CN115110105B - 一种虾壳简易制备壳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虾壳简易制备壳寡糖的方法，涉及海产品加工技术领域。本发明在虾壳中接种乳酸菌进行发酵，然后依次用柠檬酸和NaOH水溶液处理得到甲壳素；将所得甲壳素加入NaOH水溶液中处理，得到壳聚糖；将所述壳聚糖采用电解法制备得到壳寡糖；本发明通过对制备条件的优化实现了93％的电解率，无需高温高压灭杂菌，无需盐酸(HCl)，无需高锰酸钾(KMnO4)和双氧水(H2O2)脱色步骤，制备过程所需药品廉价且安全，所需设备简单，易于操作，即可实现家庭作坊式操作，亦适合工业自动化。本发明以废弃虾壳为原料，能够实现废弃虾壳的高值化，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及海产品加工技术领域，特别是涉及一种虾壳简易制备壳寡糖的方法。
背景技术
我国海域广阔，虾类资源丰富，每年的养殖量以百万吨来计算，2019年中国产量110万吨，进口60万吨。对虾加工后废弃的虾壳虾头约占虾30％的重量，这必然产生巨量的虾壳虾头加工废弃物；虾壳和虾头等废弃物中含有丰富的可利用的成分，含有钙质约60％，蛋白质约20％，几丁质约20％，其余的如虾青素、游离氨基酸、少量脂肪等则不足1％，如果没能及时处理和利用，不仅会造成重大的环境污染，还是一种严重的资源浪费，目前，对于虾壳虾头的利用方面，只有少量用于生产饲料和甲壳素，还有很大一部分没有开发利用。
虾加工品是农业、工业、医药卫生、食品等领域中不可替代的环境友好材料。虾壳的酸碱处理法是最为早期也是最为传统的广泛使用方法，这种方法有工艺简单、提取的浓度高、处理的周期短、工艺成熟等优点，但是过程使用强酸强碱和脱色步骤，存在排除出的工业废水多、酸碱对设备的腐蚀性强、耗能大并且操作安全性低等问题；另外操作过程用到的盐酸(HCl)、高锰酸钾(KMnO4)和双氧水(H2O2)是受管制的易制毒易制爆化学品，购买他们需要报备,这样给生产带来很多不便，限制了酸碱处理法的使用。酶法处理虾壳的反应条件不涉及强酸强碱，较为温和，不会产生较大的污染，对环境友好，但是酶法普遍生产成本较高，难以广泛应用在壳聚糖生产。微生物发酵法则是利用微生物发酵过程来去除虾壳中的蛋白和碳酸钙，从而获得甲壳素，这种方法是目前前景最好的一种方法，也是当今的研究热点。
壳聚糖是甲壳素的衍生物，天然无毒无污染生物降解性好的生物相容性材料，由于分子量较大、高聚合度、水溶性差等对其在工业生产与应用中存在较大的局限性。壳寡糖直接参与人体的生理调节，效果比壳聚糖更为显著，具有许多优于高分子量壳聚糖的功能，比如壳寡糖增加机体免疫功能比壳聚糖更强。而壳聚糖要通过人体的生物酶降解先得到部分小分子量的壳寡糖，一般情况下，降解比例为1－5％，其余95％的壳聚糖则通过人的肠道系统而排除，因而通过体内壳聚糖降解成壳寡糖，利用率低下。低聚壳聚糖即壳寡糖其链段分子上连接着大量的羟基和氨基活泼性基团，具有分子量低、溶解度高、吸湿保湿性好、吸收能力强和具有较好的流动性、生物相容性等优点，同时还具有抗炎、增强免疫力、抗肿瘤、抑菌、清除自由基、抗氧化等生理活性。因此，壳寡糖被誉为“生命第六要素”，得到了学术界热切的关注，在生物、化学、药品，农业等领域被广泛研究和应用，壳寡糖已被我国认定为新食品原料。近几年，国内壳寡糖需求量增速稳定在10％以上，行业处于产业生命周期的成长阶段。2019年我国壳寡糖产量1534吨，同比2018年的1365吨增长了12.38％，2020年中国壳寡糖行业产量达到1645吨。
随着壳寡糖需求日益增加，出现了主要的四大类关于壳聚糖降解方法：酸降解法利用溶液中氢离子的结合作用，引起分子长链部分断裂得到聚合度小的壳聚糖，但往往生产时间长，难以控制寡糖的聚合度等问题；化学氧化降解法利用酸性条件下的氧化还原反应作用，易产生工业污染与产物难以分离的状况；酶降解法利用酶高效的催化作用制备高活性的低聚壳聚糖，存在酶制剂的成本高且酶的作用条件要求严苛和酶回收率低的问题；物理降解法多处于实验室阶段，其有超声波降解法，γ射线降解法、机械法等，但资金投入大且要求设备与技术相对成熟。由于壳聚糖广泛存在海产品的副产品和废弃物中，虽然有上述降解方法，但技术尚未成熟，现需一种快捷有效且环保的降解方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种虾壳简易制备壳寡糖的方法，以解决上述现有技术存在的问题，实现废弃虾壳的高值化利用，同时提高壳聚糖电解制备壳寡糖的电解率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种虾壳制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：
在虾壳中接种益生菌进行发酵，然后依次用柠檬酸和NaOH水溶液处理得到甲壳素；将所述甲壳素加入NaOH水溶液中，得到壳聚糖；最后将所述壳聚糖采用电解法制备得到壳寡糖；
所述益生菌为乳酸菌；所述发酵温度为40℃，时间为36h；
采用电解法制备时，所用电极阳极为钌铱钛，阴极为纯钛，或阳极和阴极均为石墨。
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备甲壳素
A.将虾壳加入自来水中，然后加入葡萄糖和乳酸菌，在40℃条件下发酵36h；
B.将发酵结束后的滤渣洗涤至中性，加入柠檬酸水溶液中，40℃处理150min；
C.收集步骤B的滤渣，然后加入NaOH水溶液中，40℃处理180min；
D.将步骤C的滤渣洗涤至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
E.将所述甲壳素加入NaOH水溶液中，60℃反应30h，将反应后的滤渣洗涤至中性，得到壳聚糖；
(3)壳聚糖电解制备壳寡糖
F.以含有氯化钠和壳聚糖的缓冲溶液作为电解液，在电流密度300mA，温度为75℃条件下,对所述壳聚糖电解1.5h，过滤，将滤液进一步超滤，收集滤液进行冷冻干燥，得到所述壳寡糖。
进一步地，所述缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
进一步地，所述缓冲溶液的pH为4。
进一步地，所述电解液中氯化钠浓度为25g/L，壳聚糖浓度为19g/L。
进一步地，步骤(3)中滤液分子量150-3000D。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用废弃虾壳简易发酵，通过对制备条件的优化实现了93％的电解率，无需高温高压灭杂菌，无需盐酸(HCl)，无需高锰酸钾(KMnO4)和双氧水(H2O2)脱色步骤，制备过程所需药品廉价且安全，所需设备简单，易于操作，即可进行家庭作坊式操作，亦适合工业自动化，同时能够实现废弃虾壳的高值化，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明原料虾壳及各阶段产物图片；
其中：A为虾壳，B为甲壳素，C为壳聚糖，D为壳寡糖；
图2为甲壳素、壳聚糖、壳寡糖的红外谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例一
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数80％葡萄糖(相对虾壳重量)，0.5％质量分数乳酸菌(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、电解液：先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度75℃。阳极接钌铱钛(35*60*2mm)，阴极接纯钛(35*60*2mm)，加入搅拌子，电解1.5h，每隔10分钟搅拌一次；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液通过二级膜分离实验机(型号DMJ60-2)进行超滤，收集分子量在150-3000D范围的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
实施例二
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数80％葡萄糖(相对虾壳重量)，质量分数0.5％乳酸菌(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度75℃。阳极石墨棒6mm*90mm，阴极石墨棒6mm*90mm，加入搅拌子，共电解时长在1.5h，搅拌时隔时间为10分钟；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液超滤，收集分子量150-3000D的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
实施例三
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数40％葡萄糖(相对虾壳重量)，质量分数0.5％乳酸菌(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度75℃。阳极接钌铱钛(35*60*2mm)，阴极接纯钛(35*60*2mm)，加入搅拌子，电解1.5h，每隔10分钟搅拌一次；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液超滤，收集分子量150-3000D的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
实施例四
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数80％葡萄糖(相对虾壳重量)，质量分数0.1％乳酸菌(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度75℃。阳极接钌铱钛(35*60*2mm)，阴极接纯钛(35*60*2mm)，加入搅拌子，电解1.5h，每隔10分钟搅拌一次；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液超滤，收集分子量150-3000D的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
实施例五
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数80％葡萄糖(相对虾壳重量)，质量分数0.5％米曲霉(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；所用米曲霉为市售中科3.951(沪酿3.042米曲霉的孢子)；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度75℃。阳极接钌铱钛(35*60*2mm)，阴极接纯钛(35*60*2mm)，加入搅拌子，电解1.5h，每隔10分钟搅拌一次；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液超滤，收集分子量150-3000D的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
实施例六
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数80％葡萄糖(相对虾壳重量)，质量分数0.5％乳酸菌(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度55℃。阳极接钌铱钛(35*60*2mm)，阴极接纯钛(35*60*2mm)，加入搅拌子，电解1.5h，每隔10分钟搅拌一次；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液超滤，收集分子量150-3000D的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
实施例七
(1)制备甲壳素
a.微生物发酵：虾壳和自来水的物料比是1:16(g/mL)，加入质量分数80％葡萄糖(相对虾壳重量)，质量分数0.5％乳酸菌(相对虾壳重量)，40℃条件下发酵36h；
b.发酵结束，过滤，滤渣用自来水洗至中性；
c.滤渣放入质量分数12％柠檬酸水溶液中，40℃处理150min，料液比20:1(mL/g)；
d.过滤，滤渣用自来水洗至中性，加入质量分数3％NaOH水溶液，40℃条件下处理180min，料液比20:1(mL/g)；
e.过滤，滤渣用自来水洗至中性，得甲壳素；
(2)制备壳聚糖
f.将甲壳素加入质量分数40％NaOH水溶液，60℃水浴30h；
g.过滤，滤渣自来水洗至中性，得壳聚糖；
(3)壳聚糖电解
h、先调制0.2mol/L的pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，再加氯化钠和壳聚糖，氯化钠浓度25g/L，壳聚糖浓度19g/L；
i、设置电流大小为300mA，温度100℃。阳极接钌铱钛(35*60*2mm)，阴极接纯钛(35*60*2mm)，加入搅拌子，电解1.5h，每隔10分钟搅拌一次；
j、电解完毕后，抽滤，取滤液；
k.滤液超滤，收集分子量150-3000D的滤液，冷冻干燥，得壳寡糖。
本发明上述实施例所用乳酸菌均为乳酸杆菌。
实施例一至七的效果对比见表1。
表1
本发明电解率的计算方式：
1.分别取葡萄糖标准液(1mg/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，用蒸馏水补至2.0ml，加入DNS试剂1.5ml，沸水浴加热5min，获得葡萄糖浓度和其溶液吸光度之间的标准曲线。
2.取电解后的滤液2.0ml，加入DNS试剂1.5ml，沸水浴加热5min，冷却，用蒸馏水定容至25ml刻度，在540nm波长下测定吸光度，依据标准曲线算出浓度，再算得电解率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种虾壳简易制备壳寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将虾壳加入自来水中，加入葡萄糖和乳酸杆菌在40℃下发酵36h，发酵结束后过滤，然后将所得滤渣洗涤至中性；将洗涤后的滤渣按照20mL:1g的料液比加入质量分数为12％的柠檬酸水溶液中，于40℃处理150min，过滤，将得到的滤渣洗涤至中性，之后将滤渣按照20mL:1g的料液比加入质量分数3％的NaOH水溶液中，40℃处理180min，过滤，将得到的滤渣洗涤至中性，得甲壳素；将所述甲壳素加入质量分数40％的NaOH水溶液中，于60℃反应30h，过滤，将所得滤渣洗涤至中性，得到壳聚糖；最后将所述壳聚糖采用电解法制备得到壳寡糖；
所述电解法制备得到壳寡糖的过程包括如下步骤：
以含有25g/L氯化钠和19g/L壳聚糖pH为4的缓冲溶液作为电解液，在电流密度300mA，温度为75℃条件下,对所述壳聚糖电解1.5h，过滤，将滤液超滤，对所得超滤滤液进行冷冻干燥，得到壳寡糖；
所述葡萄糖的加入量为所述虾壳重量的80%，所述乳酸杆菌的加入量为所述虾壳重量的0.5%；
采用电解法制备时，所用电极阳极为钌铱钛，阴极为纯钛，或阳极和阴极均为石墨；
所述缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电解法制备得到壳寡糖的过程中，所述超滤滤液的分子量为150-3000D。
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| GR01 | Patent grant | ||
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