CN115184599A - 一种蓖麻毒素b链的检测试剂盒及其制备方法和蓖麻毒素b链的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒及其制备方法和蓖麻毒素B链的检测方法，属于生物免疫传感技术领域。本发明提供的检测试剂盒检测蓖麻毒素B链RTB时，RTB被蓖麻毒素B链适配体捕获，Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子能够增强生物相容性并增加荧光信号读出，磁性纳米配对探针中的Fe3O4纳米粒子引起△T2的显著变化，同时导致导致荧光信号发生变化，从而实现RTB的弛豫开关‑荧光双模式检测。本发明提供的检测试剂盒结合了MRS简单、灵敏、快速的特点和荧光分析的稳定性、特异性和不受复杂环境干扰的特点，可以实现蓖麻毒素B链的高灵敏度和高选择性的检测。而且，本发明提供的检测试剂盒具有良好的储存稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫传感技术领域，特别涉及一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒及其制备方法和蓖麻毒素B链的检测方法。
背景技术
蓖麻毒素是一种具有两条肽链的剧毒植物蛋白，由核糖体失活酶(蓖麻毒素A链)及与半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特异结合的凝集素(蓖麻毒素B链)组成，二者之间通过二硫键连接。植物蛋白具有毒性、生物蓄积性和致死性，在水环境中的残留对环境造成了严重的影响，还可以作为毒战剂武器。其中，B链对促进A链的毒性具有重要作用，近期研究表明，B链上的半乳糖结合位点也参与了毒素在体内的毒性作用。因此，蓖麻毒素B链(RTB)的灵敏检测对于环境监测至关重要。
目前，RTB的检测方法主要包括表面增强拉曼光谱、基质辅助激光解吸-电离质谱、荧光光谱法、比色法和免疫传感器检测法，然而，上述检测方法是基于单一方法的检测模式，容易受到复杂生物环境的干扰，其检测灵敏度不够高。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒及其制备方法和蓖麻毒素B链的检测方法。本发明提供的检测试剂盒用于检测蓖麻毒素B链时，受复杂生物环境的干扰性小，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒，包括磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针；
所述磁性纳米荧光检测探针的化学组成包括Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子和与所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子化学结合的蓖麻毒素B链适配体；
所述磁性纳米配对探针包括Fe3O4纳米粒子和与所述Fe3O4纳米粒子化学结合的互补链；
所述蓖麻毒素B链适配体与所述互补链碱基互补配对。
优选的，所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子包括Fe3O4纳米粒子以及包覆在所述Fe3O4纳米粒子外的SiO2与FITC的混合层；所述Fe3O4纳米粒子的粒径为300nm。
优选的，所述磁性纳米配对探针中Fe3O4纳米粒子的粒径为30nm。
优选的，所述检测试剂盒还包括溶剂。
优选的，所述溶剂包括磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐水溶液或甲醇水溶液。
本发明提供了上述技术方案所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子、交联剂、羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体和第一缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米荧光检测探针；
(2)将Fe3O4纳米粒子、交联剂、互补链和第二缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米配对探针；
将所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针独立包装；
所述步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中：
所述交联剂独立地包括碳二亚胺类化合物和琥珀酰亚胺类化合物；所述碳二亚胺类化合物包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或碳化二亚胺；所述琥珀酰亚胺类化合物包括N-羟基琥珀酰亚胺和/或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液独立地包括磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐水溶液或甲醇水溶液；
所述偶联反应的温度独立地为30～37℃，时间独立地为0.5～1h。
本发明提供了一种采用上述技术方案所述的所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒或上述技术方案所述制备方法得到的蓖麻毒素B链的检测试剂盒检测蓖麻毒素B链的方法，包括弛豫开关检测模式和荧光检测模式，包括以下步骤：
(1)弛豫开关检测模式
(1.1)将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到待测样品弛豫时间；
(1.2)将空白液、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到空白弛豫时间；
(1.3)根据式(1)计算横向弛豫时间；
ΔT2＝T2样品-T2空白 式(1)；
所述式(1)中T2样品为待测样品弛豫时间，T2空白为空白弛豫时间，△T2为横向弛豫时间；
(1.4)根据横向弛豫时间与弛豫时间标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述弛豫时间标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与横向弛豫时间的线性关系曲线；
(2)荧光检测模式
(2.1)将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后待测样品荧光强度；所述检测荧光强度的激发波长为440nm，发射波长为525nm；
(2.2)根据所述待测样品荧光强度与荧光标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述荧光标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与荧光强度的线性关系曲线；
所述步骤(1.1)和所述步骤(1.2)没有时间先后顺序；
所述步骤(1)与所述步骤(2)没有时间先后顺序。
优选的，步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(2.1)中，所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针的摩尔比独立地为1～3：1。
优选的，步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(2.1)中，所述孵育的温度独立地为30～37℃，时间独立地为30～90min。
本发明提供了一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒，包括磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针；所述磁性纳米荧光检测探针的化学组成包括Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子和与所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子化学结合的蓖麻毒素B链适配体；所述磁性纳米配对探针包括Fe3O4纳米粒子和与所述Fe3O4纳米粒子化学结合的互补链；所述蓖麻毒素B链适配体与所述互补链碱基互补配对。本发明提供的检测试剂盒检测蓖麻毒素B链(RTB)时，RTB被蓖麻毒素B链适配体捕获，Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子能够增强生物相容性并增加荧光信号读出，磁性纳米配对探针中的Fe3O4纳米粒子引起横向弛豫时间(ΔT2)的显著变化(横向弛豫时间长)，同时导致荧光信号发生变化(荧光强度大)，从而实现RTB的弛豫开关-荧光双模式(MRS-FL)检测。本发明提供的检测试剂盒结合了MRS的简单、灵敏、快速的特点和以及荧光分析的稳定性、特异性和不受复杂环境干扰的特点，可以实现蓖麻毒素B链的高灵敏度和高选择性的检测。而且，本发明提供的蓖麻毒素B链的检测试剂盒具有良好的储存稳定性。
本发明提供了一种蓖麻毒素B链的检测方法，采用上述技术方案所述的所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒或上述技术方案所述制备方法得到的蓖麻毒素B链的检测试剂盒进行检测。本发明提供的检测方法进行RTB检测时，当待测样品中含有RTB时，RTB被蓖麻毒素B链适配体捕获，Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子能够增强生物相容性并增加荧光信号读出，磁性纳米配对探针中的Fe3O4纳米粒子引起横向弛豫时间(△T2)的显著变化(横向弛豫时间长)，同时导致导致荧光信号发生变化(荧光强度大)，从而实现RTB的弛豫开关-荧光双模式(MRS-FL)精准检测；当待测样品中不含RTB时，蓖麻毒素B链适配体与互补链发生碱基互补配对，导致磁性纳米配对探针之中的Fe3O4磁性纳米颗粒发生聚集，横向弛豫时间长短、荧光强度低。本发明提供的检测方法结合了MRS的简单、灵敏、快速的特点和以及荧光分析的稳定性、特异性和不受复杂环境干扰的特点，MRS与荧光互补，一个样品可以实现弛豫时间与荧光的同时检测，进而实现蓖麻毒素B链的高灵敏度、高选择性和高效检测。而且，本发明提供的检测方法简便快捷，成本低。
如实施例测试结果所示，本发明提供的检测方法MRS模式的检测范围为0.001～500ng/mL，检出限(3σ/k)为0.8pg/mL，定量限(10σ/k)为2.67pg/mL，回收率为91.98～117.76％，RSD为1.08～2.87％；FL模式的检测范围为0.005～500ng/mL，检测限检出限(3σ/k)为3pg/mL，定量限(10σ/k)为10pg/mL，回收率为92.99～116.07％，RSD为2.40～3.83％，说明，本发明提供的检测方法的检测范围广、检出限和定量限低，准确度、精确度和灵敏度高，检测结果可靠性好。
附图说明
图1为蓖麻毒素B链的检测试剂盒的制备路线以及检测原理图；
图2为实施例1制备的检测试剂盒的稳定性和选择性测试结果，其中，A为MRS模式下稳定性测试结果，B为MRS模式下选择检测结果，C为FL模式下稳定性测试结果；
图3为实施例1制备的试剂盒的灵敏度测试结果，其中，A为MRS模式下不同浓度RTB的ΔT2检测值，B为弛豫时间标准曲线；C为FL模式下不同浓度RTB的荧光光谱；D为荧光强度标准曲线；
图4为实施例2～3中弛豫开关模式检测和荧光模式检测下的优化结果图，其中，A为探针MNP300@SiO2(FITC)-Apt和MNP30-Blocker在不同浓度比例的磁弛豫时间变化，B为不同孵育时间的磁弛豫时间变化，C为探针MNP300@SiO2(FITC)-Apt和MNP30-Blocker在不同浓度比例的荧光强度，D为不同孵育时间的荧光强度。
具体实施方式
本发明提供了一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒，包括磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针。
在本发明中，所述磁性纳米荧光检测探针的化学组成包括Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子和与所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子化学结合的蓖麻毒素B链适配体。在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子优选包括Fe3O4纳米粒子以及包覆在所述Fe3O4纳米粒子外的SiO2与FITC的混合层；所述Fe3O4纳米粒子的粒径优选为300nm；所述混合层的SiO2与TEOs的质量比优选为1：0.094～0.188，更优选为1：0.094～0.15，进一步优选为1：0.094～0.12。在本发明中，所述蓖麻毒素B链适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：COOH-TTTTTACACCCACCGCAGGCAGACGCAACGCCTCGGAGACTAGCC。
在本发明中，所述磁性纳米配对探针包括Fe3O4纳米粒子和与所述Fe3O4纳米粒子化学结合的互补链；所述Fe3O4纳米粒子的粒径优选为30nm。在本发明中，所述互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：NH2C12-GGCTAGTCTCCGAGCGCACAA。
在本发明中，所述检测试剂盒优选还包括溶剂。在本发明中，所述溶剂优选包括磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)、柠檬酸盐水溶液或甲醇水溶液；所述PBS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.4；所述柠檬酸盐水溶液的浓度优选为180～200g/L，更优选为180g/L；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为0.02～0.03％，更优选为0.02％。
本发明提供了上述技术方案所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子、交联剂、羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体和第一缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米荧光检测探针；
(2)将Fe3O4纳米粒子、交联剂、互补链和第二缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米配对探针；
将所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针独立包装；
所述步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子、交联剂、羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体和第一缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米荧光检测探针。
在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子的制备方法优选包括以下步骤：
将异硫氰酸荧光素、硅烷偶联剂和溶剂在避光条件下混合，进行偶联反应，得到荧光偶联物液；
将所述荧光偶联物液、Fe3O4-COOH磁性纳米粒子分散液、硅源和氨水混合，进行水解-加成反应，得到Fe3O4@SiO2(FITC)；
将所述Fe3O4@SiO2(FITC)、硅烷偶联剂和溶剂混合，进行水解反应，得到Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子。
本发明将异硫氰酸荧光素、硅烷偶联剂和溶剂在避光条件下混合，进行偶联反应，得到荧光偶联物液。在本发明中，所述硅烷偶联剂优选包括3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、乙烯基三甲氧基硅烷(A171)和乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷(A172)中的一种或几种。在本发明中，所述异硫氰酸荧光素(FITC)与硅烷偶联剂的质量比优选为1：50～60，更优选为1：52～58，进一步优选为1：54～55。在本发明中，所述溶剂优选包括醇类溶剂或缓冲溶液，所述醇类溶剂优选包括无水乙醇和/或丙醇；所述缓冲溶液优选包括磷酸盐和/或柠檬酸盐，所述缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4。在本发明中，所述异硫氰酸荧光素的质量与溶剂的体积之比优选为1g：0.5～1L，更优选为1g：0.6～0.9L，进一步优选为1g：0.7～0.8L。本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为20～25℃，在本发明的具体实施例中，所述偶联反应优选在室温条件下进行；所述偶联反应的时间优选为20～24h，更优选为21～23h，进一步优选为22h。在本发明中，所述荧光偶联物液优选储存于0～4℃条件下备用。
得到荧光偶联物液后，本发明将所述荧光偶联物液、Fe3O4-COOH磁性纳米粒子分散液、硅源和碱性试剂混合，进行水解-加成反应，得到Fe3O4@SiO2(FITC)。在本发明中，所述Fe3O4-COOH磁性纳米粒子分散液优选由醇水溶液对Fe3O4-COOH分散液进行稀释得到；所述Fe3O4-COOH分散液中的溶剂优选包括磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4；所述Fe3O4-COOH分散液中Fe3O4的粒径优选为300nm；所述Fe3O4-COOH分散液的浓度优选为0.01～0.02g/L，更优选为0.015g/L；所述Fe3O4-COOH分散液优选购买于中科雷鸣(北京)科技有限公司。在本发明中，所述醇水溶液中水与醇的体积比优选为1：5～10，更优选为1：7～8；所述Fe3O4-COOH磁性纳米粒子分散液的浓度优选为0.001～0.002g/L，更优选为0.0015g/L。在本发明中，所述硅源优选包括正硅酸乙酯(TEOS)和/或硅酸钠。在本发明中，所述Fe3O4-COOH磁性纳米粒子分散液中Fe3O4-COOH磁性纳米粒子与硅源的质量比优选为1：1.85×105～1.87×105，更优选为1：1.855×105～1.865×105，进一步优选为1：1.86×105。在本发明中，所述Fe3O4-COOH磁性纳米粒子与荧光偶联物液中荧光偶联物的质量比优选为1：2×107～3×107，更优选为1：1：2.2×107～2.8×107，进一步优选为1：2.4×107～2.5×107。在本发明中，所述碱性试剂优选包括氨水、乙醇胺(MEA)和氨甲基丙醇(AMP)中的一种或几种；所述氨水的浓度优选为28～30wt％，更优选为28.5～29.8wt％，进一步优选为29wt％；所述硅源与碱性试剂的摩尔比优选为1：1～2，更优选为1：1～1.5，进一步优选为1：1。在本发明的具体实施例中，所述将所述荧光偶联物液、Fe3O4-COOH、硅源和氨水混合，进行水解-加成反应，得到Fe3O4@SiO2(FITC)，具体优选包括：将Fe3O4-COOH、硅源和氨水混合进行Stober水解反应，将得到的水解产物液与荧光偶联物液混合进行加成反应，得到Fe3O4@SiO2(FITC)。在本发明中，所述水解反应的温度优选为20～25℃，更优选为室温；所述Stober水解反应的时间优选为20～24h，更优选为21～23h，进一步优选为22h；所述Stober水解反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的速度优选为350～450rpm，更优选为400rpm。在本发明中，所述加成反应的温度优选为20～25℃，更优选为室温；所述加成反应的时间优选为40～50h，更优选为42～48h，进一步优选为44～45h；所述加成反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的速度优选为350～450rpm，更优选为400rpm。所述水解-加成反应后，本发明优选还包括将所述Fe3O4@SiO2(FITC)反应液进行固液分离，将所得固体产物进行水洗，得到Fe3O4@SiO2(FITC)。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离即可，具体如离心分离，所述离心分离的速度优选为1000～1500rpm，更优选为1100～1400rpm，进一步优选为1200～1300rpm，所述离心分离的时间优选为5～10min，更优选为6～9min，进一步优选为7～8min。在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)优选以Fe3O4@SiO2(FITC)水分散液形式储存，所述Fe3O4@SiO2(FITC)水分散液的浓度优选为0.3～0.5mg/L，更优选为0.4mg/L，本发明以Fe3O4@SiO2(FITC)水分散液形式储存的储存稳定性高。
得到Fe3O4@SiO2(FITC)后，本发明将所述Fe3O4@SiO2(FITC)、硅烷偶联剂和溶剂混合，进行水解反应，得到Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子。在本发明中，所述硅烷偶联剂优选包括3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、乙烯基三甲氧基硅烷(A171)和乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷(A172)中的一种或几种。在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)与硅烷偶联剂的质量比优选为1：90～100，更优选为1：92～98，进一步优选为1：94～95。在本发明中，所述溶剂优选包括醇类溶剂或缓冲溶液；所述醇类溶剂优选包括无水乙醇和/或丙醇；所述缓冲溶液优选包括磷酸盐和/或柠檬酸盐，所述缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4。在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)的质量与溶剂的体积之比优选为1g：0.5～2L，更优选为1g：1～1.5L。本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为20～25℃，在本发明的具体实施例中，所述偶联反应优选在室温条件下进行；所述偶联反应的时间优选为20～24h，更优选为21～23h，进一步优选为22h；所述偶联反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的速度优选为800～1000rpm，更优选为850～950rpm，进一步优选为900rpm。
得到Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子后，本发明将Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子、交联剂、羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体(Apt-COOH)和第一缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米荧光检测探针。在本发明中，所述交联剂优选包括碳二亚胺类化合物和琥珀酰亚胺类化合物；所述碳二亚胺类化合物优选包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和/或碳化二亚胺；所述琥珀酰亚胺类化合物优选包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和/或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；所述交联剂在使用前优选先平衡至室温。在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子、碳二亚胺类化合物和琥珀酰亚胺类化合物的质量比优选为1：8700～8800：16400～16600，更优选为1：8720～8880：16450～16550，进一步优选为1：8740～8760：16500～16520。在本发明中，所述羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体优选购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。在本发明中，所述Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子与羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体的质量比优选为1：8700～8800：16400～16600，更优选为1：0.01～0.02，更优选为1：0.012～0.018，进一步优选为1：0.014～0.015。在本发明中，所述Apt-COOH优选以Apt-COOH溶液形式使用，所述Apt-COOH溶液的浓度优选为0.5～1μmol/L，更优选为0.6～0.9μmol/L，进一步优选为0.7～0.8μmol/L；所述Apt-COOH溶液中的第一缓冲溶液优选包括磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐水溶液、甲醇水溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2。在本发明中，所述第一缓冲溶液优选包括磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐水溶液、甲醇水溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3；所述Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子的质量与第一缓冲溶液的体积之比优选为1g：0.5～1L，更优选为1g：0.6～0.8L。在本发明中，所述混合的温度优选为室温；本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为30～37℃，更优选为32～37℃，进一步优选为35～37℃所述偶联反应的时间优选为0.5～1h，更优选为0.6～0.9h，进一步优选为0.7～0.8h。
所述偶联反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括将所述偶联反应得到的反应液进行固液分离，将所得液体组分进行磷酸盐缓冲溶液洗涤和磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤。在本发明中，所述固液分离的方式优选为磁分离。在本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次。在本发明中，所述磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST溶液)优选包括PBS溶液和吐温的混合溶液；所述PBST溶液中PBS的浓度优选为0.005～0.01mol/L，更优选为0.01mol/L；所述吐温优选包括Tween20和/或Tween80；所述PBST溶液中吐温的体积分数优选为0.05～0.1％，更优选为0.06～0.08％；所述PBST溶液的pH值优选为7.2～7.4；所述磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次。在本发明中，所述磁性纳米荧光检测探针优选分散于酸盐缓冲溶液，以磁性纳米荧光检测探针分散液形式存储；所述储存的温度优选为0～4℃，更优选为0～2℃；所述磁性纳米荧光检测探针分散液的浓度优选为0.01～0.02g/L，更优选为0.012～0.018g/L，进一步优选为0.014～0.015g/L。在本发明中，所述酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2。
本发明将Fe3O4纳米粒子、交联剂、互补链和第二缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米配对探针。在本发明中，所述互补链优选购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。在本发明中，所述交联剂、第二缓冲溶液、偶联反应的条件、偶联反应之后的后处理和储存形式优选与前述磁性纳米荧光检测探针的制备中相同，在此不再一一赘述。在本发明中，所述Fe3O4纳米粒子、碳二亚胺类化合物和琥珀酰亚胺类化合物的质量比优选为1：7～8：11～12，更优选为1：7.5～8：11.5～12，进一步优选为1：7.64：11.5。
得到磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针后，本发明将所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针独立包装。本发明对于所述独立包装没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的包装方式即可。
本发明提供了一种采用上述技术方案所述的所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒或上述技术方案所述制备方法得到的蓖麻毒素B链的检测试剂盒检测蓖麻毒素B链的方法，包括弛豫开关检测模式和荧光检测模式，包括以下步骤：
(1)弛豫开关检测模式
(1.1)将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到待测样品弛豫时间；
(1.2)将空白液、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到空白弛豫时间；
(1.3)根据式(1)计算横向弛豫时间；
△T2＝T2样品-T2空白 式(1)；
所述式(1)中T2样品为待测样品弛豫时间，T2空白为空白弛豫时间，△T2为横向弛豫时间；
(1.4)根据横向弛豫时间与弛豫时间标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述弛豫时间标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与横向弛豫时间的线性关系曲线；
(2)荧光检测模式
(2.1)将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后待测样品荧光强度；所述检测荧光强度的激发波长为440nm，发射波长为525nm；
(2.2)根据所述待测样品荧光强度与荧光标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述荧光标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与荧光强度的线性关系曲线；
所述步骤(1.1)和所述步骤(1.2)没有时间先后顺序；
所述步骤(1)与所述步骤(2)没有时间先后顺序。
本发明将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到待测样品弛豫时间。在本发明中，所述待测样品优选为水样品。在本发明中，所述待测样品中蓖麻毒素B链的浓度优选为0.001～5000ng/mL，更优选为0.001～500ng/mL。在本发明中，所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针的摩尔比优选为1～3：1，更优选为1.5～2.5：1，进一步优选为2：1。在本发明中，所述待测样品的体积与磁性纳米荧光检测探针得物质的量的比优选为1mL：0.1～0.3μmol/L，更优选为1mL：0.2μmol/L。在本发明中，所述磁性纳米荧光检测探针优选以磁性纳米荧光检测探针分散液形式使用，所述磁性纳米荧光检测探针分散液的浓度优选为0.01～0.02g/L，更优选为0.012～0.018g/L，进一步优选为0.014～0.015g/；所述磁性纳米荧光检测探针分散液中的溶剂优选为磷酸盐缓冲溶液，所述酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3。在本发明中，所述磁性纳米配对探针优选以磁性纳米配对探针分散液形式使用，所述磁性纳米配对探针分散液的浓度优选为0.01～0.02g/L，更优选为0.012～0.018g/L，进一步优选为0.014～0.015g/；所述磁性纳米配对探针分散液中的溶剂优选为磷酸盐缓冲溶液，所述酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3。本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，能够讲原料混合均匀即可，具体如搅拌混合；所述混合的温度优选为室温。在本发明中，所述孵育的温度优选为30～37℃，更优选为32～37℃，进一步优选为35～37℃所述孵育的时间优选为30～90min，更优选为40～80min，进一步优选为50～60min；所述孵育优选在摇荡混合条件下进行，所述摇荡混合的速度优选为800～1000rpm，更优选为9,00rpm；所述摇荡混合优选在恒温孵育箱(Forma Orbital Shaker)中进行。在本发明中，所述检测弛豫时间优选包括：将所述孵育得到的孵育液置于核磁共振(NMR)管中，利用核磁共振检测所述孵育液的弛豫时间(T2)，得到样品弛豫时间。在本发明中，所述核磁共振管的直径优选为7.5mm；所述检测的时间优选为1min。在本发明的具体实施例中，所述待测样品弛豫时间优选为3次测量的平均值。
本发明将空白液、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到空白弛豫时间。在本发明中，所述空白液优选为PBS溶液；所述PBS溶液的浓度优选为0.05～0.1μmol/L，更优选为0.08～0.1μmol/L，所述PBS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3。在本发明中，所述空白弛豫时间的检测方法与所述样品弛豫时间的检测步骤的区别在于将待测样品替换为空白液，其他条件与所述样品弛豫时间的检测步骤相同，在此不再赘述。
得到待测样品弛豫时间和空白弛豫时间后，本发明根据式(1)计算横向弛豫时间：
△T2＝T2样品-T2空白 式(1)；
所述式(1)中T2样品为待测样品弛豫时间，T2空白为空白弛豫时间，△T2为横向弛豫时间。
得到横向弛豫时间后，本发明根据横向弛豫时间与弛豫时间标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述弛豫时间标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与横向弛豫时间的线性关系曲线。
在本发明的具体实施例中，所述弛豫时间标准曲线的绘制方法优选包括：
提供梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液。在本发明的具体实施例中，所述梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液的浓度分别为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL。在本发明中，所述蓖麻毒素B链的标准品溶液中的溶剂优选为PBS溶液，所述PBS溶液的浓度优选为0.05～0.1μmol/L，更优选为0.08～0.1μmol/L，所述PBS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3；
将梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液和空白PBS溶液分别与磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到梯度浓度系列弛豫时间和空白弛豫时间；
根据式(1)计算所述梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液的横向弛豫时间，以蓖麻毒素B链标准品分散液的浓度对数(X)为横坐标，以横向弛豫时间(Y)作为纵坐标绘制曲线，得到弛豫时间标准曲线；所述弛豫时间标准曲线如式(2)所示：
Y＝153.23X+792.16，R2＝0.9995 式(2)
所述弛豫时间标准曲线的线性范围优选为0.005～500ng/mL。
本发明将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测荧光强度，得到待测样品荧光强度；所述检测荧光强度的激发波长为440nm，发射波长为525nm。在本发明中，所述将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育与前述横向弛豫时间的检测步骤相同，在此不再赘述。在本发明中，所述检测荧光强度优选包括：将所述孵育得到的孵育液置于石英比色皿中，利用荧光分光光度计检测荧光强度，得到样品荧光强度。在本发明中，石英比色皿的宽度优选为1cm。在本发明中，所述荧光分光光度计优选为F97Pro荧光分光光度计。在本发明的具体实施例中，所述样品荧光强度优选为3次测量的平均值。
得到待测样品荧光强度后，本发明根据所述待测样品荧光强度与荧光标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述荧光标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与荧光强度的线性关系曲线。
在本发明的具体实施例中，所述荧光强度标准曲线的绘制方法优选包括：
提供梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液，所述梯度浓度包括0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000和5000ng/mL；所述蓖麻毒素B链的标准品溶液中的溶剂优选为PBS溶液，所述PBS溶液的浓度优选为0.05～0.1μmol/L，更优选为0.08～0.1μmol/L，所述PBS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3；
将所述梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测荧光强度，得到梯度浓度系列荧光强度；以波长作为为横坐标(X)，以荧光强度(Y)作为纵坐标绘制曲线，得到荧光强度标准曲线；所述荧光强度标准曲线如式(3)所示：
Y＝245.01X+1219.63，R2＝0.9909 式(3)
所述荧光强度标准曲线的线性范围优选为0.005～500ng/mL。
在本发明中，所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒的制备路线以及检测原理如图1所示。当待测样品中含有RTB时，RTB被蓖麻毒素B链适配体捕获，Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子能够增强生物相容性并增加荧光信号读出，磁性纳米配对探针中的Fe3O4纳米粒子引起横向弛豫时间(△T2)的显著变化(横向弛豫时间长)，同时导致导致荧光信号发生变化(荧光强度大)，从而实现RTB的弛豫开关-荧光双模式(MRS-FL)精准检测；当待测样品中不含RTB时，蓖麻毒素B链适配体与互补链发生碱基互补配对，导致磁性纳米配对探针之中的Fe3O4磁性纳米颗粒发生聚集，横向弛豫时间长短、荧光强度低。本发明提供的检测方法结合了MRS的简单、灵敏、快速的特点和以及荧光分析的稳定性、特异性和不受复杂环境干扰的特点，MRS与荧光互补，一个样品可以实现弛豫时间与荧光的同时检测，进而实现蓖麻毒素B链的高灵敏度、高选择性和高效检测。而且，本发明提供的检测方法简便快捷，成本低。
下面结合实施例对本发明提供的蓖麻毒素B链的检测试剂盒及其制备方法和蓖麻毒素B链的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)磁性纳米荧光检测探针(MNP300@SiO2(FITC)-NH2-Apt)的合成
(1.1)将4mg FITC、250μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和2mL无水乙醇在黑暗条件下混合均匀，在室温条件下偶联反应24h，得到的FITC-APTES偶联物液，储存于4℃条件下备用。
(1.2)将1mLMNP300-COOH(MNP300即为粒径为300nm的Fe3O4，溶剂为900μL，浓度为1mg/mL)、1mL水和8mL无水乙醇混合均匀，加入200μLTEOS和200μL浓度为29wt％氨水，在室温、400rpm条件下Stober水解反应24h，加入200μLTEOs和900μLFITC-APTES偶联物液混合均匀，在室温、400rpm条件下加成反应48h，得到MNP300@SiO2(FITC)反应液；12000rpm的速度离心5min，收集MNP300@SiO2(FITC)，用去离子水洗涤5次，分散于去离子水中，得到浓度为0.4mg/L的MNP300@SiO2(FITC)水分散液。
(1.3)将2mg MNP300@SiO2(FITC)分散于1mL无水乙醇中，然后加入200μL APTES混合均匀，在室温、900rpm条件下加成反应24h，得到MNP300@SiO2(FITC)-NH2。
(1.4)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂的温度恢复至室温，将50μL浓度为10μg/mL(的MNP300@SiO2(FITC)-NH2分散液溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)悬浮于500μL PBS溶液中，然后加入100μL浓度为40mmol/L的EDC的PBS溶液、100μL浓度为100mmol/L的NHS的PBS溶液和500μL浓度为1μmol/L的Apt-COOH PBS溶液中，在37℃、800rpm条件下偶联反应1h，磁分离后，将上清液用PBS溶液洗涤3次，PBST溶液(PBS浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为0.05％，pH＝7.4)洗涤3次，然后将上清液悬浮于500μL PBS溶液中，得到浓度为0.02mg/mL的MNP300@SiO2(FITC)-NH2分散液，在4℃条件下保存备用。
(2)磁性纳米配对探针(MNP30-Blocker)的制备
按照步骤(1.4)制备磁性纳米配对探针(MNP30-Blocker)，与步骤(1.3)的区别在于，将MNP300@SiO2(FITC)-NH2替换为粒径为30nm的Fe3O4(即MNP30)，得到MNP30-Blocker分散液(浓度为0.01mg/mL)。
(3)将磁性纳米荧光检测探针分散液和磁性纳米配对探针分散液独立包装，得到蓖麻毒素B链的检测试剂盒。
所有实施例和测试例中使用的PBS溶液的浓度均为0.01mol/L，pH值均为7.3。
实施例2
(1)弛豫开关模式检测
(1.1)将(加入不用量分别为50μL、75μL、100μL、125μL和150μL，即Apt与Blocker的摩尔比分别为1、1.5、2、2.5和3)浓度为0.01mg/mL的MNP300@SiO2(FITC)-Apt分散液、加入量的浓度为0.01mg/mL的50μLMNP30-Blocker分散溶液的蓖麻毒素B链标准品(各实施例和测试例中蓖麻毒素B链标准品均购买于北京翰谱医药生物研究所)溶液和50μL PBS溶液置于离心管中，在37℃、800rpm、Forma Orbital Shake条件下孵育1h，得到孵育液。将所述孵育液然后转移至直径为7.5mm的核磁共振(NMR)管中，通过核磁共振分析1min以测量弛豫时间(T2)，平行测试3次(n＝3)，在32℃的温度下使用1.5T cute NMR分析在1H下在59.095MHz磁场下采集了以下参数：Carr–Purcell–Mei臂–Gill脉冲序列，4000个回波，回波时间3ms的重复时间和重复采样等待时间1000ms，得到不同Apt与Blocker摩尔比下的待测样品弛豫时间T2样品。
(1.2)按照步骤(1.1.1)测试空白空白弛豫时间T2空白，与步骤(1.1.1)的区别在于将蓖麻毒素B链标准品分散液替换为PBS溶液，根据式(1)计算得到不同Apt与Blocker摩尔比下的横向弛豫时间(△T2)。
(2)荧光模式检测
将步骤(1.1)得到的孵育液置于1cm石英比色皿中，以440nm为激发波长，以525nm为发射波长，利用F97Pro荧光分光光度计进行荧光强度检测，得到不同Apt与Blocker摩尔比下的荧光强度。
实施例3
按照实施例2的方法进行检测，与实施例2的区别在于：
步骤(1.1)中，MNP30-Blocker分散溶液的加入量为75μL(即Apt与Blocker的摩尔比为1.5)，孵育时间分别为30、45、60、75和90min，得到不同孵育时间下的待测样品弛豫时间T2样品。
步骤(1.2)中得到不同孵育时间下的△T2。
步骤(2)中得到不同孵育时间下的荧光强度。
图4为实施例2～3中弛豫开关模式检测和荧光模式检测下的优化结果图，其中，A为探针MNP300@SiO2(FITC)-Apt和MNP30-Blocker在不同浓度比例的磁弛豫时间变化，B为不同孵育时间的磁弛豫时间变化，C为探针MNP300@SiO2(FITC)-Apt和MNP30-Blocker在不同浓度比例的荧光强度，D为不同孵育时间的荧光强度。由图4可知，MNP300@SiO2(FITC)-Apt和MNP30-Blocker的摩尔比为1.5，孵育时间为75min时双模检测效果最佳。
实施例4
稳定性测试
按照实施例2步骤(1.1)和步骤(2)的方法进行检测，与实施例2的区别在于：MNP30-Blocker分散溶液的加入量为75μL(即Apt与Blocker的摩尔比为1.5)，孵育温度分别为4℃和25℃，孵育时间为28天，每间隔7天检测一次T2值；每间隔7天检测一次荧光强度。
实施例5
选择性测试
按照实施例2进行检测，与实施例2的区别在于：MNP30-Blocker分散溶液的加入量为50μL(即Apt与Blocker的摩尔比为1.5)；分别加入凝血酶(Thrombin)、牛血清蛋白(BSA)、溶菌酶(Lysozyme)、免疫球蛋白(IgG)、相思豆蛋白(Abrin)、人血清白蛋白(HSA)和上述6种蛋白质的混合物(Mix)作为干扰物，然后再进行孵育。
图2为实施例1制备的检测试剂盒的稳定性和选择性测试结果，其中，A为MRS模式下稳定性测试结果，B为MRS模式下选择检测结果，C为FL模式下稳定性测试结果，D为FL模式下选择检测结果，所有数据均以三个平行测量值的平均值±标准差表示。由图2中A和C可知，放置在4℃和25℃的环境中28天，此阶段T2值和荧光强度均无明显变化(p<0.05)，4℃时T2值较高且荧光强度更强，说明本发明提供的检测试剂盒具有良好的稳定性，且储存于4℃时稳定性更好。由图2中B和D可知，未检测到对其他蛋白质(包括凝血酶、BSA、溶菌酶、IgG、Abrin、HSA、Mix)的明显干扰，混合后的荧光强度接近RTB特异性检测的荧光值，表明，本发明提供的检测试剂盒不受溶液中其他干扰蛋白的影响，排除了复杂环境的干扰。因此，本发明提供的检测试剂盒对RTB具有优异的特异性。
实施例6
(1)弛豫时间标准曲线
(1.1)将RTB标准品溶解于PBS溶液中，得到RTB标准品储备液；
(1.2)利用PBS溶液将所述RTB标准品储备液依次进行稀释，得到浓度分别为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000和5000ng/mL的梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液；
(1.3)分别将50μL浓度为15μg/mL的MNP300@SiO2(FITC)-Apt分散液、50μL浓度分别为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL的RTB标准品分散液、50μL浓度为10μg/mL的MNP30-Blocker分散液和50μL PBS溶液分别置于离心管中混合均匀，得到梯度浓度的标准待测样品；
(1.4)将50μL浓度为15μg/mL的MNP300@SiO2(FITC)-Apt分散液、50μLL浓度为10μg/mL的MNP30-Blocker分散液和100μL PBS溶液置于离心管中中混合均匀作为空白样品。
(1.5)将空白样品和梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液置于Forma OrbitalShaker中，在37℃、800rpm条件下孵育75min，得到各孵育液；将各孵育液分别转移到7.5mm核磁共振(NMR)管中，并通过NMR分析1分钟以测量T2，平行检测3次(n＝3)，取3次检测的平均值，得到得到空白弛豫时间T2空白和梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品的待测样品弛豫时间T2样品，测试结果如图2中A所示，按照式(1)计算△T2；其中，T2测量过程中在32℃的温度下使用1.5T cute NMR分析在1H下在59.095MHz磁场下采集了以下参数：Carr–Purcell–Mei臂–Gill脉冲序列，4000个回波，回波时间3ms的重复时间和重复采样等待时间1000ms。
(1.6)以蓖麻毒素B链标准品分散液的浓度对数(X)为横坐标，以低场核磁仪器测得的△T2值(Y)作为纵坐标，使用Origin软件绘制曲线，得到弛豫时间标准曲线，如图2中B所示。
(2)荧光标准曲线
(2.1)将步骤(1.5)得到的孵育液置于1cm石英比色皿中，以440nm为激发波长，以525nm为发射波长，利用F97Pro荧光分光光度计进行荧光强度检测，得到梯度浓度的蓖麻毒素B链标准品分散液的荧光强度，测试结果如图2中C所示。
(2.2)以波长作为横坐标(X)为横坐标，以荧光强度(Y)作为纵坐标，使用Origin软件绘制曲线，得到式(3)所示的荧光强度标准曲线，测试结果如图2中D所示。
图3为实施例1制备的试剂盒的灵敏度测试结果，其中，A为MRS模式下不同浓度RTB的△T2检测值，B为弛豫时间标准曲线(ΔT2与蓖麻毒素浓度对数的线性关系)；C为FL模式下不同浓度RTB的荧光光谱；D为荧光强度标准曲线(荧光强度与波长之间的线性关系)，所有检测数据均以三个平行测量值的平均值±标准差表示。由图3中A～B可知，MRS模式下，弛豫时间标准曲线为Y＝153.23X+792.16，R2＝0.9995，线性检测范围为0.001～500ng/mL，检出限(3σ/k)为0.8pg/mL，定量限(10σ/k)为2.67pg/mL。由图3中C～D可知，FL模式下，荧光强度标准曲线为Y＝245.01X+1219.63，R2＝0.9909，线性检测范围为0.005～500ng/mL，检测限检出限(3σ/k)为3pg/mL，定量限(10σ/k)为10pg/mL。说明，本发明提供的检测线性范围广且线性关系良好、检出限低、定量限低、具有超高灵敏度。
对比例1
购买于天津晟佰昊生物技术有限公司的商用ELISA试剂盒，采用ELISA试剂盒的操作说明进行检测，其中，待测样品：蓖麻毒素B链的加标浓度分别为1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL的蓖麻毒素B链的自来水溶液，空白样品：不加蓖麻毒素B链的自来水。
对比例2
按照实施例1的方法制备蓖麻毒素B链的检测试剂盒，与实施例1的区别在于磁性纳米配对探针中Fe3O4的粒径为10nm，得到的磁性纳米配对探针(记为MNP10-Blocker)。
对比例3
按照实施例1的方法制备蓖麻毒素B链的检测试剂盒，与实施例1的区别在于磁性纳米配对探针中Fe3O4的粒径为20nm，得到的磁性纳米配对探针(记为MNP20-Blocker)。
实施例7
加标回收率
待测样品：经0.22μm滤膜过滤的天津管网末端提供的自来水与蓖麻毒素B链标准品的混合溶液，待测样品中蓖麻毒素B链标准品的加标水平分别为0、1、10和100ng/mL，分别采用实施例1制备的检测试剂盒、对比例1～2的试剂盒，按照实施例2进行检测，与实施例2的区别在于，对比例1选用商用ELISA试剂盒进行检测，对比例2选择磁性纳米配对探针中Fe3O4的粒径为10nm。将待测样品分别按照文献[1]～[6]的方法进行检测，检测结果如表1～2所示。
表1 RTB检测结果
由表1可知，本发明提供的检测试剂盒在MRS模式下RTB的回收率为91.98～117.76％，RSD为1.08～2.87％；FL模式下RTB的回收率为92.99～116.07％，RSD为2.40～3.83％；采用商用ELISA试剂盒进行ELISA法检测的RTB的回收率为80.21～99.87％，RSD为2.69～4.71％，说明本发明提供的检测试剂盒的回收率高，相对标准偏差小。综上所述，本发明提供的检测试剂盒的准确性和可靠性高。
表2不同检测方法的检测结果对比
注“-”表示文献中没有提及。
参考文献：
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[3]Liu H Z,Tang J J,Ma X X,et al.Galactose-functionalized magneticiron-oxide nanoparticles for enrichment and detection of ricin toxin.[J].Analytical Sciences,2011,27(1):19-24.
[4]KANDASAMY K,SELVAPRAKASH K,CHEN Y C.Using lactosylated cysteinefunctionalized gold nanoparticles as colorimetric sensing probes for rapiddetection of the ricin B chain[J].Mikrochim Acta,2019,186(12):847.
[5]Oliveira G,Schneedorf J M.A Simple,Fast and Portable Method forElectrochemical Detection ofAdenine Released by Ricin Enzymatic Activity[J].Toxins,2021,13(4):238.
[6]YANG J,ZHANG Z,PANG W,et al.Graphene oxide based fluorescencesuper-quencher@QDs composite aptasensor for detection of Ricin B-chain[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2019,301:127014-127022.
由表2可知，与传统仪器和单模检测方法相比，本发明提供的检测方法具有简单、快速、不受复杂环境的干扰、准确、可靠、经济的特点，双模式检测为实验结果提供了双重验证，为开发多种应用的多模传感平台提供了良好的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种蓖麻毒素B链的检测试剂盒，包括磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针；
所述磁性纳米荧光检测探针的化学组成包括Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子和与所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子化学结合的蓖麻毒素B链适配体；
所述磁性纳米配对探针包括Fe3O4纳米粒子和与所述Fe3O4纳米粒子化学结合的互补链；
所述蓖麻毒素B链适配体与所述互补链碱基互补配对。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Fe3O4@SiO2(FITC)纳米粒子包括Fe3O4纳米粒子以及包覆在所述Fe3O4纳米粒子外的SiO2与FITC的混合层；所述Fe3O4纳米粒子的粒径为300nm。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述磁性纳米配对探针中Fe3O4纳米粒子的粒径为30nm。
4.根据权利要求1、2或3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括溶剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述溶剂包括磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐水溶液或甲醇水溶液。
6.权利要求1～5任一项所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Fe3O4@SiO2(FITC)-NH2纳米粒子、交联剂、羧基修饰的蓖麻毒素B链适配体和和第一缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米荧光检测探针；
(2)将Fe3O4纳米粒子、交联剂、互补链和第二缓冲溶液混合，进行偶联反应，得到磁性纳米配对探针；
将所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针独立包装；
所述步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中：
所述交联剂独立地包括碳二亚胺类化合物和琥珀酰亚胺类化合物；所述碳二亚胺类化合物包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或碳化二亚胺；所述琥珀酰亚胺类化合物包括N-羟基琥珀酰亚胺和/或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液独立地包括磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐水溶液或甲醇水溶液；
所述偶联反应的温度独立地为30～37℃，时间独立地为0.5～1h。
8.一种采用权利要求1～5任一项所述的所述蓖麻毒素B链的检测试剂盒或权利要求6～7任一项所述制备方法得到的蓖麻毒素B链的检测试剂盒检测蓖麻毒素B链的方法，包括弛豫开关检测模式和荧光检测模式，包括以下步骤：
(1)弛豫开关检测模式
(1.1)将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到待测样品弛豫时间；
(1.2)将空白液、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后检测弛豫时间，得到空白弛豫时间；
(1.3)根据式(1)计算横向弛豫时间；
△T2＝T2样品-T2空白 式(1)；
所述式(1)中T2样品为待测样品弛豫时间，T2空白为空白弛豫时间，△T2为横向弛豫时间；
(1.4)根据横向弛豫时间与弛豫时间标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述弛豫时间标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与横向弛豫时间的线性关系曲线；
(2)荧光检测模式
(2.1)将待测样品、磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针混合，进行孵育后待测样品荧光强度；所述检测荧光强度的激发波长为440nm，发射波长为525nm；
(2.2)根据所述待测样品荧光强度与荧光标准曲线计算待测样品中蓖麻毒素B链的浓度；所述荧光标准曲线为蓖麻毒素B链浓度对数与荧光强度的线性关系曲线；
所述步骤(1.1)和所述步骤(1.2)没有时间先后顺序；
所述步骤(1)与所述步骤(2)没有时间先后顺序。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(2.1)中，所述磁性纳米荧光检测探针和磁性纳米配对探针的摩尔比独立地为1～3：1。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(2.1)中，所述孵育的温度独立地为30～37℃，时间独立地为30～90min。
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