CN115197305A

CN115197305A - 一种Bt蛋白Cry53A及其基因和应用

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Publication number: CN115197305A
Application number: CN202110389006.2A
Authority: CN
Inventors: 王世全; 郑爱萍; 李平; 罗莲; 王玲霞; 梁越洋; 邓其明; 李双成; 邹挺; 朱军; 刘怀年; 王爱军; 金京花
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2022-10-18

Abstract

本发明涉及生物技术领域，且公开了一种Bt蛋白Cry53A，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该Bt蛋白Cry53A及其基因和应用，提供Cry53A蛋白是一种Bt蛋白，对草地贪夜蛾有极强的杀害毒力，将其用于制备转基因植物，能够对抗草地贪夜蛾对作物的危害，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染，在本发明的效果验证试验过程中，也没有发现害虫对该蛋白产生抗性的情况。因此，本发明的Bt蛋白Cry53A具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。

Description

一种Bt蛋白Cry53A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种一种分离克隆自苏云金芽孢杆菌的抗草地贪夜蛾的蛋白、其编码基因及其应用。

背景技术

草地贪夜蛾又称为秋行军虫、秋黏虫、草地夜蛾和伪粘虫等，属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属(Spodoptera)的一种蛾，草地贪夜蛾具有适生区域广、迁飞能力和繁殖能力强、寄主范围广和取食量大等特性。

草地贪夜蛾最早出现于美洲，包括美国、巴西和墨西哥等地区，该物种一直被认为是一种偶发但极具破坏性的农业害虫，最早于1797年在美国佐治亚州被记载为有害害虫，一般认为草地贪夜蛾不能在热带和亚热带以外的地区越冬，但是，在温度适宜的夏季和秋季，它也可以在温带生存，1977年，以色列的Wiltshire认为草地贪夜蛾已经入侵并形成中东种群，并且根据其对性信息素的反应差异认为，以色列的草地贪夜蛾来源于美国-加勒比海地区，而不是来自于南美的巴西，随后，草地贪夜蛾先后入侵欧洲、非洲和亚洲等地，成为危害全球粮食生产的重大农业害虫，2016年，草地贪夜蛾在非洲首次被发现，2018年，印度首次确认草地贪夜蛾入侵并危害玉米、甘蔗和高粱等作物，目前全球共有96个国家或地区正在或曾经遭受其为害，成为全球预警的粮食作物毁灭性害虫。

草地贪夜蛾属于多食性昆虫，可取食禾本科、茄科、十字花科、石竹科和菊科等共计76科，包括玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、苜蓿、大麦、荞麦、棉花、燕麦、粟、花生、黑麦草、甜菜、苏丹草、烟草、番茄、马铃薯和洋葱等超过300种植物，但主要为害禾本科的水稻和玉米，可造成严重的产量损失，自2016年草地贪夜蛾在非洲发生以来，在12个非洲国家每年造成玉米减产约830-2060万吨，相当于0.4-1亿人口的粮食损失，在南美的阿根廷，其为害可造成玉米减产72％，即便在防控条件好的发达国家美国，其在佛罗里达州的危害也可造成玉米减产20％，更严重的是，仅2-3年时间，草地贪夜蛾已经蔓延遍及全球近100个国家和地区，造成数十亿美元的重大损失，非洲和南美洲危害高而美国危害相对较低，可能是转Bt基因抗虫玉米在美国大量推广的原因。

苏云金芽胞杆菌是一种杆状的革兰氏阳性细菌，被列为第二类第十八群芽胞杆菌属中的一个种，1911年Ernst Berliner从德国苏云金省患病的地中海粉斑螟幼虫体内再次分离到这类菌株，此时苏云金芽胞杆菌才被正式命名，人类尝试将Bt运用于生物防治是在1927年Mattes又一次从地中海粉斑螟中分离出此类菌株，1928年美国启动了防治玉米螟计划，到1929年第一次大田应，这为Bt形成商业化产品奠定了基础。

自1938年第一个含有Bt成份的商业产品Sporeine在法国面世，用于防虫治虫，1956年，科学家Angus研究确定Bt主要的杀虫活性来源于其含有的晶体蛋白，1988年，孟山都公司将Bt蛋白基因转入棉花中，获得了第一批转基因抗虫棉，1996年，孟山都公司推出抗虫Bt转基因棉花，随后，Bt转基因棉花和Bt玉米以超乎想象的速度在全球被大面积推广，据ISAAA统计，2019年全球作物种植面积中，转基因抗虫作物占了大约12％。

苏云金芽孢杆菌分布广泛，从地上的土壤到空气中的灰尘，从河流到山川，从南极冻土到热带雨林，从平原到沙漠均有分布，因而，苏云金杆菌菌种和基因资源十分丰富，已成为全世界最重要的杀虫基因资源，截止到2020年，按照新的分类方法，科学研究已发现79群741种Cry蛋白(https://www.bpprc.org/)，苏云金杆菌的杀虫原理主要依赖于其杀虫晶体蛋白(Cry)，该蛋白在害虫体内被分解成有毒的多肽，这些多肽与虫肠上皮细胞一些特异受体蛋白结合，破坏细胞膜，最后导致害虫死亡，而人体肠上皮细胞无相应的受体蛋白，且PH环境差异较大，因此该类蛋白对于人类及哺乳动物是安全的，同时，目前的苏云金芽孢杆菌主要分离自土壤中，本身也是属于地球环境自然生态系统不可分离的部分。

外来物种的侵害发展过程包括入侵、定殖和爆发三个阶段，2019年草地贪夜蛾已经入侵并且定殖中国，2020年以后将进入爆发为害阶段，目前我国对草地贪夜蛾的防控包括化学防控、理化诱控、农业防控、生物防控和培育抗性品种，化学防治是防治草地贪夜蛾最常用的方法，国际上常用氟氯氰菌酯、氯虫苯甲酰胺、顺式氯氰菊酯和丁硫克百威等杀虫剂来防治草地贪夜蛾，但是过多的使用化学杀虫剂会造成生产成本提高、环境污染、食用安全和破坏生态系统等问题，甚至害虫产生了抗药性；理化诱控主要指利用灯诱、性诱和食诱技术对草地贪夜蛾成虫进行诱杀，但是对危害作物的主要是幼虫时期，农业防治主要从栽培管理、作物布局和品种抗性等方面采取措施，以创造一个不利于草地贪夜蛾发生和为害的农田生态环境，农业防治也只能防治一部分，不能从根本上防治；生物防治主要指利用天敌昆虫、微生物农药、植物源农药、昆虫致病线虫来防治草地贪夜蛾，在我国，草地贪夜蛾的捕食性天敌昆虫有益蝽、黄带犀猎蝽和南方小花蝽等，但是我国没有草地贪夜蛾的专性寄生天敌，只能引进定居美洲原生境的天敌，如夜蛾黑卵蜂、长距姬小蜂和红腹侧沟茧蜂等，培育抗性品种来抗草地贪夜蛾不仅抗性持久，不易被环境因素所破坏，无农药残留，且对人畜危害小，对环境污染低不会破坏生态平衡，且成本低，由于去年草地贪才入侵中国，目前国内还没有发现天然的抗性品种，而应用最多的是筛选抗草地贪夜蛾的抗性基因转入作物中，基因测序同时发现，入侵的草地贪夜蛾不携带对Bt基因的抗性基因，这意味着Bt毒素和Bt作物可以有效防治草地贪夜蛾。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种Bt蛋白Cry53A及其基因和应用，以提供一种新的抗草地贪夜蛾Bt蛋白资源。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种Bt蛋白Cry53A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，Bt蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry53A的氨基酸序列(SEQID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列，在86-108有一段跨膜区域，构成跨膜区蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸，通常，膜蛋白不能在原核表达系统中表达，因此，本发明的Bt蛋白Cry53A还包括SEQ IDNo.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cry53A同等活性的由Cry53A衍生得到的蛋白质。

编码权利要求上述Bt蛋白Cry53A的基因，该核苷酸序列如；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白质可以从Bt菌株PMS45-2中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转Cry53A基因的转化体，即被草地贪夜蛾危害的植物，使其具备抗虫活性。

此外，还可以通过发酵本发明菌株PMS45-2，得到含有Cry53A蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于草地贪夜蛾的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。

含有上述基因的重组表达载体。

含有上述表达载体的宿主细胞。

进一步地，宿主细胞表达蛋白质。

含有上述Bt蛋白的饲料。

上述Bt蛋白在提高植物抗草地贪夜蛾中的应用。

上述基因在培育转基因植物、制备杀虫剂或提高植物抗虫性中的应用。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的Cry53A基因，将其转化小麦、玉米、水稻、蔬菜等被草地贪夜蛾危害的农作物，使其具备相应的抗虫活性，例如：利用密码子的简并性，将Cry53A基因设计具有玉米偏好密码子的基因序列，再将合成的Cry53A基因序列与载体连接，通过农杆菌介导转入到玉米基因组中，从而得到具有抗草地贪夜蛾活性的转基因玉米品种

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种Bt蛋白Cry53A及其基因和应用，具备以下有益效果：

该Bt蛋白Cry53A及其基因和应用，提供Cry53A蛋白是一种Bt蛋白，对草地贪夜蛾有极强的杀害毒力，将其用于制备转基因植物，能够对抗草地贪夜蛾对作物的危害，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染，在本发明的效果验证试验过程中，也没有发现害虫对该蛋白产生抗性的情况。因此，本发明的Bt蛋白Cry53A具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。

附图说明

图1显示的是用德泰生物信息学工具对Cry53A基因进行信号肽分析；

图2显示的是用德泰生物信息学工具对Cry53A基因进行跨膜区预测分析；

图3显示的是敲除跨膜区域及修改Cry53A基因碱基后与修改前的氨基酸对比；

图4显示的是重组质粒pET30a-Cry53A载体图谱；

图5显示的是重组质粒pET30a-Cry53A的酶切鉴定图谱，其中泳道1为DNA marker，泳道2为酶切重组质粒pET30a+Cry53A；

图6显示的是Cry53A基因在E.coli BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE检测图；

其中，泳道M为蛋白marker(分子量从上到下：160、120、700、50、40、35、25、20、10KDa)；泳道0为对照(不加IPTG)；line 1为含有载体pET-30a的E.coli BL21(DE3)经IPTG15℃诱导16h的表达蛋白；line 2为含有载体pET-30a的E.coli BL21(DE3)的全菌破菌后上清；line 3为含有载体pET-30a的E.coli BL21(DE3)的全菌破菌后沉淀；

图7显示的是SDS-PAGE分析包涵体中Cry53A蛋白纯化结果。

其中，泳道M为蛋白marker(分子量从上到下：160、120、700、50、40、35、25、20、10KDa)；line 1为包涵体溶解离心后上清；line 2为上清同上清同Ni-IDA孵育后流出液；line 3为50mM Imidazole的洗脱组分；line 4-6:300mM Imidazole的洗脱组；

图8显示的是饲喂三天以后观察幼虫情况，幼虫基本上长到二龄，而200ng/mlCry53A蛋白配制的饲料，一龄幼虫食用后大部分死亡，而2μg/ml但是饲喂的幼虫全部死亡。(注：图中标尺均为1mm)。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：原始序列的分析及密码子偏好改造Cry53A蛋白编码

在进行原核蛋白表达前，需要将对序列进行信号肽预测，经过测试，序列中没有信号肽如图1所示。

通过跨膜区预测软件对蛋白质序列进行分析，发现在79-101跨越细胞膜的区域有23个氨基酸残基如SEQ ID No.3蓝色区域所示，原核表达前需要对跨膜区序列进行敲除。

在不改变原有Cry53A基因所编码的氨基酸序列的情况下，使用大肠杆菌偏爱密码子进行优化，提高G+C的含量，避免某些可能降低表达的序列，改造后的情况如表1所示，改造后的Cry53A基因序列SEQ ID No.3所示改造前后氨基酸序列对比如图3所示。

表1改造前后的情况

实施例二：Cry53A基因合成与构建

新型Bt基因(Cry53A)为本实验室利用从川西森林采集的Bt菌PMS45-2分离克隆并按大肠杆菌基因喜好密码子改造获得，采用全基因合成的方法获得Cry53A基因，用NdeI和HindIII内切酶处理pET30a质粒，使之线性化，通过T4连接酶将Cry53A基因连接至线性化的pET30a质粒，获得重组质粒pET30a-Cry53Ag(重组质粒图谱如图4所示)再将重组质粒pET30a-Cry53A转化至DH5a，以获得大量的重组质粒，重组质粒的初步鉴定由酶切法完成，使用XbaI/XhoI内切酶处理重组质粒，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图5所示，酶切之后的重组质粒通过电泳分离，出现两条带，条带大小符合目的基因大小，且经过测序与原基因序列一致，表明pET30a-Cry2Ag1载体构建成功。

实施例三：Cry53A蛋白的获得

将构建正确的的pET30a–53A载体转入受体菌E.coli.BL21(DE3)(购买于北京全式金生物技术有限公司)，从转化的平板中挑选单克隆，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.5mM IPTG，之后置于37℃诱导表达。

扩大培养，生长至OD600＝0.8时，加终浓度0.5mM IPTG，15℃诱导16h后收集菌体(如果当天不做纯化操作，将菌体冻于-20℃)。

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，全菌采用20mMTris(pH8.0)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，取上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测，如图5所示，Cry53A分子量约为79kDa左右，与预测的蛋白分子量相符，检测结果显示，蛋白表达于包涵体中。

包涵体采用20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA，5mMDTT洗涤后，以20mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，分析结果见图7。

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的Lane 5-6，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea，10％Glycerol]中复性，复性后五个蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，10％Glycerol溶液约6-8h，透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

实施例4：Cry53A蛋白稳定性测试(冻融实验)及浓度测定

将蛋白从-80℃冰箱中取出，放置于冰水浴中5-10min待其缓慢融化，融化后放置于4℃冰箱内0.5h，无异常现象，说明蛋白冻融实验是正常的。

测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，测得浓度见下表2。

表2 Cry53A蛋白浓度

实施例5：蛋白杀虫活性测定

将实施例3获得的Cry53A蛋白对草地贪夜蛾进行杀虫活性测定。

用1×PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline)将蛋白溶液稀释到10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml和5ug/ml四个浓度梯度，各取1ml加入到饲料中，采用1ml 1×PBS溶液作为阴性对照，清水为空白对照，待饲料凝固以后切块放入低龄幼虫罐中，用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每个养虫罐30只，3个重复，放置光照培养箱中培养，3d、7d、14d以后检查幼虫死亡率，用毛笔轻触虫体，不能正常爬行者视为死亡，统计其死亡率。

死亡率：(死亡试虫数/处理前供试总虫数)×100％

用SPSS 10.0软件计算LC50，其测定结果见表3。

表3 Cry53A的杀虫活性

根据表3的生物活性测定结果壳子，Cry53A表达产物对草地贪具有较好的杀虫活性，其半致死浓度LC50为0.1683μg/mL(95％置信区间:0.0290-0.6498μg/mL)；而阴性对照PBS缓冲液和空白对照对草地贪夜蛾均不具杀虫活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种Bt蛋白Cry53A，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述Bt蛋白Cry53A，其特征在于，所述Bt蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

3.一种根据权利要求1或2所述Bt蛋白Cry53A的基因，其特征在于，所述核苷酸序列如；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求3所述基因的重组表达载体。

5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.一种含有权利要求1或2所述Bt蛋白的杀虫剂。

8.权利要求1或2所述Bt蛋白在提高植物抗虫性中的应用。

9.权利要求2所述的基因在培育转基因植物、制备杀虫剂或提高植物抗虫性中的应用。