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CN115109154A - 一种靶向cldn18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

一种靶向cldn18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用 Download PDF

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CN115109154A CN202110287671.0A CN202110287671A CN115109154A CN 115109154 A CN115109154 A CN 115109154A CN 202110287671 A CN202110287671 A CN 202110287671A CN 115109154 A CN115109154 A CN 115109154A
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ser
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CN202110287671.0A
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郎国竣
闫鑫甜
谭永聪
刘婵娟
孔超
闫闰
胡宇豪
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Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
Sanyou Biopharmaceuticals Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用。所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其序列信息详见本发明。本发明制备得到的抗体与hCLDN18.2‑HEK293T细胞、hCLDN18.2‑KATOIII细胞等细胞的结合能力与对照抗体IMAB362相当或者更佳；且其在hCLDN18.2‑KATOIII细胞、hCLDN18.2‑HEK293T或hCLDN18.2‑HEK293细胞上的ADCC、CDC等效应明显优于对照抗体IMAB362。

Description

一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明属于抗体领域，具体地涉及一种CLDN18.2结合分子，特别是靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
细胞连接是细胞间的联系结构，是多细胞有机体中相邻细胞之间相互联系、协同作用的重要基础。一般而言，动物细胞有四种类型的连接∶紧密连接、粘着连接、间隙连接和桥粒/半桥粒。
紧密连接，也称为封闭连接，是在内皮细胞或者上皮细胞间形成的结构，可以防止组织间的物质从细胞间隙中扩散，从而只能通过主动运输进入细胞。紧密连接的结构由几十种Claudin蛋白通过细胞内和细胞间的蛋白质相互作用形成，而这些蛋白质的表达具有一定的组织特异性。CLDN18就是紧密连接中存在的Claudin蛋白中的一种重要的蛋白质。
CLDN18是具有四次跨膜区域的膜蛋白，含有两个胞外结构域。人体内已发现两种CLDN18变体，分别是CLDN18.1和CLDN18.2。两者分布于不同的组织，前者主要表达在肺上皮细胞中，后者则特异性表达在胃上皮细胞中，且在胃干细胞中不表达。在蛋白序列上，CLDN18.1和CLDN18.2的序列相似度极高，两者的主要差别在N端，在第一个胞外结构域两者仅存在8个氨基酸的差别；除了N端之外，C端序列完全一致。
抗体疗法正在成为治疗癌症的最有前途的方法之一。CLDN18.2由于其在多种肿瘤组织中高度表达，比如非小细胞肺癌(25％)、胃癌(70％)、胰腺癌(50％)和食道癌(30％)，但是在正常组织中几乎没有表达(Kumar,V.,et al.(2018)."Emerging Therapies in theManagement of Advanced-Stage Gastric Cancer."Front Pharmacol 9:404.)，因此目前已经成为非常有潜力的一个抗体药物作用靶点。然而，由于CLDN18.1和CLDN18.2的序列相似性极高，使得开发只针对CLDN18.2而不针对CLDN18.1的抗体极其困难。
虽然目前已经有德国Ganymed公司研制的靶向CLDN18.2靶点的临床在研单克隆抗体药物IMAB362，但作为治疗剂，仍有继续开发靶向CLDN18.2靶点抗体的迫切需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的缺乏靶向CLDN18.2靶点抗体的缺陷，提供一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用。特别是开发新的、特异性识别CLDN18.2且具有更优异效果的抗体。
本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面涉及一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
所述HCDR1包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其变体1，所述HCDR2包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体2，所述LCDR1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其变体3，所述LCDR2包含如SEQ IDNO:9或者SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其变体4，所述LCDR3包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其变体5；
上述变体为在原始序列基础上进行1个、2个或3个氨基酸的取代、缺失或添加，包含所述变体的抗体或其抗原结合片段至少保持与CLDN18.2的结合能力。
其中，所述变体1的突变为对SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列进行个别位置的氨基酸替换；优选至少发生于SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的第2位。
变体2～5中的突变亦为在原序列上发生氨基酸的替换，具体地：
所述变体2的突变优选至少发生于SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的第14和/或15位。
所述变体3的突变优选至少发生于SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的第7、10和12位中的一位或多位。
所述变体4的突变优选至少发生于SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的第4位和/或第5位。
所述变体5的突变优选至少发生于SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第5、8和9位中的一位或多位。
在本发明一优选实施方案中，所述变体1中所述第2位优选突变为R，即其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
所述变体2中所述第14位优选突变为N或P，所述第15位优选突变为L。
变体3中所述第7位优选突变为S，所述第10位优选突变为R，所述第12位优选突变为R。
变体4中所述第4位优选突变为E，所述第5位优选突变为R。
变体5中所述第5位优选突变为W或F，所述第8位优选突变为L，所述第9位优选突变为V或S。
在本发明一较佳实施方案中，所述变体2的氨基酸序列如SEQ ID NO:32、33或者45所示。
在本发明另一较佳实施方案中，所述变体3的氨基酸序列如SEQ ID NO:23、39或者40所示；
在本发明另一较佳实施方案中，所述变体4的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或者41所示；
在本发明另一较佳实施方案中，所述变体5的氨基酸序列如SEQ ID NO:25、26、27、42或者43所示。
在本发明一更佳实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明另一更佳实施方案中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
本发明中所述抗体或其抗原结合片段的框架区较佳地为人源或者鼠源框架区。
所述重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或者SEQ ID NO:44所示。
所述轻链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38所示。
在本发明一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，且所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
在本发明另一具体实施方案中，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
在本发明一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:28所示或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区的包含如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其变体。
在本发明另一最佳实施方案中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其变体，且所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其变体。
在以上所述最佳实施方案中，所述变体至少保留突变前序列的功能，且所述变体与突变前序列的同一性至少为85％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步更优选至少99％。
在本发明中，上述所列CDR的氨基酸序列均是按照AbM定义规则所示出的(本发明的权利要求中也是按照AbM定义规则所示出的序列)。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformationsfor the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of MolecularBiology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and HumanServices,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath),Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明的权利要求中请求保护的范围是基于AbM定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
抗体CDR定义方法
Figure BDA0002981156570000071
Figure BDA0002981156570000081
其中，Laa-Lbb可以指从抗体轻链的N端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列；Haa-Hbb可以指从抗体重链的N端开始，第aa位至第bb位的氨基酸序列。例如，L24-L34可以指从抗体轻链N端开始，按照Chothia编码规则的从第24位至第34位的氨基酸序列；H26-H32可以指从抗体重链N端开始，按照Chothia编码规则的从第26位至第32位的氨基酸序列。
因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
本发明所述的抗体优选还包含抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区源自人源抗体重链或其变体，所述轻链恒定区源自人源抗体的κ链或者λ链或其变体。
本发明中所述抗体可为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双特异性抗体或多特异性抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述Fv优选为scFv。
本发明中，术语“全长抗体”可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本发明中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本发明中缩写为VL)和轻链恒定区(本发明中缩写为CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ。哺乳动物轻链分类为λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重链的免疫球蛋白分类为免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完全抗体形成“Y”形状。Y的茎由两条重链的第二和第三恒定区(并且对于IgE和IgM，第四恒定区)结合在一起组成，并且二硫键(链间)在铰链中形成。重链γ、α和δ具有由三个串联(成一行)Ig结构域构成的恒定区，和用于增加柔性的铰链区；重链μ和ε具有由四个免疫球蛋白结构域构成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂包括结合到单个轻链的可变和恒定区的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。
本发明中，“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段，但缺少恒定区。
本发明中，所述的scFv(single chain antibody fragment，单链抗体)可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G4S)4或(G4S)3接头，但也可使用其变体。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
本发明的抗体包括单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体或mAb或Ab，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。
本发明的第二方面涉及一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面涉及一种重组表达载体，其包含如本发明第二方面所述的分离的核酸。优选地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
本发明的第四方面涉及一种转化体，其在宿主细胞中包含本发明第三方面所述的重组表达载体；优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
本发明的第五方面涉及一种嵌合抗原受体，其包含如本发明的第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第六方面涉及一种基因修饰的细胞，其包含如本发明的第五方面所述的嵌合抗原受体；优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞，或NK细胞。
本发明的第七方面涉及一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包含培养如第四方面所述的转化体，从培养物中获得靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第八方面涉及一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述细胞毒性剂为MMAF或MMAE。
本发明的第九方面涉及一种药物组合物，其包含如第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段和/或第八方面所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体；
较佳地，所述药物组合物还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
本发明的第十方面涉及本发明第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、第八方面的抗体药物偶联物和/或第九方面所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为CLDN18.2阳性肿瘤；更优选地，所述肿瘤为胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、支气管癌、神经胶质瘤和/或白血病。
本发明的第十一方面涉及试剂盒，其包括如第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如第五方面所述的嵌合抗原受体、如第六方面所述的基因修饰的细胞、或第八方面所述的抗体药物偶联物或如第九方面所述的药物组合物；
较佳地，所述试剂盒还包括(i)施用抗体或其抗原结合片段或抗体药物偶联物或药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。
本发明的第十二方面涉及一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A含有如第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如第五方面所述的嵌合抗原受体、如第六方面所述的基因修饰的细胞、如第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如第九方面所述的药物组合物；
所述药盒B含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明的第十三方面涉及一种诊断、治疗和/或预防CLDN18.2介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本发明第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如第五方面所述的嵌合抗原受体、如第六方面所述的抗体药物偶联物或如第八方面所述的药物组合物，或者使用如第十二方面所述的套装药盒治疗有需要的患者。
其中，所述的疾病或病症可为肿瘤，优选CLDN18.2阳性肿瘤，更优选胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、支气管癌、神经胶质瘤和/或白血病。
本发明的第十四方面涉及一种免疫检测或者测定CLDN18.2的方法，其包括使用如第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如第五方面所述的嵌合抗原受体、如第八方面所述的抗体药物偶联物或如第九方面所述的药物组合物；优选地，所述检测为非诊断和/或治疗目的的。
本发明的第十五方面涉及一种联合疗法，其包括分别向有需要的患者施用如第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如第五方面所述的嵌合抗原受体、如第八方面所述的抗体药物偶联物或如第九方面所述的药物组合物，和第二治疗剂；所述第二治疗剂较佳地包含其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
此外，本发明中所用的其它术语的解释具体如下。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的靶向CLDN18.2嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的靶向CLDN18.2嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4。
“人源化抗体”是指一类工程化抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的CDR，而该人源化抗体的剩余免疫球蛋白部分来源自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，构架支持残基可以改变以保留结合亲和力(参见例如Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10032(1989),Hodgson等,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人接受抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性从常规数据库例如Los Alamos数据库和Swiss蛋白质数据库选择的抗体。以与供体抗体的构架区的同源性(基于氨基酸)表征的人抗体可以适合于提供用于插入供体CDR的重链恒定区和/或重链可变构架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变构架区的合适受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链不需要来源于相同的受体抗体。
如本领域已知，在本发明中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
如下进行序列之间序列同一性的计算。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12、空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。额外地或备选地，可以进一步使用本发明所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
如本发明所用，“载体”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
在本发明中术语“宿主细胞”可包括已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本发明包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
在一些实施方案中，氨基酸变化可以是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，氨基酸变化是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸变化不发生在CDR区中。
在本发明的一些实施方案中，本发明所述的氨基酸变化包括氨基酸的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，本发明所述的氨基酸变化为氨基酸取代，优选地保守取代。保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。
需要说明的是：本发明中变体之后的数值如“1”、“2”等没有实质含义，仅为区分相同术语。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明制备得到的抗体与hCLDN18.2-HEK293T细胞、hCLDN18.2-KATOIII细胞等细胞的结合能力与对照抗体IMAB362相当或者更佳；且其在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC、CDC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362、在hCLDN18.2-HEK293T或hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC效应也明显优于对照抗体IMAB362。其中本发明的示例性改造后抗体在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC效应还优于其他对照抗体ASK589-M5、h1901-11和hu8E5-2I。另外，在非特异性细胞结合实验中，本发明抗体与靶细胞之外的其他细胞结合能力弱于对照抗体IMAB362。
附图说明
图1显示来自小鼠免疫库的部分克隆(克隆号262和克隆号188)的Phage(表面展示对应的Fab片段)分别和hCLDN18.1-HEK293细胞以及hCLDN18.2-HEK293T细胞的结合。
图2a、2b和2c显示小鼠免疫库的人鼠嵌合抗体262与过表达人CLDN18.2或过表达人CLDN18.1细胞的结合。其中，图2a显示人鼠嵌合抗体262与hCLDN18.2-HEK293T细胞的结合；图2b显示人鼠嵌合抗体262与hCLDN18.2-KATOIII细胞的结合；图2c显示人鼠嵌合抗体262与hCLDN18.1-HEK293细胞的结合。
图3a、3b和3c显示人鼠嵌合抗体262在进行人源化改造后得到的一系列人源化抗体与过表达人CLDN18.2或过表达人CLDN18.1细胞的结合。其中，图3a显示人源化抗体262-H1L1、262-H1L2、262-H2L1、262-H2L2与hCLDN18.2-HEK293T细胞的结合；图3b显示人源化抗体262-H1L2、262-H2L2与hCLDN18.2-KATOIII细胞的结合；图3c显示人源化抗体262-H1L1、262-H1L2、262-H2L1、262-H2L2与hCLDN18.1-HEK293细胞的结合。
图4a、4b显示人鼠嵌合抗体262在过表达人CLDN18.2细胞上的CDC效应。其中，图4a显示人鼠嵌合抗体262在hCLDN18.2-HEK293T细胞上的CDC效应；图4b显示人鼠嵌合抗体262在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的CDC效应。
图5a、5b显示人源化抗体262-H1L2在过表达人CLDN18.2细胞上的CDC效应。其中，图5a显示人源化抗体262-H1L2在hCLDN18.2-HEK293T细胞上的CDC效应；图5b显示人源化抗体262-H1L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的CDC效应。
图6a、6b显示人源化抗体262-H2L2在过表达人CLDN18.2细胞上的CDC效应。其中，图6a显示人源化抗体262-H2L2在hCLDN18.2-HEK293T细胞上的CDC效应；图6b显示人源化抗体262-H2L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的CDC效应。
图7显示人鼠嵌合抗体262在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC效应。
图8显示人源化抗体262-H1L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC效应。
图9显示人源化抗体262-H2L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC效应。
图10a、10b显示人源化抗体262-H2L2在进行抗体工程改造后得到的一系列改造后抗体与过表达人CLDN18.2或过表达人CLDN18.1细胞的结合。其中，图10a显示改造后抗体与hCLDN18.2-HEK293细胞的结合；图10b显示改造后抗体与hCLDN18.1-HEK293细胞的结合。
图11显示改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53与CHO-K细胞的非特异性结合。
图12a、12b、12c、12d、12e显示改造后抗体在过表达人CLDN18.2的HEK293细胞上的CDC效应。其中，图12a至图12e分别显示改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53在hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC效应。
图13a、13b、13c、13d显示改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-23在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC效应。其中，图13a和13b显示改造后抗体262-H2L2-7在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC效应；图13c和13d显示改造后抗体262-H2L2-23在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC效应。
图14显示改造后抗体262-H2L2-2、262-H2L2-9、262-H2L2-14、262-H2L2-19、262-H2L2-20在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1过表达细胞株准备
1.1过表达人CLDN18.2的HEK293T细胞株的流式鉴定
过表达人CLDN18.2的HEK293T细胞株(以下简称hCLDN18.2-HEK293T)购买于康源博创，货号为KC-0986。采用IMAB362抗体(根据专利WO2016165762A1所披露的重链SEQ IDNO:17和轻链SEQ ID NO:24的序列信息表达、纯化制得)对hCLDN18.2-HEK293T进行鉴定。取1×105个细胞，低速离心(300g)去上清。将离心管底部的细胞通过配制好的FACS缓冲液(含体积百分比为2％的FBS的1×PBS缓冲液)润洗一次，然后向润洗后的细胞中加入12.5μg/mL抗体IMAB362，在4℃孵育1小时，接着再用上述FACS缓冲液润洗三次，加入PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam，ab98596)0.5μg，在4℃孵育1小时。其后，经FACS缓冲液润洗三次，并向细胞中加入200μL的FACS缓冲液重悬细胞，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX，AOO-1-1102)进行检测。检测结果显示商品化的hCLDN18.2-HEK293T表面高表达人CLDN18.2蛋白。
1.2过表达人CLDN18.1的HEK293细胞株的构建与流式鉴定
过表达人CLDN18.1的HEK293细胞株(以下简称hCLDN18.1-HEK293)的构建：将全长人CLDN18.1(SEQ ID NO:1)的核酸序列构建至pLVX-puro质粒(Clontech，Cat#632164)上。然后，将所得到的质粒通过电转仪(Invitrogen，NeonTM Transfection System，MP922947)电转化至HEK293细胞(
Figure BDA0002981156570000171
CRL-1573TM)中。电转化后，将所得到的细胞分别转移至含有体积百分比为10％FBS(Gibco，15140-141)且不含抗生素的DMEM培养基(Gibco，11995065)中，然后将细胞接种入10×10cm细胞培养皿中培养48小时，接着以平均0.5个/孔的密度将细胞分装至96孔细胞培养板中，加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素(Gibco，A111138-03)作为筛选压力，2周左右观察细胞株克隆生长情况，并挑取形成克隆的细胞株进行鉴定。
hCLDN18.1-HEK293的流式鉴定：按细胞破膜试剂盒(eBioscience，88-8824-00)的说明书方法对细胞进行固定和破膜，加入抗CLDN18抗体(Abcam，ab203563)，在4℃孵育1小时。再次用破膜缓冲液润洗三遍之后，加入Alexa
Figure BDA0002981156570000172
488荧光标记的驴抗兔的IgG H&L(Abcam，ab150073)0.5μg，在4℃孵育1小时，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEXAOO-1-1102)进行检测。同时采用前述1.1的方法，用IMAB362抗体排除hCLDN18.1-HEK293不表达CLDN18.2。检测结果显示hCLDN18.1-HEK293表面高表达人CLDN18.1。
1.3过表达人CLDN18.2的KATOIII细胞的构建与鉴定
过表达人CLDN18.2的胃癌细胞株KATOIII细胞株(以下简称hCLDN18.2-KATOIII)的构建是采用慢病毒转染的方式，并通过抗体IMAB362进行鉴定。具体方法如下：取5×104个状态良好的人胃癌细胞(KATOIII，
Figure BDA0002981156570000173
HTB-103TM)，以30：1的MOI比例加入包装好的含有人CLDN18.2序列(SEQ ID NO:2)的慢病毒，充分混匀，然后加入含有8μg/mL聚凝胺(Polybrene，Sigma，107689)的IMDM完全培养基(Gibco，12440061)，混合均匀，于37℃、5％浓度的CO2的恒温培养箱中孵育20小时后去除培养基，更换新鲜的IMDM完全培养基继续孵育24小时，然后以平均0.5个细胞/孔的密度将转染后的KATOIII细胞接种至96孔板中，并添加终浓度为2μg/mL嘌呤霉素进行抗性加压筛选，于37℃、5％浓度的CO2的恒温培养箱中培养2-3周，并挑取克隆进行鉴定。
以上述1.1的方法，通过抗体IMAB362对经抗性筛选的细胞株进行流式鉴定。流式鉴定的结果显示没有转染CLDN18.2的KATOIII细胞几乎不被抗体IMAB362识别，说明此KATOIII细胞株上几乎不表达CLDN18.2，通过慢病毒转染的hCLDN18.2-KATOIII能够被抗体IMAB362识别，此细胞株表面成功高表达CLDN18.2。
1.4过表达人CLDN18.2的HEK293细胞株的构建与鉴定
过表达人CLDN18.2的HEK293细胞株(以下简称hCLDN18.2-HEK293)的构建：将全长人CLDN18.2(SEQ ID NO:2)的核酸序列构建至pLVX-puro质粒(Clontech，Cat#632164)上，其余步骤参照实施例1.2。检测结果证明hCLDN18.2-HEK293表面高表达人CLDN18.2。
1.5CD16a(F158)-NF-AT-jurkat细胞株的构建与鉴定
首先构建NF-AT-Jurkat细胞株，将含有NF-AT-re核酸序列的pGL4.30质粒(promega，#E8481)通过电转仪(Invitrogen，NeonTM Transfection System，MP922947)电转化至Jurkat细胞(
Figure BDA0002981156570000181
CRL-1573TM)中。电转化后，将终浓度为500μg/mL的HygromycinB(源培，S160J7)作为筛选压力，2-3周左右观察细胞株克隆生长情况，并挑取形成克隆的细胞株进行鉴定。NF-AT-Jurkat细胞株鉴定合格后，以20：1的MOI比例加入包装好的含有CD16a(F158)序列(UniProtKB-P08637,第158位氨基酸为F苯丙氨酸)的慢病毒，添加终浓度为2μg/mL嘌呤霉素进行抗性加压筛选，于37℃、5％浓度的CO2的恒温培养箱中培养2-3周，并挑取克隆进行鉴定，最终成功获得CD16a(F158)-NF-AT-jurkat细胞株。
实施例2动物免疫
2.1免疫方案
通过皮下注射和腹腔注射的方式免疫MRL小鼠(上海灵畅生物科技有限公司，雌性，6-8周，n＝4)，免疫原采用hCLDN18.2-HEK293T。每两周免疫一次，总计免疫4次。最后，再用hCLDN18.2-HEK293T细胞加免一次。
2.2免疫后小鼠血清抗体效价检测
分别取hCLDN18.2-HEK293T细胞、hCLDN18.1-HEK293细胞及HEK293T细胞，500g低速离心去上清。在另外一块96孔稀释板上将未经免疫的阴性血清和免疫后血清用FBS进行稀释，50倍稀释4个梯度(1/50、1/250、1/1250、1/6250)。将离心管底部的细胞通过配制好的FACS缓冲液(含体积百分比为2％FBS的1×PBS缓冲液)润洗一次，然后向润洗后的细胞中加入稀释好的免疫血清，在4℃孵育1小时，接着再用上述FACS缓冲液润洗三次，加入0.5μg的PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam，ab98596)，在4℃下孵育1小时。其后，经FACS缓冲液润洗三次，并向细胞中加入200μL的FACS缓冲液重悬细胞，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX，AOO-1-1102)进行检测。检测结果表明，小鼠血清中具备高识别CLDN18.2且低识别CLDN18.1的抗体。
实施例3小鼠免疫文库构建及筛选
3.1噬菌体展示抗体基因文库构建
在免疫结束后，按安乐死标准流程处理小鼠。取小鼠脾脏，经研磨和过滤后收集脾细胞，加入1mL的TRIzolTMReagent(Thermo Fisher，15596026)裂解脾细胞，通过酚氯仿法提取总RNA，通过反转录试剂盒(TaKaRa，6210A)将提取的RNA反转录成cDNA。之后以cDNA为PCR模板，采用鼠源抗体序列的特异性引物分别扩增抗体的轻链和重链基因。PCR产物通过NcoI、NotI双酶切得到抗体基因片段，将其插入至噬菌体展示用载体上，通过T4连接酶连接，连接产物通过DNA回收试剂盒(Omega，D6492-02)回收，最后通过电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化至感受态大肠杆菌SS320中(Lucigen，MC1061F)，并涂布于含有氨苄青霉素和四环素的2-YT(C+/K+2-YT)固体平板，扩增正确转化的抗体质粒的SS320菌，最终构建成含Fab段抗体序列的文库(后续简称小鼠免疫库)。
3.2噬菌体展示抗体基因文库筛选
3.2.1细胞法筛选噬菌体展示抗体基因文库
在T25培养方瓶中培养hCLDN18.2-HEK293T细胞或者hCLDN18.1-HEK293细胞。当细胞生长密度接近90％时，去除培养上清，并用PBS(源培，B310KJ)润洗一次，然后加入5mL的4％多聚甲醛(生工，E672002-0500)进行固定1小时，最后用PBS润洗两次后作为筛选原材料。筛选时，小鼠免疫库对应的噬菌体首先与固定的hCLDN18.1-HEK293细胞在室温下孵育1小时，然后吸取经过吸附后的上清噬菌体，与固定的hCLDN18.2-HEK293T细胞孵育2小时。用1×PBS润洗两次后，加入3mL甘氨酸-HCl(pH＝2.0)轻轻混匀10分钟，以洗脱特异性结合人CLDN18.2的噬菌体，接着将洗脱上清侵染对数期的SS320菌体(Lucigen，60512-1)，静置30分钟，然后在220rpm条件下培养1小时，再通过加入VSCM13辅助噬菌体，静置30分钟，继续在220rpm条件下培养1小时，离心并置换至C+/K+2-YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于第二轮的筛选。如此反复，并对每轮随机挑选的10个克隆进行序列分析以对库进行评估，经过3轮的筛选后，库内的序列富集明显。
3.2.2单克隆的挑选
分别取hCLDN18.2-HEK293T细胞与hCLDN18.1-HEK293细胞，500g低速离心去上清，细胞用FACS缓冲液润洗后，加入用10％FBS(Gibco，15140-141)封闭1小时的噬菌体进行上清制备，在4℃孵育1小时，然后用FACS缓冲液润洗两次，以1：50的比例加入抗M13鼠源单克隆抗体(Sino Biological，11973-MM05T)，并在4℃孵育1小时。然后用FACS缓冲液润洗两次，加入APC标记的抗鼠Fc二抗(Jackson，115136071)，在4℃孵育1小时，以FACS缓冲液润洗两次，最后通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX，AOO-1-1102)进行检测。结果如图1所示，来自小鼠免疫库的克隆号188和克隆号262的噬菌体(表面展示对应的Fab片段)分别和hCLDN18.1-HEK293细胞以及hCLDN18.2-HEK293T的结合，克隆号262具有优异的高识别人CLDN18.2且低识别人CLDN18.1的特性。
以克隆号对候选抗体进行命名，采用AbM定义CDR的方式，确定了抗体重链和轻链的互补决定区序列。候选抗体262的CDR氨基酸序列如表1所示，可变区VH和VL的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
表1本发明的示例性抗体(候选抗体)的CDR氨基酸序列
Figure BDA0002981156570000201
实施例4嵌合抗体构建、表达与纯化
4.1质粒构建
将筛选获得的特异性结合人CLDN18.2的Fab序列中的VH与人IgG1的恒定区(SEQID NO:11)融合构建获得人鼠嵌合抗体262的重链(SEQ ID NO:12)，筛选获得的特异性结合人CLDN18.2的Fab序列中的VL与人的Kappa恒定区(SEQ ID NO:13)融合构建获得人鼠嵌合抗体262的轻链(SEQ ID NO:14)，将构建好的重链和轻链插入表达质粒pcDNA3.4。
4.2抗体表达纯化
抗体的表达采用的是ExpiCHO瞬转表达系统(Gibco，A29133)和转染试剂盒(Gibco，A29129)。具体方法如下：转染前一天将ExpiCHO细胞进行传代，在25mL体系内，将构建好的25μg的质粒与转染试剂混合之后滴加入25mL的ExpiCHO细胞中，充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22小时。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基(Gibco，A29100-01)并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。接着，将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用ProteinA/G亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后用100mM甘氨酸盐(pH＝3.0)洗脱目的蛋白，浓缩、置换、分装后经SDS-PAGE鉴定、SEC纯度检测，获得SEC纯度高于94％的抗CLDN18.2人鼠嵌合抗体262。
实施例5人鼠嵌合抗体262的细胞特异性结合测定
用含0.25％的EDTA的Trypsin(Gibco，25200-072)分别消化生长状态良好的hCLDN18.2-HEK293T细胞、HEK293T细胞、HEK293细胞、hCLDN18.1-HEK293细胞，取1×105个细胞和3倍梯度稀释的人鼠嵌合抗体262孵育1小时，另外以hIgG1同型无关抗体作为对照。用FACS缓冲液润洗两次，然后和0.5μg的PE标记的山羊抗人IgG Fc二抗(Abcam，ab98596)在4℃孵育1小时。其后，用FACS缓冲液洗三次，通过流式细胞仪(Beckman，CytoFLEX，AOO-1-1102)检测候选抗体在细胞上的结合。流式检测的结果如下：图2a结果表明人鼠嵌合抗体262在与hCLDN18.2-HEK293T细胞的结合上优于对照抗体IMAB362(Zolbetuximab)，其中，人鼠嵌合抗体262的EC50＝3.9nM、IMAB362的EC50＝6.4nM；图2b结果表明人鼠嵌合抗体262与hCLDN18.2-KATOIII细胞的结合能力显著优于对照抗体IMAB362，其中，262的EC50＝4.7nM、IMAB362的EC50＝9.8nM；图2c结果表明人鼠嵌合抗体262与hCLDN18.1-HEK293细胞的结合与对照抗体IMAB362相当。
实施例6抗体人源化改造
对人鼠嵌合抗体重链和轻链V区进行了氨基酸的点突变，使之更接近人的Germline。其中，被改造的候选抗体是人鼠嵌合抗体262，改造后的部分候选抗体为262-H1L1、262-H1L2、262-H2L1和262-H2L2。其中，人源化抗体的重链可变区262-H1、262-H2氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，人源化抗体的轻链可变区262-L1、262-L2氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
实施例7人源化抗体的细胞特异性结合测定
取培养状态良好的hCLDN18.2-HEK293T细胞、hCLDN18.2-KATOIII或者hCLDN18.1-HEK293细胞分别和人鼠嵌合抗体262、人源化抗体262-H1L1、262-H1L2、262-H2L1和262-H2L2(三倍梯度稀释)在4℃共孵育1小时。经FACS缓冲液润洗两遍，然后加入0.5μg的PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam，ab98596)，在4℃孵育1小时，再经FACS缓冲液润洗两遍之后，通过流式细胞仪检测。
流式检测结果如下：图3a结果表明262-H1L1、262-H2L1、262-H1L2和262-H2L2与hCLDN18.2-HEK293T细胞的结合能力与对照抗体IMAB362相当；图3b结果表明262-H1L2和262-H2L2与hCLDN18.2-KATOIII细胞的结合能力显著优于对照抗体IMAB362，其中，262-H1L2的EC50＝4.1nM、262-H2L2的EC50＝3.9nM、IMAB362的EC50＝9.8nM；图3c结果表明人源化抗体262-H2L2与hCLDN18.1-HEK293细胞的结合最低且与对照抗体IMAB362相当。
实施例8人鼠嵌合抗体262及其人源化抗体的CDC效应
经Trypsin消化培养状态良好的hCLDN18.2-HEK293T或hCLDN18.2-KATOIII细胞之后，取5×104个细胞和稀释5倍的兔血清混合，然后分别加入50μL的人鼠嵌合抗体262、人源化抗体262-H1L2、人源化抗体262-H2L2或对照抗体IMAB362(3倍梯度稀释)，于37℃孵育3小时。然后向候选抗体或对照抗体IMAB362中分别加入MTS试剂(Promega，G3580)30μL，充分混合均匀，置于37℃、5％浓度的CO2的恒温培养箱培养4小时，期间观察培养基颜色变化，通过酶标仪测定OD492值。其中以10％浓度的TritonX-100加入靶细胞作为全裂解的对照，以只加靶细胞作为空白对照，以兔补体加靶细胞作为背景阴性对照。
细胞杀伤率按如下公式计算：细胞杀伤率(％)＝(候选抗体孔OD值-背景孔OD值)/(全裂解孔OD值-空白孔OD值)×100％。MTS法检测结果如下：
如图4a所示，人鼠嵌合抗体262在hCLDN18.2-HEK293T细胞上的CDC效应优于对照抗体IMAB362，其中，人鼠嵌合抗体262的EC50＝0.28μg/mL、IMAB362的EC50＝0.62μg/mL；如图4b所示，人鼠嵌合抗体262在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的CDC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，人鼠嵌合抗体262的EC50＝1.1μg/mL、IMAB362的EC50＝25.3μg/mL。
如图5a所示，人源化抗体262-H1L2在hCLDN18.2-HEK293T细胞上的CDC效应优于对照抗体IMAB362，其中，人源化抗体262-H1L2的EC50＝0.15μg/mL、IMAB362的EC50＝0.72μg/mL；如图5b所示，人源化抗体262-H1L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的CDC效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，人源化抗体262-H1L2的EC50＝0.86μg/mL、IMAB362的EC50＝18.1μg/mL。
如图6a所示，人源化抗体262-H2L2在hCLDN18.2-HEK293T细胞上的CDC效应优于对照抗体IMAB362，其中，人源化抗体262-H2L2的EC50＝0.13μg/mL，IMAB362的EC50＝1.04μg/mL；如图6b所示，人源化抗体262-H2L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的CDC效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，人源化抗体262-H2L2的EC50＝0.47μg/mL，IMAB362的EC50＝16.3μg/mL。
实施例9人鼠嵌合抗体262及其人源化抗体的ADCC效应
在96孔细胞培养板中每孔加入50μL密度为2×105个/mL的hCLDN18.2-KATOIII细胞，置于37℃培养箱中培养过夜(16-20小时)。加入50μL梯度稀释的人鼠嵌合抗体262、人源化抗体262-H1L2、人源化抗体262-H2L2或对照抗体IMAB362，混匀后于37℃培养箱孵育20分钟，再加入复苏好的5×105个/孔的人PBMC细胞(效应细胞/靶细胞比例为50：1)，37℃培养箱孵育4小时后，通过300g离心得到上清，然后加入LDH检测试剂(Takara，MK401)反应1小时，最后通过酶标仪(MolecularDevices，SpectraMax 190)测定在492nm波长下的OD值并进行检测结果分析。其中以10％的TritonX-100加靶细胞作为全裂解的对照，以只加靶细胞作为空白阴性对照，以PBMC加靶细胞作为背景阴性对照。
细胞杀伤率按如下公式计算：杀伤率(％)＝(候选抗体孔OD值-背景孔OD值)/(全裂解孔OD值-空白孔OD值)×100％。ADCC检测结果如下：
如图7所示，人鼠嵌合抗体262在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，人鼠嵌合抗体262的EC50＝0.09nM、IMAB362的EC50＝0.57nM。
如图8所示，人源化抗体262-H1L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC效应优于对照抗体IMAB362，其中，人源化抗体262-H1L2的EC50＝0.78nM、IMAB362的EC50＝0.98nM。
如图9所示，人源化抗体262-H2L2在hCLDN18.2-KATOIII细胞上的ADCC效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，人源化抗体262-H2L2的EC50＝0.12nM，IMAB362的EC50＝0.74nM。
实施例10人源化抗体262-H2L2的抗体工程改造
为了提升抗体分子与人CLDN18.2的特异性结合且进一步降低与人CLDN18.1的非特异性结合，本实施例对人源化抗体262-H2L2进行了抗体工程改造。
对采用AbM定义的CDR进行单点或者连续两点突变，构建亲和力成熟噬菌体展示文库，利用噬菌体展示技术对亲和力成熟后的分子进行筛选，筛选方法参考实施例3.2。通过了3轮亲和力成熟改造，获得了改造后抗体，分别是262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53、262-H2L2-2、262-H2L2-9、262-H2L2-14、262-H2L2-19、262-H2L2-20。采用AbM定义CDR的方式，确定了抗体重链和轻链的互补决定区序列。各候选改造后抗体的氨基酸序列如表2和3所示。
表2本发明的示例性改造后抗体的CDR氨基酸序列
Figure BDA0002981156570000241
表3本发明的示例性改造后抗体的可变区氨基酸序列
Figure BDA0002981156570000242
Figure BDA0002981156570000251
实施例11改造后抗体与过表达人CLDN18.2或过表达人CLDN18.1细胞的结合
取培养状态良好的hCLDN18.2-HEK293细胞或者hCLDN18.1-HEK293细胞，分别与262-H2L2及部分改造后的抗体262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53(均为3倍梯度稀释)在4℃孵育1小时。经FACS缓冲液润洗两遍，然后加入0.5μg的PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam，ab98596)，在4℃孵育1小时，再经FACS缓冲液润洗两遍之后，通过流式细胞仪检测。
流式检测的结果如下：图10a结果表明改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53与hCLDN18.2-HEK293细胞的结合能力与人源化抗体262-H2L2相当；图10b结果表明改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53与hCLDN18.1-HEK293细胞无显著的结合，效果与无关抗体相当。
实施例12改造后抗体与CHO-K细胞的非特异性结合
取培养状态良好的CHO-K细胞和人源化抗体262-H2L2及改造后抗体(抗体均为3倍梯度稀释)分别在4℃孵育1小时。经FACS缓冲液润洗两遍，然后加入0.5μg的PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(Abcam，ab98596)，在4℃孵育1小时，再经FACS缓冲液润洗两遍之后，通过流式细胞仪检测。
流式检测的结果如下：图11显示改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-11、262-H2L2-23、262-H2L2-24、262-H2L2-53与CHO-K细胞的结合明显弱于对照抗体IMAB362，因此改造后抗体的特异性更好。
实施例13改造后抗体的CDC效应
本实施例中采用MTS法测定候选抗体的CDC细胞杀伤效应，具体实施方法参照实施例8，抗体浓度如图12a-图12e所示。
CDC检测结果如下：如图12a所示，改造后抗体262-H2L2-7在hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，改造后抗体262-H2L2-7的EC50＝0.4113nM、IMAB362的EC50＝2.042nM；如图12b所示，改造后抗体262-H2L2-11在hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC杀伤效应优于对照抗体IMAB362，其中，改造后抗体262-H2L2-11的EC50＝0.7569nM、IMAB362的EC50＝1.841nM；如图12c所示，改造后抗体262-H2L2-23在hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362，其中，改造后抗体262-H2L2-23的EC50＝0.6943nM、IMAB362的EC50＝2.428nM；如图12d所示，改造后抗体262-H2L2-24在hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC杀伤效应与人源化抗体262-H2L2相似，但明显优于对照抗体IMAB362，其中，改造后抗体262-H2L2-24的EC50＝0.4431nM、人源化抗体262-H2L2的EC50＝0.3432nM、IMAB362的EC50＝1.748nM；如图12e所示，改造后抗体262-H2L2-53在hCLDN18.2-HEK293细胞上的CDC杀伤效应与人源化抗体262-H2L2相似，但明显优于对照抗体IMAB362，其中，改造后抗体262-H2L2-53的EC50＝0.3995nM、人源化抗体262-H2L2的EC50＝0.3530nM、IMAB362的EC50＝2.054nM。
实施例14改造后抗体的ADCC效应
本发明所述靶向CLDN18.2的抗体Fc端与CD16a(F158)或者CD16a(V158)结合、Fab端与hCLDN18.2-HEK293结合后，会激活Jurkat细胞内部NF-AT蛋白表达，NF-AT与其反应元件结合会触发其下游的荧光素酶表达，用不同浓度梯度的本发明抗体刺激，会得到具有抗体浓度依赖性的荧光读数曲线，从而评价抗体的ADCC活性。
在96孔细胞培养板中每孔加入50μL密度为4×105个/mL的hCLDN18.2-HEK293细胞和4×106个/mL的CD16a(F158)-NF-AT-jurkat细胞，将细胞1:1混合后加入到96孔白边底透细胞培养板中，置于37℃培养箱中培养过夜(16-20小时)。加入50μL梯度稀释的改造后抗体262-H2L2-7、262-H2L2-23、人源化抗体262-H2L2、对照抗体IMAB362、对照抗体hu8E5-2I(根据专利WO2018006882A1所披露的重链SEQ ID NO:63和轻链SEQ ID NO:65的序列信息表达、纯化制得)、对照抗体ASK589-M5(根据专利US20200040101 A1所披露的重链SEQ ID NO:257和轻链SEQ ID NO:260的序列信息表达、纯化制得)或对照抗体h1901-11(根据专利WO2020200196A1所披露的重链SEQ ID NO:44和轻链SEQ ID NO:41的序列信息表达、纯化制得)，37℃培养箱孵育6h。每孔加入50μL Bright-Life(vazyme，货号：DD1204-03)，避光孵育10min，检测荧光信号。
ADCC检测结果如下：如图13a所示，改造后抗体262-H2L2-7在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362及hu8E5-2I，其中，改造后抗体262-H2L2-7的EC50＝0.031μg/mL、对照抗体IMAB362的EC50＝0.281μg/mL、对照抗体hu8E5-2I的EC50＝0.064μg/mL；如图13b所示，改造后抗体262-H2L2-7在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC杀伤效应明显优于对照抗体ASK589-M5及h1901-11，其中，改造后抗体262-H2L2-7的EC50＝0.033μg/mL、对照抗体ASK589-M5的EC50＝0.091μg/mL、对照抗体h1901-11的EC50＝0.079μg/mL；如图13c所示，改造后抗体262-H2L2-23在hCLDN18.2-HEK293细胞上的ADCC杀伤效应明显优于对照抗体IMAB362及hu8E5-2I，其中，改造后抗体262-H2L2-23的EC50＝0.047μg/mL、对照抗体IMAB362的EC50＝0.339μg/mL、对照抗体hu8E5-2I的EC50＝0.104μg/mL；如图13d所示，改造后抗体262-H2L2-23在hCLDN18.2-HEK293上的ADCC杀伤效应明显优于对照抗体ASK589-M5及h1901-11，其中，改造后抗体262-H2L2-23的EC50＝0.046μg/mL、对照抗体ASK589-M5的EC50＝0.105μg/mL、对照抗体h1901-11的EC50＝0.085μg/mL。
实施例15体内抑瘤实验
使用6-8周龄雌性SCID小鼠(24-26g)，饲养在恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度21-24℃、湿度30-53％。将1×107个hCLDN18.2-HEK293T细胞进行右侧腋窝皮下接种注射，剔除肿瘤体积差异较大的小鼠。依据肿瘤体积进行随机分组(每组8只小鼠)：分别是PBS处理组、IMAB362抗体处理组、改造后抗体处理组，其中改造后抗体分别选取了262-H2L2-2、262-H2L2-9、262-H2L2-14、262-H2L2-19、262-H2L2-20、262-H2L2-7和262-H2L2-23。细胞接种14天后即开始给药处理，每周2次给药处理，分别是静脉注射和腹膜内注射两种方式交替给药。随时观察和记录肿瘤长(L)和宽(W)，计算其肿瘤生长体积(V)，计算方式为：V＝L×W2/2。
结果表明改造后抗体都具有抑制肿瘤的效果。如图14所示，在10mg/kg相同剂量下，相对于对照抗体IMAB362，262-H2L2-2、262-H2L2-9具有更优的抑制肿瘤效果。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 三优生物医药（上海）有限公司
<120> 一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用
<130> P20017633C
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
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Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
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Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
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Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
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Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
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180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
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<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> Mus musculus
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<210> 4
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
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<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 12
<211> 454
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 14
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人鼠嵌合抗体262的轻链
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 15
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区262-H1
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gln Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区262-H2
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区262-L1
<400> 17
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区262-L2
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-7 VL
<400> 19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Trp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-23 VL
<400> 20
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Trp Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Trp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-53 VL
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Trp Val Pro Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-7/11/23/24/53/2 L-CDR1
<400> 23
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 24
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 25
Gln Gln Ser Arg Trp Val Pro Trp Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-23 L-CDR3
<400> 26
Gln Gln Ser Arg Trp Val Pro Leu Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 27
Gln Gln Ser Arg Trp Val Pro Leu Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
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Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO:29 262-H2L2-11 VH
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ser
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Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-23/24/53/2 VH
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
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Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 33
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<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 35
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Arg Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-14 VL
<400> 36
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
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Gly Thr Arg Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-19 VL
<400> 37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-20 VL
<400> 38
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-9 L-CDR1
<400> 39
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Met Gln
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-14 L-CDR1
<400> 40
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Arg Leu Met Gln
1 5 10 15
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-19 L-CDR2
<400> 41
Ala Ala Ser Asn Arg Gln Ser
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-2 L-CDR3
<400> 42
Gln Gln Ser Arg Phe Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-9 L-CDR3
<400> 43
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Ser
1 5
<210> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-9 VH
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Phe Pro
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262-H2L2-9 H-CDR3
<400> 45
Gln Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Phe Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 262- H2L2-23 L-CDR2
<400> 46
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5

Claims (24)

1.一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其特征在于，
所述HCDR1包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其变体1，所述HCDR2包含如SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体2，所述LCDR1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其变体3，所述LCDR2包含如SEQ ID NO:9或者SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其变体4，所述LCDR3包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其变体5；
所述变体为在原始序列基础上进行1个、2个或3个氨基酸的取代、缺失或添加，包含上述变体的抗体或其抗原结合片段至少保持与CLDN18.2的结合能力。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，
所述变体1的突变至少发生于SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的第2位；
所述变体2的突变至少发生于SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的第14和/或15位；
所述变体3的突变至少发生于SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的第7位、第10位和第12位中的一位或多位；
所述变体4的突变至少发生于SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的第4位和/或第5位；
所述变体5的突变至少发生于SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的第5位、第8位和第9位中的一位或多位；其中：
变体1中所述第2位优选突变为R；
变体2中所述第14位优选突变为N或P，所述第15位优选突变为L；
变体3中所述第7位优选突变为S，所述第10位优选突变为R，所述第12位优选突变为R；
变体4中所述第4位优选突变为E，所述第5位优选突变为R；
变体5中所述第5位优选突变为W或F，所述第8位优选突变为L，所述第9位优选突变为V或S。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述变体1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；
和/或，所述变体2的氨基酸序列如SEQ ID NO:32、33或者45所示；
和/或，所述变体3的氨基酸序列如SEQ ID NO:23、39或者40所示；
和/或，所述变体4的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或者41所示；
和/或，所述变体5的氨基酸序列如SEQ ID NO:25、26、27、42或者43所示。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:6所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；
较佳地，所述重链可变区的框架区为人源或者鼠源框架区；
更佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或者SEQ ID NO:44所示。
5.如权利要求3或4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:24所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:41所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；
较佳地，所述轻链可变区的框架区为人源或者鼠源框架区；
更佳地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38所示。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:40所示，且所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO:10所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO:42所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:23所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；
或者，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体还包含抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区源自人源抗体的重链或其变体，所述轻链恒定区源自人源抗体的κ链或者λ链或其变体。
9.如权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双特异性抗体或多特异性抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体；所述Fv优选scFv。
10.一种分离的核酸，其编码如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
11.一种重组表达载体，其包含如权利要求10所述的分离的核酸；优选地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
12.一种转化体，其在宿主细胞中包含如权利要求11所述的重组表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；更优选地，所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞；其中，所述哺乳动物细胞为，例如293细胞或CHO细胞。
13.一种嵌合抗原受体，其包含如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
14.一种基因修饰的细胞，其特征在于，其包含如权利要求13所述的嵌合抗原受体；优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞，或NK细胞。
15.一种靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包含培养如权利要求12所述的转化体，从培养物中获得靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段。
16.一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述细胞毒性剂为MMAF或MMAE。
17.一种药物组合物，其包含如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段和/或如权利要求16所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体；
较佳地，所述药物组合物还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
18.如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、权利要求16所述的抗体药物偶联物和/或权利要求17所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为CLDN18.2阳性肿瘤；更优选地，所述肿瘤为胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、支气管癌、神经胶质瘤和/或白血病。
19.一种试剂盒，其包括如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的嵌合抗原受体、如权利要求14所述的基因修饰的细胞、或如权利要求16中所述的抗体药物偶联物或如权利要求17所述的药物组合物；
较佳地，所述试剂盒还包括(i)施用抗体或其抗原结合片段或抗体药物偶联物或药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。
20.一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A含有如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的嵌合抗原受体、如权利要求14所述的基因修饰的细胞、如权利要求16所述的抗体药物偶联物和/或如权利要求17所述的药物组合物；
所述药盒B含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
21.一种诊断、治疗和/或预防CLDN18.2介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求17所述的药物组合物，或者使用如权利要求20所述的套装药盒治疗有需要的患者。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的疾病或病症为肿瘤，优选CLDN18.2阳性肿瘤，更优选胃癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、支气管癌、神经胶质瘤和/或白血病。
23.一种免疫检测或者测定CLDN18.2的方法，其包括使用如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求17所述的药物组合物；优选地，所述检测为非诊断和/或治疗目的的检测。
24.一种联合疗法，其包括分别向有需要的患者施用如权利要求1～9任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的嵌合抗原受体、如权利要求16所述的抗体药物偶联物或如权利要求17所述的药物组合物，和第二治疗剂；所述第二治疗剂较佳地包含其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
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