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CN115210383A - 用于控制二氧化碳生物转化法中的有机酸比率的方法 - Google Patents

用于控制二氧化碳生物转化法中的有机酸比率的方法 Download PDF

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CN115210383A
CN115210383A CN202180011765.3A CN202180011765A CN115210383A CN 115210383 A CN115210383 A CN 115210383A CN 202180011765 A CN202180011765 A CN 202180011765A CN 115210383 A CN115210383 A CN 115210383A
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CN
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sodium
fermentation broth
bioreactor
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acetic acid
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CN202180011765.3A
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B·伯德
R·塞纳拉特内
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Jupeng Bio HK Ltd
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Abstract

一种方法包括向生物反应器提供包含CO2的气态底物；向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种有机酸；和通过控制发酵液的pH来控制丁酸/乙酸比。在一个方面，当发酵液的pH降低时丁酸/乙酸比提高，当发酵液的pH提高时丁酸/乙酸浓度比降低。所述产乙酸菌包括在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶。提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000 ppm(g/g)之间。

Description

用于控制二氧化碳生物转化法中的有机酸比率的方法
本申请要求2020年1月29日提交的美国临时申请No. 62/967,220的权益，其全文经此引用并入本文。
提供了一种用于控制二氧化碳生物转化法中的有机酸比率的方法。更具体地，该方法包括向产乙酸菌提供含二氧化碳的气体料流并保持提供所需有机酸比率的pH水平。该方法提供高水平的二氧化碳转化、氢气的利用和有机酸（包括丁酸）的生产。
背景
二氧化碳的生成来自自然过程以及工业过程，包括化石燃料如煤、石油和天然气的燃烧。部分由于工业过程，大气二氧化碳浓度持续增长。这些二氧化碳浓度增长可能促成大气变化，从而导致气候变化和全球变暖。二氧化碳由于其高度氧化状态而难以在生物过程中利用。
除了二氧化碳，许多工业过程也导致产生氢气。氢气具有高水平的还原潜力。但是，氢气由于其非常易燃的性质而难以储存和利用。
可在氢气的帮助下将二氧化碳转化成有机酸的细菌发酵系统可以对尽量减少通过人类活动向环境释放二氧化碳的努力产生重大影响。
概述
一种方法包括向生物反应器提供包含CO2的气态底物；向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种有机酸；和通过控制发酵液的pH来控制丁酸/乙酸比。在一个方面，当发酵液的pH降低时丁酸/乙酸比提高，当发酵液的pH提高时丁酸/乙酸浓度比降低。产乙酸菌包括在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶（sodium translocating ATPase）。提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000ppm (g/g)之间。
在另一个方面，一种方法包括向生物反应器提供包含CO2的气态底物；向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；在发酵液中保持6或更低的pH；和用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种有机酸。在一个方面，在发酵液中保持6或更低的pH提供了0.2或更高的丁酸/乙酸浓度比。产乙酸菌包括在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶。提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000 ppm (g/g)之间。
在另一个方面，一种方法包括向生物反应器提供包含CO2的气态底物；向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；在发酵液中保持6或更低的pH；和用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种含有3个或更多个碳原子的有机酸。产乙酸菌包括在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶。提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000 ppm (g/g)之间。
附图简述
作为可详细理解本公开的上述特征的方式，可通过参考实施方案更特别地描述上文简要概述的本公开，其中一些实施方案在附图中进行说明。但是，要指出，附图仅图解本公开的典型实施方案，因此不应被认为限制其范围，因为本公开可能允许其它同等有效的实施方案。
图1图解使用CO2和H2在pH 5.4下借助伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）的乙酸和丁酸生产。
图2显示使用CO2和H2在pH 5.4下借助伍氏醋酸杆菌的丁酸浓度/乙酸浓度比 vs.比碳摄取量（specific carbon uptake）。
图3描述了使用CO2、CO和H2在pH 5.4下借助伍氏醋酸杆菌的乙酸和丁酸生产。
图4显示使用CO2、CO和H2在pH 5.4下借助伍氏醋酸杆菌的丁酸浓度/乙酸浓度比vs. 比碳摄取量。
图5描述了在pH 6.1下借助伍氏醋酸杆菌的乙酸和丁酸生产。
图6显示在pH 6.1下借助伍氏醋酸杆菌的丁酸浓度/乙酸浓度比 vs. 比碳摄取量。
图7图解丁酸浓度/乙酸浓度比 vs 培养物pH。
详述
以下描述不应以限制意义解释，而是仅为了描述示例性实施方案的一般原理。本公开的范围应参考权利要求书确定。
定义
除非另行定义，本公开的说明书通篇所用的以下术语定义如下，并且可以包括下面规定的定义的单数或复数形式：
修饰任何量的术语“大约”是指在现实世界条件下，例如在实验室、中试工厂或生产设施中遇到的该量的变化。例如，混合物或量（quantity）中所用的成分量或测量值在被“大约”修饰时包括在生产工厂或实验室中的实验条件下测量时通常使用的变化和谨慎程度。例如，产物中的组分的量在被“大约”修饰时包括在工厂或实验室中的多次实验中的批次之间的变化和分析方法中固有的变化。无论是否被“大约”修饰，量都包括这些量的等效物。在本文中陈述并被“大约”修饰的任何量也可作为未被“大约”修饰的量用于本公开。
术语“发酵罐”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置/生物反应器，其包括分批反应器、半分批反应器、连续反应器、连续搅拌釜反应器（CSTR）、鼓泡塔反应器、外循环回路反应器、内循环回路反应器、固定化细胞反应器（ICR）、滴流床反应器（TBR）、移动床生物膜反应器（MBBR）、气升式反应器、膜反应器如中空纤维膜生物反应器（HFMBR）、静态混合器、气升式发酵罐或适用于气液接触的其它容器或其它装置。
术语“发酵”、“发酵法”或“发酵反应”等旨在涵盖该方法的生长期和产物生物合成期。在一个方面，发酵是指将CO2转化成乙酸和/或丁酸。
术语“细胞密度”是指每单位体积发酵液的微生物细胞质量，例如克/升。
术语“比碳摄取量”是指单位质量的微生物细胞（克）以分钟计的每单位时间消耗的以毫摩尔（mmol）计的CO和CO2量，即毫摩尔/克/分钟。
如本文所用，生产率表示为STY。在这方面，醇生产率可表示为STY（表示为g乙醇/(L·天)或(g乙酸/(L·天)或(g丁酸/(L·天)的时空收率）。
含CO2的气态底物
在一个方面，该方法包括向生物反应器提供含CO2的气态底物。含CO2的底物可包括任何包含CO2的气体。在这方面，含CO2的气体可包括工业气体、发酵罐气体料流，包括例如发酵罐排气及其混合物。在一个相关方面，含CO2的底物可能包含氢气或其可能与氢气源共混以提供H2/CO2的所需水平和比率。
工业气体: 在一个方面，该方法包括向生物反应器提供含CO2的气态底物，其中含CO2的气态底物由工业气体生成。工业气体的一些实例包括钢厂气体、工业烟气和焚化炉废气。工业气体的实例包括在黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油炼制工艺、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造过程中产生的气体。氢气源可包括化石燃料、蒸汽重整、甲烷氧化、煤气化和水电解。
根据含CO2的气态底物的组成，也可能理想的是在将其引入发酵之前对其进行处理以除去任何不想要的杂质，如尘粒。例如，气态底物可使用已知方法过滤或洗涤。此外，根据含CO2的气态底物的组成，该方法可包括调节含CO2的底物以提高或降低CO2和/或H2的浓度以落在所需范围内。
发酵罐气体料流: 在一个方面，该方法包括向生物反应器提供含CO2的底物，其中含CO2的底物是发酵罐气体料流。发酵罐气体料流的一些实例包括在合成气的发酵中生成的发酵罐排气。合成气发酵的一些实例描述在2001年7月23日提交的美国专利No. 7,285,402中，其经此引用并入本文。
在一个方面，该方法适用于支持由气态底物，如含大量CO的工业烟气生产醇。在一些方面，含CO的气体来源于含碳废物，例如工业废气或来源于其它废物的气化。含CO的气体的发酵可能导致发酵罐排气中的CO2。因此，该方法代表用于捕获原本会排放到环境中的碳的有效方法。在这方面，来自含CO的气体的发酵的排气可能包括大约0.5摩尔%至大约50摩尔% CO。在另一个方面，来自含CO的气体的发酵的排气可能包括大约10摩尔%至大约99.5摩尔% CO2，在另一个方面，大约10摩尔%至大约90摩尔% CO2，在另一个方面，大约10摩尔%至大约80摩尔% CO2，在另一个方面，大约10摩尔%至大约70摩尔% CO2，在另一个方面，大约10摩尔%至大约50摩尔% CO2，在另一个方面，大约10摩尔%至大约40摩尔% CO2，在另一个方面，大约20摩尔%至大约90摩尔% CO2，在另一个方面，大约20摩尔%至大约80摩尔% CO2，在另一个方面，大约20摩尔%至大约70摩尔% CO2，在另一个方面，大约20摩尔%至大约50摩尔% CO2，在另一个方面，大约40摩尔%至大约90摩尔% CO2，在另一个方面，大约40摩尔%至大约80摩尔%CO2，在另一个方面，大约40摩尔%至大约70摩尔% CO2，在另一个方面，大约50摩尔%至大约90摩尔% CO2，和在另一个方面，大约50摩尔%至大约80摩尔% CO2。
气体料流的共混: 根据特定方面，来自两个或更多个来源的料流可以合并和/或共混以产生理想的和/或优化的底物料流。例如，包含高浓度CO2的料流，如来自钢厂的废气可与包含高浓度H2的料流，如来自钢厂炼焦炉的排气合并。
根据含CO2的底物的组成，含CO2的底物可直接供应到发酵过程或可进一步改性以包括适当的H2/CO2摩尔比。含CO2的底物可包括大约5至大约90摩尔% CO2和大约5至大约90摩尔% H2。在一个方面，含CO2的气体料流包括大约5至大约66.6% CO2。
在另一个方面，含CO2的底物可能包括大约0摩尔%至大约50摩尔% CO，在另一个方面，大约0.5摩尔% CO至大约50摩尔% CO，在另一个方面，大约0.5摩尔% CO至大约5摩尔%CO，和在另一个方面，大约2摩尔% CO至大约5摩尔% CO。在另一个方面，该气态底物具有小于大约2，在另一个方面，小于大约1，在另一个方面，大约0至大约2，在另一个方面，小于大约0.5，在另一个方面，小于大约0.3，在另一个方面，小于大约0.2，和在另一个方面，小于大约0.1的CO/CO2比。
在一个方面，产乙酸菌具有大约4:1至大约1:2的比率的H2/CO2的消耗摩尔比。因此，可利用向生物反应器提供的包括H2和CO2的任何底物气体。但是，向生物反应器提供的底物气体的最优水平具有大约4:1至大约1:1，在另一个方面，大约2:1，和在另一个方面，大约3.5:1至大约1.5:1的H2/CO2比。
生物反应器设计和操作
在2012年5月15日提交的美国序列号13/471,827和13/471,858、2012年5月16日提交的美国序列号13/473,167和2019年8月2日提交的美国序列号16/530,481和16/530,502中描述了发酵罐设计的描述，所有这些都经此引用并入本文。
发酵应该理想地在适当的条件下进行以发生所需发酵（例如CO2到乙酸）。要考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、搅拌速率（如果使用搅拌釜反应器）、接种物含量和避免产物抑制的最大乙酸浓度。在这方面，该方法包括在以下范围内的反应条件：
压力: 大约0至大约500 psi；
温度: 大约30℃至大约42℃；
培养基pH: 大约4至大约6.9；
搅拌速率: 大约100至大约2000 rpm；
营养物供给如本文所述。
产乙酸菌
在一个方面，所用微生物包括含钠泵的产乙酸菌，所述钠泵也可被描述为钠转运ATP酶（用于膜生物能学）。钠转运ATP酶描述在Muller, “Energy Conservation inAcetogenic Bacteria”, Appl. Environ. Microbiol. 2003年11月, 第69卷, No. 11,第6345-6353页中，其经此引用并入本文。术语钠转运ATP酶可与钠依赖性ATP酶互换使用。包括钠转运ATP酶的产乙酸菌在其生长培养基中需要大约500 ppm NaCl才能生长。为了测定产乙酸菌是否包括钠转运ATP酶，将产乙酸菌接种到含有大约30至大约50毫升具有大约0至大约2000 ppm NaCl的生长培养基的血清瓶中。在大约500 ppm或更高的NaCl浓度下的最佳生长表明该产乙酸菌包括钠转运ATP酶。
在这方面，合适的微生物包括醋酸杆菌（Acetobacterium bacteria）、凯伍产醋菌（Acetogenium kivui）、潮湿厌氧醋菌（Acetoanaerobium noterae）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、巴奇嗜碱菌（Alkalibaculum bacchi）CP11（ATCC BAA-1772）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、热自养穆尔氏菌（Moorella thermoautotrophica）、产生瘤胃球菌（Ruminococcus productus）及其组合。在另一个方面，该微生物是伍氏醋酸杆菌。
培养基组成和培养基进料速率的控制
根据一个方面，通过将合适的培养基添加到反应器容器中而开始发酵过程。反应器容器中所含的液体可包括任何类型的合适的营养培养基或发酵培养基。营养培养基包括有效地使所用微生物生长的维生素和矿物质。并不总是需要灭菌。
各种培养基组分的浓度如下：
Figure 665859DEST_PATH_IMAGE001
维生素溶液含有d-生物素、盐酸硫胺和D-泛酸钙。
使用0.5 M NaOH将培养物的pH维持在4.5至6左右。每小时每克细胞NaOH的近似用量为每克细胞0.1至0.4 ml/min。
工艺操作将pH保持在大约4至大约6.9，在另一个方面，大约5至大约6.5，在另一个方面，大约5.1至大约6，和在另一个方面，大约5.2至大约6的范围内。培养基包括小于大约0.01 g/L酵母提取物和小于大约0.01 g/L碳水化合物。
该组合物还包括大约40至大约500毫摩尔/升的钠离子浓度，在另一个方面，大约40至大约250毫摩尔/升和在另一个方面，大约50至大约200毫摩尔/升的钠离子浓度。在一个方面，钠离子浓度为大约500 ppm至大约8000 ppm，在另一个方面，大约1000 ppm至大约7000 ppm，在另一个方面，大约3000 ppm至大约6000 ppm，在另一个方面，大约2000至大约5000 ppm Na，和在另一个方面，大约3000至大约4000 ppm Na。钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠及其混合物的化合物提供。
该组合物包括钼源。在这方面，钼浓度为大约3.97 µg/L至大约396.5 µg/L，和在另一个方面，大约7.93 µg/L至大约198.25 µg/L。钼源包括Na2MoO4、CaMoO4、FeMoO4及其混合物。
该组合物还可包括络合剂。在这方面，当该组合物具有大约5.2或更大的pH时，在该组合物中可包括络合剂。络合剂可包括乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺二乙酸（EDDA）、乙二胺二琥珀酸（EDDS）、次氮基三乙酸（NTA）及其混合物。
该组合物可包括NH4 +、P、K、Fe、Ni、Co、Se、Zn或Mg的一种或多种来源。这些元素各自的来源可能如下。
NH4 +: 氮可由选自氢氧化铵、氯化铵、磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵及其混合物的氮源提供。
P: 磷可由选自磷酸、磷酸铵、磷酸钾及其混合物的磷源提供。
K: 钾可由选自氯化钾、磷酸钾、硝酸钾、硫酸钾及其混合物的钾源提供。
Fe: 铁可由选自氯化亚铁、硫酸亚铁及其混合物的铁源提供。
Ni: 镍可由选自氯化镍、硫酸镍、硝酸镍及其混合物的镍源提供。
Co: 钴可由选自氯化钴、氟化钴、溴化钴、碘化钴及其混合物的钴源提供。
Se: 硒可由Na2SeO3、C3H6NO2Se及其混合物提供。
Zn: 锌可由ZnSO4提供。
W: 钨可由选自钨酸钠、钨酸钙、钨酸钾及其混合物的钨源提供。
Mg: 镁可由选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁及其混合物的镁源提供。
S: 该组合物还可包括硫。硫可由选自半胱氨酸、硫化钠、NaHS、NaH2S及其混合物的硫源提供。
在接种后，建立有效供应初始微生物种群的初始进料气体供应速率。分析排出气体以测定排出气体的含量。气体分析的结果用于控制进料气体速率。在这方面，该方法提供大约0.1克/升的最小细胞密度。在另一个方面，该方法提供大约0.05至大约0.8，和在另一个方面，大约0.01至大约2的计算CO2浓度（mmol/min）/初始细胞密度（g/L）比。
在一个方面，可将营养物添加到培养物中以提高细胞生长速率。在接种过程中合适的营养物可包括酵母提取物的非碳水化合物部分。
与起始细胞密度相比，该发酵过程有效提高细胞密度。在达到所需水平后，从反应器中取出液相和细胞材料并补充培养基以保持所需细胞密度。在这方面，该方法提供大约2至大约50克/升，在另一个方面，大约2至大约30克/升，在另一个方面，大约2至大约20克/升，在另一个方面，大约2至大约10克/升，和在另一个方面，大约2至大约6克/升的平均细胞密度。
有机酸的生产: 在另一个方面，该方法提供有机酸的来源。在这方面，该方法可包括由发酵液获得一种或多种酸产物。在这方面，提供大约0.02至大约50克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约0.02至大约20克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约0.02至大约10克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约0.02至大约5克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约0.2至大约50克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约10至大约50克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约14至大约30克有机酸/升/天/克细胞，在另一个方面，大约2至大约20克有机酸/升/天/克细胞和在另一个方面，大约15至大约25克有机酸/升/天/克细胞的比有机酸生产率（specific organic acid productivity）。在一个方面，有机酸是乙酸或丁酸，或两者的混合物。
在一个方面，该方法包括在发酵液中保持6或更低的pH以提供0.2或更高，在另一个方面，大约0.5或更高，和在另一个方面，大约0.1或更高的丁酸/乙酸浓度比。该方法可提供大约0.5至大约5克/升/天/克细胞，在另一个方面，大约0.5至大约4克/升/天/克细胞，在另一个方面，大约1至大约3克/升/天/克细胞，和在另一个方面，大约1至大约15克/升/天/克细胞的比丁酸生产率（specific butyric acid productivity）。
在另一个方面，该方法包括在发酵液中保持6或更低的pH和用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种含有3个或更多个碳原子的有机酸。在一个方面，有机酸是丁酸或丁酸和丙酸的混合物。该方法可提供大约0.5克/升/天/克细胞或更高的比丁酸生产率。在另一个方面，该方法可提供大约0.5至大约5克/升/天/克细胞，在另一个方面，大约0.5至大约4克/升/天/克细胞，在另一个方面，大约1至大约3克/升/天/克细胞，和在另一个方面，大约1至大约15克/升/天/克细胞的比丁酸生产率。
CO2和H2的转化率: 该方法有效地提供大约0.05至大约3毫摩尔CO2/分钟/克干燥细胞的CO2摄取量、大约0.08至大约3 mmol H2/分钟/克干燥细胞的H2摄取量。该方法有效地提供大约25至大约100%的CO2转化率，在另一个方面，大约50至大约100%的CO2转化率，和在另一个方面，大约75至大约100%的CO2转化率。在另一个方面，该方法有效地提供大约25至大约100%的H2转化率，在另一个方面，大约50至大约100%的H2转化率，和在另一个方面，大约75至大约100%的H2转化率。
实施例
实施例1: 伍氏醋酸杆菌的制备
伍氏醋酸杆菌的初始冻干丸粒获自German culture collection DSMZ，菌株IDDSM-1030。最初使用丰富培养基（果糖和酵母提取物）从冻干丸粒中复苏培养物。使用适应方法（adaptation method）从血清瓶培养基中除去果糖，其中生长培养基中的果糖浓度逐步降低75%、50%、10%。生长速率和气体用量用作适应（adaptation）的指标（大约5周）。血清瓶中的初步pH适应工作将所需pH从7.4降低到6.0（3周）。此时，将培养物扩增并接种到反应器中。在反应器中，培养物进一步适应以在5.2至5.7的更低pH下生长。
实施例2: 用于在pH 5.4下用CO2和H2生长的伍氏醋酸杆菌培养物的CSTR反应器实 验
将含有CO2和H2的合成气与含有维生素、痕量金属、半胱氨酸（作为硫源）和盐的常规液体营养培养基一起连续引入含有伍氏醋酸杆菌的搅拌釜生物反应器。
在这一实验中使用含有营养培养基和积极生长的伍氏醋酸杆菌的New BrunswickBioflow 310反应器。将反应器的搅拌速率设置为600 rpm。该搅拌速率在实验全程保持恒定。将反应器的进料气体流量从100 ml/min的初始速率提高到108 ml/min。生物反应器中的温度在实验全程保持在33.0℃。Na+水平保持在大约3500 – 4000 ppm。每隔一段时间提取进入生物反应器的合成气进料和来自生物反应器的排气和生物反应器中的发酵液的样品，例如大约每天、每两小时一次和每四小时一次分别对进料气体、排气和发酵液进行取样。分析上述样品的各种气体组分的消耗或产生、发酵液（broth）乙酸浓度和培养物的光密度（细胞密度）。在实验全程将反应器的未唤醒体积（unaroused volume）保持在1900至2275毫升之间。也通过调节进入反应器的气体流量的质量流量控制器实时测量进入反应器的气体流量。这一实验的进料气体组成为70% H2、25% CO2和5% N2。
在这一实验中，在实验开始前将细胞再循环系统（CRS）连接到反应器。进入反应器的营养培养基的流速为5.0 ml/min。在实验全程保持营养培养基的进料速率。
在这一实验中，进料气体中的H2和CO2固定到细胞材料、乙酸和丁酸中。通过比较入口气体组成与流出气体组成来计算H2和CO2的脱除。组分气体摄取量可表示为通过细菌转化的气体分子的%。在这一实验中实现以下转化率；H2: 51% - 65%、CO2: 61%-75%。在这一实验中乙酸生产速率为4.63克/升/天，且丁酸生产速率为6.65克/升/天。
结果可概括如下：
平均比CO<sub>2</sub>摄取量（毫摩尔CO<sub>2</sub>/分钟/克干燥细胞） 0.19
平均比乙酸生产率（克/升/天/克细胞） 1.78
平均比丁酸生产率（克/升/天/克细胞） 2.54
平均细胞密度（克/升） 2.63
图1图解在pH 5.4下的乙酸和丁酸生产。图2显示丁酸浓度/乙酸浓度比 vs. 比碳摄取量。
实施例3: 用于在pH 5.4下用CO2、CO和H2生长的伍氏醋酸杆菌培养物的CSTR反应 器实验
将含有CO2、CO和H2的合成气与含有维生素、痕量金属、半胱氨酸（作为硫源）和盐的常规液体营养培养基一起连续引入含有伍氏醋酸杆菌的搅拌釜生物反应器。
在这一实验中使用含有营养培养基和积极生长的伍氏醋酸杆菌的New BrunswickBioflow 310反应器。将反应器的搅拌速率设置为600rpm。该搅拌速率在实验全程保持恒定。将反应器的进料气体流量从87 ml/min的初始速率提高到211 ml/min。生物反应器中的温度在实验全程保持在33.0℃。Na+水平保持在大约3500 – 4000 ppm。每隔一段时间提取进入生物反应器的合成气进料和来自生物反应器的排气和生物反应器中的发酵液的样品，例如大约每天、每两小时一次和每四小时一次分别对进料气体、排气和发酵液进行取样。分析上述样品的各种气体组分的消耗或产生、发酵液乙酸浓度和培养物的光密度（细胞密度）。在实验全程将反应器的未唤醒体积保持在1900至2275毫升之间。也通过调节进入反应器的合成气的质量流量控制器实时测量进入反应器的合成气流量。这一实验的进料合成气组成为62% H2、25% CO2、8% CO和5% N2。
在这一实验中，在实验开始前将细胞再循环系统（CRS）连接到反应器。进入反应器的营养培养基的流速为5.0 ml/min。在实验全程保持培养基的进料速率。
在这一实验中，进料气体中的H2、CO和CO2固定到细胞材料、乙酸和丁酸中。通过比较入口气体组成与流出气体组成来计算H2、CO和CO2的脱除。组分气体摄取量可表示为通过细菌转化的气体分子的%。在这一实验中实现以下转化率；H2: 35% - 63%、CO: 84%-95%、CO2: 16%-50%。在这一实验中乙酸生产速率为3.13克/升/天，且丁酸生产速率为3.18克/升/天。
结果可概括如下：
平均比CO<sub>2</sub>摄取量（毫摩尔CO<sub>2</sub>/分钟/克干燥细胞） 0.10
平均比CO摄取量（毫摩尔CO/分钟/克干燥细胞） 0.14
平均比乙酸生产率（克/升/天/克细胞） 1.12
平均比丁酸生产率（克/升/天/克细胞） 1.57
平均细胞密度（克/升） 2.78
图3图解在pH 5.4下的乙酸和丁酸生产。图4显示丁酸浓度/乙酸浓度比 vs. 比碳摄取量。
实施例4: 用于在pH 6.1下生长的伍氏醋酸杆菌培养物的CSTR反应器实验
将含有CO2和H2的气体与含有维生素、痕量金属、半胱氨酸（作为硫源）和盐的常规液体营养培养基一起连续引入含有伍氏醋酸杆菌的搅拌釜生物反应器。
在这一实验中使用含有营养培养基和积极生长的伍氏醋酸杆菌的New BrunswickBioflow 310反应器。将反应器的搅拌速率设置为600 rpm。该搅拌速率在实验全程保持恒定。将反应器的进料气体流量保持在97 ml/min至123ml/min之间。生物反应器中的温度在实验全程保持在33.0℃。Na+水平保持在大约3500 – 4000 ppm。每隔一段时间提取进入生物反应器的合成气进料和来自生物反应器的排气和生物反应器中的发酵液的样品，例如大约每天、每两小时一次和每四小时一次分别对进料气体、排气和发酵液进行取样。分析上述样品的各种气体组分的消耗或产生、发酵液乙酸浓度和培养物的光密度（细胞密度）。在实验全程将反应器的未唤醒体积保持在1900至2275毫升之间。也通过调节进入反应器的气体的质量流量控制器实时测量进入反应器的气体流量。这一实验的进料气体组成为70% H2、25% CO2和5% N2。
在这一实验中，在实验开始前将细胞再循环系统（CRS）连接到反应器。在实验过程中，进入反应器的营养培养基的流速为3.5-5.0 ml/min。在实验全程保持培养基的进料速率。
在这一实验中，进料气体中的H2和CO2固定到细胞材料、乙酸和丁酸中。通过比较入口气体组成与流出气体组成来计算H2和CO2的脱除。组分气体摄取量可表示为通过细菌转化的气体分子的%。在这一实验中实现以下转化率；H2: 29% - 70%、CO2: 40%-86%。在这一实验中乙酸生产速率为22.8克/升/天，且丁酸生产速率为2.67克/升/天。
结果可概括如下：
平均比CO<sub>2</sub>摄取量（毫摩尔CO<sub>2</sub>/分钟/克干燥细胞） 0.23
平均比乙酸生产率（克/升/天/克细胞） 7.93
平均比丁酸生产率（克/升/天/克细胞） 0.21
平均细胞密度（克/升） 3.00
图5图解在pH 6.1下的乙酸和丁酸。图6显示丁酸浓度/乙酸浓度比 vs. 比碳摄取量。
图7显示丁酸浓度/乙酸浓度比 vs. pH。图7中的各数据点是pH vs.丁酸/乙酸比的测量的平均值。中间线表示为公式y = 428.8 - 211.64x + 34.989x2 – 1.9366x3表示，其中x = pH，且y是丁酸/乙酸比。如外侧线所示，y可在y = 1.65*(428.8 - 211.64x +34.989x2 – 1.9366x3)至y = 0.35*(428.8 - 211.64x + 34.989x2 – 1.9366x3)的范围内。y的这种偏差可与不同的细菌种类、菌株和对宿主细胞的遗传修饰有关。不同的反应器条件，如温度和压力也可能影响y的值。
下表列出用于图7的数据。
pH范围 平均pH 平均比率([HBu]/[HAc]) 测量数
5.38 – 5.48 5.42 1.205 77
5.52 – 5.6 5.57 0.823 23
5.66 – 5.75 5.71 0.574 5
6.06 – 6.33 6.17 0.086 36
尽管已经借助具体实施方案、实施例及其应用描述了本文公开的本公开，但是本领域技术人员可对其做出许多修改和变动而不背离权利要求书中提出的本公开的范围。

Claims (28)

1.一种方法，其包括：
向生物反应器提供包含CO2的气态底物；
向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；
通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；
用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种有机酸；和
通过控制发酵液的pH来控制丁酸/乙酸比；
其中当发酵液的pH降低时丁酸/乙酸浓度比提高，当发酵液的pH提高时丁酸/乙酸浓度比降低，
其中所述产乙酸菌包含在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶，和
其中提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000 ppm (g/g)之间。
2.权利要求1的方法，其中所述气态底物包含CO和CO2的混合物。
3.权利要求1的方法，其中所述气态底物具有小于大约2的CO/CO2比。
4.权利要求1的方法，其中所述方法包括在发酵液中保持6或更低的pH以提供0.2或更高的丁酸/乙酸比。
5.权利要求1的方法，其中所述丁酸/乙酸比根据公式y = 428.8 - 211.64x +34.989x2 – 1.9366x3确定，其中x = pH，且y是丁酸/乙酸比，其中y在y = 1.65*(428.8 -211.64x + 34.989x2 – 1.9366x3)至y = 0.35*(428.8 - 211.64x + 34.989x2 –1.9366x3)的范围内。
6.权利要求1的方法，其中所述产乙酸菌选自醋酸杆菌、凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11（ATCC BAA-1772）、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、产生瘤胃球菌及其组合。
7.权利要求1的方法，其中所述产乙酸菌是伍氏醋酸杆菌。
8.权利要求1的方法，其中所述钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠及其混合物的化合物提供。
9.权利要求1的方法，其中所述发酵液包含小于大约0.01克/升酵母提取物和小于大约0.01克/升碳水化合物。
10.一种方法，其包括：
向生物反应器提供包含CO2的气态底物；
向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；
通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；
在发酵液中保持6或更低的pH；和
用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种有机酸；
其中在发酵液中保持6或更低的pH提供了0.2或更高的丁酸/乙酸浓度比，
其中所述产乙酸菌包含在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶，和
其中提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000 ppm (g/g)之间。
11.权利要求10的方法，其中所述气态底物选自工业气体、发酵罐气体料流及其混合物。
12.权利要求10的方法，其中所述气态底物包含CO和CO2的混合物。
13.权利要求12的方法，其中所述气态底物具有小于大约2的CO/CO2比。
14.权利要求10的方法，其中所述产乙酸菌选自醋酸杆菌、凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11（ATCC BAA-1772）、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、产生瘤胃球菌及其组合。
15.权利要求14的方法，其中所述产乙酸菌是伍氏醋酸杆菌。
16.权利要求10的方法，其中所述钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠及其混合物的化合物提供。
17.权利要求10的方法，其中所述发酵液包含小于大约0.01克/升酵母提取物和小于大约0.01克/升碳水化合物。
18.权利要求10的方法，其中所述丁酸/乙酸比根据公式y = 428.8 - 211.64x +34.989x2 – 1.9366x3确定，其中x = pH，且y是丁酸/乙酸比，其中y在y = 1.65*(428.8 -211.64x + 34.989x2 – 1.9366x3)至y = 0.35*(428.8 - 211.64x + 34.989x2 –1.9366x3)的范围内。
19.权利要求10的方法，其中所述方法提供大约0.5克/升/天/克细胞或更高的丁酸生产率。
20.一种方法，其包括：
向生物反应器提供包含CO2的气态底物；
向生物反应器提供产乙酸菌和培养基以提供发酵液；
通过一种或多种钠离子源向生物反应器提供钠离子；
在发酵液中保持6或更低的pH；和
用发酵液中的产乙酸菌发酵气态底物以产生一种或多种含有3个或更多个碳原子的有机酸；
其中所述产乙酸菌包含在生物反应器中的发酵过程中有活性的钠转运ATP酶，和
其中提供钠离子以使培养液中的Na+保持在1000至11000 ppm (g/g)之间。
21.权利要求20的方法，其中所述气态底物选自工业气体、发酵罐气体料流及其混合物。
22.权利要求20的方法，其中所述气态底物包含CO和CO2的混合物。
23.权利要求20的方法，其中所述气态底物具有小于大约2的CO/CO2比。
24.权利要求20的方法，其中所述产乙酸菌选自醋酸杆菌、凯伍产醋菌、潮湿厌氧醋菌、伍氏醋酸杆菌、巴奇嗜碱菌CP11（ATCC BAA-1772）、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、产生瘤胃球菌及其组合。
25.权利要求24的方法，其中所述产乙酸菌是伍氏醋酸杆菌。
26.权利要求20的方法，其中所述钠离子源由选自氯化钠、氢氧化钠、磷酸钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸氢钠、硫酸氢钠及其混合物的化合物提供。
27.权利要求20的方法，其中所述有机酸是丁酸或丁酸和丙酸的混合物。
28.权利要求20的方法，其中所述发酵液包含小于大约0.01克/升酵母提取物和小于大约0.01克/升碳水化合物。
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