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CN115161268B - 区域分层的软骨细胞层片的制备方法及其用途 - Google Patents

区域分层的软骨细胞层片的制备方法及其用途 Download PDF

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CN115161268B CN202210271363.3A CN202210271363A CN115161268B CN 115161268 B CN115161268 B CN 115161268B CN 202210271363 A CN202210271363 A CN 202210271363A CN 115161268 B CN115161268 B CN 115161268B
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Abstract

本发明提供一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，该方法包含以下步骤：（a）提供来自对象的软骨样本；（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞；（c）培养所述深层区软骨细胞直至细胞满盘以形成深层区软骨层片；（d）接种所述中层区软骨细胞到所述深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至细胞满盘以形成中层区软骨层片；及（e）接种所述浅层区软骨细胞到所述中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至细胞满盘以形成浅层区软骨层片，来获得所述区域分层的软骨细胞层片。

Description

区域分层的软骨细胞层片的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种制备软骨细胞层片的方法，其特征在于，从对象中取得的软骨样本中分离出软骨细胞，并从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞，再将上述三种软骨细胞分别进行细胞增殖，然后按顺序先以深层区软骨细胞建构深层区软骨层片，再在其上面植入中层区软骨细胞建构中层区软骨层片，最后再植入浅层区软骨细胞来建构浅层区软骨层片，从下到上堆叠以构建出具有三层结构的层片。
背景技术
关节软骨由于没有血管与神经组织以及低细胞基质比的特性，一旦损伤后非常难以自我修复。关节软骨损伤通常导致退行性关节疾病的早期发作。到目前为止，实现软骨组织功能的完整修复仍面临重大挑战。自体软骨细胞移植（autologous chondrocyteimplantation，ACI）目前是一种很有前景的治疗策略，也是美国食品药物管理局（FDA）批准的唯一一种基于细胞的治疗软骨损伤的治疗方法。与传统的微骨折（microfracture）方法相比，自体软骨细胞移植在一些临床病例中已经成功地再生出透明样（hyaline-like）新软骨。微骨折方法因其简单性和低成本而被广泛使用，然而此方法仅对小病变有效，且因为形成的是纤维软骨而不是透明关节软骨，仅能提供相对短期的功能改善。在近期研究中，对于更大的缺损及/或更严重的基线症状（baseline symptom），自体软骨细胞移植方法已被证明比微骨折更有效。
考虑天然关节软骨和重建复杂的区域组织对于设计合适的功能性组织修复策略至关重要。关节软骨由含有丰富的胶原纤维及蛋白聚糖（proteoglycan, PG）的基质组成，其中嵌有能生成软骨细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的软骨细胞。关节软骨分为浅层区（superficial zone，SZ）、中层区（middle zone，MZ）、及深层区（deep zone，DZ）三个区域，各具有不同的细胞形态和密度、细胞外基质结构排列、组织复杂性、及生物力学特性。浅层区（由软骨上方的10-15%组成）含有相对高密度及扁平的软骨细胞，其中胶原纤维平行于关节表面。浅层区的软骨细胞以相对较低的速率产生糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG），并分泌一种特定的浅层区蛋白（superficial zone protein，SZP），该蛋白在关节运动过程中起到使滑动流畅的作用。中层区（表面至总软骨厚度的40-50%）含有更多圆形软骨细胞及随机方向的胶原纤维。深层区（总软骨厚度的30-40%）由呈垂直柱状排列的大软骨细胞及垂直于关节表面排列的胶原纤维所组成。深层区中存在几种标记，例如在关节软骨最深层中表达的Notch-Delta信号传导通路及X型胶原蛋白。胶原纤维以II型胶原蛋白（collagen type II，Col 2）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，Aggr）为主，但也含有其他次要的IX型胶原蛋白（collagen type IX，Col 9）及XI型胶原蛋白，它们在调节纤维大小、纤维间交联、以及与蛋白聚糖的相互作用方面很重要。由于胶原蛋白和蛋白聚糖结构排列的差异，导致生物力学特性的区域性差异显著，包括与软骨深度相对应的拉伸、压缩、及剪力特性。此外，软骨的特定区域结构在调节对不同软骨组织层的适当信息传递方面也很重要。例如，保留软骨表层不仅对软骨的完整性和降低关节软骨表面的摩擦很重要，而且对调节深层区软骨细胞的增殖和代谢活动也很重要。然而，自体软骨细胞移植策略通常植入浅层、中层、深层混合在一起的软骨细胞在生物材料支架上，因此，以前软骨组织工程所构建的再生软骨通常是同质的而无分层结构，缺乏其天然浅层、中层、深层的结构。
回顾先前的研究可以得知，如果能重建天然关节软骨的分层特征，就可以增强新软骨的机械性能并保持再生软骨的长期功能。近年来就有研究尝试利用无支架和无基质、基于支架/基质、及混合方法等技术来制造具有区域分层的关节软骨。其中，最简单的就是微量颗粒培养法，颗粒确实会形成细胞和基质的区域组织，糖胺聚糖的含量通常从外表面向中心增加。然而，这种方法不适合直接应用于临床治疗，因为颗粒很小，区域变化是球形的而非取决于深度，无法修复大于一平方厘米的软骨缺损。而支架/基质方法仍然有支架孔径和互连性的控制问题，以及难以将细胞均匀地植入支架中（通常在外围显示高细胞密度，在中心显示低细胞密度）；而且支架对身体来说是一种异物，可能会引起严重的炎症及免疫反应。另外，有研究尝试使用具有硬度梯度或成分梯度的水凝胶来植入区域特异性软骨细胞来构建分层框架，然而这种方法在临床实践中经常发生各分层之间因连接较弱而剥离。为了克服上述问题，一种最为可行的方法是利用细胞层片技术，因为细胞层片技术有助于有效堆叠不同区域的软骨细胞，且它的无支架特性不会引起炎症反应并能消除免疫排斥的风险。最近，细胞层片已被应用于再生医学，例如心肌、角膜、及肾细胞的再生。此外，该技术也已被开发用于制造修复关节软骨缺损的软骨细胞层片，但之前的软骨细胞层片并不具有浅层、中层、深层的结构。
发明内容
本发明提供一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，该方法包含以下步骤：（a）提供来自对象的软骨样本；（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞三种软骨细胞；（c）接种所述深层区软骨细胞到培养皿中的培养基内，并培养所述深层区软骨细胞直至达到细胞满盘以形成深层区软骨层片；（d）接种所述中层区软骨细胞到步骤（c）所培养形成的深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至达到细胞满盘以形成中层区软骨层片；及（e）接种所述浅层区软骨细胞到步骤（d）所培养形成的中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至达到细胞满盘以形成浅层区软骨层片，来获得具有深层区软骨层片、中层区软骨层片、及浅层区软骨层片的所述区域分层的软骨细胞层片。
本发明旨在利用细胞层片技术，通过将软骨细胞先分离为浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞三种群体，再利用细胞层片技术来制造具有分层结构的再生软骨。
本发明使用Percoll非连续性密度梯度离心法，从软骨细胞中分选出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞三种软骨细胞，以重建天然关节软骨的分层结构，该结构被认为是在修复的关节软骨中重现生物力学特性及获得长期组织完整性所需的关键因素。如图1所示，从远端股骨软骨中获得的软骨细胞被分成具有形态及表型差异的三层细胞。最上面的部分主要来自关节软骨的深层区，含有较大的细胞及高浓度的蛋白聚糖。相较之下，最下面部分的细胞来自浅层区，其细胞最小，蛋白聚糖浓度相对较低，分裂速度比来自中层区及深层区的细胞慢。此外，通过检测与不同软骨区域相关的细胞外基质标记和分泌蛋白，本发明证实了密度梯度分类的亚群的个别的软骨形成特性。在中间/最上面的部分发现聚蛋白聚糖及Col-2a1相对于代表关节软骨中层区及深层区的最下面的部分有显著更高的表达。这些结果与先前使用解剖方法以及基于细胞大小的惯性螺旋微通道技术将浅层区、中层区、及深层区软骨细胞从全层（full thickness，FT）软骨块分离的研究一致。相反地，浅层区PRG4被发现在最下面的部分中有高水平的特异性表达，这也证明了在最下面的部分中大部分的细胞是来自浅层区。
体外实验显示，分层的细胞层片的软骨形成功能优于传统不分层层片。研究结果发现有以下优点：（1）本发明制作的关节软骨细胞的三层细胞层片（浅层区、中层区、深层区），以实时聚合酶链反应（real time PCR）分析软骨形成标记，发现分层细胞层片中的Col-2a1及聚集蛋白聚糖mRNA与不分层细胞层片相比显著增加，相反地，分层细胞层片中的MMP13 mRNA表达水平则低于不分层细胞层片中的表达水平。此外，与不分层层片相比，分层层片的细胞增殖率更高。（2）与不分层层片相比，分层层片分泌的TIMP-1和TIMP-3浓度显著较高，基质金属蛋白酶（MMP）-3和MMP13的浓度较低。（3）与不分层层片相比，在分层层片中产生的促炎性细胞因子（pro-inflammatory cytokine）如IL-6、IL-8、及TNF-α较少（图1）。目前已知软骨细胞能够产生炎性细胞因子，其通过自分泌及旁分泌途径对组织产生负面影响。多项研究证实，移植的软骨细胞的IL-1β表达会显著影响自体软骨细胞移植后的临床结果。因此，调节细胞层片内主要炎性细胞因子（如IL-1β及TNF-α）表达的能力可能会改善自体软骨细胞移植的表现。（4）通过阿辛蓝染色（Alcian blue staining）评估和检测糖胺聚糖含量的组织学评估，显示分层层片比不分层层片产生更多的蛋白聚糖沉积。（5）免疫荧光和蛋白质印迹法（Western blot）分析显示，在分层层片中，ADAMTS-4（a disintegrin andmetalloproteinase with thrombospondin motifs 4）、ADAMTS-5（a disintegrin andmetalloproteinase with thrombospondin motifs 5）的染色较弱，Col-2a1和聚集蛋白聚糖的染色则较强。
此外，本发明使用猪缺损模型，利用区域分层的软骨细胞层片修复软骨缺损，并与利用不分层软骨细胞层片所修复的比较。从组织学评分显示，将经Percoll非连续性密度梯度离心的三层区域软骨细胞层片，在植入12周后，新生软骨呈现出透明状并呈现原生软骨特征的区域结构（图2及图3）。此外，所产生的软骨质量更好，与植入未分层软骨细胞或对照组相比有显著的优良品质。
本文中所使用的术语“一”或“一个”是用于描述本发明的元素及组分。该术语仅为了描述方便并给出本发明的一般意义。该描述应理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非明显的另有其他含义。
本发明提供了一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，该方法包含以下步骤：（a）提供来自对象的软骨样本；（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞；（c）接种所述深层区软骨细胞到培养皿中的培养基内，并培养所述深层区软骨细胞直至达到90-100%细胞汇合（cellconfluence）以形成深层区软骨层片；（d）接种所述中层区软骨细胞到步骤（c）所培养形成的深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至达到90-100%细胞汇合以形成中层区软骨层片；及（e）接种所述浅层区软骨细胞到步骤（d）所培养形成的中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至达到90-100%细胞汇合以形成浅层区软骨层片，来获得具有所述深层区软骨层片、所述中层区软骨层片、及所述浅层区软骨层片的所述区域分层的软骨细胞层片。
在一个实施例中，所述软骨样本是关节软骨样本。在一个优选的实施例中，所述软骨样本是软骨组织。在一个更优选的实施例中，所述软骨样本是关节软骨组织。
本文中所使用的术语“对象”是指动物。在一个优选的实施例中，所述对象是指哺乳动物。在一个更优选的实施例中，所述对象是指人类。
本发明通过密度梯度离心从所述软骨细胞中分离出所述浅层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞以及所述深层区软骨细胞。在另一个实施例中，步骤（b）中的分离方法包含通过密度梯度离心的细胞分离技术。在一个优选的实施例中，所述密度梯度的范围包含1.015-1.07 g/ml。在一个更优选的实施例中，所述密度梯度离心的速率为400 × g持续20-30分钟。
在本发明中，分离出三种软骨细胞后，所述浅层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞以及所述深层区软骨细胞会分别进行培养。在一个实施例中，所述培养基包含DMEM/F12、胎牛血清、抗坏血酸和抗生素。此培养的目的是在于让细胞增殖以达到接种所需的细胞数目。在一个实施例中，所述步骤（b）进一步包含在所述三种软骨细胞分离后，将所述浅层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞、及所述深层区软骨细胞分别进行培养。
在一个实施例中，用于接种的浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞的细胞密度范围为每平方厘米1x104 - 5x104个细胞。
在一个实施例中，将所述深层区软骨细胞培养3-5天以达到90-100%细胞汇合并形成所述深层区软骨细胞层片。
在另一个实施例中，将所述中层区软骨细胞培养3-5天以达到90-100%细胞汇合并形成所述中层区软骨细胞层片。
将所述浅层区软骨细胞接种在所培养形成的所述中层区软骨细胞层片上后，将所述浅层区软骨细胞培养3-5天以达到90-100%细胞汇合，以形成所述浅层区软骨细胞层片。
在另一个实施例中，所述深层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞和所述浅层区软骨细胞会培养直至达到95-100%细胞汇合。在一个优选的实施例中，所述深层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞和所述浅层区软骨细胞会培养直至达到100%细胞汇合。
在所述区域分层的软骨细胞层片的制备过程中，所述深层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞和所述浅层区软骨细胞会各自分泌细胞因子而形成个别的细胞外基质。因此，所述区域分层的软骨细胞层片的最终产物包含具有不同区域特征的软骨细胞外基质。
在本发明中，所述区域分层的软骨细胞层片在所述浅层区软骨细胞层片形成后还需要额外培养1-3周。在所述区域分层的软骨细胞层片的制备过程中，所述浅层区软骨细胞、所述中层区软骨细胞以及该深层区软骨细胞都会持续培养。在一个实施例中，在接种所述浅层区软骨细胞后，所述区域分层的软骨细胞层片的培养时间范围为1-4周。在一个优选的实施例中，在接种所述浅层区软骨细胞后，所述区域分层的软骨细胞层片的培养时间范围为1-3周。
此外，用于培养所述区域分层的软骨细胞层片的培养基进一步添加苏拉明（suramin）。苏拉明可以通过增强Col-2a和聚集蛋白聚糖的表达并降低Col1a的合成来促进软骨细胞分化。在培养所述区域分层的软骨细胞层片的过程中，苏拉明显著抑制基质破坏蛋白酶和炎症介质的表达，同时增强白介素-1β诱导的（IL-1β）软骨细胞片中软骨合成代谢因子的产生。在一个实施例中，用于培养步骤（e）中的所述区域分层的软骨细胞层片的培养基包含苏拉明。此外，在步骤（e）中，所述区域分层的软骨细胞层片会与所述培养基分离，以获得具有深层区软骨层片、中层区软骨层片、及浅层区软骨层片的所述区域分层的软骨细胞层片。在另一个实施例中，所述步骤（e）进一步包含将所述区域分层的软骨细胞层片与所述培养基分离。
通过本发明的制备方法，三层层片由下到上的排列方式依次为所述深层区软骨细胞层片、所述中层区软骨细胞层片、及所述浅层区软骨细胞层片。因此，本发明所述的区域分层的软骨细胞层片是软骨层片的复合体，其包含深层区软骨细胞层片（内含具有深层区软骨细胞特征的软骨细胞外基质）、中层区软骨细胞层片（内含具有中层区软骨细胞特征的软骨细胞外基质）、及浅层区软骨细胞层片（内含具有浅层区软骨细胞特征的软骨细胞外基质）。本发明所制备的具有三层结构的所述区域分层的软骨细胞层片与天然软骨相似。
本发明还提供一种治疗软骨缺损的方法，包含将组合物施用于对象的软骨缺损部位，其中所述组合物包含区域分层的软骨细胞层片。所述区域分层的软骨细胞层片通过本发明的方法制备。
术语“治疗”是指疾病或病症的任何改善（也指抑制疾病或改善其至少一种临床症状的表象、范围、或严重程度）。
如本文所用，术语“软骨缺损”包括但不限于因年龄、基因突变或外力引起的损伤所造成的软骨退化或软骨缺损/磨损的疾病。软骨广泛存在于骨关节面、肋软骨、气管、耳廓、腰椎间盘。在一个实施例中，所述软骨缺损包含关节软骨缺损。
本发明的组合物施用于所述对象的优选的途径包含关节内施用。
本发明进一步提供了一种包含区域分层的软骨细胞层片的组合物。所述区域分层的软骨细胞层片通过本发明的方法制备。
此外，本发明还提供一种组合物在制备用于治疗软骨缺损的医药组合物中的用途，其中所述组合物包含区域分层的软骨细胞层片。所述区域分层的软骨细胞层片通过本发明的方法制备。在一个实施例中，所述区域分层的软骨细胞层片包含具有不同区域特征的软骨细胞外基质。
在另一个实施例中，所述软骨缺损包含关节软骨缺损。在一个优选的实施例中，所述组合物的施用途径包含关节内施用。
附图说明
图1显示不分层关节软骨细胞（Articular Chondrocytes，AC）层片与分层层片中促炎性细胞因子表达的比较。为了测定促炎基因的表达水平，在构建出三层的层片3周后提取全部的RNA。通过qRT-PCR测量IL1-β（A）、TNF-α（B）、MIF（C）、IL-6（D）及IL-8（E）的mRNA水平。如果*p < 0.05，***p<0.001，则数据在统计学上有显著差异。
图2显示修复软骨的肉眼及组织学观察。图2A显示手术后12周，对照组、未分层的及分层的关节软骨细胞（AC）层片植入组中猪膝关节缺损愈合的照片。红色圆圈表示原始的缺损边缘。图2B显示12周时修复软骨的ICRS肉眼评估分数。数据表示为平均值±SD（n =5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。图2C显示H&E染色。右侧图像表示左侧图像中的方框中显示的区域的放大图像。图2D显示手术后12周，在对照组、未分层的及分层的细胞层片植入组中番红（Safranin O）/固绿（Fast green）的染色结果；比例尺为100 μM。图2E显示手术后12周，在对照组、未分层的及分层的细胞层片植入组中阿辛蓝（Alcian blue）的染色结果；比例尺为100 μM。图2F显示用Mankin分数在小放大倍数（左侧图像）及大放大倍数（右侧图像(#)）下对切片进行评分。箭头表示陷窝（lacunae）。
图3显示再生软骨12周时的免疫组织化学染色。图3A显示Col-2a1、Col-10a1、及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的免疫组织化学染色的代表性图像。蓝色矩形表示原始缺损边缘并在右侧放大为较大的图像。图3B显示12周时细胞层片移植治疗与未治疗三组Co1-2a1染色的IOD定量分析。图3C显示12周时细胞层片移植治疗与未治疗三组聚集蛋白聚糖（Aggrecan）染色的IOD定量分析。图3D显示12周时细胞层片移植治疗与未治疗三组Col-10a1染色的IOD定量分析。数据表示为平均值±SD（n = 6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
具体实施方式
本发明可以用许多不同的形式来实施，并且不应被视为仅限于本文中所阐述的实例。所描述的实例并不限于本文中所述的本发明范围。
材料及方法
1. 细胞制备及细胞层片的构建
所有动物程序均经过机构审查委员会（Institutional Review Board, IRB）的审查及批准。取5～8月龄猪远程股骨的关节软骨。使用组织打孔器（biopsy punch）在股骨髁的非承重区制造直径8 mm、深5 mm的软骨缺损。用解剖刀将获得的关节软骨块切成小块，并在PBS中以0.1% (w/v)胰蛋白酶在温和搅拌下于37°C培养20分钟。除去胰蛋白酶，用培养基洗涤碎片，并在37°C搅拌，于含有0.01% (w/v)（0.166 U/ml）胶原酶P（Boehringer/RocheMannheim, Germany）及10%胎牛血清（fetal calf serum, FCS）的培养基中消化整夜。然后将关节软骨片在含有1.5 mg/ml II型胶原酶及5% FBS的补充DMEM/F12中于37°C消化10小时。在对细胞外基质进行10小时酶消化后，通过70-μm尼龙细胞过滤器（Becton Dickinson,Franklin Lakes, NJ）过滤，将释放的细胞与组织碎片分离，并通过150 × g离心5分钟从滤液中收集。然后将细胞以1×PBS洗涤两次并重新悬浮于1 ml的DMEM/F12 培养基中。各种区域软骨细胞的分离根据Byoung等人的报告（Min BH, Kim HJ, Lim H, Park SR.Characterization of subpopulated articular chondrocytes separated by Percolldensity gradient. In vitro cellular & developmental biology Animal. 2002;38(1):35-40）进行并经过一些修改。简言之，将关节软骨细胞在按重量制备的Percoll非连续性（GE Healthcare）密度梯度（密度为1.015-1.07 g/ml）上分层，并在离心机中以400 × g离心20-30分钟。为了制造不分层或分层的细胞层片，根据上述方法获取关节或深层区软骨细胞，在37℃、5% CO2及95%空气的大气中，将其以每平方厘米1 x 104 - 5 x 104个细胞接种在6孔培养皿上，并置于添加有10%胎牛血清（FBS; GIBCO, NY, USA）、100 μg/ml抗坏血酸、及1%抗生素-抗霉菌剂（antibiotics–antimycotic）（GIBCO, NY, USA）的DMEM/F12中。连续培养约3-5天，直到第一层软骨细胞达到汇合，将第二层软骨细胞（包括不分层软骨细胞及中层区软骨细胞）接种在第一层上并连续培养约3-5天直至100％汇合。随后将第三层软骨细胞（包括不分层软骨细胞及浅层区软骨细胞）接种在第二层上并继续培养1-3周。此外，该培养皿的成分可以在此额外的1-3周内进一步添加苏拉明（suramin）。三周后，细胞培养皿中形成一层薄膜，在倒置显微镜下发现其含有三层软骨细胞及细胞外基质（ECM）。根据Yamato等人报道的方法（Yamato M, Utsumi M, Kushida A, et al. Tissueengineering. 2001;7(4):473-480）将这些薄片收集到聚偏二氟乙烯（polyvinylidenedifluoride, PVDF）膜上。获取不分层层片及分层层片并进行生化、组织学、及免疫荧光评估。
2. 细胞增殖和存活率
为检测细胞增殖率，直接计算不分层层片（未分层的）及分层层片（分层的）的细胞数。将这些层片用TrypLE Express在37℃消化30分钟，然后用0.25 mg/mL胶原酶P在37℃培养30分钟。收集分散的细胞并使用计数器计数。通过MTT测定来确定细胞存活率。
3. 细胞层片的基因表现
使用TRIzol (Invitrogen)提取软骨细胞层片的总RNA。根据制造商的说明，将2 μg所纯化的总RNA用Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒（ThermoFisher）进行反转录。简言之，将该溶液在65°C培养5分钟，将其与第一链缓冲液、DTT、及RNaseOUT混合并使最终体积为20 μL。接着，将该溶液在42°C培养60分钟，然后在70°C培养15分钟以灭活反转录酶活性。使用SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)进行实时聚合酶链反应（real-time PCR），并在LightCycler PCR及检测系统（Roche Diagnostics）上进行处理。每个反应（20 μl）以一式两份进行，且含有1 μl的cDNA模板以及以下引物序列：
col2-a1：正向引物(ACTCCTGGCACGGATGGTC)及反向引物(CTTTCTCACCAACATCGCCC)；
aggrecan：正向引物(CCCAACCAGCCTGACAACTT)及反向引物(CCTTCTCGTGCCAGATCATCA)；
col-10a1：正向引物(TGAACTTGGTTCATGGAGTGTTTTA)及反向引物(TGCCTTGGTGTTGGATGGT)；
gapdh：正向引物(TCACGACCATGGAGAAGGCT)及反向引物(CAGGAGGCATTGCTGATGATC)；
col-1a1：正向引物(CTGGTACGGCGAGAGCATGACC)及反向引物(GGAGGAGCAGGGCCTTCTTGAG)；
sox5：正向引物(GGCCAAGCAGCAGCAAGAACAG)及反向引物(AGCTGAAGCCTGGAGGAAGGAG)；
sox6：正向引物(CAGCCCTGTCAGTCTGCCTAACA)及反向引物(GCATCTTCCGAGCCTCCTGAATAGC)；
sox9：正向引物(GGCAATCCCAGGGTCCACCAAC) 及反向引物(TGGTCGAACTCGTTGACGTCGAAG) ；
mmp13：正向引物(ACCCAGGAGCCCTCATGTTTCC)及反向引物(CAGGGTTTCTCCTCGGAGACTG)；
runx2：正向引物(CCAGACCAGCAGCACTCCATAC)及反向引物(GGGAACTGCTGTGGCTTCCATC)；
prg4：正向引物(CTCCCAAGGAGCAGCTTCTAC)及反向引物(GGTGGTGGGAGCTGGTTCCTTG)；
pcna：正向引物(GCGCCTGGTCCAGGGC)及反向引物(TCACGCCCATGGCCAAATTGC)；
IL-1β：正向引物(GTACATGGTTGCTGCCTGAA)及反向引物(CTAGTGTGCCATGGTTTCCA)；
IL-6：正向引物(GGCAGAAAACAACCTGAACC)及反向引物(GTGGTGGCTTTGTCTGGATT)；
IL-8：正向引物(TAGGACCAGAGCCAGGAAGA)及反向引物(CAGTGGGGTCCACTCTCAAT)；
TNFα：正向引物(ACTGCACTTCGAGGTTATCG)及反向引物(GCTGGTTGTCTTTCAGCTTC)；
MIF：正向引物(CGTGCGCCCTTTGCAGTCTG)及反向引物(TGGCCGCGTTCATGTCGTAG)。
循环参数为95℃ 15分钟以活化DNA聚合酶，随后95℃ 15秒、60℃ 20秒、及72℃30秒共40个循环。在反应结束时产生熔解曲线。将每个测试基因的阈值循环数（C t）以持家GAPDH基因值（ΔC t ）归一化，并将每个实验样本参考其对照（ΔΔC t ）。倍数变化值表示为2−ΔΔCt 。
4. 总糖胺聚糖（GAG）定量
使用1,9-二甲基亚甲蓝（DMMB；Polysciences）测定总硫酸化糖胺聚糖含量。使用来自鲨鱼软骨的硫酸软骨素C（Chondroitin sulfate C）作为标准。简言之，将100 μL消化后的样本与1 ml二甲基亚甲蓝染料溶液混合，并立即测量656 nm的吸光度。使用Hoechst33258染料测量DNA。简言之，将10 μL消化后的样本与200 μL Hoechst染料溶液（0.7 μg/mL）混合。在340 nm的激发波长与465 nm的发射波长下进行荧光测量。从小牛胸腺DNA获得标准曲线。将糖胺聚糖含量以每个样本测量的DNA量标准化，并表示为μg GAG/μg DNA。
5. 体液因子（humoral factor）的测量
在添加有1% FBS及1% AB的3 mL DMEM/F12中培养不分层层片及分层层片72小时。收集上清液并以12,000g离心10分钟以去除细胞碎片。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量转化生长因子β1（TGF-β1）、金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP3）、金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）、基质金属蛋白酶3（MMP3）、基质金属蛋白酶13（MMP13）的浓度。由于FBS中含有蛋白质，减去含1% FBS的空白培养基所检测到的信号以作为校准。每个供体至少重复测量两次，并使用平均值。
6. 免疫荧光测定
将三层细胞层片的冰冻切片用OCT包埋剂（optimal cutting temperaturecompound）固定并冷冻。将细胞层片与Col-2a1一级抗体（Proteintech，15943-1-AP，1:100稀释）、Aggrecan（Proteitech, 13880-1-AP）、MMP3（Proteitech 66338-1-Ig）、MMP-13（Proteintech, 18165-1-AP）、ADAMTS-4（ABclonal，A2525）、ADAMTS-5（ABclonal，A2836）、及二级抗体（LEADGENE®山羊抗兔IgG (H+L)-TAMRA及LEADGENE®山羊抗小鼠 IgG (H+L)-FAM）一起培养。将细胞核用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。然后在高质量的荧光显微镜下观察样本并拍照。
7. 阿辛蓝染色
在培养后获取关节软骨细胞层片及分层层片，然后在最佳切割温度的复合物中包埋及冷冻。接着，使用标准方法用阿辛蓝对5 μm厚的切片进行蛋白聚糖染色。
8. 软骨细胞层片的移植
制备好细胞层片后，将该细胞层片自体植入同一只猪体内。移植手术前，肌肉内给予0.2 mg/kg导美睡（Dormicum）及40 μg/kg美托咪定（Medetomidine）。手术过程中会使用异氟醚（isoflurane）、一氧化二氮（dinitrogen monoxide）、及氧气的混合体进行吸入麻醉。使用组织打孔器在动物的股骨髁区域制造直径8 mm、深5 mm的软骨缺损，并且将受损的全层软骨用软骨细胞层片覆盖或不用软骨细胞层片覆盖。这将在移植组的6头小型猪（7个月大）的膝盖里进行。六头猪将分为三组。第1组（n=6）：接受股骨缺损并用三层分层的层片填充；第2组（n=6）：接受股骨缺损但未填充细胞；第3组（n=6）：接受股骨缺损并用不分层关节软骨细胞层片填充。12周后取出软骨，用4%多聚甲醛（paraformaldehyde）固定1周，并脱钙1个月。接下来，将标本包埋在石蜡中，切成5 μm的切片，并用番红（safranin-O）、阿辛蓝染色。
9. HE染色及免疫组织化学检查
将获取的软骨片固定在4%多聚甲醛中，在分级的乙醇中脱水，然后包埋在石蜡中。将标本用苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）、番红及阿辛蓝染色。也进行免疫组织学分析。将Col-2a1一级抗体（Proteintech，15943-1-AP，1:100稀释）、Aggrecan(Proteitech, 13880-1-AP)、Col10a1（Abcam, ab49945）、及二级抗体（DAKO）依次用于免疫组织学检测。然后在高质量的显微镜下观察样本并拍照。
10. 用于评估软骨修复的组织学分级分数
使用Mankin的组织学分级分数来评估组织切片（Mankin HJ, Dorfman H,Lippiello L, Zarins A. Biochemical and metabolic abnormalities in articularcartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology withbiochemical and metabolic data. The Journal of bone and joint surgery American volume. 1971;53(3):523-537），并如先前所述修改（Sakakibara Y, Miura T,Iwata H, et al. Effect of high-molecular-weight sodium hyaluronate onimmobilized rabbit knee. Clinical orthopaedics and related research. 1994(299):282-292）。总分范围从0到14，包括来自四个类别的分数：软骨结构、细胞异常、基质染色、及潮标（tidemark）完整性。软骨结构的分级为0（正常组织）到6（软骨组织完全破坏）。细胞异常的分级为0（正常组织）到3（细胞过少）。基质染色（用番红）的分级为0（正常组织或染色轻微减少）到4（无染色）。潮标完整性的分级为0（完好）到1（破坏）。根据分数的总和，将每个切片分成四个组织学等级中的一个：正常（0-2）；轻度（3-6）；中度（7-10）；或严重（11-14）。
11. 肉眼评估
在移植细胞层片后的第12周，牺牲各组中的猪并取得软骨。对缺损部位拍照并使用国际软骨修复协会（International Cartilage Repair Society，ICRS）评分系统评分。总分范围从0到12，包括来自三个类别的分数：缺损修复程度、与边界区的融合、及肉眼可见的外观。缺损修复程度的分级为0（未修复）到4（与周围软骨一样）。与边界区的融合的分级为0（不接触到1/4的移植物与周围软骨融合）到4（与周围软骨完全融合）。肉眼可见的外观的分级为0（移植区域全部退化）到4（完整光滑的表面）。
结果
分离区域关节软骨细胞并评估浅层区（SZ）、中层区（MZ）、及深层区（DZ）软骨细胞的功能特性
将5个月大的猪的股骨关节软骨全层切除并收集。股骨关节软骨中存在三个不同的区域，即浅层区（SZ）、中层区（MZ）、及深层区（DZ）。而浅层区（SZ）、中层区（MZ）、及深层区构成软骨总厚度的顶部10-15%、中部40-50%、深部30-40%。骨端软骨三个区域中的那些软骨细胞具有不同的细胞大小（数据未显示）。基于物理特性，将来自三个区域的软骨细胞通过Percoll非连续性密度梯度分级分离，并使密度固定在1.015-1.07 g/ml。离心后，具有不同浮力的浅层区（SZ）、中层区（MZ）、及深层区（DZ）软骨细胞会分布在不同的Percoll密度层中。考虑到深层区（DZ）与中层区（MZ）及浅层区（SZ）相比具有较低的细胞密度，因此本发明收集最上层部分中最大的细胞作为深层区（DZ）软骨细胞、中间层的细胞作为中层区（MZ）软骨细胞、及最下层尺寸最小的细胞作为浅层区（SZ）软骨细胞（数据未显示）。为了验证密度梯度策略是否真的能将软骨细胞从不同区域中分离出来，本发明进一步分析了col-2a1、aggrecan、col-1a1、col-10a1、sox5、sox6、sox9、mmp13、runx2、及prg4的mRNA表达水平（数据未显示）。数据显示，对软骨细胞分化和软骨维持重要的基因（包括col-2a1、aggrecan、sox5、sox6、及sox9）在中层区（MZ）中的显著表达较高。相较之下，col-10a1、mmp13、及runx2在深层区（DZ）中的表达较高。Prg4则被发现在浅层区（SZ）中的表达最高。此外，与中层区（MZ）及深层区（DZ）相比，浅层区（SZ）具有较低的细胞生长速率、细胞存活率与由较低水平的糖胺聚糖和蛋白聚糖所合成的软骨基质。
分层的软骨细胞层片促进细胞存活率、细胞增殖、及软骨形成标记的表达
为了比较软骨缺损的修复质量，将包括浅层区（SZ）、中层区（MZ）、及深层区（DZ）亚群的区域软骨细胞在体外培养制成三层细胞层片（将浅层区（SZ）、中层区（MZ）、及深层区（DZ）从上到下依次堆叠，并将其称为分层关节软骨细胞层片），并与由混合的软骨细胞在体外培养所制成的传统细胞层片（称为不分层关节软骨细胞层片）互相比较。经过额外的3周扩增后，收获细胞并计数（数据未显示）。结果表明，分层细胞层片中的细胞数量显著高于不分层细胞层片中的细胞数量。此外，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclearantigen，PCNA）的转录分析显示分层细胞层片组中比例升高了2.5倍（数据未显示）。通过使用MTT测定，显示分层细胞层片中的平均活细胞百分比略有增加（数据未显示）。从早期的研究中发现，植入软骨细胞的许多标记基因如Col1a1、Col2a1、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、白介素1β（IL-1β）、及骨唾液酸蛋白2（bone sialoprotein-2, BSP-2）的表达会影响自体软骨细胞移植的临床结果。为了比较两种细胞层片的软骨形成能力，本发明利用实时聚合酶链反应（real time PCR）分析软骨形成标记，发现与不分层细胞层片相比，分层细胞层片中的col-2a1及aggrecan mRNA明显增加（以col-2a1来说，分层关节软骨细胞层片比不分层关节软骨细胞层片为4.8倍；以aggrecan来说，分层关节软骨细胞层片比不分层关节软骨细胞层片为30倍）。相反地，分层细胞层片中的mmp13 mRNA表达水平则低于不分层细胞层片中的mmp13 mRNA表达水平（分层关节软骨细胞层片比上不分层关节软骨细胞层片为0.8倍）（数据未显示）。
与不分层层片相比，分层层片分泌较低浓度的细胞外基质破坏酶
为了研究不分层关节软骨细胞层片及分层关节软骨细胞层片所产生的TGF-β、MMP-3、MMP-13、TIMP-1、及TIMP-3蛋白水平，收集细胞层片培养物的上清液并进行ELISA。将不分层关节软骨细胞层片及分层关节软骨细胞层片所分泌的体液细胞因子的浓度做出总结（数据未显示）。分层关节软骨细胞层片产生更高浓度的TIMP-3（分层层片6100至6200pg/mL；不分层层片5320至5470 pg/mL）、TIMP-1（分层层片31至33 ng/mL；不分层层片22至23 ng /mL）（数据未显示），并且不分层关节软骨细胞层片产生更高浓度的MMP3（分层层片7至8 ng/mL；不分层层片22至26 ng/mL）（数据未显示）、MMP-13（分层层片260至275 ng/mL；不分层层片320至340 ng/mL）（数据未显示）。不分层层片及分层层片的TGF-β1浓度则没有显著差异（数据未显示）。
促炎性细胞因子基因在分层层片中的表达低于不分层层片
从以前的报导中发现，移植物中促炎性细胞因子如IL-1β及TNF-α的表达水平对自体软骨细胞移植治疗后的临床结果有负面影响。因此，本发明通过qRT-PCR检测了分层层片及不分层层片中促炎性细胞因子基因的表达，包括IL1-β、TNF-α、IL-6、IL-8、及MIF。如图1所示，IL1-β、TNF-α、IL-6、IL-8在分层层片中的基因表达明显低于不分层层片（以IL1-β来说，不分层层片比上分层层片，分层层片是不分层层片的0.03倍；以TNF-α来说，分层层片是不分层层片的0.01倍；以IL-6来说，分层层片是不分层层片的0.4倍；以IL-8来说，分层层片是不分层层片的0.2倍）。
分层关节软骨细胞层片及不分层关节软骨细胞层片的基质生产能力和免疫组织化学分析的比较
为了研究分层关节软骨细胞层片及不分层关节软骨细胞层片上的软骨形成特性，进行蛋白质印迹法、阿辛蓝染色、及免疫荧光。作为软骨特异性基质胶原蛋白的Col-2的表达在分层关节软骨细胞层片中显著更高（数据未显示）。相比之下，蛋白酶MMP3及MMP13在分层关节软骨细胞层片中的表达较低（数据未显示）。ADAMTS-5（一种密切参与软骨破坏进程的细胞外蛋白酶）的表达在分层关节软骨细胞层片中也很低（数据未显示）。阿辛蓝染色则证实，分层关节软骨细胞层片中显示出比不分层关节软骨细胞层片中更深的蓝色染色。这表明总蛋白聚糖沉积（产生细胞外基质能力的指标）在分层关节软骨细胞层片中更高（数据未显示）。此外，免疫荧光分析显示，Col-2a1及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）在分层软骨细胞层片中的染色高于在不分层层片中的染色。相比之下，MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、及ADAMTS-5在分层软骨细胞层片中的染色低于在不分层层片中的染色（数据未显示）。
由肉眼可见的外型及组织学评估进行体内修复评估
在手术后12周采集关节样本进行肉眼及组织学评估。根据缺损覆盖程度、新软骨颜色、边界区的融合、及表面光滑度进行平均肉眼评分。手术后12周，在植入不分层关节软骨细胞层片（未分层的层片）及分层关节软骨细胞层片（分层的层片）的组中的软骨缺损再生优于对照组（图2A）。从肉眼看来，植入物为分层层片的组，其缺损完全被修复组织覆盖，而其他两组的骨软骨缺损只有部分被填充（图2A）。此外，分层层片组中新形成的组织几乎与相邻的正常组织融合在一起，植入组织和天然组织之间的界限比未分层组中的更不清楚（图2A）。此外，与未分层组相比，分层组中的关节表面更完整、更光滑、更类似于正常的关节组织（图2A）。从数量上看，未分层组（9±0.3）与分层组（10.5±0.1）的ICRS肉眼评分明显高于对照组（4±0.5）（图2B）。此外，经分层的关节软骨细胞层片处理的缺损的得分显著高于经未分层的关节软骨细胞层片处理的缺损的得分（p<0.05）（图2B）。为了观察不同植入的组之间的细胞结构及基质组成，本发明用H&E（图2C）、番红（图2D）、及阿辛蓝染色（图2E）进行了显微组织学评估。对照组中的缺损含有较少的细胞分布并且被类似纤维组织的疏松结缔组织包围，阿辛蓝及番红的染色效果也非常弱。相比之下，植入未分层层片的缺损，其修复区的大部分软骨细胞比对照组更均匀地分布在修复区，并且表现出更高的阿辛蓝及番红染色强度。此外，在分层层片植入组中，新软骨显示更接近天然软骨的区域结构，在浅层区，细胞分布密集且蛋白聚糖含量（如番红所染色）较低。在中层区，蛋白聚糖含量随深度增加而增加，软骨细胞呈圆形并且比浅层区更稀少。此外，也可清楚地观察到陷窝（lacunae）（空心三角形）。在深层区，软骨细胞排列成柱状，且存在软骨特异性陷窝（实心三角形）。并且也表现出三组中最强的阿辛蓝及番红染色强度。最后，使用Mankin组织学评分系统对软骨组织再生质量的相对定量评估分别为对照组13.2、未分层层片组4.3、及分层层片组1.8。这表明与无植入物或经未分层层片处理的缺损相比，经分层层片处理的缺损的组织学评分显著提高（图2F）。为了进一步表征新软骨的组成，本发明对Col-2a1、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、及Col-10a1进行免疫组织化学染色（IHC）以分别检测成熟软骨基质及肥大软骨基质。如图3A所示，新软骨的Col-2a1及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）含量在未分层组及分层组中呈阳性染色，但在对照组中则为阴性。此外，Col-2a1在缺损内再生组织的细胞外基质中表达。相反地，聚集蛋白聚糖（Aggrecan）既保持在细胞内也沉积在细胞外基质中。此外，分层组比未分层组呈现出更多的Col-2a1及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）染色，这与累积光密度（integratedoptical density，IOD）测量的结果一致（图3B及图3C）。然而，这些新软骨在对照组及未分层组中对Col-10a1的染色呈现阳性（图3A，图3D），表示它们是纤维软骨。相比之下，分层组的新软骨是透明软骨，其可由大量的蛋白聚糖与Col-2a1沉积以及缺乏Col-10a1来证实。
本领域技术人员能理解本发明可达成的目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的方法及组合物、其制造程序与方法及其用途是优选的实施例的代表，是示例性的且不仅局限于本发明领域。本领域技术人员将会想到其中可修改之处及其他用途。这些修改都包含在本发明的范围内。本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何本领域技术人员都能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。
说明书中提及的所有专利及出版物，都以本发明有关领域的一般技术为准。所有专利和出版物都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个出版物都被具体且单独地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件、或许多要件、或限制条件、或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并不意在排除任何等同于所示及说明的特点或其部分的名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应当了解虽然已根据优选的实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的申请专利范围内。
<110> 高雄医学大学
<120> 区域分层的软骨细胞层片的制备方法及其用途
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<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col2a1正向引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> col2a1反向引物
<400> 2
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gapdh反向引物
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caggaggcat tgctgatgat c 21
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> col1a1正向引物
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ctggtacggc gagagcatga cc 22
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<212> DNA
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<220>
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ggccaagcag cagcaagaac ag 22
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agctgaagcc tggaggaagg ag 22
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<223> sox6正向引物
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> runx2反向引物
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gggaactgct gtggcttcca tc 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> prg4正向引物
<400> 21
ctcccaagga gcagcttcta c 21
<210> 22
<211> 22
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<213> 人工序列
<220>
<223> prg4反向引物
<400> 22
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<213> 人工序列
<220>
<223> pcna forward primer
<400> 23
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<223> pcna反向引物
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<211> 20
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<220>
<223> IL-1B正向引物
<400> 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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ggcagaaaac aacctgaacc 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6反向引物
<400> 28
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-8反向引物
<400> 30
cagtggggtc cactctcaat 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> TNFa正向引物
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<220>
<223> MIF正向引物
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cgtgcgccct ttgcagtctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MIF反向引物
<400> 34
tggccgcgtt catgtcgtag 20

Claims (10)

1.一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，所述方法包含以下步骤：
（a）提供来自对象的软骨样本；
（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞；
（c）接种所述深层区软骨细胞到培养皿中的培养基内，并培养所述深层区软骨细胞直至达到90-100%细胞汇合以形成深层区软骨层片；
（d）接种所述中层区软骨细胞到步骤（c）所培养形成的深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至达到90-100%细胞汇合以形成中层区软骨层片；以及
（e）接种所述浅层区软骨细胞到步骤（d）所培养形成的中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至达到90-100%细胞汇合以形成浅层区软骨层片，来获得具有所述深层区软骨层片、所述中层区软骨层片、所述浅层区软骨层片的所述区域分层的软骨细胞层片。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述软骨样本是关节软骨样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）中的分离方法包含通过密度梯度离心的细胞分离技术。
4.根据权利要求1所述的方法，其中用于接种的浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞的细胞密度范围为每平方厘米1x104 - 5x104个细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（e）中，在接种所述浅层区软骨细胞后，所述区域分层的软骨细胞层片的培养时间为1-3周。
6.根据权利要求1所述的方法，其中用于培养步骤（e）中的所述区域分层的软骨细胞层片的培养基包含苏拉明（suramin）。
7.一种组合物在制备用于治疗软骨缺损的医药组合物中的用途，其中所述组合物包含由权利要求1所述的方法制备的区域分层的软骨细胞层片。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述软骨缺损包含关节软骨缺损。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述组合物的施用途径包含关节内施用。
10.一种包含区域分层的软骨细胞层片的组合物，其由权利要求1所述的方法制备。
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