CN115097123A - 一种碱性磷酸酶标记物、制备方法、应用及其标记抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碱性磷酸酶标记物、制备方法、应用及其标记抗体的方法，碱性磷酸酶标记物为生物素标记的碱性磷酸酶；用于通过链霉亲和素‑生物素放大反应标记链霉亲和素标记的抗体，采用发明的碱性磷酸酶标记物及标记方法，可以有效提高碱性磷酸酶的标记量，进一步提高了检测项目的灵敏度。

Description

一种碱性磷酸酶标记物、制备方法、应用及其标记抗体的方法

技术领域

本发明涉及酶促化学发光检测技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶标记物、制备方法、应用及其标记抗体的方法。

背景技术

化学发光法具有灵敏度高、线性宽等优势，但对于某些项目来说灵敏度仍是不够，本专利提出一种特殊的标记方法可有效提高试剂的灵敏度，该技术几乎适用于所有项目。

酶促化学发光法，是体外诊断试剂中主流技术，其中以贝克曼为代表的碱性磷酸酶(ALP)和雅培为代表的吖啶酯(AE)是最为广泛采用的标记物。

现有的碱性磷酸酶(ALP)酶促化学发光法，常用磁微粒和固定抗体连接，检测抗体(Ab)通过常用交联剂连接于ALP，两种抗体识别与待测物的不同抗原位点，形成双抗体夹心结构，通过磁微粒的固相作用，可进行洗脱多于的复合物之外的成份，最后复合物上的ALP可作用于底物(AMPPD)促进其发光，发光信号的高低反应出待测物的浓度水平。

因此，在标记ALP多采用交联剂进行桥接的方法，即在检测抗体的氨基和2IT进行反应，ALP的氨基和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)的进行反应，SMCC的基团又和2IT进行交联，最后，复合物中ALP的多少受限于Ab的氨基数。对于个别要求灵敏度特别高的项目来说达不到要求，如超敏肌钙、竞争法项目等来说，ALP标记率相对较低，灵敏度不够。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有的抗体标记碱性磷酸酶酶促技术，标记产物中ALP的多少受限于Ab的氨基数，对于个别要求灵敏度特别高的项目来说达不到要求，本发明提供了解决上述问题的一种碱性磷酸酶标记物、制备方法、应用及其标记抗体的方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种碱性磷酸酶标记物，为生物素标记的碱性磷酸酶；用于通过链霉亲和素-生物素放大反应标记链霉亲和素标记的抗体。

进一步可选地，所述生物素包括(+)-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯。

一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，将生物素与碱性磷酸酶混合反应，制备获得上述的一种生物素标记的碱性磷酸酶。

进一步可选地，所述生物素与碱性磷酸酶的摩尔比为10/1～30/1；更优选地为15/1～25/1。

进一步可选地，所述生物素与碱性磷酸酶的摩尔比为20/1。

一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，包括以下步骤：

将生物素溶解在有机溶剂中，配制生物素溶液；

对碱性磷酸酶经透析处理后加入生物素溶液，在室温条件下静置反应，制备获得生物素标记的碱性磷酸酶。

进一步可选地，生物素溶液中，生物素的摩尔浓度为6mM～15mM，更优选为10mM。

一种碱性磷酸酶标记物的应用，用于制备碱性磷酸酶酶促化学发光法检测试剂，或用于碱性磷酸酶酶促化学发光检测方法中。

一种碱性磷酸酶标记物标记抗体的方法，将生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体混合，通过生物素与链霉亲和素发生放大反应，实现碱性磷酸酶标记抗体；所述生物素标记的碱性磷酸酶为上述的一种碱性磷酸酶标记物，或者为上述的一种碱性磷酸酶标记物的制备方法制备获得的生物素标记的碱性磷酸酶。

进一步可选地，生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体两者的质量比为1:1～3:1。

链霉亲和素标记的抗体可通过如下方法制备获得：

步骤1：将抗体(Ab)和还原剂(2IT)进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体(Ab-SH)；

步骤2：取链霉亲和素(SA)和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)进行反应，获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素(SA-SMCC)；

步骤3：将含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，获得所述抗体-链霉亲和素偶联物(Ab-SA)。

本发明具有如下的优点和有益效果：

现有的抗体标记碱性磷酸酶酶促技术，标记产物中ALP的多少是有Ab的氨基数决定，对于个别要求灵敏度特别高的项目来说达不到要求，如超敏肌钙、竞争法项目等来说，ALP标记率相对较低，灵敏度不够。本发明提供了一种碱性生物素标记的碱性磷酸酶，用于通过链霉亲和素-生物素放大反应标记链霉亲和素标记的抗体，通过SA和BHNS的亲和放大系统，得到结构稳定的Ab-ALP复合物，由于一个亲合素可以连接4个生物素，则可实现在相同的抗体量的条件下，可连接4倍量的ALP的高灵敏度ALP标记物。

现在的抗体标记碱性磷酸酶酶促技术，(即，抗体的氨基和2IT进行反应，ALP的氨基和SMCC的进行反应，AMCC的基团又和2IT进行交联)已经能满足灵敏度的需要，因为大发光通量大，可适当的延长试剂的检测时间，也不影响检测效率。而对于单人份POCT发光来说，快速检测是竞争的一大优势，故想要较快速度得到测定结果，则进一步提高试剂的灵敏度就显得特别重要。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明的碱性磷酸酶标记物标记抗体的方法的流程图。

图2为实施例3的对照组和贝克曼的临床一致性图。

图3为实施例3的实验组和贝克曼的临床一致性图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1

本实施例提供了一种碱性磷酸酶标记物，为生物素标记的碱性磷酸酶；用于通过链霉亲和素-生物素放大反应标记链霉亲和素标记的抗体。通过以下方法制备获得：

取(+)生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(BNHS)溶解在有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，制备得到BNHS溶液；取2μL浓度为10mM的BNHS溶液备用；

按BHNS:ALP的摩尔比为20:1的量，取碱性磷酸酶(ALP)经PBS透析处理(透析12h-24h，中间替换一次透析液)后，加入2μL浓度为10mM的BNHS溶液，室温条件静置反应30min；

再通过PBS透析处理(透析12h-24h，中间替换一次透析液)，获得生物素标记的碱性磷酸酶，简称ALP-BNHS。

实施例2

本实施例提供了一种碱性磷酸酶标记物标记抗体的方法，将生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体混合，通过生物素与链霉亲和素发生放大反应，实现碱性磷酸酶标记抗体，如图1所示，具体制备方法如下所示：

步骤1：制备生物素标记的碱性磷酸酶

具体采用实施例1的方法制备得到ALP-BNHS。

步骤2：制备链霉亲和素标记的抗体

将抗体(Ab)和还原剂(2IT)进行第一接触反应，以便获得经还原的含有巯基的抗体(Ab-SH)；

取链霉亲和素(SA)和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯(SMCC)进行反应，获得马来酰亚胺修饰的链霉亲和素(SA-SMCC)；

将含有巯基的抗体和马来酰亚胺修饰的链霉亲和素进行第二接触反应，获得所述抗体-链霉亲和素偶联物(Ab-SA)。

具体方法为：

(1)配制50mM/L的2-IT溶液，取2.4uL缓慢滴加至0.2mg的Ab中，室温混匀反应30min。

(2)配制20mM/L的SMCC溶液，，取10uL缓慢滴加至2mg的SA中，室温混匀反应30min。

(3)Ab-2IT和SA-SMCC以质量比2:1的关系连接，室温混匀反应60min。

步骤3：碱性磷酸酶标记物标记抗体

按照物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体两者的质量比为2:1，将物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体混合均匀后，室温反应30min，获得碱性磷酸酶标记的抗体(Ab-ALP)。

实施例3

基于实施例2提供的标记方法，检测抗原，具体设计试验如下所示：

(一)试验方法

1、临床样本来源

购买贝克曼有值的肌钙临床血清，离心后检测上清。

2、对照组

免疫磁珠：0.4mg/ml链霉亲和素磁珠、4.0μg/ml肌钙单克隆抗体、1％牛血清白蛋白、0.05M Tris、0.9％NaCl、0.3％PC950、0.05％tween20。

酶工作液：：1mg/0.8mg碱性磷酸酶标记的肌钙单克隆抗体、1％牛血清白蛋白、0.05M Tris、0.9％NaCl、PH7.4、0.3％PC950、0.05％tween20、1mM MgCl₂缓冲液、0.1mMZnCl₂缓冲液。

清洗液：0.05M Tris-HCl缓冲液、0.05％吐温。

AMPPD底物。

3、实验组

免疫磁珠：同对照组。

酶工作液：2mg/1mg实施例2制备的碱性磷酸酶标记的肌钙单克隆抗体、1％牛血清白蛋白、0.05M Tris、0.9％NaCl、PH7.4、0.3％PC950、0.05％tween20、1mM MgCl₂缓冲液、0.1mM ZnCl₂缓冲液。

清洗液：同对照组。

AMPPD底物同对照组。

(三)试验结果

检测结果如表1、表2、图1和图2所示。如表1所示，通过信噪比可得出实验组的灵敏度远远高于对照组的灵敏度；且实验组的发光值高于对照组的发光值。如表2、图2、图3所示，实验组的临床测值更接近比对厂家贝克曼的结果值，二者相关性R²达0.97，对照组的测值相对较差。

表1

表2

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种碱性磷酸酶标记物，其特征在于，为生物素标记的碱性磷酸酶；用于通过链霉亲和素-生物素放大反应标记链霉亲和素标记的抗体。

2.根据权利要求1所述的一种碱性磷酸酶标记物其特征在于，所述生物素包括(+)-生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯。

3.一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，其特征在于，将生物素与碱性磷酸酶混合反应，制备获得权利要求1或2所述的一种生物素标记的碱性磷酸酶。

4.根据权利要求3所述的一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，其特征在于，所述生物素与碱性磷酸酶的摩尔比为10/1～30/1。

5.根据权利要求4所述的一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，其特征在于，所述生物素与碱性磷酸酶的摩尔比为20/1。

6.根据权利要求3～5任一项所述的一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将生物素溶解在有机溶剂中，配制生物素溶液；

对碱性磷酸酶经透析处理后加入生物素溶液，在室温条件下静置反应，制备获得生物素标记的碱性磷酸酶。

7.根据权利要求6所述的一种碱性磷酸酶标记物的制备方法，其特征在于，生物素溶液中，生物素的摩尔浓度为6mM～15mM。

8.一种碱性磷酸酶标记物的应用，其特征在于，用于制备碱性磷酸酶酶促化学发光法检测试剂，或用于碱性磷酸酶酶促化学发光检测方法中。

9.一种碱性磷酸酶标记物标记抗体的方法，其特征在于，将生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体混合，通过生物素与链霉亲和素发生放大反应，实现碱性磷酸酶标记抗体；所述生物素标记的碱性磷酸酶为权利要求1或2所述的一种碱性磷酸酶标记物，或者为权利要求3～7任一项所述的一种碱性磷酸酶标记物的制备方法制备获得的生物素标记的碱性磷酸酶。

10.根据权利要求0所述的一种碱性磷酸酶标记物标记抗体的方法，其特征在于，生物素标记的碱性磷酸酶与链霉亲和素标记的抗体两者的质量比为1:1～3:1。

Images