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CN115093461A - 中间体化合物、化合物及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

中间体化合物、化合物及其制备方法、药物组合物和用途 Download PDF

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CN115093461A
CN115093461A CN202210488766.3A CN202210488766A CN115093461A CN 115093461 A CN115093461 A CN 115093461A CN 202210488766 A CN202210488766 A CN 202210488766A CN 115093461 A CN115093461 A CN 115093461A
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CN202210488766.3A
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陈晨晨
朱新旺
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Hefei Jing Peptide Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Hefei Jing Peptide Biological Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种合成新型的催产素类似物的中间体化合物、新型的催产素类似物及其制备方法、药物组合物和用途。中间体化合物具有式(IV)所示的结构；催产素类似物为具有式(I)所示的结构的化合物；化合物的制备方法包括：将式(IV)所示中间体化合物进行硫醇烯反应，以便所述式(I)所示化合物；药物组合物包含式(I)所示化合物。本发明的化合物可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产出血和产后出血，且具有较长的半衰期和较低的EC50值。

Description

中间体化合物、化合物及其制备方法、药物组合物和用途
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体地，本发明涉及一种中间体化合物、化合物及其制备方法、药物组合物和用途。
背景技术
催产素是哺乳动物体内下丘脑分泌的多肽类荷尔蒙，含有九个氨基酸残基和一对二硫键。它参与到许多生理过程中，如中枢神经系统的神经传递、乳房和子宫平滑肌收缩、乳房肿瘤生长及卵巢的自分泌和旁分泌等。目前的催产素及其类似物产品存在半衰期短或EC50值过大甚至没有效果等缺点。
因此，本发明亟需一种新型的催产素类似物产品。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种合成新型的催产素类似物的中间体化合物、新型的催产素类似物及其制备方法、药物组合物和用途，该催产素类似物具有较长的半衰期和较低的EC50值。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
催产素在临床上主要应用于引产和产后出血控制，但其存在半衰期较短(2-5分钟)的缺点。二硫键对于维持催产素结构的刚性和生理活性起到至关重要的作用，但是二硫键本身容易受到体内还原性物质(例如自由巯基)的影响，从而直接影响催产素的半衰期。因此，对于二硫键修饰的改造是催产素重要改造方向之一。据文献报道，通过烯烃复分解反应将催产素的二硫键替换成C-C键，改造后的化合物(即为催产素类似物)可极大地增长半衰期(5-60倍)，但含有C-C键的催产素类似物的EC50值增大了三个数量级，甚至没有效果。此外，将S-S键改造成硫醚键是较为流行的二硫键改造策略，硫醚键在二面角、共价半径等生化和几何参数上接近，使得硫醚键具有更高的稳定性。目前文献报道，通常直接将催产素二硫键的一个S原子替换成C原子，得到的催产素类似物中含有硫醚键，但结果显示，上述改造可增加催产素类似物的半衰期，却对催产素类似物的活性产生影响，极大地增加催产素类似物的EC50值。
然而，本发明的发明人通过大量实验发现，将催产素中的其中一个半胱氨酸的侧链-SH替换成-R4-CH＝CH2(例如R4为无或C1-C5亚烷基)，该烯基可与另一个半胱氨酸的巯基在硫醇烯反应下连接形成硫醚键，可将原催产素的-S-S-键改造成-R1-CH2-S-(例如R1为C1-C6亚烷基)，改造后的化合物(即为催产素类似物)具有较长的半衰期，同时还能够维持原有活性，该化合物的EC50值与催产素的EC50值相当，甚至更低。
基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物，其为式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，
Figure BDA0003630457110000021
其中，X为-S-CH2-R1-，R1为C1-C6亚烷基。
发明人经过大量实验得到上述化合物为一种新型的催产素类似物，其具有较长的半衰期和较低的EC50值，可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产和产后出血。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种中间体化合物。根据本发明的实施例，所述中间体化合物具有式(IV)所示的结构，
Figure BDA0003630457110000022
其中，R2为-SH、R3为-R4-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-R4-CH＝CH2；R4为无或C1-C5亚烷基。
本发明的中间体化合物可用于合成前述的式(I)所示的催产素类似物。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备式(I)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：将式(IV)所示中间体化合物进行硫醇烯反应，以便获得所述式(I)所示化合物；
Figure BDA0003630457110000031
其中，X为-S-CH2-R1-；R1为C1-C6亚烷基；R2为-SH、R3为-R4-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-R4-CH＝CH2；R4为无或C1-C5亚烷基。
发明人经过大量实验发现，采用上述方法可有效合成式(I)所示的催产素类似物，该催产素类似物可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产和产后出血，且制备方法简单。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包含：前述的化合物或依据前述的方法制备的化合物。本发明的药物组合物具有较长的半衰期和较低的EC50值，可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产和产后出血。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的化合物、依据前述的方法制备的化合物或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于促进乳腺排乳以及预防或治疗引产和产后出血。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中的催产素类似物制备步骤示意图；
图2为本发明实施例1中的催产素类似物HPLC分析图；
图3为本发明实施例1中的催产素类似物ESI-MS质谱图；
图4为本发明实施例2中的催产素类似物和催产素的EC50值。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“亚烷基”是指直链或支链的饱和二价烷烃基团。包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH2(CH3)CH2-)。
在本文中，术语“C1-Cn”是指具有1至n个有限数量的碳原子的烷基，例如1、2、3、4、5或6个碳原子。进一步理解，所述术语“C1-C6”应解释为其中包括的任何子范围，例如C1-C6、C2-C5、C3-C4、C1-C2、C1-C3、C1-C4、C1-C5；尤其是C1-C2、C1-C3。
在本文中，本发明的化合物可为优选的化合物。术语“优选的化合物”是指得到的更合乎需要的生物活性的化合物，例如，化合物的立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐。示例性地，本发明化合物的分离、纯化或部分纯化的立体异构体，也包括在本发明范围内。这种材料的纯化和分离可以通过本领域已知的标准技术实现。
需要说明的是，本发明的化合物还可以包括本发明化合物的所有可能的立体异构体，可以是单一立体异构体，或任何比例的所述立体异构体，例如(R)或(S)异构体，或(E)或(Z)异构体的任何混合物。利用任何合适的本领域说明的方法，例如：色谱，尤其是手性色谱，可以实现本发明化合物的单一立体异构体的分离，例如：单一对映异构体或单一非对应异构体的分离。
需要说明的是，本发明的化合物还可以包括本发明化合物所有可能的互变异构体，作为单一互变异构体，或所述互变异构体的任何比例的任何混合物。
在本文中，术语“药学上可接受的盐”是指化合物或其立体异构体，与该化合物或其立体异构体的相对无毒的无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。例如，参见S.M.Berge等人“Pharmaceutical Salts”J.Pharm.Sci.1977，66,1-19。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”或者“药学上可接受的载体”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
对本文所提及的其他药学上可接受的辅料以及其工艺可参考关于此主题的大量文献，具体而言参见Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Arthur H.Kibbe编辑，American Pharmaceutical Association,Washington,USA和Pharmaceutical Press,London；以及Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie、Kosmetik和angrenzendeGebiete，H.P.Fiedler编辑，第4版，编辑Cantor、Aulendorf和早期版本。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的融合蛋白或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射方式被给药。
在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
本发明提出了一种中间体化合物、化合物及其制备方法、药物组合物和用途，下面将分别对其进行详细描述。
化合物
在本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物，其为式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐。
Figure BDA0003630457110000061
其中，X为-S-CH2-R1-，R1为C1-C6亚烷基。
研究表明，将原化合物(催产素)二硫键的一个S原子替换成C原子，从而使硫醚键替代二硫键形成新的化合物(即为催产素类似物)，该化合物具有较长的半衰期，但其活性明显降低，极大地提高了EC50值。基于此，发明人经过实验发现，硫醚键连接处的原子数目对化合物的活性产生影响，从而，发明人经过大量的实验得到上述化合物，其具有较长的半衰期和较低的EC50值，可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产和产后出血。
根据本发明的实施例，R1为亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚异丙基。发明人经过实验发现，将半胱氨酸的侧链-SH替换成烯基结构，该烯基结构的原子数目可对化合物的活性产生影响，当R1为亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚异丙基时，得到的化合物的活性较好，优选为R1为亚甲基。
根据本发明的实施例，所述化合物具有式(II)或式(III)所示的结构，
Figure BDA0003630457110000071
发明人发现，用亚乙基替代催产素的一个S原子，得到的上述催产素类似物，其可提高半衰期，且能基本保持催产素的活性，甚至可进一步提高催产素的活性。
中间体化合物
在本发明的又一方面，本发明提出了一种中间体化合物。根据本发明的实施例，所述中间体化合物具有式(IV)所示的结构，
Figure BDA0003630457110000072
其中，R2和R3各种独立地选自-R4-CH＝CH2或-SH，且R2和R3的其中之一必须为-SH，R4为无或C1-C5亚烷基。
本发明的中间体化合物可用于合成前述的化合物，使得合成的化合物具有较长的半衰期和较低的EC50值，可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产出血和产后出血。
根据本发明的实施例，R2为-SH、R3为-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-CH＝CH2。
制备式(I)所示化合物的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备式(I)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：将式(IV)所示中间体化合物进行硫醇烯反应，以便所述式(I)所示化合物；
Figure BDA0003630457110000081
其中，X为-S-CH2-R1-，R1为C1-C6亚烷基；R2和R3各种独立地选自-R4-CH＝CH2或-SH，且R2和R3的其中之一必须为-SH，R4为无或C1-C5亚烷基。
发明人经过大量实验发现，采用上述方法可有效合成式(I)所示化合物，该化合物可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产和产后出血，且制备方法简单。
根据本发明的实施例，R1为亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚异丙基，优选为亚甲基。
根据本发明的实施例，R2为-SH、R3为-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-CH＝CH2。
根据本发明的实施例，所述式(IV)所示中间体化合物是通过固相合成法获得的。
根据本发明的实施例，所述固相合成法选自Fmoc固相合成法。
根据本发明的实施例，所述硫醇烯反应包括：将所述式(IV)所示中间体化合物在盐酸胍和光引发剂存在的条件下进行光照处理。
根据本发明的实施例，所述光照处理在光波长为365nm、光强度为(5-8)×105μJ/cm2的光照条件下进行0.5h-2h。发明人经过大量实验得到上述光照处理条件，由此，可有效合成式(I)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(即为光引发剂2959)。发明人经过大量实验筛选出上述光引发剂，由此，可有效合成式(I)所示化合物。发明人经过实验发现，当采用对二甲氨基吡啶(DMAP)、引发剂VA-044、蒽醌磺酸钠和光引发剂819等光引发剂合成式(I)所示化合物时，结果发现，采用上述光引发剂均通过二硫键形成二聚体或者直接不发生反应，无法得到式(I)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述光引发剂与所述式(IV)所示中间体化合物的摩尔比为(0.2-1)：1。发明人经过大量实验得到上述配比，由此，可有效合成式(I)所示化合物。
根据本发明的实施例，所述式(IV)所示中间体化合物于所述盐酸胍和式(IV)所示中间体化合物的混合液中的终浓度为3-5mM。
根据本发明的实施例，进行所述硫醇烯反应之前，预先将所述式(IV)所示中间体化合物进行纯化处理。
根据本发明的实施例，所述纯化处理采用高效液相色谱纯化进行。
根据本发明的实施例，进一步将所述纯化处理得到的式(IV)所示中间体化合物进行冻干处理。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对式(I)所示化合物和式(IV)所示中间体化合物所描述的特征和优点，同样适用于该制备式(I)所示化合物的方法，在此不再赘述。
药物组合物
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包含：前述的化合物或依据前述的方法制备的化合物。本发明的药物组合物可有效促进乳腺排乳以及预防或治疗引产出血和产后出血，且具有较长的半衰期和较低的EC50值。
根据本发明的实施例，所述组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)。典型的药物组合物为注射溶液。所述药物组合物可通过静脉注射来施用。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对式(I)所示化合物和制备式(I)所示化合物的方法所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。
方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种促进乳腺排乳的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：向受试者施用药学上可接受量的前述式(I)所示化合物或前述的药物组合物。根据本发明的实施例，该方法可有效促进乳腺排乳。
根据本发明的实施例，所述方法的给药途径包括静脉注射。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对式(I)所示化合物、制备式(I)所示化合物的方法和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该促进乳腺排乳的方法，在此不再赘述。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种预防或治疗引产出血和产后出血的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：向受试者施用药学上可接受量的前述式(I)所示化合物或前述的药物组合物。根据本发明的实施例，该方法可有效预防或治疗引产出血和产后出血。
根据本发明的实施例，所述方法的给药途径包括静脉注射。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对式(I)所示化合物、制备式(I)所示化合物的方法和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该预防或治疗引产出血和产后出血的方法，在此不再赘述。
用途
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述式(I)所示化合物、依据前述的方法制备的化合物或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于促进乳腺排乳以及预防或治疗引产出血和产后出血。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对式(I)所示化合物、制备式(I)所示化合物的方法和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：化合物(即为催产素类似物)的制备
Ⅰ.Fmoc固相合成中间体化合物的过程
需要制备的中间体化合物的氨基酸序列为：烯丙基甘氨酸-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-CONH2。
称取1300mg取代度为0.31mmol/g的(0.4mmol)的氨基树脂(Rink amide AMresin，购买于天津南开和成科技有限公司)放入多肽合成管中，加入5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和5mL的二氯甲烷(DCM)，室温放置30min对氨基树脂进行溶胀。向多肽合成管中加入10mL的20％哌啶溶液(20％哌啶溶液为100mL哌啶溶于400mL DMF中，额外添加2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)至终浓度为0.1M)进行Fmoc保护基脱除，33℃条件下反应两次，两次的反应时间分别为5min、10min。称取475mg(1.6mmol)的Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)和628mg(1.52mmol)的缩合剂HCTU(即为6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)放入50mL的离心管中，10mL DMF溶解后，再加入528μL(3.2mmol)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，将上述得到的混合溶液转移至多肽合成管中，33℃振荡条件下进行氨基酸偶合反应，反应时间为1h。余下的氨基酸序列顺序依次为Leu、Pro、Cys、Asn、Gln、Ile、Tyr和烯丙基甘氨酸，根据余下氨基酸序列的顺序依次对每个氨基酸进行Fmoc脱保护和氨基酸偶合过程。偶合过程称量按照添加量为氨基树脂的4equiv的Fmoc保护氨基酸、3.8equiv的缩合剂HCTU和8equiv的DIEA。
固相合成完成后，将10mL切割试剂(由10mL三氟乙酰基(TFA)、500μL H2O、500mg苯酚和250μL Tips(三异丙基硅烷，cas：6485-79-6)制备而成)加入上述氨基酸偶合反应完成后的氨基树脂中，然后在26℃条件下振荡反应2.5h。过滤取滤液，室温下使用氮气鼓出，得到的裂解液，将裂解液浓缩至5mL以下。加入适量冰乙醚沉淀后离心收集沉淀，重复冰乙醚洗涤过程一次，得到粗肽。使用HPLC对粗肽进行半制备分离后冻干，得到128mg纯肽，总产率为32％。
Ⅱ.化合物(催产素类似物)的光引发硫醇烯反应(thiol-ene反应)
称取50mg纯肽，溶于13mL浓度为6M的盐酸胍溶液中(纯肽的终浓度为3.85mM)，PH＝5。向溶液中加入5.6mg的光引发剂2959(光引发剂2959的添加量为纯肽的0.5equiv)。超声溶解后，放入UVP CL-1000L紫外交联仪中，在光波长为365nm、光强度为7.2×105μJ/cm2的条件下进行1h的光照反应。将光照反应后得到的溶液利用0.22μm生物膜过滤后，使用高效液相色谱法(HPLC)进行半制备分离后冻干，得到15mg催产素类似物，产率为30％，采用HPLC和ESI-MS对得到的催产素类似物进行检测。催产素类似物制备步骤如图1所示，检测结果如图2～3所示，其中，图1中的圆圈内的字母为氨基酸的缩写。
实施例2：催产素类似物的钙流实验活性分析
1、检测溶液准备：
1)250mM probenecid(丙磺舒，sigma-Aldrich公司，货号#P8761)。丙磺舒具有抑制细胞对Ca2+荧光染料的外排作用，保证染料留在胞内。
2)Flex缓冲液(又称“Flex buffer”)配制：10×HBSS，终浓度为l×；1M Hepes，终浓度为20nM；1M MgSO4，终浓度为1mM；1M Na2CO3，终浓度为3.3mM；1M CaCl2，终浓度为1.3mM；10％(w/v)BSA，终浓度为0.1％；250mM丙磺舒，终浓度为2.5mM；用10M HCl(约90μL)调pH至7.4。
3)20％(w/v)pluronic acid：每20mg pluronic acid(商品名Pluronic F-127，Sigma-Aldrich)溶解到100μL二甲基亚砜(DMSO)中，储存于4℃备用。Pluronic acid是一种表而活性剂，能防止钙离子荧光探针(Fluo-4 AM)染料在溶液中聚合，并帮助其通过细胞膜进入胞内，同时还能减轻多次更换培养基对细胞带来的伤害。
4)1μM Fluo-4 AM溶液(每块96孔板约需要8mL)，现配现用：8mL Flex buffer中加入8μL 1mM Fluo-4AM溶液和4μL 20％pluronic acid。
2、HEK293T细胞准备：
1)中皿中HEK293T细胞生长至60％～70％融合度时，进行转染，转染7μg表达催产素受体(OTR，购买于金斯瑞生物科技)的质粒。
2)转染24小时后进行转铺，即先用100μL/孔poly-lysine将黑色96孔板进行包被处理，然后用培养基将细胞吹匀并计数，用培养基将调节细胞密度，按照6万细胞/100μL/孔铺进96孔板。
3、实验过程：
1)于含有HEK293T细胞的96孔板中移除细胞培养基，每孔加入150μL Flex buffer清洗细胞，吸出后每孔加入75μL Fluo-4 AM溶液，在37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中孵育1小时。
2)将改造的催产素类似物使用Flex buffer溶解，得到催产素类似物的终浓度为0.2mM的药物溶液。然后分配到加药孔板中，每孔细胞需加入50μL的药物溶液，总共三孔。同时将原型催产素(氨基酸序列为Cys-Tyr-Ile-Gly-Asp-Cys-Pro-Leu-Gly，两个Cys之间通过二硫键连接)按照同样处理后，加入到加药孔板中含有细胞的三个孔中，作为对照。
3)Fluo-4 AM孵育细胞完成后，用150μL Flex buffer清洗细胞，吸出后加入50μLFlex buffer，将细胞板、加药板和枪头放入Flexstation(Molecular Devices)机器中，机器内实时温度为37℃。20秒后通过自动进样器加入50μL两倍浓度的药物溶液。通过485nm荧光激发染料荧光基团发光，并记录525nm处的发射光。1分钟内，每隔1.5s秒记录一次荧光值，具体参见图4。
实验数据记录后，通过GraphPad prism处理后，得到催产素类似物和催产素的半最大效应浓度(EC50)分别为56nM和68nM。证实改造后催产素具有和原型相近或者略高的生物活性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种化合物，其为式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐，
Figure FDA0003630457100000011
其中，X为-S-CH2-R1-，R1为C1-C6亚烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1为亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚异丙基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有式(II)或式(III)所示的结构，
Figure FDA0003630457100000012
4.一种中间体化合物，其特征在于，具有式(IV)所示的结构，
Figure FDA0003630457100000013
其中，R2为-SH、R3为-R4-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-R4-CH＝CH2；
R4为无或C1-C5亚烷基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，R2为-SH、R3为-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-CH＝CH2。
6.一种制备式(I)所示化合物的方法，其特征在于，包含：
将式(IV)所示中间体化合物进行硫醇烯反应，以便得到所述式(I)所示化合物；
Figure FDA0003630457100000021
其中，X为-S-CH2-R1-；
R1为C1-C6亚烷基；
R2为-SH、R3为-R4-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-R4-CH＝CH2；
R4为无或C1-C5亚烷基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，R1为亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚异丙基；
任选地，R2为-SH、R3为-CH＝CH2，或R3为-SH、R2为-CH＝CH2；
任选地，所述式(IV)所示中间体化合物是通过固相合成法获得的；
任选地，所述固相合成法选自Fmoc固相合成法。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述硫醇烯反应包括：
将所述式(IV)所示中间体化合物在盐酸胍和光引发剂存在的条件下进行光照处理；
任选地，所述光照处理在光波长为365nm、光强度为(5-8)×105μJ/cm2的光照条件下进行0.5h-2h；
任选地，所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；
任选地，所述光引发剂与所述式(IV)所示中间体化合物的摩尔比为(0.2-1)：1；
任选地，所述式(IV)所示中间体化合物在所述盐酸胍和式(IV)所示中间体化合物的混合液中的终浓度为3-5mM；
任选地，进行所述硫醇烯反应之前，预先将所述式(IV)所示中间体化合物进行纯化处理；
任选地，所述纯化处理采用高效液相色谱纯化进行；
任选地，进一步将所述纯化处理得到的式(IV)所示中间体化合物进行冻干处理。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含：
权利要求1～3任一项所述的化合物或依据权利要求6～8任一项所述的方法制备的化合物；
任选地，所述组合物进一步包括：
药学上可接受的辅料。
10.权利要求1～3任一项所述的化合物、依据权利要求6～8任一项所述的方法制备的化合物或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗引产和产后出血或促进乳腺排乳。
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