CN115232306B - 一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯及其制备方法与应用 - Google Patents
一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种氟化修饰的直链聚(β‑氨基酯)及其制备方法与应用，以含氟双丙烯酸酯和氨基醇为单体通过迈克尔加成反应合成聚(β‑氨基酯)，再用胺类分子进行封端获得氟化修饰的直链聚(β‑氨基酯)。本发明制备的氟化修饰的直链聚(β‑氨基酯)可作为载体用于同时递送氧气及基因药物进入细胞内，其中氧气可增强电离辐射造成的DNA损伤，基因药物可通过改变肿瘤细胞内的特定基因表达，两者共同作用可高效增敏肿瘤放疗，为减少放疗抗性、增效肿瘤放疗提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成及生物医药领域，具体涉及一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯及其制备方法与应用。
背景技术
放疗是临床治疗恶性肿瘤的最主要方式之一，它能通过电离辐射(例如X射线或γ射线)造成DNA损伤，从而杀伤肿瘤细胞。在放疗的过程中，氧气能够通过提供孤对电子以及促进活性氧(ROS)的产生，来稳定电离辐射引起的DNA损伤。因此放疗部位氧气含量对放疗效果有着至关重要的影响。然而由于肿瘤异常的脉管系统，大多数的实体肿瘤的肿瘤微环境(TME)都是高度乏氧的，从而造成了实体瘤对于放疗的抗性。同时临床的放疗还面临着另一个严峻的挑战，放疗通常都是局部治疗，因此对于肿瘤已经产生的远端转移病灶无法进行抑制。
提高肿瘤微环境氧气含量的策略能够极大提升放疗效果，同时不对机体造成额外毒副作用，因此受到了广泛关注。氧气是公认的放疗增敏剂，它能固定辐射产生的DNA分子损伤，并且能够促进活性氧产生从而促进肿瘤细胞死亡。通过氧气递送载体直接向肿瘤部位递送氧气可直接缓解肿瘤部位乏氧，目前可作为氧气载体材料有全氟碳(PFC)等，虽具有极高的氧气结合能力，能够在高氧环境吸附氧气，并在乏氧环境释放出已吸附的氧气，但现有氧气递送载体往往功能单一，并且其体内清除途径尚不明晰。
基因治疗是一种新兴的肿瘤治疗手段，通过向细胞内递送外源性的RNA或DNA，影响相关基因表达，从而达到肿瘤预防或治疗目的。免疫系统是癌症基因治疗的重要靶点。肿瘤的免疫基因治疗可以直接作用于肿瘤细胞，诱导它们免疫原性死亡或增加它们对机体免疫系统的敏感性，还可以通过基因治疗的手段使靶细胞释放免疫刺激性细胞因子，如GM-CSF、IL-12、CD40L等。但由于基因药物易被体内的核酸酶降解，并且本身很难穿透细胞膜，因此需要高效的递送载体。其中，阳离子聚合物是最常见的基因载体之一。但是，大部分的阳离子聚合物的细胞内吞水平较低并且难以从内含体中逃逸出来，因此，它的基因转染效果较差。
因此有必要找寻一种有效策略，可通过向肿瘤部位递送氧气缓解肿瘤微环境的乏氧情况以增强电离辐射对实体肿瘤造成的损伤，同时通过高效递送基因药物调节放疗引发的抗肿瘤免疫的过程以实现全面的增敏放疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯及其制备方法与应用，本发明制备的一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯可作为载体用于同时递送氧气及基因药物进入细胞内，其中氧气可增强电离辐射造成的DNA损伤，基因药物可通过改变肿瘤细胞内的特定基因表达，两者共同作用可高效增敏肿瘤放疗。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯，具有如下结构通式：
其中，n为10～30的整数；R为C1～C20的含氟亚烷基；R1为羟基取代的C2～C10的烷基；R2为取代或未取代的C3～C20烷基、取代或未取代的C3～C20杂烷基中的一种，所述C3～C20杂烷基为至少一个C被O或N取代的烷基。
进一步地，所述取代基为羟基或氨基。
进一步地，R为m为1～20的整数；其中，*为连接位点。
进一步地，所述R1为其中，*为连接位点。
进一步地，所述R2为以下结构中的一种：
其中，*为连接位点。
本发明第二方面提供了一种第一方面所述的氟化修饰的直链聚β-氨基酯的制备方法，以含氟双丙烯酸酯和氨基醇为单体通过迈克尔加成反应合成聚β-氨基酯，然后用胺类分子进行封端，得到所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯。
进一步地，所述含氟双丙烯酸酯具有如下结构通式：
其中，m为1～20的整数。
进一步地，所述氨基醇为4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-戊醇。
进一步地，所述含氟双丙烯酸酯与氨基醇的摩尔比为1：0.8～1.5。
进一步地，所述迈克尔加成反应的温度为30～80℃，例如50℃。
进一步地，所述制备方法还包括对迈克尔加成反应的反应物进行多次沉降，然后真空抽除溶剂的操作。
进一步地，采用胺类分子进行封端处理的具体操作为：将合成的聚β-氨基酯及胺类分子溶于二氯甲烷中，搅拌反应得到所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯。
进一步地，所述胺类分子选自精胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基-2,2-二甲基丙烷、1,3-戊烷二胺、2-甲基-1,5-戊二胺、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷、2-[(3-氨丙基)胺]乙醇、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪中的一种，对应的结构式如下所示：
进一步地，所述含氟双丙烯酸酯与胺类分子的摩尔比为1：0.8～1.5。
进一步地，所述含氟双丙烯酸酯、氨基醇与胺类分子的摩尔比为1.2：1：1。
本发明第三方面提供了一种第一方面所述的一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯在制备增敏抗肿瘤放疗药物和/或肿瘤基因治疗药物中的应用。
进一步地，所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯作为载体用于递送增敏剂和/或基因药物。
进一步地，所述增敏剂为氧气。
进一步地，所述基因药物为促进抗肿瘤免疫反应的DNA、mRNA、siRNA或miRNA。
进一步地，所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯与基因药物缩合形成纳米复合物。
进一步地，对所述纳米复合物进行氧气预饱和处理，将处理后的纳米复合物用于向实体瘤同时递送氧气和基因药物。
本发明将制备得到的氟化修饰的直链聚β-氨基酯与基因药物缩合形成纳米复合物，对纳米复合物进行氧气预饱和处理后注射至肿瘤部位，纳米复合物能够在肿瘤部位释放氧气，缓解肿瘤微环境的乏氧，从而增强电离辐射对肿瘤细胞的杀伤；同时，形成的纳米复合物可被肿瘤高效内吞，并通过质子海绵效应逃逸内涵体，在肿瘤细胞质中释放基因药物，改变靶基因的表达，从而实现基因治疗的目的。
本发明的有益效果在于：
1.本发明设计了一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯，通过在经典基因递送载体聚β-氨基酯上引入氟链，利用氟原子独特的氟效应，能够同时实现向肿瘤部位高效递送氧气以及基因药物；其中，氟化修饰的直链聚β-氨基酯可与基因药物缩合形成纳米复合物，对纳米复合物进行氧气预饱和处理后注射至肿瘤部位，能够有效增敏放疗并增强放疗引发的抗肿瘤免疫，从而增强放疗对实体瘤的抑制；同时联合联合程序性死亡受体-1抗体(αPD-L1)治疗，可进一步加强放疗引发全身抗肿瘤免疫反应，并实现有效的远端瘤抑制。
2.本发明所述的一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯，通过含氟双丙烯酸酯以及氨基醇两种单体聚合，并利用胺类分子进行封端制备得到，制备方法简单，工艺可控；且该氟化修饰的直链聚β-氨基酯细胞毒性低，可作为载体用于同时递送氧气和基因药物，治疗效果显著，为放疗增敏的临床应用提供了新的策略。
附图说明
图1为实施例1制备的乳白色液体(a)及氟化修饰的直链聚β-氨基酯(b)的核磁共振氢谱图；
图2为对比例1制备的直链聚β-氨基酯的核磁共振氢谱图；
图3为不同封端剂封端的氟化修饰直链聚β-氨基酯与siRNA自组装形成的纳米复合物的粒径；
图4为不同浓度的实施例1制备的氟化修饰的直链聚β-氨基酯和对比例1制备的直链聚β-氨基酯对B16F10细胞的细胞毒性；
图5为不同聚合物/siRNA质量比时，f8PsA、cPsA和PEI/siADAR1纳米复合物对B16F10细胞的细胞毒性；f8PsA为实施例1制备的氟化修饰的直链聚β-氨基酯与siADAR1缩合得到的纳米复合物，cPsA为对比例1制备的直链聚β-氨基酯与siADAR1缩合得到的纳米复合物，PEI/siADAR1为聚乙烯亚胺(PEI)与siADAR1缩合得到的纳米复合物；
图6为水、主链含氟数为6、8、10的氟化修饰直链聚β-氨基酯纳米复合物和主链不含氟的直链聚β-氨基酯纳米复合物的载氧能力；
图7为瘤内注射氟化修饰直链聚β-氨基酯纳米复合物和直链聚β-氨基酯纳米复合物前以及注射后1、2和4小时B16F10肿瘤氧合状态的光声成像，圆圈圈出的为肿瘤部位；
图8为不同聚合物/Cy3-siRNA纳米复合物处理4小时后，B16F10细胞的内吞水平；
图9为不同聚合物/Cy3-siRNA纳米复合物处理4小时后，B16F10细胞的荧光共聚焦图像，图中数字代表Cy3-siRNA与Lysotracker Deep Red染色的内含体的共定位率；
图10为经过不同纳米复合物处理后，B16F10细胞中ADAR1 mRNA的相对表达水平；
图11为瘤内不同注射纳米复合物24小时后，B16F10肿瘤内的ADAR1mRNA的相对表达水平；
图12为经过不同治疗后，各组小鼠的平均肿瘤生长曲线；
图13为经过不同治疗后，各组小鼠的存活曲线；
图14为经过不同治疗后，各组远端瘤模型小鼠远端瘤的平均肿瘤生长曲线；
图15为经过不同治疗后，各组远端瘤模型小鼠的存活曲线；
图16为经不同治疗后小鼠树突细胞的成熟情况；
图17为经不同治疗后小鼠B16F10肿瘤内的CD8+效应T细胞的定量统计；
图18为经过不同治疗后B16F10肿瘤中TNF-α、IFN-γ以及IFN-β的浓度；
图19为经过不同治疗后血清中TNF-α和IFN-γ的浓度；
在上述图10～图19中，fPsA均指代f8PsA，fPsN均指代f8PsN。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例涉及一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯的制备，合成路线如下所示：
具体的制备过程如下所示：
(1)将八氟-1,6-己二醇二丙烯酸酯(222mg,0.6mmol)和4-氨基-1-丁醇(45mg,0.5mmol)混合，50℃搅拌48小时，然后用冰乙醚沉降3次，真空抽除溶剂，得乳白色液体。
(2)将步骤(1)中制备得到的乳白色液体(200mg)和精胺(101mg,0.5mmol)溶于二氯甲烷(1mL)，50℃搅拌4小时，然后用冰乙醚沉降3次，真空抽除溶剂，得到黄色液体，即为氟化修饰的直链聚β-氨基酯，简称f8PBAE。
对步骤(1)制备得到乳白色液体以及本实施例制备得到的f8PBAE进行核磁氢谱(1HNMR)表征，1H NMR结果如图1所示，图1(a)为乳白色液体的1H NMR图，图1(b)为f8PBAE的1HNMR图；进一步对f8PBAE进行凝胶渗透色谱(GPC)表征，测得分子量Mn为8000，Mw为11300，分子量分布宽度为1.41。
实施例2
本实施例涉及一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯的制备，合成方法与实施例1相同，仅将反应物八氟-1,6-己二醇二丙烯酸酯替换为六氟-1,5-戊二醇二丙烯酸酯，制备得到氟化修饰的直链聚β-氨基酯，简称f6PBAE。
实施例3
本实施例涉及一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯的制备，合成方法与实施例1相同，仅将反应物八氟-1,6-己二醇二丙烯酸酯替换为十氟-1,7-庚二醇二丙烯酸酯，制备得到氟化修饰的直链聚β-氨基酯，简称f10PBAE。
实施例4
本实施例涉及不同封端剂制备的氟化修饰的直链聚β-氨基酯，合成方法与实施例1相同，仅将封端剂精胺分别替换为1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基-2,2-二甲基丙烷、1,3-戊烷二胺、2-甲基-1,5-戊二胺、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷、2-[(3-氨丙基)胺]乙醇、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，制备得到不同封端的氟化修饰的直链聚β-氨基酯。
对比例1
本对比例涉及一种直链聚β-氨基酯的制备，合成方法与实施例1相同，仅将反应物八氟-1,6-己二醇二丙烯酸酯替换为1,6-己二醇二丙烯酸酯，制备得到直链聚β-氨基酯，简称cPBAE。
对制备得到的cPBAE进行1H NMR表征，1H NMR结果如图2所示；进一步对cPBAE进行凝胶渗透色谱(GPC)表征，测得分子量Mn为8500，Mw为13000，分子量分布宽度为1.53。
性能研究
1.不同封端剂对纳米复合物粒径的影响
纳米复合物的制备：将实施例1及实施例4中采用不同封端剂制备得到的f8PBAE分别溶解于焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)水中，各配置成5mg/mL原液，再分别与带负电的siRNA的DEPC水溶液(0.1mg/mL)按照相同质量比(聚合物/siRNA＝100：1)混合。涡旋15秒，37℃孵育30分钟，即可得到不同纳米复合物。
利用纳米粒度仪表征用不同封端剂封端的氟化修饰直链聚β-氨基酯与siRNA形成的纳米复合物的粒径，表征结果如图3所示，纳米复合物的粒径与氟化修饰直链聚β-氨基酯封端剂的种类有关，当封端剂采用精胺时，所得纳米复合物粒径最小，约为200nm。
2.细胞毒性
(1)研究聚合物f8PBAE与cPBAE的细胞毒性
将B16F10细胞接种至96孔板中(1.0×104细胞/孔)，培养24小时。将培养基替换成90μL/孔的无血清的DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)，将f8PBAE、cPBAE或PBS加入孔中，根据加入的物质类别分为以下三组实验：f8PBAE组、cPBAE组及加入PBS的空白对照组，每组各设置以下浓度梯度：10、20、40、60、80、100μg/mL，37℃孵育4小时，再将无血清的DMEM换成含10％FBS的DMEM继续孵育20小时，用MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑)法测定细胞的存活率。
测试结果如图4所示，图中fPBAE指代f8PBAE，纵坐标的细胞存活率为样品处理后细胞的吸光值与空白对照细胞吸光值比值的百分比。cPBAE显示出浓度依赖性细胞毒性，当cPBAE的浓度为100μg/mL时，其细胞存活率约为40％。而f8PBAE组在浓度为10～100μg/mL范围内，细胞存活率均大于80％，表明f8PBAE具有较低的细胞毒性，这主要是因为氟化修饰能够降低阳离子聚合物与细胞膜的相互作用，从而减少其对细胞膜的破坏。
(2)研究由不同聚合物f8PBAE、cPBAE、PEI与siADAR1制备的纳米复合物的细胞毒性
根据上述纳米复合物的制备方法，将不同聚合物f8PBAE、cPBAE、PEI分别与siADAR1制备不同质量比的f8PBAE/siADAR1(简称f8PsA)、cPBAE/siADAR1(简称cPsA)、PEI/siADAR1纳米复合物。
为检测不同比例的不同聚合物/siADAR1纳米复合物的细胞毒性，将B16F10细胞接种至96孔板中(1.0×104细胞/孔)，培养24小时。将培养基替换成无血清的DMEM(90μL/孔)，然后将f8PsA、cPsA或PEI/siADAR1纳米复合物(聚合物/siADAR1质量比为60、80、100或120，1μg siADAR1/mL,10μL)加入到孔中，37℃孵育4小时，再将无血清的DMEM换成含10％FBS的DMEM继续孵育20小时，用MTT法测定细胞的存活率。
测试结果如图5所示，图中fPBAE指代f8PsA、cPBAE指代cPsA、PEI指代PEI/siADAR1。由图可知，f8PsA纳米复合物的细胞毒性远小于cPsA以及PEI/siADAR1纳米复合物。且在f8PsA纳米复合物中聚合物与siADAR1的质量比高达120时，其细胞存活率仍大于80％。
由上述测试结果可知，本发明制备的氟化修饰直链聚β-氨基酯及由其缩合基因药物制备得到的纳米复合物均表现出低细胞毒性。
3.氧气运载能力
(1)研究由不同聚合物f8PBAE、f6PBAE、f10PBAE、cPBAE与siADAR1制备的纳米复合物的氧气运载能力
根据上述纳米复合物的制备方法，将实施例1-3制备的单体含氟原子数为8，6，10的氟化修饰直链聚β-氨基酯f8PBAE、f6PBAE、f10PBAE及对比例1制备的单体不含氟的直链聚β-氨基酯cPBAE分别与siADAR1制备相同质量比(聚合物/siADAR1质量比为100)的f8PsA、f6PsA、f10PsA、cPsA纳米复合物。
将上述制备的不同的纳米复合物置于无菌氧室内(氧气流量＝5L/分钟)，通氧5分钟，得到氧气预饱和的纳米复合物。氧气预饱和的纳米复合物(2mL)用去离子水(4mL)稀释，通过便携式测氧仪测量溶液的氧气浓度。
测量结果如图6所示，在水中添加氧气预饱和的单体主链含有八个氟原子的f8PsA后，体系中氧气浓度在100秒内由原先的8.32mg/L增加至11.92mg/L，并且该氧气浓度能够保持超过15分钟，表明f8PsA纳米复合物具有良好的氧气运载能力。而在水中添加氧气预饱和的cPsA、f6PsA或f10PsA后体系中的氧气浓度显著低于f8PsA，这表明单体主链含氟原子数量为八时，聚合载氧能力最强。
(2)纳米复合物缓解肿瘤微环境乏氧
进一步通过光声成像测定B16F10荷瘤小鼠瘤内注射不同纳米复合后肿瘤组织的乏氧水平。选择肿瘤体积约100mm3的B16F10荷瘤小鼠，分别瘤内注射新制备的氧气预饱和的f8PsA或cPsA纳米复合物(0.5mg siADAR1/kg,50μL)。瘤内注射后0、1、2和4小时，使用Visualsonic Vevo LAZER光声(PA)成像系统以Oxy-hem双光谱模式(750和850nm)对肿瘤部位进行光声成像。通过Vevo LAZER成像系统的数据分析软件分析全肿瘤氧饱和度，结果如图7所示。结果表明，注射氧气预饱和的f8PsA纳米复合物后，瘤内氧合血红蛋白信号明显增强，并且4小时内几乎保持不变。相比之下，注射氧气预饱和的cPsA纳米复合物后，4小时内几乎检测不到氧合血红蛋白信号。上述结果说明，通过注射氧气预饱和的f8PsA纳米复合物可有效缓解肿瘤内乏氧的微环境。
4.氟化修饰直链聚β-氨基酯对肿瘤细胞内动力学影响
(1)氟化修饰直链聚β-氨基酯提高肿瘤细胞对基因药物的内吞水平
根据上述纳米复合物的制备方法，将实施例1制备的单体含氟原子数为8的氟化修饰直链聚β-氨基酯f8PBAE及对比例1制备的单体不含氟的直链聚β-氨基酯cPBAE分别与Cy3-siNC制备相同质量比(聚合物/Cy3-siNC质量比为100)的f8PsN、cPsN纳米复合物；此外，将PEI与Cy3-siNC以质量比5:1制备得到PEI/Cy3-siNC纳米复合物。
将B16F10细胞接种至96孔板中(1.0×104细胞/孔)，培养24小时。然后将培养基替换成无血清的DMEM，将f8PsN或cPsN纳米复合物以及PEI/Cy3-siNC纳米复合物按照0.3μgCy3-siNC/孔的量加入到孔中，孵育4小时。弃掉培养基，含20U/mL肝素钠的PBS溶液清洗3次，加入RIPA裂解液(100μL/孔)裂解20分钟。通过酶标仪测定所得裂解液中Cy3-siNC的含量(λex＝550nm,λem＝580nm)。BCA试剂盒测定细胞内蛋白含量，细胞摄取量表示为“μgCy3-siRNA/mg蛋白”，这里的Cy3-siRNA指代Cy3-siNC。具体参见图8，f8PsN纳米复合物(对应图中fPBAE)表现出了最高的细胞摄取水平，显著高于商用试剂PEI。这表明氟化修饰直链聚β-氨基酯能促进肿瘤细胞对纳米复合物的摄取。
(2)氟化修饰直链聚β-氨基酯促进基因药物内含体逃逸
将B16F10细胞接种至共聚焦专用培养皿(直径20mm，3×104细胞/皿)，培养24小时。将培养基替换成无血清的DMEM，将f8PsN或cPsN纳米复合物(聚合物/Cy3-siNC质量比为100)按照1μg Cy3-siNC/皿的量加入到孔中，37℃孵育4小时。弃掉培养基，用含20U/mL肝素钠的PBS溶液清洗3次，Hoechst33258(5μg/mL)和Lysotracker Deep Red(200nM)分别染色30分钟和1小时，通过共聚焦激光扫描显微镜观察并拍照。利用Image J计算Cy3-siNC和Lysotracker Deep Red的共定位率，测试结果如图9所示。实验结果显示，B16F10细胞和f8PsN纳米复合物共孵育4小时后，细胞内出现大量的绿色荧光siRNA，绿色与红色荧光(内含体)之间的共定位率仅27.2％。上述结果表明氟化修饰直链聚β-氨基酯能促进基因药物内含体逃逸。
(3)氟化修饰直链聚β-氨基酯促进基因药物体外转染能力
体外试验：将B16F10细胞接种至6孔板中(2.0×104细胞/孔)，培养24小时。然后将培养基替换成无血清的DMEM(2mL)，将f8PsN、f8PsA或cPsA纳米复合物(聚合物/siRNA质量比为100)按照2μg siRNA/孔的量加入到孔中，37℃孵育4小时。将无血清的DMEM换成含10％FBS的DMEM继续孵育20小时。利用Trizol试剂提取细胞总RNA，PrimeScript RT试剂盒逆转录得cDNA。通过SYBR Premix Ex Taq试剂盒在实时PCR系统中法分析cDNA，测定加入样品后的细胞与加入等体积PBS的细胞中ADAR1 mRNA表达水平的比值。具体参见图10(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，实验结果表明f8PsA的ADAR1基因沉默效率(～70％)。这表明氟化修饰直链聚β-氨基酯可通过促进纳米复合物的细胞摄取及内含体逃逸，从而提高基因沉默效率。
动物体内试验：进一步验证氟化修饰直链聚β-氨基酯促进基因药物体内转染的能力，当B16F10荷瘤小鼠的肿瘤体积达到200mm3时，被随机分为4组，每组4只。瘤内注射PBS、f8PsN、cPsA或f8PsA纳米复合物(0.5mg siRNA/kg,50μL)。给药后24小时，收集小鼠肿瘤组织。称取30mg所得肿瘤组织，匀浆并用Trizol试剂提取总RNA，通过与体外基因沉默相同步骤进行RT-PCR，计算加入样品后的肿瘤组织与加入等体积PBS的肿瘤组织中ADAR1 mRNA表达水平的比值。结果如图11所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，实验结果与体外基因沉默结果一致，f8PsA纳米复合物的ADAR1基因沉默效率(66.7％)显著高于cPsA纳米复合物(5.1％)。
5.体内抗肿瘤疗效
将肿瘤体积～70mm3的B16F10荷瘤小鼠，随机分为8组。分别在第0、2和4天瘤内注射50μL PBS、氧气预饱和的cPsA纳米复合物、氧气预饱和的f8PsN纳米复合物或氧气预饱和的f8PsA纳米复合物。瘤内注射2小时后，对第3-8组的小鼠肿瘤部位进行X射线辐照放疗，放疗时用铅板遮蔽保护小鼠的其余部位。注射的纳米复合物剂量为0.5mg siRNA/kg，放疗剂量为6Gy。最后在第5、7和9天，对第5和8组小鼠静脉注射αPD-L1(1mg/kg)。每两天测量一次小鼠肿瘤体积及体重。肿瘤体积＝长×宽2/2。小鼠肿瘤体积达到1000mm3时，视为死亡。在首次治疗后60天内，持续记录剩余小鼠存活数量。
试验结果如图12所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，仅瘤内注射PBS的小鼠肿瘤迅速生长。而单独注射氧气预饱和f8PsA纳米复合物或仅进行放疗(RT)的抗肿瘤疗效并不明显，14天时肿瘤抑制率分别为～13％和～54％。RT+f8PsN的抑瘤效果明显增强肿瘤抑制率(～70％)，表明纳米复合物通过缓解肿瘤部位乏氧状可有效增敏放疗。联合治疗组RT+f8PsA，抑瘤效果显著增强，其肿瘤抑制率～82％远高于抑制率为～59％的RT+cPsA组。联合αPD-L1后其抗肿瘤疗效进一步增强(肿瘤抑制率～95％)。相比之下，RT+αPD-L1的肿瘤抑的肿瘤抑制率仅有～59％。这可能是由于免疫检查点抑制剂，通过克服肿瘤细胞的免疫逃逸，从而促进促进T细胞杀伤肿瘤。治疗后各组小鼠的存活情况如图13所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，与抑瘤效果相一致，在22天的观察期内，RT+f8PsA和RT+f8PsA+αPD-L1组小鼠的组小鼠的存活为100％，明显优于其他各治疗组。上述结果表明，f8PsA可以通过缓解肿瘤乏氧以及增强机体抗肿瘤免疫，共同促进放疗的抗肿瘤疗效，并且联合αPD-L1治疗后，放疗的抗肿瘤疗效能够被进一步增强。
6.体内远端肿瘤抑制
在C57BL/6小鼠左右两侧皮下分别接种B16F10细胞(1.0×106/只)，构建了B16F10黑色素远端瘤模型。当肿瘤体积长至～70mm3时，将B16F10荷瘤小鼠随机分为8组(每组8只)。分别在第0、2和4天瘤内注射50μLPBS、氧气预饱和的cPsA纳米复合物、氧气预饱和的f8PsN纳米复合物或氧气预饱和的f8PsA纳米复合物。瘤内注射2小时后，对第3-8组的小鼠肿瘤部位进行X射线辐照放疗。X射线辐照时，用铅版遮蔽保护小鼠除右侧瘤外全部部位(包括左侧远端瘤)。每两天测量一次小鼠原位瘤和远端瘤的体积及体重。当任意一侧肿瘤体积达到1000mm3时，小鼠被认定为死亡。在首次治疗后38天内，持续记录剩余小鼠存活数量。
各组远端瘤的抑制情况如图14所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，对原位瘤进行RT+f8PsA+αPD-L1治疗后，小鼠未经直接治疗的远端瘤肿瘤生长被显著抑制。14天时远端瘤抑制率为～68％。相比之下，仅接受单侧放疗的小鼠远端瘤抑制率只有～13％。
小鼠存活情况如图15所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，RT+f8PsA+αPD-L1治疗也显著延长了荷瘤小鼠的存活时间。在首次治疗后的第20天RT+f8PsA+αPD-L1组的小鼠存活率为100％。而仅接受单侧放疗的小鼠则全部死亡。上述结果表明f8PsA纳米复合物可增强放疗的远端效应。
7.氟化修饰直链聚β-氨基酯治疗对各免疫细胞的影响
将新鲜收集的肿瘤组织剪碎匀浆并用尼龙网(200目)过滤，离心(4℃,1500rpm,5分钟)收集细胞。加入红细胞裂解液，室温静置3分钟，PBS洗涤3次，即制得B16F10肿瘤单细胞悬液。收集小鼠腹股沟处淋巴结，用无菌注射器内芯研磨，尼龙网(200目)过滤。离心(4℃,1500rpm,5分钟)收集细胞，PBS洗涤3次，即制得淋巴结单细胞悬液。取制备好的肿瘤和淋巴结单细胞悬液(1×106细胞/管)，anti-C16/32封闭10分钟，并分别加入荧光抗体染色30分钟，离心(4℃,1500rpm,5分钟)PBS洗涤3次，流式细胞仪检测。
用于T细胞染色的抗体和稀释倍数分别为：anti-CD3-FITC(1/50)、anti-CD8a-APC(1/50)和anti-CD4-PE(1/50)。用于树突细胞染色的抗体和稀释倍数分别为：anti-CD11c-FITC(1/50)、anti-CD86-PE(1/50)和anti-CD80-APC(1/50)。
测试结果如图16、17所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)。RT+f8PsA组小鼠的树突细胞成熟水平提高至RT组的～3倍。RT+f8PsA+αPD-L1组提高至RT组的～5倍。经过不同治疗后肿瘤内T细胞的分化情况如图17所示，结果表明经过RT+f8PsA和RT+f8PsA+αPD-L1治疗的肿瘤内CD8+T细胞占比显著升高，分别提高至RT组的～1.5和～2倍。
8.氟化修饰直链聚β-氨基酯治疗对各炎症相关细胞因子表达水平的影响
按照ELISA试剂盒提供的说明书进行操作，通过ELISA实验分别测定治疗后各组小鼠的肿瘤组织中的TNF-α、IFN-γ及IFN-β和血清中的TNF-α及IFN-γ含量。
肿瘤组织内的细胞因子变化参见图18(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，RT+f8PsA组小鼠肿瘤内的TNF-α和IFN-γ浓度分别为54.2pg/100μg肿瘤组织和259.7pg/100μg肿瘤组织。显著高于RT+cPsA组27.9pg/100μg肿瘤组织和88.2pg/100μg肿瘤组织。当进一步联合αPD-L1治疗后TNF-α和IFN-γ浓度进一步升高分别为74.7pg/100μg肿瘤组织和305.5pg/100μg肿瘤组织，提高至RT+αPD-L1组的～2倍。肿瘤内IFN-β浓度也表现出相同的趋势，RT+f8PsA组浓度为16.4pg/100μg肿瘤组织，RT+f8PsA+αPD-L1组的浓度为26.8pg/100μg肿瘤组织，远高于RT和RT+cPsA组。小鼠血清中的细胞因子变化如图19所示(图中fPsA指代f8PsA，fPsN指代f8PsN)，经过RT+f8PsA+αPD-L1治疗的小鼠血清中的IFN-γ及TNF-α浓度显著高于RT和RT+αPD-L1组，进一步证实了其抗肿瘤疗效。
本发明公开了一种氟化修饰直链聚β-氨基酯，能够同时实现向肿瘤部位高效递送氧气以及基因药物。该递送策略适用于多种实体瘤，通过缓解实体瘤乏氧微环境可增强放疗产生的DNA损伤，从而克服实体瘤的放疗抗性。另外通过基因治疗的手段激活机体抗肿瘤免疫反应，放大放疗的远隔效应，从而实现局部放疗全身起效，从而克服实体瘤放疗无法治疗肿瘤远端转移灶的缺陷。
上述两种siRNA：siADAR1、siNC的正反义序列如表1所示：
表1siADAR1、siNC的正反义序列
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.一种氟化修饰的直链聚β-氨基酯在制备增敏抗肿瘤放疗药物和/或肿瘤基因治疗药物中的应用，其特征在于，所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯作为载体用于递送增敏剂和/或基因药物，所述增敏剂为氧气，所述基因药物为促进抗肿瘤免疫反应的siRNA；
所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯具有如下结构通式：
其中，n为10～30的整数；R为C1～C20的含氟亚烷基；R1为羟基取代的C2～C10的烷基；R2为取代或未取代的C3～C20烷基、取代或未取代的C3～C20杂烷基中的一种，所述C3～C20杂烷基为至少一个C被O或N取代的烷基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述R为m为1～20的整数；所述R1为/>所述R2为以下结构中的一种：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其特征在于，以含氟双丙烯酸酯和氨基醇为单体通过迈克尔加成反应合成聚β-氨基酯，然后用胺类分子进行封端，得到所述氟化修饰的直链聚β-氨基酯。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含氟双丙烯酸酯具有如下结构通式：
其中，m为1～20的整数。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氨基醇为4-氨基-1-丁醇或5-氨基-1-戊醇。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述胺类分子选自精胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基-2,2-二甲基丙烷、1,3-戊烷二胺、2-甲基-1,5-戊二胺、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷、2-[(3-氨丙基)胺]乙醇、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪中的一种。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含氟双丙烯酸酯与氨基醇的摩尔比为1：0.8～1.5；所述迈克尔加成反应的温度为30～80℃。
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