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CN115093483B - Il-17ra融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用 - Google Patents

Il-17ra融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用 Download PDF

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CN115093483B CN202210693381.0A CN202210693381A CN115093483B CN 115093483 B CN115093483 B CN 115093483B CN 202210693381 A CN202210693381 A CN 202210693381A CN 115093483 B CN115093483 B CN 115093483B
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Abstract

本发明提供了IL‑17RA融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用。所述IL‑17RA融合蛋白包括可操作地连接的、依次串联的信号肽、IL‑17RA胞外结构域和IgG1恒定区。本发明的IL‑17RA融合蛋白具有延长的半衰期，获得了更长效的药物活性，并且与抗体药物相比降低了免疫原性。本发明的设计使IL‑17RA融合蛋白消除了ADCC、ADCP和CDC作用，并且保留新生儿Fc受体(FcRn)介导的体内循环利用的作用，与已上市的IL‑17A和IL‑17RA抗体相比，副反应低且更为安全。

Description

IL-17RA融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体而言，涉及IL-17RA融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用。
背景技术
银屑病俗称牛皮癣，是一种慢性易于复发的自身免疫性皮肤病，通常会对患者生理及心理造成极大损害，WHO将其视为全球重大健康问题之一，发病率占世界人口的0.1％～3％，目前全球已有银屑病患者1.25亿。我国总患病率为0.47％，目前已有近650万临床登记患者，斑块银屑病是该疾病最常见的五种形式之一，占所有病例的80％～90％，其中中重度患者占38％，未来患者数量将在2030年达到950万人，中重度患者比例将提高到40％。银屑病发病机制和先天和适应性免疫系统的失调，包括树突状细胞激活和促炎性细胞因子分泌，导致银屑病特征皮肤炎症的发生有关。近年来，近13种单克隆抗体和以抗体为基础的生物疗法已经被批准用于治疗银屑病，处于临床研究阶段的单抗药物约有10个左右，其中优特克(ustekinumab，IL-12/IL-23抗体，强生)抗体、TNF-α药物依那西普(Etanercept，安进)和阿达木单抗(Humira，艾伯维)是最畅销的药物。口服磷酸二酯酶4(PDE4)选择性抑制剂药物apremilast(Otezla，Celgene公司)也于2014年9月在美国获得批准，治疗难治性银屑病。然而，即便是这些生物药物作为二线药物来使用，治疗效果和安全性依然堪忧，而且多达40％的中度至重度银屑病患者使用现有的生物制剂治疗失败，这种现象被称为生物制品疲劳现象。
最新的研究表明：银屑病的发病机制和T17辅助性细胞(Th17细胞)相关，而由Th17细胞及先天性免疫细胞产生的促炎细胞因子IL-17A已被证实是在银屑病的发病机制中的主要细胞因子，免疫系统靶向于IL-17-TH17通路中的IL-23，通过IL-17A间接导致银屑病的发生。从理论上讲，抑制IL-17相比于其他生物制剂可能是一种更安全的治疗选择，这在诺华已上市的针对IL-17A全人源IgG1单抗苏金单抗(secukinumab)、阿斯利康公司已上市的针对IL-17A受体全人源IgG2单抗(Brodalumab)、以及礼来公司的针对IL-17A全人源IgG4单抗(ixekizumab)与依那西普和优特克单抗(IL-12/IL-23抗体)头对头优效性比较研究中得到证实。研究表明，针对IL-17A靶标开发的抑制剂与目前的炎性疾病治疗药物(如TNF-α抑制剂)相比，可以提高疗效和安全性，且对TNF-α抑制剂及IL-12和IL-23抑制剂无效的银屑病患者有效，比IL-12和IL-23抑制剂具有更专一性。特别值得一提的是，于2015年1月上市的苏金单抗(商品名Cosentyx)，欧洲药品管理局(EMA)批准其可取代其他具有显著副作用的一线系统疗法用于银屑病患者的一线治疗。
目前仍然需要更多的具有优良疗效的创新药物作为供患者选择的治疗途径。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了IL-17RA融合蛋白、药物组合物、注射剂及其应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种IL-17RA融合蛋白，其特征在于包括可操作地连接的、依次串联的信号肽、IL-17RA胞外结构域和IgG1恒定区。
(2)根据(1)所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述IL-17RA胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
(3)根据(1)所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述IgG1恒定区的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
(4)根据(1)所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述信号肽为IL-17-RA天然信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
(5)根据(1)所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述IL-17RA胞外结构域与所述IgG1恒定区之间采用接头连接。
(6)根据(1)所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述IL-17RA融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
(7)一种分离的、编码根据(1)-(6)中任一项所述IL-17RA融合蛋白的核酸。
(8)一种表达载体，其含有与启动子有效连接的根据(7)所述的核酸。
(9)一种宿主细胞，其含有根据(8)所述的表达载体。
(10)根据(9)所述的宿主细胞，其中该宿主细胞的保藏编号为CGMCC 21011。
(11)一种由根据(1)-(6)中任一项所述的IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体，该二聚体由两分子所述IL-17RA融合蛋白通过所述IgG1恒定区的半胱氨酸结合形成双链。
(12)根据(1)-(6)中任一项所述的IL-17RA融合蛋白或根据权利要求11所述的蛋白二聚体在制备用于治疗银屑病,克罗恩病,斑块银屑病,胃肠炎,白塞病综合征,关节炎,葡萄膜炎,化脓性汗腺炎,扁平苔藓,副银屑病,哮喘,银屑病关节炎,肌腱炎,复发-缓解型多发性硬化,甲状腺相关性眼病,幼年型类风湿性关节炎,多发性硬化,狼疮肾炎,椎关节炎,强直性脊柱炎,类风湿关节炎,炎症性肠疾病,非酒精性脂肪肝,巨细胞性动脉炎,非放射学性轴性脊柱关节炎，寻常痤疮,三阴性乳腺肿瘤,多发性骨髓瘤，非小细胞肺癌,腺癌，结直肠癌，前列腺癌，卡波济氏肉瘤,黑色素瘤,宫颈癌和/或其他炎症性疾病的药物中的应用。
(13)一种药物组合物，包含治疗有效量的根据(1)-(6)中任意一项所述的IL-17RA融合蛋白或根据权利要求11所述的蛋白二聚体作为活性成分和可药用的辅料。
(14)根据(13)所述的药物组合物，其中所述可药用的辅料选自稀释剂、缓冲剂、保护剂、表面活性剂、抗氧化剂中的一种或多种。
(15)根据(14)所述的药物组合物，其中所述缓冲剂选自组氨酸-醋酸缓冲液、Tris-醋酸缓冲液、盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液，精氨酸缓冲液，琥珀酸缓冲液，柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
(16)根据(14)所述的药物组合物，其中所述保护剂选自海藻糖、吐温-20、吐温-80、蔗糖、氨基酸、多元醇、二糖、多糖中的一种或多种。
(17)根据(14)所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、泊洛沙姆中的一种或多种。
(18)根据(13)所述的药物组合物，其中单剂所述药物组合物包含5mg/ml-150mg/ml的所述IL-17RA融合蛋白或所述蛋白二聚体。
(19)根据(13)所述的药物组合物，其中所述药物组合物为冻干剂或注射液的形式。
(20)一种用于治疗银屑病,克罗恩病,斑块银屑病,胃肠炎,白塞病综合征,关节炎,葡萄膜炎,化脓性汗腺炎,扁平苔藓,副银屑病,哮喘,银屑病关节炎,肌腱炎,复发-缓解型多发性硬化,甲状腺相关性眼病,幼年型类风湿性关节炎,多发性硬化,狼疮肾炎,椎关节炎,强直性脊柱炎,类风湿关节炎,炎症性肠疾病,非酒精性脂肪肝,巨细胞性动脉炎,非放射学性轴性脊柱关节炎，寻常痤疮,三阴性乳腺肿瘤,多发性骨髓瘤，非小细胞肺癌,腺癌，结直肠癌，前列腺癌，卡波济氏肉瘤,黑色素瘤,宫颈癌和/或其他炎症性疾病的注射剂，包含(13)-(19)中任一项所述的药物组合物。
(21)根据(20)所述的注射剂，其中所述注射剂为冻干粉剂的形式或液体制剂的形式。
(22)根据(20)所述的注射剂，其中所述注射剂为皮下注射剂或静脉滴注剂。
(23)根据(21)所述的注射剂，其中在所述液体制剂中，所述静脉制剂包含5mg/ml-150mg/ml的所述IL-17RA融合蛋白或所述蛋白二聚体、2-100mM的Tris-醋酸、10-250mM的精氨酸、50-500mM的海藻糖、0.01-5％的吐温-20。
(24)根据(21)所述的注射剂，其中所述液体制剂是采用注射用水、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液或乳酸林格氏液配制得到的。
(25)根据(21)所述的注射剂，其中所述冻干粉剂是通过将所述液体制剂冷冻干燥制得的。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明提供的IL-17RA融合蛋白是全人源抗体Fc融合蛋白药物。本发明通过将IL-17RA与抗体Fc段融合，延长了药物分子的半衰期，获得了更长效的药物活性，并且与抗体药物相比降低了免疫原性。
另外，本发明发现选择IgG1的Fc段，并且进一步对该Fc的序列进行合适的突变，能够大大消除抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬(ADCP)和补体依赖的细胞介导的细胞毒作用(CDC)，并且保留新生儿Fc受体(FcRn)介导的体内循环利用的作用，与已上市的IL-17A和IL-17RA抗体相比，副反应低且更为安全。
另外，本发明通过选择和设计IL-17RA的序列，使得IL-17RA融合蛋白能够靶向IL-17A、IL-17C、IL-17F、IL-17A/F等多个靶点，且亲和力高，从而能够选择性地阻断IL-17A、IL-17C、IL-17F和IL-17A/F与其受体的结合，进而有效阻断多种促炎性IL-17细胞因子的生物学活性，抑制炎症信号通路，因此可更加有效地缓解自身免疫性疾病的症状，可获得比单一IL-17A靶点抗体药物更好的治疗收益，获得比IL-17RA单抗更好的安全性。其作用机制与目前已上市和在研的IL-17靶点药物均不同，系全球同类首创的药物。
本发明从与IL-17A的结合亲和力、生物学活性细胞实验、GRO-α因子抑制能力、体外活性效价、体内效价、ADCC/CDC功能活性、FcRn结合亲和力、安全药理学、药代动力学、毒理学方面对上述药物活性和安全性进行了综合的评价。
附图说明
图1示出重组人IL-17RA融合蛋白的氨基酸序列。
图2示出在一个实施方案中所用表达载体pCHO1.1/NVS451的图谱。
图3示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)与人IL-17A蛋白的亲和力测定曲线及拟合曲线。
图4示出在实验例1中苏金单抗与人IL-17A蛋白的亲和力测定曲线及拟合曲线。
图5示出在实验例1中野生型IL-17RA与人IL-17A蛋白的亲和力测定曲线及拟合曲线。
图6示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)与人IL-17F蛋白的亲和力测定曲线及拟合曲线。
图7示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)与人IL-17A/F蛋白的亲和力测定曲线及拟合曲线。
图8示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)与人IL-17C蛋白的亲和力测定曲线及拟合曲线。
图9示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)和苏金单抗对IL-17A诱导作用下GRO-α因子抑制作用的S曲线。
图10示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)对IL-17A/F诱导作用下GRO-α因子抑制作用的S曲线。
图11示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白(NVS451)对IL-17F诱导作用下GRO-α因子抑制作用的S曲线。
图12示出在实验例1中用不同药物处理异种皮肤移植SCID鼠之后的皮肤外观。
图13示出在实验例1中用不同药物处理异种皮肤移植SCID鼠之后的皮肤外观。
图14示出在实验例1中用不同药物处理异种皮肤移植SCID鼠之后的皮肤病理切片。
图15示出在实验例1中RitxV301与利妥昔单抗的ADCC效应比较。
图16示出在实验例1中RitxV301与利妥昔单抗的CDC效应比较。
图17示出在实验例1中在酸性条件下(pH6.0)不同浓度NVS451与人FcRn的SPR分析图谱。
图18示出在实验例1中在中性条件下(pH7.4)不同浓度NVS451与人FcRn的SPR分析图谱。
图19示出在实验例1中IL-17RA融合蛋白NVS451(V301)、V302和V303与IL-17A的亲和力比较；图中V300、V301、V302、V303、V301*、V302*、V303*的浓度均为100ug/ml。
生物材料保藏信息
本发明提供的能够稳定表达本发明的IL-17RA融合蛋白的中华仓鼠卵巢细胞已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.21011。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本文中，术语“注射剂”是指：由药物制成的供注入体内的无菌溶液(包括真溶液、乳浊液和混悬液)，以及供临用前配制成所述无菌溶液(包括真溶液、乳浊液和混悬液)的冻干粉末或浓溶液。
在本文中，术语“静脉滴注”是指：通过输液管，将包含药物的大量液体由静脉输入体内的方法。又称“输液”、“点滴”、“静滴”、“挂水”。
在本文中，术语“IL-17A”是指白细胞介素17A。
在本文中，术语“IL-17RA”是指IL-17A的受体。
在本文中，术语“活性成分”是指对疾病具有治疗作用的药物分子，例如本文所述的IL-17RA融合蛋白。
本发明提供了一种IL-17RA融合蛋白，其特征在于包含可操作地连接的、依次串联的信号肽、IL-17RA胞外结构域和IgG1恒定区。
信号肽的作用主要是引导目的蛋白从细胞胞质内分泌到细胞外。该融合蛋白由于存在IgG1恒定区，因此在分泌至细胞外时，两分子融合蛋白通过恒定区的半胱氨酸结合形成双链并发挥活性。
优选地，本发明采用人源IL-17RA的胞外结构域(Gene bank编号：NP_055154)，并且进行R108K、D122G和H155D突变，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。还优选地，本发明采用人源IL-17RA的胞外结构域，并且进行L9P、R108K、D122G和H155D突变，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明发现，与包含野生型相比，包含这两个突变体的IL-17RA融合蛋白具有提高的热稳定性，和提高的对IL-17A的结合亲和力。所述氨基酸编号从所述人源IL-17RA的胞外结构域氨基酸序列的第1位起算。
还优选地，本发明采用人源IL-17RA的胞外结构域，并且进行L9P、R108K、D122G、H155D、G243W和A267V突变，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明发现，IL-17RA融合蛋白包含该突变体与包含野生型相比具有提高的热稳定性，和提高的对IL-17A、IL-17C、IL-17F、IL-17A/F的结合亲和力；与包含上述带有三个和四个突变的突变体相比，具有更高的对IL-17A的结合亲和力。
本发明选择人源IgG1(Gene bank编号：3500)的恒定区(Fc)与IL-17RA形成融合蛋白。该融合蛋白不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，并且由于Fc部分具有一定抗体的特性且稳定，使得融合后的蛋白获得更长的循环寿命，半衰期延长。IgG同种型包括IgG1，IgG2和IgG4，其会引起不同的ADCC、ADCP和CDC效应，可对靶组织和非靶组织的毒性产生重大影响。IgG1的恒定区具有较强的ADCC、ADCP和CDC效应。本发明发现选择IgG1的恒定区，并且进一步对该Fc的序列进行合适的突变，能够降低IL-17RA融合蛋白的ADCC、ADCP和CDC效应。
在优选的实施方案中，突变位点总结于下表1。另外的突变是用丝氨酸残基替换IgG1铰链区的半胱氨酸残基，以避免融合蛋白序列中存在未配对的半胱氨酸。
表1
注：表1中所述的氨基酸编号是从人源IgG1氨基酸序列的第1位起算的。
该IgG1-Fc的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
信号肽是影响产量优化和产品质量的主要因素之一。重要的是信号肽切割位点应由切割清晰、切割概率高的单个残基明确界定。优选地，将人源IL17RA的天然信号肽用于融合蛋白，该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述IL-17RA胞外结构域与所述IgG1恒定区之间采用接头连接。接头可以为本领域常用的那些，例如一个或多个连续的GSG、一个或多个连续的GGGGS、和GSAGSAAGSG。
优选地，所述IL-17RA融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQID NO.8所示(IL-17RA胞外结构域分别带有三个突变、四个突变、六个突变)，其具有522个氨基酸残基。
例如，SEQ ID NO.8的序列如图1所示，其中前32个氨基酸(粗体)为IL-17RA信号肽，浅灰色背景的字母为经6个突变(粗体加下划线字母)的重组人源IL-17RA的氨基酸序列；黑色背景字母为接头氨基酸序列；深灰色背景字母为经表1所述3个修饰(粗体加下划线字母)的Fc部分的氨基酸序列，其中两个粗体半胱氨酸残基负责Fc的二聚化。星号(*)示出潜在的糖基化位点。
本发明提供的IL-17RA融合蛋白的作用机理是，使用诱饵受体(IL-17RA-Fc)与天然受体竞争结合IL-17分子，通过与IL-17A、IL-17C、IL-17F及IL-17A/F以高亲和力结合并选择性地阻断IL-17A、IL-17C、IL-17F和IL-17A/F与其受体的结合，不与IL-17B、IL-17D、IL-17E结合，有效阻断多种促炎性IL-17细胞因子的生物学活性，抑制炎症信号通路，从而更加有效地缓解自身免疫性疾病的症状，可获得比单一IL-17A靶点抗体药物更好的治疗收益，并获得比IL-17RA单抗更好的安全性。
本发明还提供了一种分离的、编码根据本发明所述IL-17RA融合蛋白的核酸。
在一个优选的实施方案中，本发明利用分子生物学技术设计了融合蛋白的cDNA序列，并优化了密码子使其在CHO细胞中表达。优化后的编码所述氨基酸序列SEQ ID NO.1-8的DNA序列分别如SEQ ID NO.9-16所示。
本发明还提供了一种分离的、由本发明所述的编码所述融合蛋白的DNA转录得到的mRNA。
本发明还提供了一种表达载体，其含有与启动子有效连接的根据本发明所述的核酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有根据本发明所述的表达载体。
在一些优选的实施方案中，使用适于在悬浮和无血清培养基中生长的CHO细胞用作宿主细胞。还优选地，所述表达载体中包含两个选择性标记嘌呤霉素和甲氨蝶呤，其可促进高产和稳定细胞系的创建。
在更优选的实施方案中，宿主细胞的保藏编号为CGMCC 21011。该宿主细胞的构建使用Thermo Scientific公司的CHO-STM细胞，构建后其可以稳定表达本发明的IL-17RA融合蛋白。此外，该宿主细胞还具有许多优点：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。因此，该CHO细胞是重组糖基蛋白生产的首选体系。该宿主细胞已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.21011。
本发明还提供了一种由根据本发明所述的IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体，该二聚体由两分子所述IL-17RA融合蛋白通过所述IgG1恒定区的半胱氨酸结合形成双链。
本发明所述的IL-17RA融合蛋白由于存在IgG1恒定区，因此在分泌至细胞外时，两分子融合蛋白通过恒定区的半胱氨酸结合形成双链并发挥活性。
本发明还提供了根据本发明所述的IL-17RA融合蛋白或由该IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体在制备用于治疗银屑病,克罗恩病,斑块银屑病,胃肠炎,白塞病综合征,关节炎,葡萄膜炎,化脓性汗腺炎,扁平苔藓,副银屑病,哮喘,银屑病关节炎,肌腱炎,复发-缓解型多发性硬化,甲状腺相关性眼病,幼年型类风湿性关节炎,多发性硬化,狼疮肾炎,椎关节炎,强直性脊柱炎,类风湿关节炎,炎症性肠疾病,非酒精性脂肪肝,巨细胞性动脉炎,非放射学性轴性脊柱关节炎，寻常痤疮,三阴性乳腺肿瘤,多发性骨髓瘤，非小细胞肺癌,腺癌，结直肠癌，前列腺癌，卡波济氏肉瘤,黑色素瘤,宫颈癌等和/或其他炎症性疾病的药物中的应用
本发明从与IL-17A的结合亲和力、生物学活性细胞实验、GRO-α因子抑制能力、体外活性效价、体内效价、ADCC/CDC功能活性、FcRn结合亲和力、安全药理学、药代动力学、毒理学方面对IL-17AR融合蛋白的药物活性和安全性进行了综合的评价。结果证明，所述IL-17RA融合蛋白能够靶向IL-17A、IL-17C、IL-17F、IL-17A/F等多个靶点，且亲和力高，从而能够选择性地阻断IL-17A、IL-17C、IL-17F和IL-17A/F与其受体的结合，进而有效阻断多种促炎性IL-17细胞因子的生物学活性，抑制炎症信号通路，因此可更加有效地缓解自身免疫性疾病的症状，可获得比单一IL-17A靶点抗体药物更好的治疗收益，获得比IL-17RA单抗更好的安全性。
本发明还提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的根据本发明所述的IL-17RA融合蛋白或由该IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体作为活性成分和可药用的辅料。
可药用的辅料可以根据所用的剂型和实际需要进行选择。
本发明从包材、缓冲体系、辅料、剂量、处方组成、冻干工艺等方面深入研究和设计了所述IL-17RA融合蛋白的制剂及制剂处方。
在一些优选的实施方案中，所述药物组合物的可药用辅料选自稀释剂、缓冲剂、保护剂、表面活性剂、抗氧化剂中的一种或多种。
优选地，缓冲剂选自组氨酸-醋酸缓冲液、Tris-醋酸缓冲液、盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液，精氨酸缓冲液，琥珀酸缓冲液，柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选地，保护剂选自海藻糖、吐温-20、吐温-80、蔗糖、氨基酸(例如精氨酸)、多元醇、二糖、多糖中的一种或多种。其中最优选为海藻糖、以及海藻糖+精氨酸的组合。
在一些实施方案中，海藻糖以二水海藻糖的形式存在。
优选地，表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、泊洛沙姆(poloxamer)中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，单剂所述药物组合物包含5mg/ml-150mg/ml的所述IL-17RA融合蛋白或由该IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体。
可以根据需要将本发明所述的药物组合物制成合适的剂型。在本发明中，所述IL-17RA融合蛋白优选为冻干剂或注射液的形式。
因此，本发明还提供了一种用于治疗银屑病,克罗恩病,斑块银屑病,胃肠炎,白塞病综合征,关节炎,葡萄膜炎,化脓性汗腺炎,扁平苔藓,副银屑病,哮喘,银屑病关节炎,肌腱炎,复发-缓解型多发性硬化,甲状腺相关性眼病,幼年型类风湿性关节炎,多发性硬化,狼疮肾炎,椎关节炎,强直性脊柱炎,类风湿关节炎,炎症性肠疾病,非酒精性脂肪肝,巨细胞性动脉炎,非放射学性轴性脊柱关节炎，寻常痤疮,三阴性乳腺肿瘤,多发性骨髓瘤，非小细胞肺癌,腺癌，结直肠癌，前列腺癌，卡波济氏肉瘤,黑色素瘤,宫颈癌等和/或其他炎症性疾病的注射剂，其包含本发明所述的药物组合物。
所述注射剂可以为冻干粉剂的形式或液体制剂的形式。
优选地，所述注射剂为皮下注射剂或静脉滴注剂。最优选为皮下注射剂。
在液体制剂中，所述注射剂优选包含所述IL-17RA融合蛋白、Tris-醋酸、精氨酸、海藻糖、吐温-20以及合适的溶剂。
更优选地，所述注射剂包含5mg/ml-150mg/ml的所述IL-17RA融合蛋白或由该IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体、2-100mM的Tris-醋酸、10-250mM的精氨酸、50-500mM的海藻糖、0.01-5％的吐温-20以及合适的溶剂。
所述溶剂可以采用配制注射剂常用的溶剂。例如注射用水、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液或乳酸林格氏液等。
所述液体制剂是采用溶剂配制得到的。
可以采用制药领域常用的方法按照本发明所述的处方配制所述液体制剂。
冻干粉剂可以通过将所述液体制剂冷冻干燥而制得。
在优选的实施方案中，冻干工艺包括预冻、一次干燥(升华)和二次干燥(解析)。预冻包括将温度由5℃降至-40℃，并保持合适的时间；一次干燥包括将温度升至-5至0℃，并保持合适的时间；二次干燥包括将温度升至25℃至30℃，并保持合适的时间。
根据本发明对IL-17RA融合蛋白的制剂及制剂处方的研究，本发明开发了药品稳定性优良、可以安全注射给药的药物制剂。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程和制药领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
制备例1：质粒构建
NVS451(即，IL-17RA融合蛋白)由信号肽、rhIL17-RA ECD(即，人源IL17-RA胞外结构域)、接头肽段和IgG1 Fc结构域组成。其中信号肽采用IL17RA的天然信号肽。rhIL17-RAECD中包含六个突变位点，分别为L9P、R108L、D122G、H155D、G243W和A267V(氨基酸编号不包含信号肽序列)。接头肽段为GSG。IgG1 Fc结构域采用IgG1、2、4的杂合体，以去除潜在的ADCC、CDC和ADCP效应。NVS451的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。
采用Thermo Scientific公司的pCHO1.0哺乳动物细胞表达载体构建质粒。pCHO1.0表达载体含有两个表达框，由于NVS451融合蛋白的表达只需要一个表达框，因此使用SfiI酶切位点移除了另外一个表达框，被移除的表达框包含有EcoRV和PacI克隆位点。移除一个表达框之后的pCHO1.0载体通过序列测序来验证，并命名为pCHO1.1。合成的NVS451融合蛋白基因通过AvrII和Bstz17I克隆位点插入pCHO1.1(Kan抗性)表达载体，并转化DH5α感受态细胞，涂板筛选，接种扩增含有正确大小质粒的克隆，质粒提取获得大量构建好的NVS451融合蛋白表达质粒pCHO1.1-NVS4510。基因测序验证pCHO1.1-NVS451表达载体构建正确。
制备例2：细胞株筛选及稳定性评价
NVS451融合蛋白细胞株的构建及筛选选用CHO-STM(符合现行药品生产管理规范的细胞库(cGMP-banked)，该细胞以及配套的表达载体pCHO1.0源于Thermo Scientific公司的 Kit)细胞作为原始细胞基质。NVS451融合蛋白表达质粒pCHO1.1-NVS451含有嘌呤霉素和MTX的筛选标记。pCHO1.1-NVS4510通过转染试剂转入CHO-S细胞。转染过程如下：50μg环状的表达质粒pCHO1.1-NVS451通过Opti PRO SFM稀释至1.5ml体积，50μl Freestyle Max转染试剂(GIBCO)通过Opti PRO SFM稀释至1.5ml，然后质粒稀释液和转染试剂稀释液等体积混合，加入30ml 1E6细胞/ml的CHO-S细胞悬液。转染细胞培养48小时后使用嘌呤霉素和MTX作为筛选压力进行两阶段的稳转克隆细胞池(Pools)筛选。由于未转染的CHO-S缺乏pac(腺苷酸环化酶)活性，仅具有基础DHFR(二氢叶酸还原酶)活性，因此只有被pCHO1.1-NVS4510质粒转染并整合入基因组的CHO-S细胞才能在含有嘌呤霉素和MTX的CD FortiCHOTM筛选培养基中存活和繁殖。筛选分两个阶段进行，每个阶段都使用嘌呤霉素和MTX进行筛选。最后形成4个稳转克隆细胞池(Pool)，分别为T3S1，T3S2，T3S3，T3S4。通过14天的简单流加批次培养(SFB)来评价表达量。结合基于细胞的GRO-α抑制活性实验、亲和ELISA和SPR分析方法(采用常规方法，故不赘述)，选出T3S1和T3S4两个稳转克隆池用于分离单克隆(LDC)。单克隆的分离采用两轮有限稀释分离单克隆，每轮细胞铺板浓度小于1个细胞/孔(按照统计学的数学计算方法)，最终获得5个候选单克隆：T3S4-7E3-6G5；T3S4-7E3-3C3；T3S4-17G2-6E2；T3S4-8F2-6E10；T3S1-18E7-6C5。
对5个候选单克隆进行70PDL(细胞倍增时间，相当于70个代次)的稳定性评价，基于表达稳定性、基因拷贝数、以及mRNA转录水平的稳定性，最终选择单克隆VAN301-T3S1-18E7-6C5作为主单克隆(保藏编号为CGMCC 21011)，选择VAN301-T3S4-17G2-6E2作为备份克隆。
使用该单克隆VAN301-T3S1-18E7-6C5建立PCB(原始细胞库)，并在此基础上建立GMP条件的MCB(主细胞库)和WCB(工作细胞库)。
制备例3：细胞培养
NVS451融合蛋白可通过14天fed-Batch培养工艺进行生产。细胞复苏：从细胞库中取一支细胞，37.0±0.5℃水浴复苏，解冻后立即将种子液转入装有10ml预热Dynamis(含8mM L-Gln、1:100ACA和1g/L P188)培养基的50ml离心管中，300g离心5分钟，弃上清后再加入10ml预热的Dynamis培养基重悬细胞，将重悬后的细胞液转移至装有28.0ml Dynamis培养基的125ml摇瓶中，细胞密度在(0.15～0.35)×106细胞/ml，细胞活率大于90％。种子传代与扩增：传代培养基为Dynamis，传代培养中细胞的初始接种密度应为(0.40±0.10)×106细胞/mL，培养3天后，细胞密度达到(2.0～5.0)×106细胞/mL即可传代，传代过程中应保证细胞活率高于90.0％。
反应器流加培养(Fed batch)：细胞初始接种密度为(0.40±0.10)×106细胞/mL，流加2×补料C+(Efficient FeedC+,Cat#:A2503101，Gibco)，培养过程中每天检测葡萄糖和乳酸含量，第3/5/7/9/11/13天分别流加450.0g/kg的葡萄糖母液补至5.0g/L。
细胞培养收获条件：当培养至第14天或细胞活率低于80.0％时收获，以先到达条件为准。
制备例4：NVS451融合蛋白纯化
细胞培养收获液首先通过两级深层过滤膜包进行澄清处理，然后加入1％吐温80，0.3％磷酸三丁酯进行病毒灭活，之后使用GE公司的MabSelect SuRe亲和层析填料捕获目的蛋白，接着使用Millipore公司的Eshmuno CPX阴离子层析填料和GE公司的Capto Adhere阳离子层析填料进行两步精细纯化，然后使用ASAHI KASEI公司的BioEX纳滤膜进行纳滤，使用Millipore公司的Pellicon 2、截留分子量50KDa的PES材质、C流道超滤膜进行超滤渗滤，最后加入辅料聚山梨酯20，经除菌过滤后得到NVS451原液。
1.深层过滤
使用串联的深层过滤膜(一级深层过滤膜D0HC和二级过滤器A1HC，Millipore公司)进行深层过滤，去除细胞等杂质，收获含目的蛋白的澄清液。过滤样品时，进口流速≤100LMH(基于A1HC)，D0HC的最大载量为60L/m2，A1HC最大载量为140L/m2，控制压力，深层过滤的单步回收率一般在90％左右。
2.去垢剂病毒灭活
在澄清收获液中加入50mM Tris-HAc,150mM NaCl,25％PS80,pH7.4使得最终吐温80的浓度为1.0％。加入100％磷酸三丁酯使最终浓度为0.3％。16～26℃下孵育360–480分钟，然后进行亲和层析。
3.亲和层析
使用MabSelect SuRe填料进行亲和层析，实现产品的初步纯化。使用50mM Tris-HAc,150mM NaCl,pH 7.4作为平衡和上样后淋洗1缓冲液，再用20mM Tris,1M NaCl,0.5MArg,pH8.6进行淋洗2，最后用50mM甘氨酸，pH3.5缓冲液洗脱目的蛋白。洗脱液使用1M Tris碱中和至pH7.8-8.2。
4.阳离子层析
使用Millipore公司的Eshmuno CPX作为阳离子层析填料。亲和层析中和后样品用1M HAc调节至pH6.3-6.7，调节后的样品作为阳离子层析上样样品。经过淋洗和梯度洗脱，能有效去除HCP、蛋白A、DNA以及一些产品类似物杂质及片段等与产品相关的杂质。
用20mM PB,pH6.5作为平衡和上样后淋洗缓冲液，25mM PB,110mM NaCl，pH6.5作为淋洗2，洗脱使用25mM PB,110mM NaCl,pH6.5拉梯度至20mM PB,1M NaCl,pH6.5，0-50％B(10CV)进行梯度洗脱。
5.阴离子层析
使用GE公司的Capto Adere填料作为阴离子层析填料，以去除部分与产品和工艺相关的杂质。阳离子层析洗脱液首先用1M Tris碱和注射用水调节pH至8.4-8.6，电导19.0-23.0，调节pH电导后的样品作为阴离子层析上样样品。
用20mM Tris,0.2M NaCl,pH8.5作为平衡和上样后淋洗缓冲液，20mM Tris,0.2MNaCl,60mM Arg,pH8.0作为淋洗2缓冲液，使用20mM Tris,0.2M NaCl,290mM Arg,pH7.1缓冲液洗脱目的蛋白。
6.纳滤
阴离子层析洗脱样品使用旭化成公司纳滤器BioEX进行除病毒过滤。
纳滤工艺主要利用病毒和蛋白产品的分子大小不同，潜在病毒被纳滤膜截留，目的蛋白流穿，从而实现两者分离。预过滤膜能够吸附上样样品中的颗粒等杂质，同时增加纳滤膜处理量。纳滤膜可有效截留细小病毒等潜在病毒。采用A1HC(Millipore公司)进行预过滤和BioEX(旭化成公司)去除潜在的病毒。过滤样品时，控制预过滤膜上压力差≤2bar，纳滤膜上压力差≤3bar，纳滤膜的载量≤600g/m2。
7.超滤渗滤
纳滤后中间品采用Pellicon 2(Millipore公司)超滤膜包进行浓缩，然后再换液至20mM Tris-HAc,65mM Arg,120mM海藻糖，pH7.5缓冲体系中。超滤膜包材质为PES，截留分子量50kDa，C流道。超滤渗滤的载量为≤300g/m2；浓缩时进口通量150-300LMH,跨膜压(TMP)≤1.5bar，浓缩至浓度18.0-22.0g/L；然后进行换液，换液时进口通量150-300LMH,TMP≤2bar，换液体积≥5DV，过浓缩时进口通量150-300LMH,TMP≤2bar，过浓缩至浓度80.0-90.0g/L。
8.辅料添加及最终过滤
向超滤渗滤后样品中加入10％(w/w)聚山梨酯20母液，再使用20mM Tris-HAc,65mM Arg,120mM Trehalose，pH7.5缓冲液调节蛋白浓度至70.20～150.80mg/mL，即制备得到原液。之后进行除菌过滤，除菌过滤采用PES材质(0.22μm)过滤器过滤。原液聚山梨酯20的最终含量为0.02％(w/v)，辅料添加及除菌过滤的总回收率一般在80％以上。
9.原液
辅料添加及除菌过滤后的原液进行质量检测，纯度达到97％以上。
将原液储存在-40±5℃冰箱中。
实验例1：药效学研究
1.体外药效学
NVS451的活性分子是由人IL-17RA胞外段突变体和人IgG1 Fc突变体两部分组成的双链融合蛋白，经CHO细胞重组表达获得。因此，该分子可表现出IL-17RA和Fc分子两方面的生物学功能特性。通过表面等离子共振(SPR)、体外靶细胞杀伤测定等分析技术对NVS451体外生物学活性开展系列研究，旨在阐明其体外药效相关属性。
1.1 IL-17A结合亲和力比较分析
NVS451(用量是75ug/ml)可与人IL-17A以高亲和力结合。用100nM-0.8nM的人IL-17A(Acrobiosystems,Cat:ILA-H5118)进行表面等离子共振，实验方法如下：
试剂配制
包被液：取1.06g的Na2CO3和0.84g NaHCO3用超纯水充分溶解，用浓盐酸调其PH值为9.60后定容至200ml，用0.22滤膜过滤，放4℃保存；
10×TBS母液：取12.114g的Tris和43.83g的NaCl加入超纯水中充分溶解，用盐酸调PH值为7.55后定容至500ml，用0.22滤膜过滤，放4℃保存；
4×底物缓冲液母液：取7.16g的Na HPO·12H O和2.1g的柠檬酸用超纯水充分溶解，用NaOH调PH值为5.5后定容至100ml，用0.22滤膜过滤，放4℃保存。
实验操作
包被：
将IL-17A按照COA用超纯水重构，放置约30分钟左右，使其溶解充分，用室温下平衡好的包被液稀释IL-17A到30nM，后加入酶标板内，每孔100μl，封板膜封板放置在4℃过夜(约16h)。
洗板：
洗液现用现配，取100ml的10×TBS母液加入到900ml的超纯水稀释成1×TBS，再加入2.5ml的20％Tween 20，用配制好的洗液反复洗板4次，每孔300μl，拍干。
封闭：
现用现配，取2.5g的BSA用洗液稀释到50ml配制成5％BSA封闭液；在拍干的板内加入300μl的封闭液，37℃孵育1.5h。
洗板：
重复步骤2洗板。
加入样品：
稀释液现用现配，取5ml的封闭液用洗液稀释到50ml，配制成0.5％BSA样品稀释液，2倍梯度稀释样品到10μg/ml，将稀释好的样品加入到酶标板中，100μl/孔，设置背景对照(不包被+样品+二抗，包被+不加样品+二抗，不包被+不加样品+不加二抗)。封板膜封板37℃孵育1h。
洗板：
重复步骤2洗板。
二抗：
稀释液现用现配，取5ml的封闭液用洗液稀释到50ml，配制成0.5％BSA抗体稀释液，将辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗人IgG和Fcγ片段特异性(min X Bov,Hrs,Ms Sr Prot)稀释成1:12000，每孔加入100μl，封板膜封板37℃孵育1h。
洗板:
重复步骤2洗板。
显色:
取12ml的4×底物缓冲液加入到36ml的超纯水中稀释成1×底物缓冲液后再加入38.5μl 3％H2O2和240μl 20mg/mL TMB(用DMSO溶解)，每孔加入200μl，37℃孵育20分钟。
终止:
在显色结束的板内每孔加入50μl 1mol/L硫酸。
读数:
450nm的波长下测量各孔的吸光度(OD值)，求其平均值。
数据处理：
将所得的OD值用GraphPad Prism 5对数据进行四参数拟合，并求出EC50。
(SPR)测试(结果如图3所示)，KD为1.8×10-12M，亲和力高于同等条件下的苏金单抗(结果如图4所示)(已在国外批准上市(2015)的IL-17A单抗药物)和野生型人IL-17RA(wtIL-17RA，购自ACROBIOSYSTEMS公司)(结果如图5所示)。与IL-17A结合亲和力比较分析结果总结于表2。
表2.与IL-17A结合亲和力比较分析
采用制备例1-4中相同的方法制备了IL-17RA胞外结构域具有3个突变(V302)和4个突变(V303)的IL-17RA融合蛋白(氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示)。
采用亲和ELISA方法检测V302和V303与IL-17A的亲和力。使用了两种试剂盒(R&D，Cat#:317-ILB-050；Peprotech，Cat#:900-K84)按照生产商提供的方法进行检测，结果显示(图19)，具有六个突变的NVS451与IL-17A亲和力百分比(上述两种试剂盒分别为776％和464％)显著高于V302和V303分子与IL-17A的亲和力。而V302和V303分子与IL-17A的亲和力与野生型人IL-17RA相当。
1.2不同种属来源的IL-17A的结合亲和力分析
在该研究中，比较在相同条件下4个物种(人、食蟹猴、小鼠、大鼠)的IL-17A分子(KINGFISHER,货号分别为：RP0921H-025，RP1031Y-025，RP0355M-025；大鼠Biolegend，778704)与NVS451的结合情况，结果显示NVS451与4个不同物种IL-17A均可结合，且结合亲和力由高到低依次为：人>食蟹猴>大鼠>小鼠(KD见表3)。
表3.与不同种属IL-17A结合亲和力比较分析
1.3IL-17A、C、F、AF的结合亲和力分析
除了与人IL-17家族的IL-17A分子结合外，NVS451还与人源IL-17C、IL-17F、IL-17AF结合(结果分别见图6-8)。KD结果总结于表4。
在另一项研究中，比较了NVS451和野生型人IL-17RA与IL-17C、IL-17F(Acrobiosystems，ILC-H52H7，ILF-H4240)的亲和力大小，结果显示NVS451对人IL-17C、IL-17F的亲和力均高于野生型人IL-17RA(表5)。
表4 NVS451与人IL-17家族结合亲和力表征
表5.NVS451和野生型IL-17RA与IL-17C、IL-17F的亲和力比较
弱结合：图谱有响应信号，但强度低，无法量化读值。
N.A.：不适用
1.4生物学活性细胞实验
NVS451体外活性检测所使用的细胞系CCD-1070Sk(人成纤维上皮细胞系，ATCCCRL-2091)属于人成纤维上皮细胞系，其表面存在包括IL-17A、A/F和F在内的多种细胞因子受体。IL-17A能够和该细胞表面上的IL-17A受体IL-RA结合，刺激细胞产生细胞因子GRO-α，并且其含量可以用ELISA双抗夹心法准确检测到。当IL-17A和NVS451与CCD-1070Sk细胞共孵育时，NVS451能够通过与IL-17A的结合竞争抑制IL-17A与细胞表面上的IL-17A受体IL-17RA的结合，从而降低细胞上清液中GRO-α的分泌量。并且NVS451也能够基于同样的竞争抑制作用机制，通过与IL-17A/F、IL-17F结合，降低细胞上清液中GRO-α的分泌量。因此可以通过测定细胞GRO-α分泌量来测定NVS451对于包括IL-17A、IL-17A/F、IL-17F等多个靶点的体外活性作用。
1.4.1 NVS451在IL-17A诱导下的GRO-α因子抑制能力
通过测量IL-17A诱导的从人成纤维上皮细胞系CCD-1070Sk中释放GRO-α的抑制能力，分析了NVS451融合蛋白的体外相对效价，结果用半数抑制浓度IC50值表示(表6)。
1、T75培养瓶内的人成纤维上皮细胞系CCD-1070Sk细胞用2ml 0.05％EDTA的胰酶消化，约2-5分钟，加入8ml完全培养基(10％FBS的EMEM基础培养基)中和，然后在1000rpm下离心5分钟，用完全培养基重悬至细胞密度为1E5/ml，以100ul每孔，10000细胞每孔重悬于96孔板中，培养大约24小时，待细胞汇合度达到95％-100％开始给药实验。
2、细胞诱导及给药：所有药物的稀释均使用完全培养基，先将NVS451蛋白稀释至起始浓度为4ug/ml(终浓度为1ug/ml)，然后两倍梯度稀释9个点，以及最后一个0ug/ml浓度点，50ul每孔加入到细胞板中，然后将IL-17A稀释至浓度40ng/ml(终浓度为10ng/ml)，以50ul每孔加入每一个反应孔中，细胞给药培养作用24小时。
3、孵育24小时后，使用孔板离心机1500rpm离心5分钟，然后取上液100ul准备ELISA实验检测，此步骤是将3个复孔的细胞上清液混合稀释后，在ELISA实验中分别加入酶标板的3个复孔
4、ELISA分析
A、用PBS x 1稀释捕获抗体(鼠抗人GROα抗体，R&D Cat#DY275-05-840255)至浓度为0.25μg/ml，立即向每个ELISA微孔中加入100μl，包被平板并在室温下孵育过夜(24℃±4)。
B、清除各孔液体，每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤板4次。最后一次用吸水纸彻底清理干净(洗涤缓冲液需要提前一天放置室温直至完全溶解)。
C、每孔加入300μl封闭缓冲液。在室温下((24℃±4)孵育至少1小时。
D、样品制备：
离心96孔CRL-2091细胞培养板，1000rpm离心5分钟。
将50μl的预孵育样品(sup)加入200μl样品稀释剂(样品现在以1:5稀释)稀释后准备上样。
E、标准品准备：
在稀释剂中制备1μg/ml的标准品系列稀释液，总共7个点稀释液和一个零点
F、清除各孔液体，每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤板4次。最后一次用吸水纸彻底清理干净。
G、立即向每个孔中加入100μL标准品或样品，一式三份。在室温下((24℃±4)，600rpm，孵育2小时。
H、清除各孔液体，每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤板4次。最后一次用吸水纸彻底清理干净。
I、稀释剂中的稀释检测抗体(生物素化的山羊抗人GROα抗体,R&D Cat#DY275-05-840256)浓度为1.0μg/ml(初始浓度100μg/ml)。
J、在每个孔中加入100μl稀释的检测抗体。在室温下(24℃±4)，600rpm，孵育2小时。
K、清除各孔液体，每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤板4次。最后一次用吸水纸彻底清理干净。
L、取6μL生物素偶联-HRP缀合物(1：2,000)，加入总体积为12ml样品稀释液(计算1个96孔板)。
M、每孔加入100μl。在室温下(24℃±4)，600转，孵育30分钟。
N、清除各孔液体，每孔用300μl洗涤缓冲液洗涤板4次。最后一次用吸水纸彻底清理干净。
O、每孔加入100μl底物溶液(ABTS底物提前30分钟放置室温，取出当次实验需要的用量)。在室温下分别孵育20分钟以进行显色。
P、使用酶标仪在405nm处监测颜色显色，波长校正设定在650nm。
同时检测目前市售IL-17A单克隆抗体苏金单抗(Cosentyx)在这一体外相对效价检测方法下的GRO-α的抑制能力，结果用半数抑制浓度IC50值表示(表6)。结果显示出NVS451融合蛋白对IL-17A诱导的释放GRO-α细胞因子有抑制能力，并且较苏金单抗(Cosentyx)的IC50值更低(图9)。
表6NVS451和苏金单抗的体外活性效价：IL-17A诱导产生GRO-α的IC50(μg/ml)
1.4.2NVS451对IL-17A、IL-17A/F、IL-17F多种配体的体外活性效价比较
与上述实验相类似地，IL-17A/F与IL-17F诱导的人成纤维上皮细胞系CCD-1070Sk也能够产生GRO-α细胞因子，不同配体诱导作用下的NVS451融合蛋白体外效价结果用半数抑制浓度IC50值表示(表7)。抑制作用S曲线分别见图10和图11。
表7NVS451抑制人类皮肤成纤维细胞CCD-1070Sk GRO-a分泌检测结果
2.体内药效学
银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，以角质形成细胞过度增殖和异常分化为特点，由多种因素引起，发病机制尚未完全阐明，目前认为诸多免疫细胞和免疫相关细胞(包括树突状细胞、T细胞、内皮细胞等)，以及细胞因子参与了银屑病的发病和疾病状态的维持[1]，现有的应用较广泛的动物模型大致可分为药物诱导急性炎症模型、基因工程模型和异体移植模型。
咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)诱导模型，IMQ是Toll样受体(Toll like receptor，TLR)7/8的激动剂，Van der Fits[2]等研究发现IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损改变伴随着IL-23/IL-17轴的变化，与人类银屑病病理变化有很多相似之处，且具有操作简便、花费少等优点，因此用IMQ涂抹小鼠皮肤建立银屑病是目前国内外广泛应用的银屑病模型。但作为一种急性炎症性模型，其局限性为：(1)非特异性，不只在银屑病中，在其他疾病如系统性红斑狼疮、特应性皮炎等皮损中也有类似的炎症表现[3]，IMQ诱导的皮肤炎症模型还被用于系统性红斑狼疮的研究[4]；(2)治疗窗口期短，咪喹莫特外用可引起小鼠脱水及体质量减轻，连续外用超过2周可能导致小鼠死亡[5]；(3)可重复性差，缺乏标准操作规程等。
异种皮肤移植免疫缺陷鼠(SCID)模型，是将人类皮肤移植到SCID小鼠上，注射患者的T细胞诱发银屑病症状，其遗传表型和致病过程最接近于人类银屑病，且因动物免疫缺陷，不受抗药抗体(anti-drag antibody，ADA)影响，是研究银屑病发病机理以及药物开发的最适合工具之一，而且最适合于在开始临床试验之前进行探索新型抗银屑病剂/治疗策略的临床前分析[6,7,8]。
2.1NVS451在异种皮肤移植SCID小鼠银屑病模型中的药效评价(5，10，15mg/kgNVS451)。
将上述浓度的NVS451蛋白配置成20mM Tris-醋酸，65mM精氨酸，120mM海藻糖，0.02％吐温20，pH 7.5的制剂处方。
实验共使用60只SCID鼠(Envigo,耶路撒冷,以色列C.B-17/IcrHsd-scid-bg(米色-SCID)小鼠)，移植健康人皮肤于小鼠背部后，随机分为6组，每组10只小鼠：阴性对照组(阴性对照组是使用上述制剂处方去掉NVS451)、激素组(2mg/只动物地塞米松)、苏金单抗组(60mg/kg)和供试品高剂量(15mg/kg)、中剂量(10mg/kg)、低剂量(5mg/kg)组。阴性对照组、供试品组及苏金组皮下注射隔天给药共28天。激素组外用地塞米松每天2次，共28天。实验结束观察皮肤外观(结果见图12)、，并测量皮肤厚度。结果显示：NVS451对红肿、斑块和鳞屑均有一定程度改善作用，且与剂量呈正相关；15mg/kg剂量组与苏金组表皮厚度无统计学差异(P＞0.05)，该模型中NVS451具有与苏金相似的治疗效果。
表8.异种移植皮肤的目检结果
表9异种移植皮肤的组织学评估和厚度
*地塞米松与全部治疗组比较，-p＜0.01
**高剂量测试品与苏金单抗比较，-不显著的
***高剂量测试品和苏金单抗与低剂量和中剂量的比较，-p＜0.05，p＜0.05
2.2NVS451(2.1中所述的制剂处方)在异种皮肤移植SCID小鼠银屑病模型中的药效评价(15，22.5，30，45，60mg/kg NVS451)
实验共使用100只SCID鼠(购于Envigo)，移植健康人皮肤于小鼠背部后，随机分为10组(见表10)。实验结束观察皮肤外观(结果见图13)、取移植皮肤进行银屑病相关的组织学评估(结果见图14)，并测量皮肤厚度。结果显示，NVS451组均显示了治疗作用，其中15mg/kg一周两次、30mg/kg一周两次、22.5mg/kg一周两次和60mg/kg一周一次组，疗效类似，均为7/10的异种移植皮肤完全恢复且表皮厚度降低。但15mg/kg每周两次组，剩余3/10较其他治疗组显示了部分恢复，皮肤厚度为334±174μm，组织学评分为1.1(依据皮损表皮厚度，乳头上表皮变薄，角化过度，角化不全，粒细胞缺乏，Munro微脓肿，正常或异常网嵴延长，血管弯曲度，真皮乳头层单核细胞浸润等指标综合评估)。
表10.研究分组及剂量(辅料对照组为制剂处方去掉NVS451)
表11.异种移植皮肤的组织学评估和厚度
3.次要药效学
3.1 ADCC/CDC效应相关受体结合亲和力分析
NVS451发挥药效的作用机制不依赖于ADCC/CDC活性，而且Fc的细胞毒性作用ADCC/CDC可能带来不必要的免疫相关不良事件(irAE)，存在潜在的安全风险[9]。为避免产生该效应，NVS451的Fc部分突变了相关活性位点。在亲和力分析研究中，评估了与ADCC相关的7个CD分子及与CDC相关的C1q分子。结果表明，NVS451(75ug/ml)与ADCC相关的CD分子的结合亲和力处于不结合或低水平(KD大于10-5M数量级，见表12)。在另一项研究中，与其他部分相同但具有天然IgG1 Fc的IL-17AR融合蛋白(V301-wtFc)(75ug/ml)相比，NVS451与ADCC/CDC相关Fc受体亲和力显著降低(见表13)。
V301-wtFc的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
表12.NVS451与ADCC、CDC效应相关受体的亲和力分析
表13 NVS451和V301-wtFc与ADCC、CDC效应相关受体亲和力分析
3.2 Fc片段区的ADCC/CDC功能活性评价
IgG1和IgG3亚型抗体的Fab区先结合靶细胞，其Fc部分再与NK等CTL细胞上的Fc受体(如FcγRIII)结合，之后可诱导产生ADCC。缺少膜表达IL-17的细胞模型无法有效在体外验证是否产生ADCC。因此，将可刺激ADCC的利妥昔单抗(Rituximab)的Fab段和NVS451的Fc段融合，构建RitxV301(即RitxNVS451)验证嵌合分子(轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示)。以此对ADCC/CDC效应的去除进行验证(用GraphPad Prism 5分析软件分析实验数据，以抗体的浓度对数为x轴，对应的计算杀伤率值为y轴，选用四参数方程回归模拟，拟合抗体的计量效应曲线。所得数据经GraphPad Prism5软件分析，阳性对照抗体(利妥昔单抗)符合四参数方程式y＝D+(A-D)/[1+(X/C)B]，在半对数坐标轴上成典型的S型曲线，R2≥0.95,计算EC50，通过EC50值判断ADCC和CDC效应))。研究结果显示(图15和16)：利妥昔单抗(罗氏(瑞士)在Raji细胞上表现了较强的ADCC和CDC杀伤效应，而RitxV301未显示出ADCC和CDC效应，说明NVS451的Fc区的设计使得RitxV301不能诱导NK-92MI CD16a细胞产生对Raji细胞的杀伤，并且NVS451的Fc区不能跟补体中的C1q分子结合，无法启动补体级联反应。
3.3 FcRn结合亲和力分析
Fc融合蛋白一般通过Fc的FcRn介导的循环提高目标蛋白药物的半衰期，改善药代动力学特征[10]。对FcRn的结合亲和力大小与药物在体内半衰期相关[11]。NVS451可与人、猴、大鼠的FcRn(acrobiosystems FCM-H5286，FCM-C5284，FCM-R5287)结合。同等条件下，其亲和力与苏金抗、野生型IgG1 Fc(即V301-wtFc)均在相同水平(KD的数量级达10-8M，见表14)，实验方法如下：。
试剂配制
运行试剂：含2mM KH2PO4,10mM Na2HPO4,137mM NaCl,2.7mM KCl，0.05％吐温-20(Tween-20)，pH调节至6.0；
His捕获试剂盒(货号：28-9950-56，GE)，其中包括：鼠抗His抗体(1mg/mL)，固定试剂(10mM醋酸钠，pH 4.5)，再生试剂(甘氨酸盐酸，pH 1.5)；
氨基偶联试剂盒(货号：BR100050，GE)，其中包括：115mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，750mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10.5mL 1M乙醇胺(pH8.5)。将每管EDC和NHS分别加入10mL的去离子水，分装保存到-18℃至更低温度，保质期两个月。(参考GE氨基偶联指导手册《22-0510-62AG》)。
按照产品COA对IL-17RA-wtFc(即V301-wtFc)蛋白，不同种属的FcRn蛋白进行溶解，以大于10μg每管的规格进行分装。避免反复冻融。
蛋白脱盐
使用脱盐柱及运行缓冲液(Running Buffer)将苏金单抗和IL-17RA-wtFc蛋白脱盐。脱盐后的蛋白用UV-V进行浓度测定。脱盐后的蛋白以大于10μg每管的规格进行分装，并避免反复冻融。
芯片制备
将鼠抗His抗体用固定试剂(10mM醋酸钠，pH 4.5)稀释到50μg/mL，芯片每个通道使用约100μL鼠抗His抗体，固定两个通道约使用190μL固定试剂加入10μL鼠抗His抗体。首先，CM5芯片(biocore传感器芯片，GE)的表面用400mM EDC和100mM NHS以10μL/分钟的流速进行420s的活化。其次，将50μg/mL的鼠抗His抗体以10μL/分钟的流速注入到实验通道(FC4)约420s，固定量约为9000至14000RU。最后，芯片用1M乙醇胺以10μL/分钟进行420s封闭。参比通道(FC3)与试验通道(FC4)进行相同的操作。(参考GE的His捕获试剂盒指导手册《28-9974-71AB》)。
捕获配体
将FcRn原液样品用运行试剂稀释至0.5μg/mL，并以10μL/分钟的流速注入到实验通道(FC4)约40RU。参比通道(FC3)不需要进行配体的捕获。
分析物多循环分析
将不同浓度的NVS451，苏金单抗和IL-17RA-wtFc样品用相应运行试剂进行稀释，将稀释后的样品依次以30μL/分钟的流速按照相应结合时间和解离时间注入到实验通道与参比通道。每一个浓度分析后，芯片需要用pH值为1.5的甘氨酸盐酸以30μL/分钟的流速再生60s，洗掉配体以及未解离的分析物。进行下一个浓度分析时，实验通道需要重新捕获相同量的配体。
其他
所有的操作步骤均在运行试剂中进行，SPR的分析试剂均需过滤脱气使用。
结果
数据分析:
使用Biacore 8K分析软件计算每个抗体的KD值。参比通道(FC3)用于背景的扣减。
在4批独立测试研究中，pH6.0酸性条件下NVS451(浓度:25nM-1.5625nM)可与人、食蟹猴、大鼠3不同种属的FcRn结合(图17)；且在pH7.4中性条件下(NVS451浓度100nM-1.5625nM)均不结合(图18)。
表14人、大鼠、食蟹猴的FcRn受体亲和力比较
实验例2：安全性评价
1.安全药理学
1.1食蟹猴安全药理试验
食蟹猴(购自北京中科灵瑞生物技术股份有限公司)安全药理试验伴随长毒进行，皮下注射实验例1的2.1节中的处方，NVS451剂量为15mg/kg、50mg/kg和150mg/kg(每周给药2次，连续给药4周，共给药9次，即分别于D1、D4、D8、D11、D15、D18、D22、D25和D29给药)。在本试验中，设置辅料对照组，使用实验例1的2.1节中的处方去掉NVS451，结合毒性指标观察进行了安全药理指标的检测，各组动物精神状态、行为活动等均未见异常；动物呼吸平稳，未见呼吸急促或减慢，也未见异常的胸式或腹式呼吸。在不同时间点(首次给药前(D-2)，以及首次给药后4h(±20分钟)、24h(±20分钟)、48h(±20分钟)、72h(±20分钟))进行各组动物的呼吸指标和心电图检查，均未见与给药相关的TV和RR，以及心率、P-R间期、QT间期、QRS时限、QRS电压、STe及QTcB值的规律性改变，心电图波形未见异常。于首次药前(D-2)，首次药后3～5小时(D1)，5次药后3～5小时(D15)，末次药后3～5小时(D29)以及恢复期结束前(D56)进行心电肢体II导联测定，观察心率、心电图波形、P-R间期、QRS时限、Q-T间期，未见异常，各时间点血压检测包括MBP、DBP和SBP检测均未见明显异常改变。故认为以15、30和150mg/kg的剂量皮下注射，供试品对食蟹猴中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统均未见明显影响。
1.2大鼠中枢神经系统试验
GLP(良好实验室管理规范)条件下，通过功能组合观察法(FOB)评估NVS451单次皮下注射给药对SD大鼠(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物生产许可证：SCXK(京))中枢神经系统功能的影响，剂量分别为30mg/kg(低剂量)、100mg/kg(中剂量)和300mg/kg(高剂量)。供试品高剂量组雄性动物在药后2h可见体温升高(辅料对照组(即制剂处方去掉NVS451)vs高剂量组：37.72±0.29℃vs 38.40±0.14℃)；供试品高、中、低剂量组雌性动物在药后24h可见体温升高，辅料对照组vs高、中、低剂量组：37.60±0.28℃vs38.80±0.23、38.72±0.44、38.54±0.28℃)。上述体温的改变未见雌雄一致性，且未见规律性改变，认为与给药不相关。在笼内观察、手抓观察、开放环境观察、刺激性反应观察过程中，未见动物出现与给药相关的异常表现；未见与供试品相关的动物直立数、粪块数、前肢抓力、体温改变。结果表明，本试验条件下，NVS451对大鼠中枢神经系统功能无影响。
2.药代动力学
2.1食蟹猴体内动力学
试验共用24只食蟹猴，分为4组(每组6只动物，雌雄各半)。单次皮下和静脉注射给药，组1至组4分别给予5(皮下注射)、15(皮下注射)、50(皮下注射)、15(静脉注射)mg/kg的NVS451，给药容量1mL/kg。
试验从动物后肢皮下静脉非给药部位采集药代血样(约1mL)至无抗凝剂的管中，1-3组动物采血时间点为：药前(前一天)、给药开始后1h、2h、4h、8h、24h(D2)、32h(D2)、48h(D3)、56h(D3)、72h(D4)、96h(D5)；第4组动物采血时间点为：药前(前一天)、给药开始后3分钟、1h、2h、6h、24h(D2)、32h(D2)、48h(D3)、56h(D3)、72h(D4)、96h(D5)。血样用于制备血清样本，并用于药代动力学分析(表15)。
表15.NVS451在食蟹猴体内的药代动力学参数
Cmax比＝Cmax中、高剂量均值/Cmax低剂量均值；
AUC比＝AUClast中、高剂量均值/AUClast低剂量均值；
F％＝(AUClast/剂量(SC))/(AUClast/剂量(IV))*100％。
试验结果表明：在5～50mg/kg剂量范围内，单次皮下注射给予食蟹猴后，NVS451在食蟹猴体内的血药浓度随剂量增加而增加；单次皮下注射和静脉注射给予食蟹猴后，性别间未观察到明显差异。
NVS451以5、15、50mg/kg的剂量单次皮下注射给予食蟹猴后，NVS451的平均Cmax和AUClast增长比例高于剂量增长比例。单次皮下注射给予5、15、50mg/kg剂量组动物NVS451的Cmax比值分别为1:6.12:38.06(雄)和1:5.46:34.29(雌)；AUClast比值分别为1:4.83:25.52(雄)和1:4.76:20.88(雌)。
经独立样本t检验表明，皮下注射和静脉注射各组的代谢动力学参数性别间均无统计学差异，NVS451在动物体内的代谢特征基本无明显性别差异。
在5～50mg/kg剂量范围内，NVS451在食蟹猴体内的T1/2，各剂量组雌雄动物平均T1/2在27.20～39.90之间；皮下注射各剂量组的Tmax基本一致，药物浓度均在4～8h达峰。
2.2大鼠体内动力学
试验共用48只SD大鼠，分为4组(每组12只动物，雌雄各半)。单次皮下和静脉注射给药，组1至组4分别给予10(皮下注射)、30(皮下注射)、100(皮下注射)、30(静脉注射)mg/kg的NVS451，给药容量2mL/kg。
试验从动物颈静脉采集药代血样(约0.4mL)至无抗凝剂的管中，1-3组动物采血时间点为：给药前(D-1)，给药开始后1h、2h、4h、8h、24h、32h、48h、56h、72h、96h；第4组动物采血时间点为：给药前(D-1)，给药开始后3min、1h、2h、6h、24h、32h、48h、56h、72h、96h。血样用于制备血清样本，并用于药代动力学分析(表16)。
表16.NVS451在SD大鼠体内的药代动力学参数表
Cmax比＝Cmax中、高剂量均值/Cmax低剂量均值；
AUC比＝AUClast中、高剂量均值/AUClast低剂量均值；
F％＝(AUClast/剂量(SC))/(AUClast/剂量(IV))*100％。
试验结果表明：在10～100mg/kg剂量范围内，单次皮下注射给予SD大鼠后，NVS451在SD大鼠体内的血药浓度随剂量增加而增加；单次皮下注射和静脉注射给予SD大鼠后，性别间未观察到明显差异。
NVS451以10、30、100mg/kg的剂量单次皮下注射给予SD大鼠后，NVS451的平均Cmax和AUClast增长比例低于剂量增长比例。单次皮下注射给予10、30、100mg/kg剂量组动物NVS451的Cmax比值分别为1：2.03：6.56(雄)和1：1.62：6.04(雌)；AUClast比值分别为1：1.92：5.29(雄)和1：1.85：5.85(雌)。
皮下注射和静脉注射各组的代谢动力学参数性别间无明显差异，NVS451在动物体内的代谢特征基本无明显性别差异。
在10～100mg/kg剂量范围内，NVS451在SD大鼠体内的T1/2，各剂量组雌雄动物T1/2在51.46～69.48之间；皮下注射各剂量组的Tmax基本一致，药物浓度均在8～24h达峰。
3.分布和排泄
本试验主要采用TCA沉淀蛋白的方法结合SHPLC(分子排阻高效色谱法)对经同位素(125I)标记的注射用NVS451融合蛋白(NVS451)皮下注射给予SD大鼠后的组织分布及排泄特征进行了研究。
试验共用36只动物，分为6组，每组6只动物，雌雄各半。以30mg/kg的剂量单次颈背部皮下注射给予供试品。125I标记后的供试品放化纯度为99.03％，比活性为0.09KBq/μg。1-4组动物分别于给药后4h、24h、96h和120h采集动物甲状腺、心、肺、肝、脾、肾、膀胱、生殖腺(卵巢、睾丸)、胃、小肠、脂肪、肌肉、脑、背部皮肤(非给药部位)、肠内容物、血清、尿液。5组动物给药后每天收集一次粪、尿，共收集5天。6组动物于注射后每小时收集1次排出胆汁，共收集8h。
试验结果表明：
1)大鼠皮下注射给予125I-NVS451后，药物主要分布在肠内容物、尿液、膀胱、背部皮肤等组织/器官中，而肌肉、脂肪、脑内较少分布。药物在绝大部分组织中的达峰时间在4h～24h，然后随着时间的延长浓度逐渐下降。
药物在背部皮肤(非给药部位)有一定的分布。其达峰时间为24h，4h与120h药物含量大致相等。与其他组织/器官相比，药物在背部皮肤浓度下降较为缓慢。
2)大鼠皮下注射给予125I-NVS451后放射性主要经肾排泄，5天后排泄掉给入药物的90％以上；胆汁排泄较少。
4.代谢
根据“ICH-S6(R1)生物制品的临床前安全性评价”指导原则，NVS451是大分子蛋白质药物，预期其在体内降解成肽和氨基酸，然后被排泄或重新用于体内蛋白质或肽的合成，因此未评估NVS451的代谢。
5.毒理学
选择食蟹猴和SD大鼠进行毒理学研究，NVS451与食蟹猴和大鼠IL-17A有交叉反应，为相关种属。试验均在GLP条件下进行，遵循现行的食品和药物管理局良好实验室管理规范(21CFR Part 58)，国家药品监督管理局(原国家食品药品监督管理总局)的《药物非临床研究质量管理规范》(局第34号令，2017年9月)。
6.单次给药毒性
6.1食蟹猴毒性研究
目的是评价NVS451单次皮下注射给予食蟹猴后观察14天内可能出现的急性毒性反应情况，设置45mg/kg、150mg/kg和450mg/kg三个剂量组。试验期间，各组动物均未见死亡或濒死。各给药组动物临床观察未见异常。与自身药前值和辅料对照组(制剂处方去掉NVS451)相比，各给药组动物体重、体温、心电图参数、血细胞计数、凝血指标、血生化、尿液检查均未见给药相关的异常改变。观察期结束(D15)，所有动物大体解剖均未见异常。结论：在本试验条件下，所有动物均未见死亡或濒死，未见给药相关的异常改变，最大耐受剂量(MTD)大于或等于450mg/kg。
6.2大鼠毒性研究
目的是评价NVS451单次皮下注射给予SD大鼠后观察14天内可能出现的急性毒性反应情况，设置90mg/kg、300mg/kg、900mg/kg三个剂量组。试验期间，各组动物均未见死亡或濒死，观察期结束(D15)，各组动物大体观察均未见异常改变。结论：本试验条件下，所有动物均未见死亡或濒死，动物最大耐受剂量(MTD)大于或等于900mg/kg。
7.重复给药毒性
7.1食蟹猴重复给药毒性研究
使用40只食蟹猴(20只/性别)，按性别随机分为4组(5只/性别/组)，分别为辅料对照组和供试品低、中、高剂量组。辅料对照组动物给予辅料对照品，2mL/kg，供试品低、中、高剂量组给予NVS451，给药剂量分别为15、50、150mg/kg，给药容量分别为0.2、0.67、2mL/kg，给药浓度为75mg/mL。所有动物经后肢皮下注射给药，每周给药2次，连续给药4周，共9次，即D1、D4、D8、D11、D15、D18、D22、D25和D29给药。试验期间，对动物进行临床观察、体重、体温、心电图、呼吸(呼吸频率和潮气量)、血压、眼科检查、血细胞计数、凝血功能、血液生化、尿液分析和免疫学指标(T淋巴细胞亚群、细胞因子、C反应蛋白、血清免疫球蛋白、补体、抗药抗体)指标的检测；首次和第8次给药前后，对各组动物采血进行血药浓度测定。末次药后次日(D30)对部分动物(3只/性别/组)实施安乐死，4周恢复期结束(D57)对剩余动物实施安乐死；所有动物均进行骨髓涂片及阅片、大体解剖观察，主要脏器称重，计算相对脏器重量(脏体比和脏脑比)，并对40余种组织器官进行组织病理学检查。
结果：试验期间，各组动物均未见死亡或濒死，各组动物临床观察、体重、体温、眼科检查、尿液检查、血细胞计数、凝血功能(FIB除外)、血生化指标、淋巴细胞亚群、补体、细胞因子(除IL-17A)和免疫球蛋白均未见与给药相关的异常改变。动物心电图、呼吸和血压参数均未见给药相关的异常改变。给药局部肉眼观察未见红斑、水肿、硬结、破溃等异常反应。
试验期间，与同期同性别辅料对照组相比，5次药后次日(D16)，供试品高剂量组雄性动物可见CRP升高(193.0％)；末次药后次日(D30)，供试品低、中、高剂量组雄性动物可见CRP升高(70.5％、218.5％、246.9％)，供试品高剂量组雄性动物还可见FIB升高(56.4％)，差异具有统计学意义(P≤0.05)。停药4周后，以上改变均完全恢复。
7.1.1组织病理学检查：
试验过程中未发现动物死亡或濒死情况。
末次药后(D30)，15、50和150mg/kg剂量组动物的注射局部及腹股沟淋巴结可见与供试品相关改变，其中注射局部表现为真皮/皮下/肌层轻微～中度的单个核细胞性炎症，为供试品引起的刺激性反应；腹股沟淋巴结轻微～中度的副皮质区/髓索淋巴细胞数量增多，与注射局部单个核细胞性炎症相关，结合临床病理学相关指标未见明显改变，考虑为非不良反应。
4周恢复期结束(D57)，15和50mg/kg剂量组注射局部与供试品相关改变已完全恢复，150mg/kg剂量组注射局部与供试品相关改变已基本恢复。
7.2大鼠重复给药毒性研究
使用192只SD大鼠，雌雄各半，分性别区段按照体重随机分为8组，1～4组主试验组的120只大鼠用作毒理研究(15只/性别/组)，5～8组卫星组的72只大鼠用于血清抗体和毒代动力学检测(6～10只/性别/组)。试验期间，辅料对照组动物给予NVS451白辅料溶液(4mL/kg)；供试品低、中、高剂量组分别给予NVS451，给药剂量分别为30、100、300mg/kg，给药容量分别为0.4、1.33、4mL/kg。所有动物均经颈背部皮下注射给药，每周给药2次，连续给药4周，共给药9次(即D1、D4、D8、D11、D15、D18、D22、D25和D29给药)，4周恢复期。
试验期间，主试验组动物主要进行临床观察，并对体重、食量、体温、血细胞计数、凝血功能、血液生化、眼科检查、尿液检查、T淋巴细胞亚群和细胞因子进行检测；卫星组动物于首次和第8次给药前后采血进行毒代动力学检测，并于不同时间点(首次给药前(D-1)、第15次给药前(D14)、末次给药前(D28)以及恢复期结束(D56))采血进行抗体测定。末次药后次日(D30)对主试验组前10只动物/性别/组实施安乐死，4周恢复期结束后(D57)对剩余动物实施安乐死。主试验组所有动物均进行大体解剖观察，主要脏器称重，计算相对脏器重量；并对辅料对照组、高剂量组动物40余种组织器官及低、中剂量组动物注射局部、进行组织病理学检查。
结果：试验期间，各组动物均未见死亡或濒死，临床观察未见异常。给药局部肉眼观察未见红斑、充血、肿胀、溃疡和硬结。各组动物眼科检查和尿液检查均未见异常；与同期同性别辅料对照组相比，各组动物体重、体温、食量、血细胞计数、凝血功能、血生化、T淋巴细胞亚群均未见与给药相关的异常改变。
7.2.1病理学检查：
本试验过程中无动物发生死亡。
安乐死动物大体观察，未见与供试品相关改变。
给药结束(D30)安乐死动物，30、100和300mg/kg剂量组注射局部可见与供试品相关的刺激性反应，表现为注射局部皮下和/或真皮轻微至中度单个核细胞性炎症。至4周恢复期结束，注射局部炎症基本完全恢复。
8.局部耐受毒性
局部耐受毒性试验伴随长毒开展，食蟹猴和SD大鼠均为每周给药两次(大鼠三个剂量组30、100和300mg/kg，食蟹猴三个剂量组15、50和150mg/kg)，连续给药4周，共9次(即D1、D4、D8、D11、D15、D18、D22、D25和D29给药)。试验期间，各组动物给药局部观察未见红斑、水肿、硬结、破溃等异常反应，局部耐受良好，未见毒性。
9.其他毒性
采用体外试管法，观察75mg/mL NVS451对人红细胞溶血及凝聚的影响(实验条件为常规条件)。自恒温箱温育后15分钟开始至3h观察结束时，供试品管中均可见试管上层液体无色澄明，管底红细胞下沉，经震荡后均匀分散，结果无溶血和凝聚发生。本试验条件下，75mg/mL的NVS451在体外对人红细胞无溶血作用，不引起人红细胞凝聚。
结论
1.药效学综合评估和结论
体外药效学：与IL-17A结合亲和力比较分析显示NVS451可与人IL-17A以高亲和力结合，亲和力高于同等条件下的苏金单抗和野生型人IL-17RA。除了与人IL-17家族的IL-17A分子结合外，NVS451还与IL-17C、IL-17F、IL-17AF结合。NVS451对人IL-17C、IL-17F的亲和力均高于野生型人IL-17RA。生物学活性细胞实验显示，NVS451融合蛋白显示出对IL-17A、IL-17A/F、IL-17F诱导的GRO-α细胞因子的抑制能力，并且对IL-17A诱导的GRO-α细胞因子的抑制能力较苏金单抗(Cosentyx)的IC50值更低。
根据这些体外效价结果，NVS451主要通过抑制IL-17A和IL-17C、IL-17F、IL-17AF活性发挥作用。SPR实验显示的相互作用提示，在体内，推荐剂量的NVS451在银屑病患者中发挥主要抑制IL-17A，辅以抑制IL-17C、IL-17F、IL-17AF分子的临床活性。
亲和力分析研究表明NVS451与ADCC相关的CD分子的结合亲和力处于不结合或低水平，和天然IgG1 Fc相比，其与ADCC/CDC相关Fc受体亲和力显著降低，证明NVS451的ADCC结合位点被突变去除。与FcRn结合亲和力分析显示，NVS451可与人、猴、大鼠的FcRn结合。同等条件下，其亲和力与苏金单抗、野生型IgG1 Fc均在相同水平，pH6.0酸性条件下NVS451可与人、食蟹猴、大鼠3不同种属的FcRn结合，且在pH7.4中性条件下均不结合。NVS451是一种携带人IgG1 Fc结构域的可溶性抗体Fc融合蛋白，因此理论上能够与Fc受体相互作用，但NVS451发挥药效的作用机制不依赖于ADCC/CDC活性，且Fc的细胞毒性作用ADCC/CDC可能带来不必要的免疫相关副作用，存在潜在安全风险。为避免产生该效应，NVS451的Fc部分突变了相关活性位点。研究证实，和天然IgG1 Fc相比，其与ADCC/CDC/ADCP相关Fc受体亲和力显著降低，且靶细胞杀伤实验(如图15和16所示)证实NVS451无ADCC/CDC活性作用。
体内药效学：在体内功能上，主要是在人T细胞驱动的银屑病模型中评估NVS451对银屑病的疗效。研究已证实，人类皮肤异种移植模型最适合于在开始临床试验之前进行探索新型抗银屑病剂/治疗策略的临床前分析，通过异种移植SCID鼠模型人皮肤组织学评估，包括评分和表皮厚度，显示了NVS451治疗人源化银屑病模型的疗效，在异种皮肤移植SCID小鼠银屑病模型中，NVS451以5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg剂量隔天给药28天后，结果显示NVS451对红肿、斑块和鳞屑均有一定程度改善作用，且与剂量呈正相关；15mg/kg剂量组与苏金组表皮厚度无统计学差异(P＞0.05)，每周使用最高剂量的NVS451(60mg/kg)治疗一次与每周使用两次的低剂量治疗同样有效，最重要的是，每周使用NVS451治疗两次或每周使用高剂量治疗一次，显示出与苏金单抗的阳性对照相似的治疗效果。苏金单抗被认为是治疗银屑病最有前景的药物之一，这项研究为临床治疗的有效性提供了强有力的临床证据支持。
安全药理学：GLP条件下，NVS451单次皮下注射给药30mg/kg、100mg/kg和300mg/kg，结果显示NVS451对大鼠中枢神经系统功能无影响。食蟹猴安全药理试验伴随长毒进行：以15、30和150mg/kg的剂量皮下注射，供试品对食蟹猴中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统均未见明显影响。
2.药代和毒理学综合评估和结论
由于NVS451与食蟹猴与啮齿动物IL-17A有交叉反应，因此选择食蟹猴和大鼠作为毒性评价的相关物种。NVS451分别以15、50和150mg/kg的剂量重复皮下注射给予食蟹猴，每周2次，连续给药4周，共给药9次，各组动物均未见死亡或濒死，未见明显全身毒性反应，认为本试验的未见不良反应剂量(NOAEL)为150mg/kg。注射用NVS451融合蛋白分别以30、100和300mg/kg的剂量重复皮下注射给予SD大鼠，每周给药2次，连续给药4周，共给药9次，动物未见明显全身毒性反应，认为未见不良反应剂量(NOAEL)为300mg/kg。食蟹猴和大鼠毒代动力学表明，反复给药后，NVS451无蓄积。
在食蟹猴和大鼠体内进行了单剂量非GLP的药代动力学试验，以观察NVS451经静脉和皮下途径给药的药代动力学基本情况。NVS451单次皮下给药后在雄性和雌性食蟹猴体内的吸收药代动力学进行了评价，其药代动力学行为具有典型的免疫球蛋白分子的低血清清除率和半衰期，各个剂量组皮下给药96小时后均能检测到有效药物。在食蟹猴和SD大鼠的单次药代动力学试验中，代谢数据无明显性别差异，在5～50mg/kg剂量范围内，NVS451在食蟹猴体内的T1/2，各剂量组雌雄动物平均T1/2在27.20～39.90h之间。NVS451在SD大鼠体内的T1/2，在10～100mg/kg剂量范围内，各剂量组雌雄动物T1/2在51.46～69.48h之间。
3.非临床结论：
NVS451是一种选择性靶向IL-17A，IL-17C、IL-17F和IL-17AF异源二聚体细胞因子的高亲和力抗体Fc融合蛋白，结合数据表明NVS451与人和食蟹猴体内的预定靶点有很高的亲和力。
综上，本发明进行了项目的非临床数据总结，该数据提供了靶点特异性和作用方式的证据，每周使用NVS451治疗两次或每周使用高剂量治疗一次，显示出与苏金单抗的阳性对照相似的治疗效果。NVS451在全面毒理学研究中耐受性良好。所有非临床评价研究为NVS451临床治疗的有效性和安全性提供了强有力的证据支持。
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Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
20 25 30
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
35 40 45
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
50 55 60
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
65 70 75 80
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
85 90 95
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
100 105 110
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
115 120 125
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
130 135 140
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
145 150 155 160
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
165 170 175
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
180 185 190
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
195 200 205
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
210 215 220
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
225 230 235 240
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
245 250 255
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
260 265 270
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
275 280 285
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Pro Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
20 25 30
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
35 40 45
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
50 55 60
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
65 70 75 80
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
85 90 95
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
100 105 110
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
115 120 125
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
130 135 140
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
145 150 155 160
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
165 170 175
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
180 185 190
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
195 200 205
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
210 215 220
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
225 230 235 240
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
245 250 255
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
260 265 270
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
275 280 285
<210> 3
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Pro Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
20 25 30
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
35 40 45
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
50 55 60
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
65 70 75 80
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
85 90 95
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
100 105 110
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
115 120 125
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
130 135 140
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
145 150 155 160
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
165 170 175
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
180 185 190
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
195 200 205
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
210 215 220
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
225 230 235 240
Leu Lys Trp Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
245 250 255
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Val Thr Val Ser Cys Pro
260 265 270
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
275 280 285
<210> 4
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
100 105 110
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
20 25 30
<210> 6
<211> 554
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
35 40 45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65 70 75 80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
115 120 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
180 185 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
260 265 270
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
290 295 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305 310 315 320
Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
325 330 335
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
340 345 350
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
355 360 365
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
370 375 380
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
385 390 395 400
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
405 410 415
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
420 425 430
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
435 440 445
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
450 455 460
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
485 490 495
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
500 505 510
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
515 520 525
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
530 535 540
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550
<210> 7
<211> 554
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Pro Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
35 40 45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65 70 75 80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
115 120 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
180 185 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
260 265 270
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
290 295 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305 310 315 320
Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
325 330 335
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
340 345 350
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
355 360 365
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
370 375 380
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
385 390 395 400
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
405 410 415
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
420 425 430
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
435 440 445
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
450 455 460
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
485 490 495
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
500 505 510
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
515 520 525
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
530 535 540
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550
<210> 8
<211> 554
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Pro Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
35 40 45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65 70 75 80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
115 120 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
180 185 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
260 265 270
Leu Lys Trp Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Val Thr Val Ser Cys Pro
290 295 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305 310 315 320
Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
325 330 335
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
340 345 350
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
355 360 365
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
370 375 380
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
385 390 395 400
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
405 410 415
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
420 425 430
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
435 440 445
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
450 455 460
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
485 490 495
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
500 505 510
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
515 520 525
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr
530 535 540
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550
<210> 9
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 9
ctgagactgc tggaccacag agccctggtc tgctcccagc ccggcctgaa ctgcaccgtg 60
aagaactcta cctgcctgga cgactcctgg atccaccccc ggaacctgac cccctccagc 120
cccaaggacc tgcagatcca gctgcacttc gcccacaccc agcagggcga cctgttcccc 180
gtggcccaca tcgagtggac cctgcagacc gacgcctcca tcctgtacct ggaaggcgcc 240
gagctgtccg tgctgcagct gaacaccaac gagcggctgt gcgtgcgctt cgagttcctg 300
tccaagctgc ggcaccacca caagcggtgg cggttcacct tctcccactt cgtggtggac 360
cccggccagg aatacgaagt gaccgtgcac catctgccca agcccatccc cgacggcgac 420
cccaaccacc agtccaagaa ctttctggtg cccgactgcg aggacgcccg gatgaaggtc 480
acaaccccct gcatgtcctc cggctccctg tgggacccca acatcaccgt ggaaaccctg 540
gaagcccacc agctgcgggt gtccttcacc ctgtggaacg agtccaccca ctaccagatc 600
ctgctgacct ccttccccca catggaaaac cacagctgct tcgagcacat gcaccacatc 660
cctgcccctc ggcccgagga attccaccag cggtccaacg tgaccctgac cctgcggaac 720
ctgaagggct gctgccggca ccaggtgcag attcagccct tcttctcctc ttgcctgaac 780
gactgcctgc ggcactccgc caccgtgtcc tgccctgaga tgcccgacac ccccgagccc 840
atccctgact acatgcctct gtgg 864
<210> 10
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
ctgagactgc tggaccacag agcccccgtc tgctcccagc ccggcctgaa ctgcaccgtg 60
aagaactcta cctgcctgga cgactcctgg atccaccccc ggaacctgac cccctccagc 120
cccaaggacc tgcagatcca gctgcacttc gcccacaccc agcagggcga cctgttcccc 180
gtggcccaca tcgagtggac cctgcagacc gacgcctcca tcctgtacct ggaaggcgcc 240
gagctgtccg tgctgcagct gaacaccaac gagcggctgt gcgtgcgctt cgagttcctg 300
tccaagctgc ggcaccacca caagcggtgg cggttcacct tctcccactt cgtggtggac 360
cccggccagg aatacgaagt gaccgtgcac catctgccca agcccatccc cgacggcgac 420
cccaaccacc agtccaagaa ctttctggtg cccgactgcg aggacgcccg gatgaaggtc 480
acaaccccct gcatgtcctc cggctccctg tgggacccca acatcaccgt ggaaaccctg 540
gaagcccacc agctgcgggt gtccttcacc ctgtggaacg agtccaccca ctaccagatc 600
ctgctgacct ccttccccca catggaaaac cacagctgct tcgagcacat gcaccacatc 660
cctgcccctc ggcccgagga attccaccag cggtccaacg tgaccctgac cctgcggaac 720
ctgaagggct gctgccggca ccaggtgcag attcagccct tcttctcctc ttgcctgaac 780
gactgcctgc ggcactccgc caccgtgtcc tgccctgaga tgcccgacac ccccgagccc 840
atccctgact acatgcctct gtgg 864
<210> 11
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
ctgagactgc tggaccacag agcccccgtc tgctcccagc ccggcctgaa ctgcaccgtg 60
aagaactcta cctgcctgga cgactcctgg atccaccccc ggaacctgac cccctccagc 120
cccaaggacc tgcagatcca gctgcacttc gcccacaccc agcagggcga cctgttcccc 180
gtggcccaca tcgagtggac cctgcagacc gacgcctcca tcctgtacct ggaaggcgcc 240
gagctgtccg tgctgcagct gaacaccaac gagcggctgt gcgtgcgctt cgagttcctg 300
tccaagctgc ggcaccacca caagcggtgg cggttcacct tctcccactt cgtggtggac 360
cccggccagg aatacgaagt gaccgtgcac catctgccca agcccatccc cgacggcgac 420
cccaaccacc agtccaagaa ctttctggtg cccgactgcg aggacgcccg gatgaaggtc 480
acaaccccct gcatgtcctc cggctccctg tgggacccca acatcaccgt ggaaaccctg 540
gaagcccacc agctgcgggt gtccttcacc ctgtggaacg agtccaccca ctaccagatc 600
ctgctgacct ccttccccca catggaaaac cacagctgct tcgagcacat gcaccacatc 660
cctgcccctc ggcccgagga attccaccag cggtccaacg tgaccctgac cctgcggaac 720
ctgaagtggt gctgccggca ccaggtgcag attcagccct tcttctcctc ttgcctgaac 780
gactgcctgc ggcactccgt gaccgtgtcc tgccctgaga tgcccgacac ccccgagccc 840
atccctgact acatgcctct gtgg 864
<210> 12
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
gagcccaagt cctccgacaa gacccacacc tgtcccccct gccctgctcc tcctgtggct 60
gggccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 120
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 180
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 240
aactccacct accgggtggt gtctgtgctg acagtgctgc accaggactg gctgaacggc 300
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccct ccagcatcga aaagaccatc 360
tccaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc tagccgggac 420
gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga aaggcttcta cccctccgat 480
atcgccgtgg aatgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 540
gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 600
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg agggcctgca caaccactac 660
acccagaagt ccctgtccct gagccccggg aaa 693
<210> 13
<211> 96
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 13
atgggcgctg ccagatctcc cccttctgct gtgcctggac ctctgctggg cctccttctg 60
ctgctgctgg gagtgctggc tcctggcggc gctagc 96
<210> 14
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
atgggcgctg ccagatctcc cccttctgct gtgcctggac ctctgctggg cctccttctg 60
ctgctgctgg gagtgctggc tcctggcggc gctagcctga gactgctgga ccacagagcc 120
ctggtctgct cccagcccgg cctgaactgc accgtgaaga actctacctg cctggacgac 180
tcctggatcc acccccggaa cctgaccccc tccagcccca aggacctgca gatccagctg 240
cacttcgccc acacccagca gggcgacctg ttccccgtgg cccacatcga gtggaccctg 300
cagaccgacg cctccatcct gtacctggaa ggcgccgagc tgtccgtgct gcagctgaac 360
accaacgagc ggctgtgcgt gcgcttcgag ttcctgtcca agctgcggca ccaccacaag 420
cggtggcggt tcaccttctc ccacttcgtg gtggaccccg gccaggaata cgaagtgacc 480
gtgcaccatc tgcccaagcc catccccgac ggcgacccca accaccagtc caagaacttt 540
ctggtgcccg actgcgagga cgcccggatg aaggtcacaa ccccctgcat gtcctccggc 600
tccctgtggg accccaacat caccgtggaa accctggaag cccaccagct gcgggtgtcc 660
ttcaccctgt ggaacgagtc cacccactac cagatcctgc tgacctcctt cccccacatg 720
gaaaaccaca gctgcttcga gcacatgcac cacatccctg cccctcggcc cgaggaattc 780
caccagcggt ccaacgtgac cctgaccctg cggaacctga agggctgctg ccggcaccag 840
gtgcagattc agcccttctt ctcctcttgc ctgaacgact gcctgcggca ctccgccacc 900
gtgtcctgcc ctgagatgcc cgacaccccc gagcccatcc ctgactacat gcctctgtgg 960
ggctccggcg agcccaagtc ctccgacaag acccacacct gtcccccctg ccctgctcct 1020
cctgtggctg ggccctccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1080
tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1140
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 1200
gaacagtaca actccaccta ccgggtggtg tctgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 1260
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgccctc cagcatcgaa 1320
aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc cgcgagcccc aggtgtacac cctgccccct 1380
agccgggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa aggcttctac 1440
ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1500
accccccctg tgctggactc cgacggctca ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac 1560
aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga gggcctgcac 1620
aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg agccccggga aa 1662
<210> 15
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 15
atgggcgctg ccagatctcc cccttctgct gtgcctggac ctctgctggg cctccttctg 60
ctgctgctgg gagtgctggc tcctggcggc gctagcctga gactgctgga ccacagagcc 120
cccgtctgct cccagcccgg cctgaactgc accgtgaaga actctacctg cctggacgac 180
tcctggatcc acccccggaa cctgaccccc tccagcccca aggacctgca gatccagctg 240
cacttcgccc acacccagca gggcgacctg ttccccgtgg cccacatcga gtggaccctg 300
cagaccgacg cctccatcct gtacctggaa ggcgccgagc tgtccgtgct gcagctgaac 360
accaacgagc ggctgtgcgt gcgcttcgag ttcctgtcca agctgcggca ccaccacaag 420
cggtggcggt tcaccttctc ccacttcgtg gtggaccccg gccaggaata cgaagtgacc 480
gtgcaccatc tgcccaagcc catccccgac ggcgacccca accaccagtc caagaacttt 540
ctggtgcccg actgcgagga cgcccggatg aaggtcacaa ccccctgcat gtcctccggc 600
tccctgtggg accccaacat caccgtggaa accctggaag cccaccagct gcgggtgtcc 660
ttcaccctgt ggaacgagtc cacccactac cagatcctgc tgacctcctt cccccacatg 720
gaaaaccaca gctgcttcga gcacatgcac cacatccctg cccctcggcc cgaggaattc 780
caccagcggt ccaacgtgac cctgaccctg cggaacctga agggctgctg ccggcaccag 840
gtgcagattc agcccttctt ctcctcttgc ctgaacgact gcctgcggca ctccgccacc 900
gtgtcctgcc ctgagatgcc cgacaccccc gagcccatcc ctgactacat gcctctgtgg 960
ggctccggcg agcccaagtc ctccgacaag acccacacct gtcccccctg ccctgctcct 1020
cctgtggctg ggccctccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1080
tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1140
aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 1200
gaacagtaca actccaccta ccgggtggtg tctgtgctga cagtgctgca ccaggactgg 1260
ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgccctc cagcatcgaa 1320
aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc cgcgagcccc aggtgtacac cctgccccct 1380
agccgggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa aggcttctac 1440
ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1500
accccccctg tgctggactc cgacggctca ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac 1560
aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga gggcctgcac 1620
aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg agccccggga aa 1662
<210> 16
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 16
atgggcgctg ccagatctcc cccttctgct gtgcctggac ctctgctggg cctccttctg 60
ctgctgctgg gagtgctggc tcctggcggc gctagcctga gactgctgga ccacagagcc 120
cccgtctgct cccagcccgg cctgaactgc accgtgaaga actctacctg cctggacgac 180
tcctggatcc acccccggaa cctgaccccc tccagcccca aggacctgca gatccagctg 240
cacttcgccc acacccagca gggcgacctg ttccccgtgg cccacatcga gtggaccctg 300
cagaccgacg cctccatcct gtacctggaa ggcgccgagc tgtccgtgct gcagctgaac 360
accaacgagc ggctgtgcgt gcgcttcgag ttcctgtcca agctgcggca ccaccacaag 420
cggtggcggt tcaccttctc ccacttcgtg gtggaccccg gccaggaata cgaagtgacc 480
gtgcaccatc tgcccaagcc catccccgac ggcgacccca accaccagtc caagaacttt 540
ctggtgcccg actgcgagga cgcccggatg aaggtcacaa ccccctgcat gtcctccggc 600
tccctgtggg accccaacat caccgtggaa accctggaag cccaccagct gcgggtgtcc 660
ttcaccctgt ggaacgagtc cacccactac cagatcctgc tgacctcctt cccccacatg 720
gaaaaccaca gctgcttcga gcacatgcac cacatccctg cccctcggcc cgaggaattc 780
caccagcggt ccaacgtgac cctgaccctg cggaacctga agtggtgctg ccggcaccag 840
gtgcagattc agcccttctt ctcctcttgc ctgaacgact gcctgcggca ctccgtgacc 900
gtgtcctgcc ctgagatgcc cgacaccccc gagcccatcc ctgactacat gcctctgtgg 960
ggctccggcg agcccaagtc ctccgacaag acccacacct gtcccccctg ccctgctcct 1020
cctgtggctg ggccctccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1080
tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1140
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aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc cgcgagcccc aggtgtacac cctgccccct 1380
agccgggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa aggcttctac 1440
ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1500
accccccctg tgctggactc cgacggctca ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac 1560
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aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg agccccggga aa 1662
<210> 17
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 17
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Pro Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
20 25 30
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
35 40 45
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
50 55 60
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
65 70 75 80
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
85 90 95
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Lys Arg Trp Arg Phe
100 105 110
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
115 120 125
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
130 135 140
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu Asp Ala Arg Met Lys Val
145 150 155 160
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
165 170 175
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
180 185 190
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
195 200 205
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
210 215 220
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
225 230 235 240
Leu Lys Trp Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
245 250 255
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Val Thr Val Ser Cys Pro
260 265 270
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
275 280 285
Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
290 295 300
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
305 310 315 320
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
325 330 335
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
340 345 350
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
355 360 365
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
370 375 380
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
385 390 395 400
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
405 410 415
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
420 425 430
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
435 440 445
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
450 455 460
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
465 470 475 480
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
485 490 495
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
500 505 510
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520
<210> 18
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 18
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Ser
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (30)

1.一种IL-17RA融合蛋白，其特征在于包括可操作地连接的、依次串联的信号肽、IL-17RA胞外结构域和IgG1恒定区；其中所述IL-17RA胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述IgG1恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述信号肽为IL-17-RA天然信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述IL-17RA胞外结构域与所述IgG1恒定区之间采用接头连接。
4.根据权利要求1所述的IL-17RA融合蛋白，其中所述IL-17RA融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种分离的、编码根据权利要求1-4中任一项所述IL-17RA融合蛋白的核酸。
6.一种表达载体，其含有与启动子有效连接的根据权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其含有根据权利要求6所述的表达载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中该宿主细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.21011。
9.一种由根据权利要求1-4中任一项所述的IL-17RA融合蛋白形成的蛋白二聚体，该二聚体由两分子所述IL-17RA融合蛋白通过所述IgG1恒定区的半胱氨酸结合形成双链。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的IL-17RA融合蛋白或根据权利要求9所述的蛋白二聚体在制备用于治疗银屑病、关节炎、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎、哮喘、肌腱炎、甲状腺相关性眼病、多发性硬化、狼疮肾炎、椎关节炎、强直性脊柱炎、类风湿关节炎、炎症性肠疾病、非酒精性脂肪肝、巨细胞性动脉炎、非放射学性轴性脊柱关节炎、三阴性乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤、黑色素瘤或宫颈癌的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述银屑病为斑块银屑病、副银屑病或银屑病关节炎。
12.根据权利要求10所述的应用，其中所述多发性硬化为复发-缓解型多发性硬化。
13.根据权利要求10所述的应用，其中所述类风湿性关节炎为幼年型类风湿性关节炎。
14.一种药物组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1-4中任意一项所述的IL-17RA融合蛋白或根据权利要求9所述的蛋白二聚体作为活性成分和可药用的辅料。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述可药用的辅料选自稀释剂、缓冲剂、保护剂、表面活性剂、抗氧化剂中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述缓冲剂选自组氨酸-醋酸缓冲液、Tris-醋酸缓冲液、盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液，精氨酸缓冲液，琥珀酸缓冲液，柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述保护剂选自吐温-20、吐温-80、氨基酸、多元醇、二糖、多糖中的一种或多种。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述二糖选自海藻糖和蔗糖。
19.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、泊洛沙姆中的一种或多种。
20.根据权利要求14所述的药物组合物，其中单剂所述药物组合物包含5mg/ml-150mg/ml的所述IL-17RA融合蛋白或所述蛋白二聚体。
21.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物为冻干剂或注射液的形式。
22.一种用于治疗银屑病、关节炎、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎、哮喘、肌腱炎、甲状腺相关性眼病、多发性硬化、狼疮肾炎、椎关节炎、强直性脊柱炎、类风湿关节炎、炎症性肠疾病、非酒精性脂肪肝、巨细胞性动脉炎、非放射学性轴性脊柱关节炎、三阴性乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤、黑色素瘤或宫颈癌的注射剂，包含权利要求14-21中任一项所述的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的注射剂，其中所述银屑病为斑块银、屑病副银屑病或银屑病关节炎。
24.根据权利要求22所述的应用，其中所述多发性硬化为复发-缓解型多发性硬化。
25.根据权利要求22所述的应用，其中所述类风湿性关节炎为幼年型类风湿性关节炎。
26.根据权利要求22所述的注射剂，其中所述注射剂为冻干粉剂的形式或液体制剂的形式。
27.根据权利要求22所述的注射剂，其中所述注射剂为皮下注射剂或静脉滴注剂。
28.根据权利要求26所述的注射剂，其中在所述液体制剂中，所述静脉制剂包含5mg/ml-150mg/ml的所述IL-17RA融合蛋白或所述蛋白二聚体、2-100mM的Tris-醋酸、10-250mM的精氨酸、50-500mM的海藻糖、0.01-5％的吐温-20。
29.根据权利要求26所述的注射剂，其中所述液体制剂是采用注射用水、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、氯化钠水溶液或乳酸林格氏液配制得到的。
30.根据权利要求26所述的注射剂，其中所述冻干粉剂是通过将所述液体制剂冷冻干燥制得的。
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