中，细胞的治疗有效量可包括10⁴个细胞/kg、10⁵个细胞/kg、10⁶个细胞/kg、10⁷个细胞/kg、10⁸个细胞/kg、10⁹个细胞/kg或更高。

有用的剂量可在0.1至5μg/kg或0.5至1μg/kg的范围内。在特定实施方案中，剂量可包括1μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、70μg/kg、90μg/kg、150μg/kg、350μg/kg、500μg/kg、750μg/kg、1000μg/kg、0.1至5mg/kg或0.5至1mg/kg。在特定实施方案中，剂量可包括1mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg、100mg/kg或更高。

治疗有效量可通过在治疗方案的过程期间(例如每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年)施用单个或多个剂量来实现。

(X)试剂盒。还提供了用于测试先天性病症的试剂盒。试剂盒可包括用于取血的刺血针、用于收集血滴的过滤卡、用于收集脸颊上皮细胞的口腔拭子、用于收集血液的管、用于溶解DBS或细胞的溶液以及用于消化DBS或细胞中的标志物蛋白的适当缓冲液和酶。试剂盒还可包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包括抗肽结合剂(例如，抗体)和/或试剂或用品，以评估IDUA和/或GAA的缺乏或减少。在特定实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，所述一个或多个容器包括以下抗肽抗体：抗IDUA 218、抗IDUA 462、抗GAA 155、抗GAA332、抗GAA 376、抗GAA 601、抗GAA 855、抗GAA 882和抗GAA 892。在特定实施方案中，抗IDUA 218抗体包含SEQ ID NO:10-21、40和41。在特定实施方案中，抗IDUA 462抗体包含SEQID NO:22-33、42和43。在特定实施方案中，抗GAA 155抗体包含SEQ ID NO:44-65。在特定实施方案中，抗GAA 376抗体包含SEQ ID NO:66-87。可将抗体固定在固相载体如柱或珠粒上。试剂盒还可包括用于从抗体释放肽的洗脱缓冲液。在特定实施方案中，试剂盒可包括一种或多种标记的参考肽以对特征肽进行绝对定量。在特定实施方案中，试剂盒还可包括有效使用试剂盒所需的一些或全部必要的实验室和/或医疗用品，如纱布、无菌粘合带、手套、管等。可改变本文所述的任何试剂盒的内容物。

试剂盒的部件可准备好储存和以后使用。与此类一个或多个容器相伴的可为由管制试剂盒的制造、使用或销售的政府机构开具的呈表格形式的报告书，所述报告书反映由制造、使用或销售的机构核准(在需要时)。

任选地，试剂盒还包括在方法中使用试剂盒的说明。在各种实施方案中，说明书可包括适当的说明以解释与使用试剂盒相关的结果；相关废物的适当处置；等等。说明书可采用试剂盒内提供的印刷说明书的形式，或者可将说明书印刷在试剂盒本身的一部分上。说明书可呈页、小册子、手册、CD-ROM或计算机可读装置的形式，或者可在诸如网站的远程位置提供说明书的指导。

包括以下示例性实施方案和实施例以说明本公开的特定实施方案。鉴于本公开，本领域普通技术人员应认识到，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可对本文所公开的特定实施方案作出许多改变并且仍获得相似或类似结果。

(XI)示例性实施方案。

1.一种检测生物样品中I型粘多糖贮积症(MPS I)和/或庞贝病的一种或多种特征肽的方法，所述方法包括：

获得来自受试者的所述生物样品；

用酶消化来自所述生物样品的蛋白质以产生肽混合物；

从所述肽混合物内富集以下特征肽：

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:1的MPS I的第一IDUA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第一IDUA特征肽并且包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ ID NO:11的CDRH2和SEQ ID NO:12的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13的CDRL1、SEQ ID NO:14的CDRL2和SEQ ID NO:15的CDRL3；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:2的第二IDUA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第二IDUA特征肽并且包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:22的CDRH1、SEQ ID NO:23的CDRH2和SEQ ID NO:24的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ ID NO:26的CDRL2和SEQ ID NO:27的CDRL3；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:3的庞贝病的第一GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第一GAA特征肽并且包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:44的CDRH1、SEQ ID NO:45的CDRH2和SEQ ID NO:46的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:47的CDRL1、SEQ ID NO:48的CDRL2和SEQ ID NO:49的CDRL3；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:4的庞贝病的第二GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第二GAA特征肽；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:5的庞贝病的第三GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第三GAA特征肽并且包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ ID NO:68的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ ID NO:70的CDRL2和SEQ ID NO:71的CDRL3；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:6的庞贝病的第四GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第四GAA特征肽；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:7的庞贝病的第五GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第五GAA特征肽；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:8的庞贝病的第六GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第六GAA特征肽；和/或

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:9的庞贝病的第七GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第七GAA特征肽；

并且

对所述富集的肽进行液相色谱-多反应监测质谱(LC-MRM-MS)以确定每种特征肽的浓度，从而检测所述生物样品中MPS I和/或庞贝病的一种或多种特征肽。

2.如实施方案1所述的方法，其中所述方法作为新生儿筛查(NBS)的一部分进行，所述新生儿筛查另外筛查所述受试者的苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病中的一种或多种。

3.如实施方案1或2所述的方法，其中所述方法在所述受试者中不存在庞贝病和/或MPS I的临床症状的情况下进行。

4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品是干血斑(DBS)、口腔拭子、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞(WBC)。

5.如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述酶是胰蛋白酶。

6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，所述方法还包括：

将每种特征肽的浓度与相应的预定阈值浓度进行比较；并且

在以下情况诊断所述受试者：

当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或者当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽不存在时，诊断所述受试者患有MPS I；和/或

当所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度或者当所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽不存在时，诊断所述受试者患有庞贝病。

7.如实施方案6所述的方法，其中从来自正常对照受试者群体的相应生物样品中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差来计算每种特征肽的预定阈值浓度。

8.如实施方案7所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在10pmol/L至350pmol/L范围内的浓度。

9.如实施方案6-8中任一项所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且SEQ IDNO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的预定阈值浓度包括35pmol/L或更低。

10.如实施方案7所述的方法，其中所述生物样品是PBMC，并且来自正常对照受试者群体的PBMC中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在300pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

11.如实施方案7所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在100pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

12.如实施方案7所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在30pmol/g至85pmol/g范围内的浓度。

13.如实施方案7-9中任一项所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在10pmol/L至250pmol/L范围内的浓度。

14.如实施方案6-9和13中任一项所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且SEQID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的预定阈值浓度包括25pmol/L或更低。

15.如实施方案7或10所述的方法，其中所述生物样品是PBMC，并且来自正常对照受试者群体的PBMC中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在350pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

16.如实施方案7、11和12中任一项所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在100pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

17.如实施方案7、11、12和13中任一项所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在30pmol/g至80pmol/g范围内的浓度。

18.如实施方案6-9、13和14中任一项所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中SEQ ID NO:5的庞贝病的所述第三GAA特征肽的平均浓度包括在25pmol/L至250pmol/L范围内的浓度。

19.如实施方案6-9、13、14和18中任一项所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且SEQ ID NO:5的庞贝病的所述第三GAA特征肽的预定阈值浓度包括30pmol/L或更低。

20.如实施方案1-19中任一项所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:1的所述第一IDUA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:18的VH结构域和/或SEQ ID NO:21的VL结构域。

21.如实施方案1-20中任一项所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:2的所述第二IDUA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:30的VH结构域和/或SEQ ID NO:33的VL结构域。

22.如实施方案1-21中任一项所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:3的所述第一GAA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含以下中的一者或多者：SEQ ID NO:57的VH结构域；SEQ ID NO:65的VL结构域；SEQ ID NO:55的重链；或SEQ ID NO:63的轻链。

23.如实施方案1-22中任一项所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:5的所述第三GAA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含以下中的一者或多者：SEQ ID NO:79的VH结构域；SEQ ID NO:87的VL结构域；SEQ ID NO:77的重链；或SEQ ID NO:85的轻链。

24.如实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述受试者正在经历针对MPS I和/或庞贝病的一种或多种治疗，并且在所述一种或多种治疗之前获得所述生物样品，并且所述方法还包括

重复所述获得、消化、富集，并在所述一种或多种治疗期间或之后对源自所述受试者的第二生物样品进行；

并且

在以下情况确定所述一种或多种治疗有效：

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的浓度高于在所述一种或多种治疗之前所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的相应肽浓度时，确定所述一种或多种治疗对MPS I有效；和/或

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的浓度高于在所述一种或多种治疗之前所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的相应肽浓度时，确定所述一种或多种治疗对庞贝病有效，

或者

在以下情况确定所述一种或多种治疗无效：

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的浓度等于或低于在所述一种或多种治疗之前所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的相应肽浓度或者当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽不存在时，确定所述一种或多种治疗对MPS I无效；和/或

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的浓度等于或低于在所述一种或多种治疗之前所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的相应肽浓度时或者当所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽不存在时，确定所述一种或多种治疗对庞贝病无效。

25.如实施方案1-24中任一项所述的方法，所述方法还包括：

在以下情况预测所述受试者将对酶替代疗法(ERT)产生免疫应答：

当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的浓度不存在时，预测所述受试者将对用于MPS I的酶替代疗法(ERT)产生免疫应答；和/或

当所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的浓度不存在时，预测所述受试者将对用于庞贝病的酶替代疗法(ERT)产生免疫应答。

26.如实施方案25所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤(MTX)、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、利妥昔单抗、硼替佐米、环磷酰胺和/或血浆置换，以减少或预防所述免疫应答。

27.如实施方案25或26所述的方法，其中所述免疫应答包括产生针对ERT中的酶的中和抗药物抗体。

28.一种用于筛查受试者中的I型粘多糖贮积症(MPS I)和/或庞贝病的测定，所述测定包括：

(i)结合SEQ ID NO:1的MPS I的IDUA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ IDNO:11的CDRH2和SEQ ID NO:12的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13的CDRL1、SEQ ID NO:14的CDRL2和SEQ ID NO:15的CDRL3；

结合SEQ ID NO:2的MPS I的IDUA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:22的CDRH1、SEQ ID NO:23的CDRH2和SEQ ID NO:24的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ ID NO:26的CDRL2和SEQ ID NO:27的CDRL3；

结合SEQ ID NO:3的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:44的CDRH1、SEQ ID NO:45的CDRH2和SEQ ID NO:46的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:47的CDRL1、SEQ ID NO:48的CDRL2和SEQ ID NO:49的CDRL3；和/或

结合SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ ID NO:68的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ ID NO:70的CDRL2和SEQ ID NO:71的CDRL3；

和/或

(ii)结合SEQ ID NO:4的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段；

结合SEQ ID NO:6的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段；

结合SEQ ID NO:7的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段；

结合SEQ ID NO:8的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段；和/或

结合SEQ ID NO:9的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段；

和/或

(iii)参考特征肽，所述参考特征肽包括：

SEQ ID NO:1的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:2的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:3的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:4的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:6的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:7的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:8的庞贝病的GAA特征肽；和/或

SEQ ID NO:9的庞贝病的GAA特征肽。

29.如实施方案28所述的测定，其中所述参考特征肽是同位素标记的。

30.如实施方案28或29所述的测定，其中所述抗体或其抗原结合片段连接至磁珠。

31.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ ID NO:11的CDRH2和SEQ IDNO:12的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13的CDRL1、SEQ ID NO:14的CDRL2和SEQ ID NO:15的CDRL3。

32.如实施方案31所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域在SEQ IDNO:18中列出，并且所述VL结构域在SEQ ID NO:21中列出。

33.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:22的CDRH1、SEQ ID NO:23的CDRH2和SEQ IDNO:24的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ ID NO:26的CDRL2和SEQ ID NO:27的CDRL3。

34.如实施方案33所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域在SEQ IDNO:30中列出，并且所述VL结构域在SEQ ID NO:33中列出。

35.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:44的CDRH1、SEQ ID NO:45的CDRH2和SEQ IDNO:46的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:47的CDRL1、SEQ ID NO:48的CDRL2和SEQ ID NO:49的CDRL3。

36.如实施方案35所述的抗体或其抗原结合片段，其中

所述VH结构域在SEQ ID NO:57中列出，和/或所述重链在SEQ ID NO:55中列出；并且

所述VL结构域在SEQ ID NO:65中列出，和/或所述轻链在SEQ ID NO:63中列出。

37.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ IDNO:68的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ ID NO:70的CDRL2和SEQ ID NO:71的CDRL3。

38.如实施方案37所述的抗体或其抗原结合片段，其中

所述VH结构域在SEQ ID NO:79中列出，和/或所述重链在SEQ ID NO:77中列出；并且

所述VL结构域在SEQ ID NO:87中列出，和/或所述轻链在SEQ ID NO:85中列出。

39.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

和/或

(iii)参考特征肽，所述参考特征肽包括：

SEQ ID NO:1的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:2的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:3的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:4的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:6的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:7的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:8的庞贝病的GAA特征肽；和/或

SEQ ID NO:9的庞贝病的GAA特征肽。

40.如实施方案39所述的试剂盒，所述试剂盒还包括滤纸卡、冲孔工具、口腔拭子、血液收集管、消化酶、消化缓冲液、所述抗体或其抗原结合片段的固体载体以及洗脱缓冲液中的一种或多种。

41.如实施方案39或40所述的试剂盒，其中所述参考特征肽是同位素标记的。

42.如实施方案39-41中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段连接至磁珠。

(XII)实验性实施例。

实施例1.本研究证明了使用DBS作为生物样品，两种IDUA特征肽生物标志物及其相关抗体对于使用免疫-SRM方法筛查MPS I患者的有效性。本研究还证明了使用相关抗体在市售PBMC中检测到两种IDUA特征肽生物标志物。

材料和方法。标准免疫-SRM方案用于此研究。简言之，对于每个样品获得一个1/4英寸DBS冲孔，并将其放入96孔板(96孔

聚丙烯，0.5ml，Greiner)上的指定孔中。向每个孔中添加200μL的50mM碳酸氢铵缓冲液中的0.1％triton和6μL的0.2M二硫苏糖醇(DTT)，并在37℃烘箱(杂交烘箱，Illumina)中提取DBS持续半小时。提取后，向每个孔中添加37.5μL胰蛋白酶(在50mM乙酸中1μg/μL)(TPCK处理的胰蛋白酶，Worthington，LS003742)以在37℃烘箱中消化2小时。然后，向消化后的每个样品添加适量的内部标准物(IS)和10μL的Tris缓冲液(pH 8.0)，并在1000rpm下充分混合2分钟。

然后将200μL消化溶液转移至新的孔中，留下蛋白质保存纸(来自DBS)。将用于每种靶向肽的适量单克隆抗体(mAb)包被的磁珠(Dynabeads-蛋白G磁珠，Invitrogen，目录号10004D)添加至溶液中，并将混合物以1000rpm在4℃下静置过夜。第二天，使用磁性板架用250μL的0.1X PBS+0.01％CHAPS洗涤mAb-珠-肽复合物两次。第二次洗涤后，将30μL的于水中的5％乙酸+3％ACN添加至mAb-珠-肽复合物中进行肽洗脱，并在1000rpm下静置5分钟。然后，在磁板架上分离洗脱液和珠。将洗脱液转移至不同的96孔板并以3000rpm离心2分钟。将来自每孔的15μL透明洗脱液转移至新孔中，使用LC-MS/MS进行数据分析。将剩余的洗脱液储存在-20℃作为备用。

分离的肽混合物的LC-MS/MS在具有Ionkey源和双M-级梯度泵和负载色谱泵(Milford,MA)的Waters Xevo TQ-XS上进行。色谱溶剂是A：H₂O+0.1％FA和B：ACN+0.1％FA。作为初始步骤，使用98:2A:B的恒定流以20μL/min将肽负载到M-级阱对称性C18柱(300μM x25mm，100A，5uM)上持续三分钟。负载后，使流动反向。将肽从捕获柱中洗脱出来，并使用150μM x 100mm BEH C18 ionkey(130A，1.7μM)进行分离。在Q1和Q3四极杆中以单位分辨率获得SRM跃迁。选择每种肽的前体和片段质量以产生最高强度跃迁。调整前体质量、片段质量和碰撞能量以优化所生成的信号。

特征肽生物标志物IDUA 218和IDUA 462被开发用于监测DBS中的艾杜糖醛酸酶(IDUA)水平以筛查I型粘多糖贮积症(MPS I)患者。使用标准免疫-SRM方案，在测定中使用分别针对IDUA 218和IDUA 462的1μg和4μg抗体来捕获内源性肽和1.25fmol的IS。所述研究包括11名MPS I患者(2名患者患有减弱形式，其中一名患者提供ERT前和ERT后样品；4名患者患有严重形式，其中一名患者提供ERT前、ERT后和骨髓移植后(BMT)样品；3名患者患有未知形式的MPS I；以及2名BMT后患者)。无论疾病严重程度如何，所有治疗前患者都表现出极低水平的IDUA，而正常对照和治疗后患者的IDUA水平在正常范围内(图3A-3D)。IDUA肽生物标志物可用于诊断和/或预测MPS I。

如图4A和4B所示，通过将不同量的IS掺入DBS基质中，构建了两种IDUA肽生物标志物的线性曲线。图中的虚线显示了在正常群组中定量的最低肽量，对于IDUA 218和IDUA462分别为0.64fmol(29.43pmol/L)和0.30fmol(13.77pmol/L)。表2总结正常范围、试验性截断值、检测下限(LOD)、定量下限(LOQ)、日内和日间变异系数(CV)以及IDUA肽对于IDUA免疫-SRM方法的相对稳定性。通过在5个不同的日子进行5个重复测定获得日内和日间测定CV。日内CV评估同一天内来自相同样品的5次测定的结果的一致性，而日间CV评估来自不同5天的测定的结果的一致性。如表2中所总结，IDUA分析的所有CV均低于15％。通过在不同温度(包括-20℃、室温(RT)和37℃)下储存DBS在两周过程内评估DBS样品中IDUA肽的相对稳定性。通过比较在RT和37℃下储存的DBS与在-20℃下储存的DBS的IDUA浓度来计算相对稳定性。总之，这些数据表明用于IDUA分析的免疫-SRM方法可以高度定量的方式进行。

表2.用于IDUA肽免疫-SRM方法的分析灵敏值。

LOD：检测下限；LOQ：定量下限；CV：变异系数；RT：室温

如图3B和3D所示，尽管大多数MPS I患者显示IDUA水平不存在，即IDUA浓度低于两种IDUA肽的LOD，但一名患有减弱MPS I的患者显示IDUA浓度略有升高(高于两种IDUA肽的LOD)。对于具有更浓缩蛋白质的生物样品，如白细胞、PBMC或口腔拭子，预期免疫-SRM方法应允许对这两个患者群体之间的蛋白质浓度差异进行更细致的调查。

如图5A和5B所示，在500μL商业PBMC样品(500μg蛋白质/mL)情况下，当与对照DBS样品相比时，存在两种IDUA肽生物标志物的检测肽浓度的8-12倍增加。

实施例2.本研究证明，通过免疫-SRM方法，使用如实施例1中所述的相关抗体在来自口腔拭子的细胞中检测到两种IDUA特征肽生物标志物。

口腔拭子样品。控制机构审查委员会批准了口腔拭子样品的方案，并且所有受试者都签署了书面知情同意书。正常对照口腔拭子样品从商业供应商处获得。所有口腔拭子样品在实验室中在-20℃或-80℃下储存。盲法样品用由发送者提供的ID标记，并且鉴定且同意的患者样品在收到后获得实验室ID。剥离袋中的尼龙植绒干拭子(Nylo n FlockedDry Swabs in Peel Pouches)Copan Diagnostics 502CS01购自Fisher Scientific(Chicago,IL；目录号23-600-951)。2-mL低温储存小瓶(Internal Thread)获自FisherScientific(Chicago,IL；目录号12-567-501)。口腔拭子样品收集遵循以下中描述的方案：CHLA.(2016年，4月4日)。口腔拭子收集程序。CHLA-Clinical Pathology；(2016年，7月27日)。口腔DNA收集说明。Pathway Genomics；(2017年，12月14日)。口腔拭子样品收集说明。Otogenetics；PDXL PDX L.(2017年，11月28日)。口腔拭子收集程序–PersonalizedDx Labs[视频].YouTube。在万维网上在youtube/3ftvHkfM71o？t＝146；和Centers of DiseaseControl and Prevention(CDC).(2020年，7月8日)用于收集、处理和测试Covid-19的临床试样的临时指南。在万维网上在cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/guidelines-clinical-specimens.html。如上文针对DBS所述，将含有细胞的口腔拭子的尖端夹入试管中用于溶解和消化。

如图6A和6B所示，假设唾液体积相似，与DBS样品相比，使用口腔拭子收集的上皮细胞产生了两种IDUA肽生物标志物的肽浓度的2.9-18.2倍增加。

实施例3.本研究证明，免疫-SRM方法是区分MPS I的假性缺陷病例与确诊MPS I患者的可行选择。

根据实施例1中论述的标准免疫-SRM方案进行实验。图7A和7B示出4例MPS I假性缺陷病例的IDUA 218和IDUA 462的肽浓度。存在假性缺陷IDUA浓度的广泛范围。然而，即使假性缺陷病例的最低IDUA浓度(对于IDUA 218和IDUA 462分别为8.63pmol/L和3.82pmol/L)仍高于确诊MPS I患者的最高IDUA浓度(对于IDUA 218和IDUA 462分别为6.76pmol/L和2.32pmol/L)。本研究表明，免疫-SRM可用作MPS I的NBS的一级或二级测试，以降低来自假性缺陷病例的假阳性率。将进行使用免疫-SRM作为主要筛查方法的未来大型群组试点研究，以测试与筛查MPS I和庞贝病的目前方法相比更高的假阳性率。

实施例4.本研究证明，开发针对GAA肽的单克隆抗体是可行的。

抗体产生如下进行：i)在兔免疫之前用N末端半胱氨酸合成肽并与佐剂蛋白缀合；ii)收集来自免疫兔的血清样品，并将血清中的抗体用于通过免疫-SRM进行的肽捕获试验，用于兔选择；iii)在2至3次免疫加强(对兔进行多次免疫)后，选择最佳兔，并且通过细胞分选分离其浆细胞并培养以提供抗体；iv)如实施例1中所述进行免疫-SRM以验证浆细胞正在产生针对预期靶标的可行抗体。克隆和表达cDNA以产生最终单克隆抗体。

为了开发针对GAA 332和GAA 855的单克隆抗体，免疫兔血清样品中的抗体用于捕获纯化的GAA 332和GAA 855肽以及来自DBS样品的内源性GAA 332和GAA 855肽，如图8A和8B所示。此数据表明免疫兔可产生针对GAA 332和GAA 855肽的相应抗体。含有抗体的上清液用于PBMC的免疫-SRM测定。如图9所示，在从PBMC样品(500μL商业PBMC样品(500μg蛋白质/mL))捕获肽后，GAA 855的上清液中的抗体能够产生强信号。本研究表明，兔可产生抗GAA肽抗体。

为了开发针对GAA 155和GAA 376的单克隆抗体，免疫兔血清样品中的抗体用于捕获纯化的GAA 155和GAA 376肽、来自DBS样品的内源性GAA 155和GAA 376肽以及来自口腔拭子样品的内源性GAA 155和GAA 376肽，如图10A和10B所示。如实施例1和2中所述，获得DBS和口腔拭子样品并从所述样品制备肽用于免疫-SRM。此数据表明免疫兔可产生针对GAA155和GAA 376肽的相应抗体。含有抗体的上清液用于口腔拭子的免疫-SRM测定。如图10A和10B所示，上清液中GAA 155和GAA 376的抗体能够在口腔拭子中产生比DBS高2-100倍的分析响应。本研究表明，兔可从DBS和口腔拭子中产生用于富集的抗GAA肽抗体。

实施例5.根据如实施例1中论述的DBS样品的标准免疫-SRM方案进行实验。如图11所示，本研究证明，免疫-SRM方法是区分庞贝患者与酸性α-葡萄糖苷酶假性缺陷的可行选择。在真阳性庞贝患者中，GAA肽显著减少或不存在。在来自DBS的婴儿发作型与晚发型庞贝病患者之间存在GAA浓度的细微差异。对于具有更浓缩蛋白质的生物样品，如白细胞、PBMC或口腔拭子，预期免疫-SRM方法将允许对这两个患者群体之间的蛋白质浓度差异进行更细致的调查。没有GAA的那些患者可能与CRIM阴性状态相符，并且最终可能需要免疫调节以在ERT之前减少阻断抗体。

如图11所示，本研究证明，免疫-SRM方法是区分假性缺陷病例与确诊庞贝患者的可行选择。因此，免疫-SRM可用作庞贝病的NBS的一级或二级测试，以降低来自假性缺陷病例的假阳性率。

预测实施例1。用于诊断庞贝病(PD)的GAA特征肽的免疫-SRM测定。

外周血单核细胞(PBMC)和白细胞(WBC)。PBMC和WBC可通过本领域已知的方案来收集，如在Kerfoot等人,Proteomics Clin Appl,2012.6(7-8):394-402；Grievink等人(2016)Biopreserv Biobank 14(5):410-415；Corkum等人(2015)BMC Immunol.16:48；Jia等人(2018)Biopreserv Biobank 16(2):82-91；Boyum(1968)Scand.J.Clin.Lab Invest.增刊97:77；Boyum(1977)Lymphology 10(2):71-76；Morgensen和Cantrell(1977)PharmTherap.1:369-383；Beeton和Chandy(2007)J Vis Exp.(8):326；Brocks等人(2006)Invivo 20(2):239；Faguet和Agee(1993)J Imm Meth 165(2):217；Brousso等人(1997)Immunol Let 59(2):85；以及Dagur和McCoy(2015)Curr Protoc Cytom.73:5.1.1-5.1.16中描述的方案。可溶解分离的PBMC或WBC，并且来自细胞的蛋白质可如上文针对DBS所述进行消化。

来自患有PD的患者或来自疑似患有PD的患者的DBS、口腔拭子样品、PBMC或WBC(如本文所述)连同来自正常对照的相应样品将使用如本文所述的GAA 155、GAA 332、GAA 376、GAA 601、GAA 855、GAA 882、GAA 892特征肽或它们的组合通过免疫-SRM进行分析。免疫-SRM诊断将与临床诊断进行比较。如果可用，将获得每位患者的GAA基因的遗传信息和治疗信息。免疫-SRM测定可与特征肽多重复用以测试MPS I(IDUA 218和/或IDUA 462)。这些研究将显示利用本文所述的抗体的免疫-SRM测定可用于检测生物样品(包括DBS、口腔拭子样品、PBMC或WBC)中所公开的GAA和/或IDUA特征肽，并根据检测到的特征肽水平诊断受试者是否患有庞贝病和/或MPS I。此外，所述研究将表明庞贝病和/或MPS I的假性缺陷病例可与庞贝病和/或MPS I的真实病例区分开来，从而降低诊断这些LSD的假阳性率。

(XIII)结束段落。本文所公开的每个实施方案可包括以下项、基本上由或由以下项组成：其特别陈述的要素、步骤、成分或组分。因此，术语“包括(include)”或“包括(including)”应理解为叙述：“包含/包括(comprise)、由...组成(consist of)或基本上由...组成(consist essentially of)”。过渡术语“包含/包括(comprise)”或“包含/包括(comprises)”意指包括但不限于，并且允许包括未指定的要素、步骤、成分或组分，即使在较大的量时也是如此。过渡短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制为指定的要素、步骤、成分或组分以及并不实质地影响所述实施方案的那些。实质性影响将导致利用DBS、从口腔拭子获得的细胞、PBMC或WBC、本文公开的抗体和免疫-SRM来可靠地诊断MPS I和/或庞贝病的能力的统计学上显著的降低。

除非另外指示，否则说明书和权利要求书中所用的表示成分的量、性质如分子量、反应条件等的所有数字应当理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中所陈述的数值参数都是近似值，所述值可根据本发明要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度，并且不试图将等效物原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数均应当至少根据报告的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。当要求进一步清楚时，术语“约”当与陈述的数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理地归于它的含义，即将稍微大于或稍微小于陈述值或范围表示为在以下范围内：陈述值的±20％；陈述值±19％；陈述值±18％；陈述值±17％；陈述值±16％；陈述值±15％；陈述值±14％；陈述值±13％；陈述值±12％；陈述值±11％；陈述值±10％；陈述值±9％；陈述值±8％；陈述值±7％；陈述值±6％；陈述值±5％；陈述值±4％；陈述值±3％；陈述值±2％；或陈述值±1％。

尽管陈述本发明的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所陈述的数值尽可能准确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。

除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一个/种”、“所述”以及类似的指代语应解读为涵盖单数和复数指代语。本文中列举数值的范围仅意在作为一种单个地提及落在所述范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另外指示，否则每个单个数值都并入到本说明书中，如同其在本文中被单个地列举一样。除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地说明本发明，而不会对原本要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解读为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。

本文所公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解读为是限制性的。每个组的成员可单个地提及和要求保护，或以与所述组的其它成员或本文中出现的其它要素的任何组合形式提及和要求保护。可预见，出于简便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可包括于所述组内，或从所述组中删除。当出现任何这种包括或删除时，本说明书被认为含有所修改的组，因此满足所附权利要求中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。

本文描述了本发明的某些实施方案，包括为本发明人所知用于实施本发明的最佳模式。当然，本领域技术人员在阅读前面的描述后将会明了这些所描述实施方案的变化形式。本发明人预期本领域的熟练技术人员会适时采用此类变化形式，而且本发明人意图本发明能以除了本文具体描述的方式之外的其它方式来实施。因此，本发明包括在适用法律允许的所附的权利要求中列举的主题的所有修改形式和等效形式。此外，除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则呈所有可能变化形式的上述要素的任何组合都涵盖在本发明内。

此外，在整个说明书中，已经大量参考了专利、印刷的出版物、期刊文章和其他书面文本(本文的参考材料)。每一参考材料关于它们的参考教义单个地以引用的方式整体并入本文。

应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可采用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，例如但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代性配置。因而，本发明不限于明确示出和描述的实施方案。

本文示出的细节是作为实例并且仅出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且之所以呈现所述细节，是为了提供认为是本发明的各个实施方案的原理和概念方面的最有用和易理解的描述的内容。就此而言，除对于本发明的基本理解所必需的之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，借助于附图和/或实施例所作的描述使得本领域技术人员明了如何可以在实践中体现本发明的若干形式。

除非在以下实施例中明确并毫无疑问地修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义，否则在本公开中使用的定义和解释意指并且旨在控制任何未来构建。在术语的构建将使它无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(Webster's Dictionary)第3版或本领域普通技术人员已知的字典诸如生物化学和分子生物学牛津字典(Attwood T等人编辑，Oxford University Press,Oxford,2006)中取得。

序列表

<110> 西雅图儿童医院以西雅图儿童研究机构名义经营(Seattle Children'sHospital d/b/a Seattle Children's Research Institute)

<120> 用于溶酶体贮积病的蛋白质组学筛查

<130> S281-0014PCT/SCRI.253WO1

<150> US 63/002,992

<151> 2020-03-31

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Leu Gly Gly Pro Gly Asp Ser Phe His Thr Pro Pro Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Gly Val Pro Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro

1 5 10 15

Lys

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 218 VH CDR1

<400> 10

Arg Tyr Trp Met His

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 218 VH CDR2

<400> 11

Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 218 VH CDR3

<400> 12

Ala Met Asp Tyr

1

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 218 VL CDR1

<400> 13

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 218 VL CDR2

<400> 14

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 218 VL CDR3

<400> 15

Trp Gln Gly Leu His Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 16

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 218可变重结构域编码序列

<400> 16

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ttacagatgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg gactgagctt gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagg tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca atggtgggac taactacaat 240

gagaagttca agaacaaggc cacactgaat gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacgtt agctatggac 360

tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca 396

<210> 17

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 218可变重结构域氨基酸序列

<400> 17

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Val Thr Asp

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 218可变重结构域氨基酸序列

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 19

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 218可变轻结构域编码序列

<400> 19

atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac caacggtgat 60

gttgtgatga cccagactcc actcactttg tcggttacca ttggacaacc agcctccatc 120

tcttgcaagt caagtcagag cctcttacat agtgatggaa agacatattt gaattggtcg 180

ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa actggactct 240

ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 300

agagtggagg ctgaggattt gggagtttat tattgctggc aaggtttaca ttttccgtgg 360

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393

<210> 20

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 218可变轻结构域氨基酸序列

<400> 20

Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu

1 5 10 15

Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val

20 25 30

Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Ser Leu Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Trp Gln Gly Leu His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 218可变轻结构域氨基酸序列

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Ser Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Leu His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 462 VH CDR1

<400> 22

Asp Thr Tyr Met His

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 462 VH CDR2

<400> 23

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 462 VH CDR3

<400> 24

Thr Ala Arg Ala Pro Phe Ala Tyr

1 5

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 462 VL CDR1

<400> 25

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 462 VL CDR2

<400> 26

Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗IDUA 462 VL CDR3

<400> 27

Gln Gln Val Val Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 28

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 462可变重结构域编码序列

<400> 28

atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60

gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120

tgcacagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatgc actgggtgaa ccagaggcct 180

gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaatac taaatatggc 240

ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgccca gacagctcgg 360

gccccgtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 408

<210> 29

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 462可变重结构域氨基酸序列

<400> 29

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Gly

65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Gln Thr Ala Arg Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 462可变重结构域氨基酸序列

<400> 30

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Gly Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Ala Arg Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 31

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 462可变轻结构域编码序列

<400> 31

atgaggtgct ctcttcagtt cttggggatg cttatgttct ggatctctgg agtcagtggg 60

gatattgtga taacccagga tgaagtctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 120

atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 180

tttctgcaga ggccaggaca gtctcctcag ctcctggtct attggatgtc cacccgtgca 240

tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actgaaaatc 300

agtagagtga aggctgagga tgtcggtatg tattactgtc aacaagttgt agagtatcca 360

ttcacgttcg gcacggggac aaaattggaa ataaaa 396

<210> 32

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗IDUA 462可变轻结构域氨基酸序列

<400> 32

Met Arg Cys Ser Leu Gln Phe Leu Gly Met Leu Met Phe Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Val Ser Gly Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Val Ser Asn Pro

20 25 30

Val Thr Ser Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Met Tyr Tyr

100 105 110

Cys Gln Gln Val Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 462可变轻结构域氨基酸序列

<400> 33

Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Val Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Val Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Val

85 90 95

Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 34

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 35

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 36

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 37

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 38

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 39

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Gly-Ser接头

<400> 39

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 40

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 218可变重结构域编码序列

<400> 40

caggtccaac tgcagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aggtactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtgg gactaactac 180

aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg aatgttgaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac gttagctatg 300

gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctca 339

<210> 41

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 218可变轻结构域编码序列

<400> 41

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

tcgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggttt acattttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 42

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 462可变重结构域编码序列

<400> 42

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaaccagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180

ggcccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc ccagacagct 300

cgggccccgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗IDUA 462可变轻结构域编码序列

<400> 43

gatattgtga taacccagga tgaagtctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 60

atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 120

tttctgcaga ggccaggaca gtctcctcag ctcctggtct attggatgtc cacccgtgca 180

tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac actgaaaatc 240

agtagagtga aggctgagga tgtcggtatg tattactgtc aacaagttgt agagtatcca 300

ttcacgttcg gcacggggac aaaattggaa ataaaa 336

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 155 VH CDR1

<400> 44

Ser Tyr Val Met Ser

1 5

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 155 VH CDR2

<400> 45

Val Ile Ser Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 155 VH CDR3

<400> 46

Gly Phe Ser Gly Asp Asn Tyr Val

1 5

<210> 47

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 155 VL CDR1

<400> 47

Gln Ser Ser Gln Asn Val His Ser Asn Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 155 VL CDR2

<400> 48

Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 155 VL CDR3

<400> 49

Ala Gly Asp Tyr Thr Thr Asn Ile Tyr Val

1 5 10

<210> 50

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-H1)重链编码序列

<400> 50

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagcctctg gattctccct caatagttat gtaatgagtt gggtccgcca ggctccaggg 180

gaggggctgg aatggatcgg ggtcattagt actggtggta tcacatacta cgcgaactgg 240

gcaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 300

ccgagaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag gatttagtgg tgataattac 360

gtctggggcc caggcaccct ggtcaccgtc tccttcgggc aacctaaggc tccatcagtc 420

ttcccactgg ccccctgctg cggggacaca cccagctcca cggtgaccct gggctgcctg 480

gtcaaaggct acctcccgga gccagtgacc gtgacctgga actcgggcac cctcaccaat 540

ggggtacgca ccttcccgtc cgtccggcag tcctcaggcc tctactcgct gagcagcgtg 600

gtgagcgtga cctcaagcag ccagcccgtc acctgcaacg tggcccaccc agccaccaac 660

accaaagtgg acaagaccgt tgcgccctcg acatgcagca agcccatgtg cccaccccct 720

gaactcctgg ggggaccgtc tgtcttcatc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780

atctcacgca cccccgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccagga tgaccccgag 840

gtgcagttca catggtacat aaacaacgag caggtgcgca ccgcccggcc gccgctacgg 900

gagcagcagt tcaacagcac gatccgcgtg gtcagcaccc tccccatcgc gcaccaggac 960

tggctgaggg gcaaggagtt caagtgcaaa gtccacaaca aggcactccc ggcccccatc 1020

gagaaaacca tctccaaagc cagagggcag cccctggagc cgaaggtcta caccatgggc 1080

cctccccggg aggagctgag cagcaggtcg gtcagcctga cctgcatgat caacggcttc 1140

tacccttccg acatctcggt ggagtgggag aagaacggga aggcagagga caactacaag 1200

accacgccgg ccgtgctgga cagcgacggc tcctacttcc tctacagcaa gctctcagtg 1260

cccacgagtg agtggcagcg gggcgacgtc ttcacctgct ccgtgatgca cgaggccttg 1320

cacaaccact acacgcagaa gtccatctcc cgctctccgg gtaaatga 1368

<210> 51

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-H1)重链编码序列

<400> 51

cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60

tgcacagcct ctggattctc cctcaatagt tatgtaatga gttgggtccg ccaggctcca 120

ggggaggggc tggaatggat cggggtcatt agtactggtg gtatcacata ctacgcgaac 180

tgggcaaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 240

agtccgagaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggatttag tggtgataat 300

tacgtctggg gcccaggcac cctggtcacc gtctccttcg ggcaacctaa ggctccatca 360

gtcttcccac tggccccctg ctgcggggac acacccagct ccacggtgac cctgggctgc 420

ctggtcaaag gctacctccc ggagccagtg accgtgacct ggaactcggg caccctcacc 480

aatggggtac gcaccttccc gtccgtccgg cagtcctcag gcctctactc gctgagcagc 540

gtggtgagcg tgacctcaag cagccagccc gtcacctgca acgtggccca cccagccacc 600

aacaccaaag tggacaagac cgttgcgccc tcgacatgca gcaagcccat gtgcccaccc 660

cctgaactcc tggggggacc gtctgtcttc atcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 720

atgatctcac gcacccccga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca ggatgacccc 780

gaggtgcagt tcacatggta cataaacaac gagcaggtgc gcaccgcccg gccgccgcta 840

cgggagcagc agttcaacag cacgatccgc gtggtcagca ccctccccat cgcgcaccag 900

gactggctga ggggcaagga gttcaagtgc aaagtccaca acaaggcact cccggccccc 960

atcgagaaaa ccatctccaa agccagaggg cagcccctgg agccgaaggt ctacaccatg 1020

ggccctcccc gggaggagct gagcagcagg tcggtcagcc tgacctgcat gatcaacggc 1080

ttctaccctt ccgacatctc ggtggagtgg gagaagaacg ggaaggcaga ggacaactac 1140

aagaccacgc cggccgtgct ggacagcgac ggctcctact tcctctacag caagctctca 1200

gtgcccacga gtgagtggca gcggggcgac gtcttcacct gctccgtgat gcacgaggcc 1260

ttgcacaacc actacacgca gaagtccatc tcccgctctc cgggtaaatg a 1311

<210> 52

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-H1)可变重结构域编码序列

<400> 52

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120

acagcctctg gattctccct caatagttat gtaatgagtt gggtccgcca ggctccaggg 180

gaggggctgg aatggatcgg ggtcattagt actggtggta tcacatacta cgcgaactgg 240

gcaaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 300

ccgagaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag gatttagtgg tgataattac 360

gtctggggcc caggcaccct ggtcaccgtc tccttc 396

<210> 53

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-H1)可变重结构域编码序列

<400> 53

cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60

tgcacagcct ctggattctc cctcaatagt tatgtaatga gttgggtccg ccaggctcca 120

ggggaggggc tggaatggat cggggtcatt agtactggtg gtatcacata ctacgcgaac 180

tgggcaaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 240

agtccgagaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggatttag tggtgataat 300

tacgtctggg gcccaggcac cctggtcacc gtctccttc 339

<210> 54

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155重链氨基酸序列

<400> 54

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn

35 40 45

Ser Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Ile Thr Ser Pro Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Gly Phe Ser Gly Asp Asn Tyr Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Phe Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

130 135 140

Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu

145 150 155 160

Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly

165 170 175

Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser

180 185 190

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln

195 200 205

Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp

210 215 220

Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn

275 280 285

Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu

340 345 350

Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser

355 360 365

Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 55

<211> 436

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155重链氨基酸序列

<400> 55

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Val

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Ser Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Phe

85 90 95

Ser Gly Asp Asn Tyr Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Phe Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys

115 120 125

Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

130 135 140

Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr

145 150 155 160

Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr

180 185 190

Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu

210 215 220

Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

225 230 235 240

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

245 250 255

Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln

260 265 270

Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr

275 280 285

Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg

290 295 300

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

305 310 315 320

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys

325 330 335

Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val

340 345 350

Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val

355 360 365

Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

370 375 380

Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser

385 390 395 400

Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val

405 410 415

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg

420 425 430

Ser Pro Gly Lys

435

<210> 56

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155可变重结构域氨基酸序列

<400> 56

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn

35 40 45

Ser Tyr Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Ile Thr Ser Pro Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Gly Phe Ser Gly Asp Asn Tyr Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Phe

130

<210> 57

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155可变重结构域氨基酸序列

<400> 57

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Tyr Val

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Ser Thr Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Phe

85 90 95

Ser Gly Asp Asn Tyr Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Phe

<210> 58

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-K3)轻链编码序列

<400> 58

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccatcttcca cgtctgcggc tgtgggaggc 120

acagtcacca tcaactgcca gtccagtcag aatgttcata gtaacaacta cttatcctgg 180

tttcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atctggcttc cactctggca 240

tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggctctggga cagagttcac tctcaccatc 300

agcgacctgg agtgtgatga tgctgccact tactactgtg caggcgatta tactactaat 360

atttatgttt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaag gtgatccagt tgcacctact 420

gtcctcatct tcccaccagc tgctgatcag gtggcaactg gaacagtcac catcgtgtgt 480

gtggcgaata aatactttcc cgatgtcacc gtcacctggg aggtggatgg caccacccaa 540

acaactggca tcgagaacag taaaacaccg cagaattctg cagattgtac ctacaacctc 600

agcagcactc tgacactgac cagcacacag tacaacagcc acaaagagta cacctgcaag 660

gtgacccagg gcacgacctc agtcgtccag agcttcaata ggggtgactg ttag 714

<210> 59

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-K3)轻链编码序列

<400> 59

gctgacattg tgatgaccca gactccatct tccacgtctg cggctgtggg aggcacagtc 60

accatcaact gccagtccag tcagaatgtt catagtaaca actacttatc ctggtttcag 120

cagaaaccag ggcagcctcc caagctcctg atctatctgg cttccactct ggcatctggg 180

gtcccatcgc ggttcaaagg cagtggctct gggacagagt tcactctcac catcagcgac 240

ctggagtgtg atgatgctgc cacttactac tgtgcaggcg attatactac taatatttat 300

gttttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 360

atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 420

aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 480

ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 540

actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 600

cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttag 648

<210> 60

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-K3)可变轻结构域编码序列

<400> 60

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccatcttcca cgtctgcggc tgtgggaggc 120

acagtcacca tcaactgcca gtccagtcag aatgttcata gtaacaacta cttatcctgg 180

tttcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atctggcttc cactctggca 240

tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggctctggga cagagttcac tctcaccatc 300

agcgacctgg agtgtgatga tgctgccact tactactgtg caggcgatta tactactaat 360

atttatgttt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaa 399

<210> 61

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155 (克隆pEB0613A-3B2-K3)可变轻结构域编码序列

<400> 61

gctgacattg tgatgaccca gactccatct tccacgtctg cggctgtggg aggcacagtc 60

accatcaact gccagtccag tcagaatgtt catagtaaca actacttatc ctggtttcag 120

cagaaaccag ggcagcctcc caagctcctg atctatctgg cttccactct ggcatctggg 180

gtcccatcgc ggttcaaagg cagtggctct gggacagagt tcactctcac catcagcgac 240

ctggagtgtg atgatgctgc cacttactac tgtgcaggcg attatactac taatatttat 300

gttttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaa 333

<210> 62

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155轻链氨基酸序列

<400> 62

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser

35 40 45

Ser Gln Asn Val His Ser Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ala Gly Asp Tyr Thr Thr Asn Ile Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys

145 150 155 160

Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp

165 170 175

Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn

180 185 190

Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser

195 200 205

Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly

210 215 220

Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 63

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155轻链氨基酸序列

<400> 63

Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ala Ala Val

1 5 10 15

Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Asn Val His Ser

20 25 30

Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp

65 70 75 80

Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Thr

85 90 95

Thr Asn Ile Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly

100 105 110

Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln

115 120 125

Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe

130 135 140

Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr

145 150 155 160

Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr

165 170 175

Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His

180 185 190

Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

210 215

<210> 64

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 155可变轻结构域氨基酸序列

<400> 64

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser

35 40 45

Ser Gln Asn Val His Ser Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ala Gly Asp Tyr Thr Thr Asn Ile Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Glu Val Val Val Lys

130

<210> 65

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 155可变轻结构域氨基酸序列

<400> 65

Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ala Ala Val

1 5 10 15

Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Asn Val His Ser

20 25 30

Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp

65 70 75 80

Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Thr

85 90 95

Thr Asn Ile Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 376 VH CDR1

<400> 66

Ser Val Asp Met Ser

1 5

<210> 67

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 376 VH CDR2

<400> 67

Phe Ser Asn Ala Tyr His Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ser Lys Ser

1 5 10 15

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 376 VH CDR3

<400> 68

Gly Val Pro Gly Tyr Val Thr Lys Ser Ser Leu

1 5 10

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 376 VL CDR1

<400> 69

Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser

1 5 10

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 376 VL CDR2

<400> 70

Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗GAA 376 VL CDR3

<400> 71

Ala Gly Tyr Ser Ser Gly Val Ile Asp Val Ser Ala

1 5 10

<210> 72

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-H2)重链编码序列

<400> 72

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

gagcacctgg tggagtccgg gggaggcctg gtcaaccctg gaggatccct gacactcacc 120

tgcacagcct ctggattctc cctcaacagc gtcgacatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtggat cggattcagt aatgcttatc ataggacata ctacgcgagc 240

tggtcgaaaa gccgatccac catcaccaga aacaccaacg agaacacggt gactctgaaa 300

atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgagagg tgttcctggt 360

tatgttacta aaagtagtct ctggggccca ggcaccctgg tcaccgtctc ctcagggcaa 420

cctaaggctc catcagtctt cccactggcc ccctgctgcg gggacacacc cagctccacg 480

gtgaccctgg gctgcctggt caaaggctac ctcccggagc cagtgaccgt gacctggaac 540

tcgggcaccc tcaccaatgg ggtacgcacc ttcccgtccg tccggcagtc ctcaggcctc 600

tactcgctga gcagcgtggt gagcgtgacc tcaagcagcc agcccgtcac ctgcaacgtg 660

gcccacccag ccaccaacac caaagtggac aagaccgttg cgccctcgac atgcagcaag 720

cccatgtgcc caccccctga actcctgggg ggaccgtctg tcttcatctt ccccccaaaa 780

cccaaggaca ccctcatgat ctcacgcacc cccgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840

agccaggatg accccgaggt gcagttcaca tggtacataa acaacgagca ggtgcgcacc 900

gcccggccgc cgctacggga gcagcagttc aacagcacga tccgcgtggt cagcaccctc 960

cccatcgcgc accaggactg gctgaggggc aaggagttca agtgcaaagt ccacaacaag 1020

gcactcccgg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca gagggcagcc cctggagccg 1080

aaggtctaca ccatgggccc tccccgggag gagctgagca gcaggtcggt cagcctgacc 1140

tgcatgatca acggcttcta cccttccgac atctcggtgg agtgggagaa gaacgggaag 1200

gcagaggaca actacaagac cacgccggcc gtgctggaca gcgacggctc ctacttcctc 1260

tacagcaagc tctcagtgcc cacgagtgag tggcagcggg gcgacgtctt cacctgctcc 1320

gtgatgcacg aggccttgca caaccactac acgcagaagt ccatctcccg ctctccgggt 1380

aaatga 1386

<210> 73

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-H2)重链编码序列

<400> 73

caggagcacc tggtggagtc cgggggaggc ctggtcaacc ctggaggatc cctgacactc 60

acctgcacag cctctggatt ctccctcaac agcgtcgaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg gatcggattc agtaatgctt atcataggac atactacgcg 180

agctggtcga aaagccgatc caccatcacc agaaacacca acgagaacac ggtgactctg 240

aaaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag aggtgttcct 300

ggttatgtta ctaaaagtag tctctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggg 360

caacctaagg ctccatcagt cttcccactg gccccctgct gcggggacac acccagctcc 420

acggtgaccc tgggctgcct ggtcaaaggc tacctcccgg agccagtgac cgtgacctgg 480

aactcgggca ccctcaccaa tggggtacgc accttcccgt ccgtccggca gtcctcaggc 540

ctctactcgc tgagcagcgt ggtgagcgtg acctcaagca gccagcccgt cacctgcaac 600

gtggcccacc cagccaccaa caccaaagtg gacaagaccg ttgcgccctc gacatgcagc 660

aagcccatgt gcccaccccc tgaactcctg gggggaccgt ctgtcttcat cttcccccca 720

aaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac 780

gtgagccagg atgaccccga ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgc 840

accgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt ggtcagcacc 900

ctccccatcg cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac 960

aaggcactcc cggcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccagagggca gcccctggag 1020

ccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctg 1080

acctgcatga tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacggg 1140

aaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg acagcgacgg ctcctacttc 1200

ctctacagca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgc 1260

tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 1320

ggtaaatga 1329

<210> 74

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-H2)可变重结构域编码序列

<400> 74

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

gagcacctgg tggagtccgg gggaggcctg gtcaaccctg gaggatccct gacactcacc 120

tgcacagcct ctggattctc cctcaacagc gtcgacatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtggat cggattcagt aatgcttatc ataggacata ctacgcgagc 240

tggtcgaaaa gccgatccac catcaccaga aacaccaacg agaacacggt gactctgaaa 300

atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgagagg tgttcctggt 360

tatgttacta aaagtagtct ctggggccca ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 414

<210> 75

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-H2)可变重结构域编码序列

<400> 75

caggagcacc tggtggagtc cgggggaggc ctggtcaacc ctggaggatc cctgacactc 60

acctgcacag cctctggatt ctccctcaac agcgtcgaca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg gatcggattc agtaatgctt atcataggac atactacgcg 180

agctggtcga aaagccgatc caccatcacc agaaacacca acgagaacac ggtgactctg 240

aaaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag aggtgttcct 300

ggttatgtta ctaaaagtag tctctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 76

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376重链氨基酸序列

<400> 76

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Asn Ser Val Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Phe Ser Asn Ala Tyr His Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser

65 70 75 80

Trp Ser Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr

85 90 95

Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Gly Val Pro Gly Tyr Val Thr Lys Ser Ser Leu Trp

115 120 125

Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr

145 150 155 160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro

180 185 190

Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser

195 200 205

Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

210 215 220

Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys

225 230 235 240

Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro

290 295 300

Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu

305 310 315 320

Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

325 330 335

Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro

355 360 365

Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn

370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys

385 390 395 400

Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln

420 425 430

Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

435 440 445

His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 77

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376重链氨基酸序列

<400> 77

Gln Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Val

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Ser Asn Ala Tyr His Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ser Lys

50 55 60

Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Pro Gly Tyr Val Thr Lys Ser Ser Leu Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser

180 185 190

Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys

210 215 220

Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp

260 265 270

Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu

275 280 285

Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn

305 310 315 320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly

325 330 335

Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu

340 345 350

Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp

405 410 415

Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 78

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376可变重结构域氨基酸序列

<400> 78

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Asn Ser Val Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Phe Ser Asn Ala Tyr His Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser

65 70 75 80

Trp Ser Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr

85 90 95

Val Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Gly Val Pro Gly Tyr Val Thr Lys Ser Ser Leu Trp

115 120 125

Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 79

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376可变重结构域氨基酸序列

<400> 79

Gln Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Ser Val

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Phe Ser Asn Ala Tyr His Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ser Lys

50 55 60

Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Pro Gly Tyr Val Thr Lys Ser Ser Leu Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 80

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-K2)轻链编码序列

<400> 80

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgcca tcgtgatgac ccagactcca tcttccaagt ctgtccctgt gggagacaca 120

gtcaccatca attgccaggc cagtcagagt gtttatggta acaacgaatt atcctggtat 180

cagcagaaac caggacaacc tcccaagctc ctgatctaca aggcttccac tctggcatct 240

ggggtccctt cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagt 300

ggcgtggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatatagtag tggtgtgatt 360

gatgttagtg ctttcggcgg ggggaccgag gtggtggtca aaggtgatcc agttgcacct 420

actgtcctca tcttcccacc agctgctgat caggtggcaa ctggaacagt caccatcgtg 480

tgtgtggcga ataaatactt tcccgatgtc accgtcacct gggaggtgga tggcaccacc 540

caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600

ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660

aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717

<210> 81

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-K2)轻链编码序列

<400> 81

atcgtgatga cccagactcc atcttccaag tctgtccctg tgggagacac agtcaccatc 60

aattgccagg ccagtcagag tgtttatggt aacaacgaat tatcctggta tcagcagaaa 120

ccaggacaac ctcccaagct cctgatctac aaggcttcca ctctggcatc tggggtccct 180

tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag tggcgtggag 240

tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggatatagta gtggtgtgat tgatgttagt 300

gctttcggcg gggggaccga ggtggtggtc aaaggtgatc cagttgcacc tactgtcctc 360

atcttcccac cagctgctga tcaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 420

aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 480

ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 540

actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 600

cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc aataggggtg actgttag 648

<210> 82

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-K2)可变轻结构域编码序列

<400> 82

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

acatttgcca tcgtgatgac ccagactcca tcttccaagt ctgtccctgt gggagacaca 120

gtcaccatca attgccaggc cagtcagagt gtttatggta acaacgaatt atcctggtat 180

cagcagaaac caggacaacc tcccaagctc ctgatctaca aggcttccac tctggcatct 240

ggggtccctt cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagt 300

ggcgtggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatatagtag tggtgtgatt 360

gatgttagtg ctttcggcgg ggggaccgag gtggtggtca aa 402

<210> 83

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376 (克隆pEB0613B-4B1-K2)可变轻结构域编码序列

<400> 83

atcgtgatga cccagactcc atcttccaag tctgtccctg tgggagacac agtcaccatc 60

aattgccagg ccagtcagag tgtttatggt aacaacgaat tatcctggta tcagcagaaa 120

ccaggacaac ctcccaagct cctgatctac aaggcttcca ctctggcatc tggggtccct 180

tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag tggcgtggag 240

tgtgacgatg ctgccactta ctactgtgca ggatatagta gtggtgtgat tgatgttagt 300

gctttcggcg gggggaccga ggtggtggtc aaa 333

<210> 84

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376轻链氨基酸序列

<400> 84

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Lys Ser Val Pro Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gly Tyr Ser Ser Gly Val Ile Asp Val Ser Ala Phe Gly Gly Gly

115 120 125

Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile

130 135 140

Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val

145 150 155 160

Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val

165 170 175

Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln

180 185 190

Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr

195 200 205

Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln

210 215 220

Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

225 230 235

<210> 85

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376轻链氨基酸序列

<400> 85

Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly Asp

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn

20 25 30

Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Ser Ser Gly Val

85 90 95

Ile Asp Val Ser Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly

100 105 110

Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln

115 120 125

Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe

130 135 140

Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr

145 150 155 160

Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr

165 170 175

Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His

180 185 190

Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

210 215

<210> 86

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有前导序列的抗GAA 376可变轻结构域氨基酸序列

<400> 86

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Lys Ser Val Pro Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gly Tyr Ser Ser Gly Val Ile Asp Val Ser Ala Phe Gly Gly Gly

115 120 125

Thr Glu Val Val Val Lys

130

<210> 87

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 无前导序列的抗GAA 376可变轻结构域氨基酸序列

<400> 87

Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly Asp

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn

20 25 30

Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Ser Ser Gly Val

85 90 95

Ile Asp Val Ser Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

Claims

1.一种筛查受试者的庞贝病和I型粘多糖贮积症(MPS I)的方法，所述方法包括：

获得源自所述受试者的生物样品；

用酶消化来自所述生物样品的蛋白质以产生肽混合物；

从所述肽混合物内富集以下特征肽：

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述GAA特征肽并且包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ ID NO:68的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ ID NO:70的CDRL2和SEQ IDNO:71的CDRL3；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:2的第一IDUA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第一IDUA特征肽并且包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:22的CDRH1、SEQ ID NO:23的CDRH2和SEQ ID NO:24的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ ID NO:26的CDRL2和SEQ ID NO:27的CDRL3；以及

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:1的MPS I的第二IDUA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第二IDUA特征肽并且包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ ID NO:11的CDRH2和SEQ ID NO:12的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13的CDRL1、SEQ ID NO:14的CDRL2和SEQ ID NO:15的CDRL3；

对所述富集的肽进行液相色谱-多反应监测质谱(LC-MRM-MS)以确定每种特征肽的浓度；并且

在以下情况诊断所述受试者：

当所述GAA特征肽的浓度低于预定阈值浓度时或者当所述GAA特征肽不存在时，诊断所述受试者患有庞贝病；以及

当所述第一IDUA特征肽和所述第二IDUA特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或者当所述第一IDUA特征肽和所述第二IDUA特征肽不存在时，诊断所述受试者患有MPS I。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法作为新生儿筛查(NBS)的一部分进行，所述新生儿筛查另外筛查所述受试者的苯丙酮尿症、原发性先天性甲状腺功能减退症、囊性纤维化和镰状细胞病中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法在所述受试者中不存在庞贝病和/或MPS I的临床症状的情况下进行。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是干血斑(DBS)、口腔拭子、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞(WBC)。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述酶是胰蛋白酶。

6.一种检测生物样品中I型粘多糖贮积症(MPS I)和/或庞贝病的一种或多种特征肽的方法，所述方法包括：

获得来自受试者的所述生物样品；

用酶消化来自所述生物样品的蛋白质以产生肽混合物；

从所述肽混合物内富集以下特征肽：

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:3的庞贝病的第一GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第一GAA特征肽并且包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:44的CDRH1、SEQ ID NO:45的CDRH2和SEQ ID NO:46的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:47的CDRL1、SEQ ID NO:48的CDRL2和SEQ ID NO:49的CDRL3；

用抗体或其抗原结合片段富集SEQ ID NO:5的庞贝病的第三GAA特征肽，所述抗体或其抗原结合片段结合所述第三GAA特征肽并且包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ ID NO:68的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ ID NO:70的CDRL2和SEQ ID NO:71的CDRL3；

并且

7.如权利要求6所述的方法，其中所述生物样品是干血斑(DBS)、口腔拭子、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞(WBC)。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述酶是胰蛋白酶。

9.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括：

将每种特征肽的浓度与相应的预定阈值浓度进行比较；并且

在以下情况诊断所述受试者：

当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的浓度低于相应的预定阈值浓度时或者当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽不存在时，诊断所述受试者患有MPSI；和/或

10.如权利要求9所述的方法，其中从来自正常对照受试者群体的相应生物样品中的每种特征肽的平均浓度的标准偏差来计算每种特征肽的所述预定阈值浓度。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在10pmol/L至350pmol/L范围内的浓度。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是PBMC，并且来自正常对照受试者群体的PBMC中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在300pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在100pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:1的MPS I的所述第一IDUA特征肽的平均浓度包括在30pmol/g至85pmol/g范围内的浓度。

15.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在10pmol/L至250pmol/L范围内的浓度。

16.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是PBMC，并且来自正常对照受试者群体的PBMC中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在350pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

17.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在100pmol/L至1000pmol/L范围内的浓度。

18.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是口腔拭子，并且来自正常对照受试者群体的口腔拭子中SEQ ID NO:2的MPS I的所述第二IDUA特征肽的平均浓度包括在30pmol/g至80pmol/g范围内的浓度。

19.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是DBS，并且来自正常对照受试者群体的DBS中SEQ ID NO:5的庞贝病的所述第三GAA特征肽的平均浓度包括在25pmol/L至250pmol/L范围内的浓度。

20.如权利要求6所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:1的所述第一IDUA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:18的VH结构域和/或SEQ ID NO:21的VL结构域。

21.如权利要求6所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:2的所述第二IDUA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:30的VH结构域和/或SEQ ID NO:33的VL结构域。

22.如权利要求6所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:3的所述第一GAA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含以下中的一者或多者：SEQ ID NO:57的VH结构域；SEQ ID NO:65的VL结构域；SEQ ID NO:55的重链；或SEQ ID NO:63的轻链。

23.如权利要求6所述的方法，其中用于富集SEQ ID NO:5的所述第三GAA特征肽的所述抗体或其抗原结合片段包含以下中的一者或多者：SEQ ID NO:79的VH结构域；SEQ ID NO:87的VL结构域；SEQ ID NO:77的重链；或SEQ ID NO:85的轻链。

24.如权利要求6所述的方法，其中所述受试者正在经历针对MPS I和/或庞贝病的一种或多种治疗，并且在所述一种或多种治疗之前获得所述生物样品，并且所述方法还包括

并且

在以下情况确定所述一种或多种治疗有效：

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的浓度高于在所述一种或多种治疗之前所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的相应浓度时，确定所述一种或多种治疗对庞贝病有效，

或者

在以下情况确定所述一种或多种治疗无效：

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的浓度等于或低于在所述一种或多种治疗之前所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽的相应浓度或者当所述第一IDUA特征肽和/或所述第二IDUA特征肽不存在时，确定所述一种或多种治疗对MPS I无效；和/或

当在所述一种或多种治疗期间或之后所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的浓度等于或低于在所述一种或多种治疗之前所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽的相应浓度时或者当所述第一GAA特征肽、所述第二GAA特征肽、所述第三GAA特征肽、所述第四GAA特征肽、所述第五GAA特征肽、所述第六GAA特征肽和/或所述第七GAA特征肽不存在时，确定所述一种或多种治疗对庞贝病无效。

25.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括：

26.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤(MTX)、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、利妥昔单抗、硼替佐米、环磷酰胺和/或血浆置换，以减少或预防所述免疫应答。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述免疫应答包括产生针对ERT中的酶的中和抗药物抗体。

28.一种用于筛查受试者的I型粘多糖贮积症(MPS I)和/或庞贝病的测定，所述测定包括：

重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ ID NO:11的CDRH2和SEQ ID NO:12的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQID NO:13的CDRL1、SEQ ID NO:14的CDRL2和SEQ ID NO:15的CDRL3；

结合SEQ ID NO:2的MPS I的IDUA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:22的CDRH1、SEQ ID NO:23的CDRH2和SEQ ID NO:24的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ IDNO:26的CDRL2和SEQ ID NO:27的CDRL3；

结合SEQ ID NO:3的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:44的CDRH1、SEQ ID NO:45的CDRH2和SEQ ID NO:46的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:47的CDRL1、SEQ IDNO:48的CDRL2和SEQ ID NO:49的CDRL3；和/或

结合SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ ID NO:68的CDRH3；以及VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ IDNO:70的CDRL2和SEQ ID NO:71的CDRL3；

和/或

(iii)参考特征肽，所述参考特征肽包括：

SEQ ID NO:1的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:2的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:3的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:4的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:6的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:7的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:8的庞贝病的GAA特征肽；和/或

SEQ ID NO:9的庞贝病的GAA特征肽。

29.如权利要求28所述的测定，其中所述参考特征肽是同位素标记的。

30.如权利要求28所述的测定，其中所述抗体或其抗原结合片段连接至磁珠。

31.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ ID NO:11的CDRH2和SEQ ID NO:12的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:13的CDRL1、SEQ ID NO:14的CDRL2和SEQ ID NO:15的CDRL3。

32.如权利要求31所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域在SEQ ID NO:18中列出，并且所述VL结构域在SEQ ID NO:21中列出。

33.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:22的CDRH1、SEQ ID NO:23的CDRH2和SEQ ID NO:24的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:25的CDRL1、SEQ ID NO:26的CDRL2和SEQ ID NO:27的CDRL3。

34.如权利要求33所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH结构域在SEQ ID NO:30中列出，并且所述VL结构域在SEQ ID NO:33中列出。

35.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:44的CDRH1、SEQ ID NO:45的CDRH2和SEQ ID NO:46的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:47的CDRL1、SEQ ID NO:48的CDRL2和SEQ ID NO:49的CDRL3。

36.如权利要求35所述的抗体或其抗原结合片段，其中

37.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：重链可变(VH)结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQ ID NO:68的CDRH3；以及轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:69的CDRL1、SEQ ID NO:70的CDRL2和SEQ ID NO:71的CDRL3。

38.如权利要求37所述的抗体或其抗原结合片段，其中

39.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

和/或

(iii)参考特征肽，所述参考特征肽包括：

SEQ ID NO:1的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:2的MPS I的IDUA特征肽；

SEQ ID NO:3的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:4的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:5的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:6的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:7的庞贝病的GAA特征肽；

SEQ ID NO:8的庞贝病的GAA特征肽；和/或

SEQ ID NO:9的庞贝病的GAA特征肽。

40.如权利要求39所述的试剂盒，所述试剂盒还包括滤纸卡、冲孔工具、口腔拭子、血液收集管、消化酶、消化缓冲液、所述抗体或其抗原结合片段的固体载体以及洗脱缓冲液中的一种或多种。

41.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述参考特征肽是同位素标记的。

42.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段连接至磁珠。