[go: up one dir, main page]

CN115074389A - 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用 - Google Patents

稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115074389A
CN115074389A CN202210661981.9A CN202210661981A CN115074389A CN 115074389 A CN115074389 A CN 115074389A CN 202210661981 A CN202210661981 A CN 202210661981A CN 115074389 A CN115074389 A CN 115074389A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
plasmid
construction method
primer
pse5519
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210661981.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈瑞爱
杨泽坤
向程威
黄梅
王婷
杨洁
徐婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
South China Agricultural University
Original Assignee
Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd, South China Agricultural University filed Critical Zhaoqing Institute Of Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210661981.9A priority Critical patent/CN115074389A/zh
Publication of CN115074389A publication Critical patent/CN115074389A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/24052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。该构建方法包括：(1)采用构建重组质粒；(2)采用所述重组质粒转染细胞，得到重组细胞；(3)将重组细胞和慢病毒包装质粒共同培养，得到慢病毒样颗粒的培养液；(4)将慢病毒样颗粒的培养液感染宿主细胞，筛选得到稳定株，培养后获得细胞系。实施本发明，可稳定提升NS1mRNA和蛋白的表达水平。

Description

稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及尤其涉及一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法及其应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒(DTMUV)是一种能使感染禽类表现出减蛋综合征为主要症状的致病因子，它感染的宿主包括鸡、鸭、鹅、麻雀和鸽子。2010年上旬，DTMUV病最先在我国东南部地区爆发，并且在较短的时间内快速蔓延到中部乃至全国各地的鸭养殖地区。肉鸭感染后主要表现为共济失调，生长缓慢、精神萎靡、食欲废绝；感染蛋鸭主要表现为产蛋率长期低下，就算恢复后产下的种蛋的受精率和孵化率也会受到影响；感染病鸭临床症状表现为拉青色稀便，伴有四肢瘫痪，甩头等神经症状，死亡率为5％-25％。病鸭剖检后:肝脏有出血及稍微肿大；脾脏有均匀的如针尖状白色坏死点；卵巢会因感染时长的不同表现出出血、萎缩、坏死、龟裂；病理性切片观察可诊断为出血性卵巢炎。目前，DTMUV主要流行于我国大部分的养鸭养鹅地区，给中国的水禽养殖业造成巨大的经济损失。
NS1的分子量约为40kDa，由352个氨基酸组成。主要存在于感染的细胞内，但也可定位于细胞表面，可由细胞中缓慢分泌。在宿主信号肽酶的作用下，NS1易位到内质网中并从E蛋白中分离出来，该过程中，宿主的蛋白酶也有参与。有研究认为NS1在病毒复制的早期起作用，NS1和NS4A通过互作一同参与了RNA复制。NS1蛋白也属于病毒的主要抗原，能诱导细胞产生非中和抗体，同时伴随着补体反应。NS1能抑制宿主细胞I型IFNs的诱导来拮抗天然免疫反应，为病毒复制创造有利条件。该细胞系过表达NS1蛋白，可用于后续NS1蛋白功能互作方面的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法及其应用，其可稳定的表达NS1蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于钓取鸭坦布苏病毒中NS1基因的引物组合，其特征在于，包括引物一和引物二，所述引物一为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；所述引物二为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
相应的，本发明还公开了一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法，其包括：
(1)采用上述的引物组合构建重组质粒；
(2)采用所述重组质粒转染细胞，得到重组细胞；
(3)将重组细胞和慢病毒包装质粒共同培养，得到慢病毒样颗粒的培养液；
(4)将慢病毒样颗粒的培养液感染宿主细胞，筛选得到稳定株，培养后获得细胞系。
作为上述技术方案的改进，步骤(1)包括：
(1.1)采用上述的引物组合对NS1基因进行PCR扩增；
(1.2)将PCR扩增产物与经过酶切得到的PSE5519载体同源重组，并转化进入DH5α感受态细菌；
(1.3)将DH5α感受态细菌进行单克隆细菌扩增培养，分离得到PSE5519-NS1重组质粒。
作为上述技术方案的改进，步骤(1.2)中，采用BamHI-HF和XhoI对PMT406载体进行酶切，回收8537bp载体片段，得到PSE5519载体。
作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，所述细胞为BHK-21细胞。
作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，所述慢病毒包装质粒为pCMV-dR8.9质粒和pCMV-VSV-G质粒。
作为上述技术方案的改进，步骤(4)中，所述宿主细胞为BHK-21细胞。
相应的，本发明还公开了一种质粒，其为上述的PSE5519-NS1重组质粒。
相应的，本发明还公开了一种成套质粒，其包括上述的PSE5519-NS1重组质粒、pCMV-dR8.9质粒和pCMV-VSV-G质粒。
相应的，本发明还公开了上述的构建方法构建得到的细胞亚系下述(1)～(3)任一项中的应用：
(1)制备和/或筛选治疗鸭坦布苏病毒的药物；
(2)制备用于预防鸭坦布苏病毒的疫苗；
(3)用于检测鸭坦布苏病毒病毒的试剂盒。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明通过特定的引物组合，构建了稳定过表达NS1的载体PSE5519-NS1，并进一步构建了稳定表达鸭坦布苏病毒非结构蛋白NS1的细胞系。该细胞系可稳定表达NS1蛋白，与合适的缺失NS1的黄病毒反式互补，用于拯救缺失病毒，对生物等级安全高的黄病毒可实现低生物安全等级实验室操作。本发明的细胞系优势在于：NS1蛋白的表达量强，BHK细胞的稳定株puro抗性明显；荧光效率在90％以上，且经WB和QPCR检测有效。相比于CN109468281A，本细胞系在mRNA水平表达高效，并且不需要NS1特异性抗体也能检测到蛋白表达。
附图说明
图1是实施例1中工具载体PMT406的图谱；
图2是实施例1中载体PSE5519的图谱；
图3是实施例1中菌落PCR鉴定图；其中，M为DNA分子量标准，1-4为挑取的阳性转化子；
图4是实施例4中q-PCR检测结果图；
图5是实施例4中稳定株BHK-PSE5519荧光图片；
图6是实施例4中稳定株BHK-PMT406荧光图片；
图7是实施例4中westernblot试验结果图，其中，1为BHK-PMT406,2为BHK-PSE5519；
图8是实施例4中实施例4中westernblot试验结果图，其中，1为BHK-PMT406，2为BHK-PSE5519。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明实施例中使用的仪器，试剂如下：
超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；CO2恒温培养箱Forma 371(Thermo公司，美国)；生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；移液器Research plus(Eppendorf公司，德国)；高速离心机Centrifuge 5804R(Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000 Touch(Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽Mini Protean Tetra(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪Power Pac Basic(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)。
Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；BCA定量试剂盒购自Thermo(23227)；Flag(HRP)抗体购自YEASEN(30502ES60)；ACTIN抗体购自YEASEN(30103ES60)；TIAN prepMini Plasmid Kit购自Promega(A1460)；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；PBS购自GIBCO，(cat.no.14190)；Opti-MEM购自GIBCO(cat.no.31985)0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Prime STAR GXL(R050)购自TAKARA；TRIZOL RNA分离试剂购自Invitrogen；PrimeScriptRT Master Mix购自taraka；TaKaRa TB GreenTM Premix Ex TaqTM II购自takara；RT T4 DNA连接酶及其他常用限制性内切酶均购自TAKARA；抗DTMUV NS1蛋白抗体由南京金斯瑞生物有限购公司制备。
pCMV-dR8.9质粒和pCMV-VSV-G质粒，购自Addgene。大肠杆菌感受态细胞胞DH5α购自大连宝日医生物有限公司。
本发明实施例涉及的测序及引物合成均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1构建用于过表达NS1的质粒PSE5519-NS1
1.设计钓取NS1基因的引物；
Primer 1(+)：
5’-TGGCAAAGAATTGGATCCGCCACCATGGACACGGGGTGCTCA-3’。
Primer 2(－)：
5’-AGCCATGACCTTTGATTTGATC-3’。
该引物一(Primer 1，SEQ ID NO：1)、引物二(Primer 2，SEQ ID NO：2)用于PCR钓取目的基因NS1的序列。
Primer 3(+)
5’-CGGCTCTAGAGCCTCTGCTA-3’
Primer 4(－)
5’-CGTGAGTCAAACCGCTATCCAC-3’
该引物三(Primer 3，SEQ ID NO：3)、引物四(Primer 4，SEQ ID NO：4)用于菌落PCR鉴定转化子。将上述引物送生物工程公司合成。
2、PCR扩增目的基因片段；
具体的，PCR体系如下表所示：
试剂 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>O 32.5
5×Buffer(with Mg<sup>2+</sup>) 10
10×T4 Ligation Buffer 1
dNTP(各2.5mM) 4
Primer1(+)(10μM) 1
Primer2(－)(10μM) 1
Template 1
PrimeSTAR 0.5
PCR条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
3、将工具载体PMT406(参图1)用BamHI-HF和XhoI进行酶切，回收8537bp载体片段，得到PSE5519。
4、将PCR扩增的目的片段与线性化的PSE5519同源重组，具体配方如下表所示：
试剂 阳性对照/μL 自连对照/μL 连接组/μL
胶回收后的目的基因片段 4 4 4
线性化的表达载体 1 1 1
无缝克隆反应液 15 0 15
dd H2O Up to 20 Up to 20 Up to 20
混匀后在42℃孵育30分钟，然后转移到冰上。放置2-3分钟后取10μL反应液体转化到感受态细胞中。
说明：阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的基因片段是目的基因(带有同样的同源重组交换臂)
5、将上述连接产物直接用于转化DH5α感受态细菌，并按厂家说明书进行转化。转化完成后，挑取平板上长出的转化子重悬于10μL LB培养液中，从中取1μL做模板进行菌落PCR鉴定。并对菌落进行PCR鉴定；具体的：PCR体系如下表所示：
试剂 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>O 13.7
10×Buffer(with Mg<sup>2+</sup>) 2
dNTP(各2.5mM) 1.6
Primer3(+)(10μM) 0.8
Primer4(－)(10μM) 0.8
Template 1
Taq酶 0.1
PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
测定结果如图3所示，从图中可以看出，阳性克隆得到了1393bp的片段，而阴性克隆得到了0bp的片段。
6、挑取单克隆细菌扩增培养，并用TIAN prep Mini Plasmid Kit提取质粒，命名为PSE5519-NS1，并进行PCR测序。测序结果如SEQ NO：5所示，阳性克隆测序结果表明，和预期的目的基因序列基本一致。
实施例2慢病毒包装和纯化
1、细胞准备与转染
预先准备2个T10cm培养皿的293T细胞，细胞生长形态好。
培养基为DMEM+10％FBS，1％Glutamax，1％青霉素-链霉素。
将细胞分到10个10cm培养皿中，每瓶的细胞密度约1×107个。24h后，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为80-90％，分布均匀。
转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入9μL的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。
取两支无菌的1.5μL离心管，A管中加入100μg PSE5519-NS1质粒，65μgdR8.9包装质粒和35μg VSVG质粒，用Opti-MEM培养基补齐到5μL。静置5min。
B管中加入500μL Trans-EZ溶液和4.5μL Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到A管中，边加边轻轻晃匀。
室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。
取1支5μL的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板1μL。
来回晃动培养板，混匀后放回到5％二氧化碳培养箱。
6小时后，移去细胞上清，更换为10μL的DMEM完全培养基。转染后24h观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60–80％。
将细胞送回培养箱继续培养2天(36-48小时)。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
收集所有的上清，分装到50μL离心管中。4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。总的上清约为160μL，用60μL 0.22μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
2，慢病毒的浓缩和纯化
取6个ΜLtra-clear SW28离心管，用70％乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
每个ΜLtra-clear SW28离心管中加入约32μL的预先处理的病毒上清液。
取一支10μL的移液管，吸取12μL 20％的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4μL。同样地，将剩下8μL的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28超速离心转头中。4℃，25000rpm.(82700g)离心2小时。
小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。
每管中加入200μL不含血清的opti-MEM洗下沉淀。将SW28超速离心管插入到50μL锥底离心管中，盖上盖子。在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。用200μL移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
集中后的病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80℃。
实施例3筛选稳定表达NS1的BHK细胞
BHK细胞在T75培养皿培养至生长状态良好，弃培养液，加入2μL PBS清洗两遍。
加入2μL 0.25％胰酶消化细胞，细胞计数后铺6孔板，每孔30万个细胞。
12h后显微镜下观察细胞生长状态，按照MOI＝50使用慢病毒进行侵染。
侵染后8h换液，侵染后48H加嘌呤霉素进行筛选，浓度为2ug/μL，每两到三天换液。
持续筛选2周，得到稳定株，取样进行mRNA和WB检测。
实施例4 qPCR及western blot鉴定细胞系功能
本实施例采用实施例3得到的稳定株(命名：BHK-PSE5519)进行实验。此外，采用空白组(即将实施例2中转染过程中的质粒直接替换为PMT406质粒，命名：BHK-PMT406)进行实验，对照实验结果。
一、qPCR实验
细胞株冻存-80反复冻融3次后吸取300μL加700μL Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。
2、12000rpm离心5min，弃沉淀。
3、按200μL氯仿/μL Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
4、4℃12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。不要吸取中间界面；
6、按0.5μL异丙醇/μL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1μL 75％乙醇/μL Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。
11、50μLDEPC水溶解，55-60℃孵育5min。
12、RNA测定浓度后按照takara PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect RealTime)说明反转录成cDNA，使用TaKaRa TB GreenTM Premix Ex TaqTM II进行qPCR。其中，采用的引物序列、PCR体系如下两表所示
Figure BDA0003691081080000091
Figure BDA0003691081080000092
实验结果如下表及图4所示，从图中可以看出：目的病毒PSE5519感染BHK细胞样本，QPCR检测结果显示，NS1基因有显著的过表达效果。NS1基因过表达稳定株构建成功。
定量数值及分析(2-ΔΔCt分析法)
Figure BDA0003691081080000093
二、Western Blot实验
收细胞，弃去细胞培养液，按细胞量加入适量的1×Lysis Buffer、4℃裂解细胞10-15min。
用细胞刮把细胞刮下，并转移至相对应标记好的1.5μL EP管中，冰浴10～15min。
4℃，12000g，离心5min，缓慢吸取上清至相对应标记好的1.5μLEP管中。BCA法蛋白定量，计算蛋白浓度。
处理蛋白样品：加入5*Loading Buffer，95℃-100℃加热5min，-20℃保存备用。
配制SDS-PAGE
1)取等体积分离胶缓冲液和分离胶溶液混匀，即取两种溶液各2.0/2.7/4.0μL。
2)往步骤1)中的混合溶液中加入40/60/80μL的改良型过硫酸铵溶液，混匀。
3)将步骤2)中的溶液注入制胶玻璃板中，加入适量水或乙醇覆盖于分离胶之上。
4)待分离胶凝固后，倒去上层水或醇。
5)取1.0/1.5/2.0μL浓缩胶预混液，加入10/15/20μL的改良型过硫酸铵溶液，混匀。
6)注入制胶玻璃板中，插入梳齿。待浓缩胶凝固后，拔去梳齿即可用于电泳。
电泳
1)上样：把胶装在电泳槽中夹好，加足够的1*电泳液后开始准备上样。
2)电泳：两块胶恒流25mA-30mA，3h左右。
3)登记：在上样记录本上记录上样顺序和抗体稀释比例等信息。
免疫印迹(湿转)
转膜：把夹板放入转移电泳装置中，加入合适的1*转移缓冲液，在冰浴中，400mA恒流条件下电转120min，进行转膜。
免疫显色
封闭：配制封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)，PVDF膜要完全浸没在封闭液中，室温封闭2h
一抗孵育：4度孵育过夜。
洗膜：把PVDF膜取出来，放入培养皿中，加入适量1*TBST溶液，放在脱色摇床上轻摇，洗膜3次，每次10min
二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h
洗膜：1*TBST洗膜3次，每次10min。
ECL显色：在凝胶成像系统上显色。
实验结果如图5～图8所示，从图中可以看出，试验组BHK-PSE5519NS1蛋白表达良好。
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Figure BDA0003691081080000121
Figure BDA0003691081080000131
Figure BDA0003691081080000141
序列表
<110> 华南农业大学
华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司
<120> 稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcaaagaa ttggatccgc caccatggac acggggtgct ca 42
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccatgacc tttgatttga tc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggctctaga gcctctgcta 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtgagtcaa accgctatcc ac 22
<210> 5
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg 60
gatccgccac catggacacg gggtgctcaa tcgacttggc taggaaagaa ttgaaatgtg 120
gacaaggcat gtttgtcttc aacgatgttg aggcttggaa ggataattat aagtactatc 180
catccacacc aaggagactt gccaaagtcg tggcagaagc tcatgaggct ggaatttgtg 240
gcatacgatc agtcagcagg ctcgagcaca acatgtgggt aagcatcaaa catgagttga 300
acgcgatctt ggaagacaac gccattgact tgactgtggt ggttgaagaa aatcctggaa 360
gatacaggaa aaccaatcag aggctgccga acgttgatgg agagctcatg tacggatgga 420
agaaatgggg gaaaagtatt tttagcagcc cgaagatgtc aaataataca tttgtcatcg 480
atggaccaaa aactaaagag tgcccagatg agagaagagc atggaatagt atgaagattg 540
aagactttgg gtttggagtg ttgtccacaa aggtatggat ggaaatgcga acagaaaata 600
caactgattg tgacaccgca gtaatgggca cagcaattaa aggaaataga gctgtgcaca 660
gtgacctgag ctattggata gagagcaaga ataatggaag ctggaaactg gagagagctg 720
tgctgggcga ggtgaagtca tgcacatggc cggaaaccca cacactgtgg agtgacagcg 780
ttgtggagag tgaactcatc atacctaaaa cattgggagg accgaagagt catcacaaca 840
cgaggacagg atacaaggtt cagagttccg gaccgtggga tgagaaagag attgtaatag 900
acttcgacta ctgccctgga acaactgtca cagtaacgag ctcgtgccgc gacagagggc 960
cttcagctag gacaacaaca gcgagtggga aactgataac agattggtgt tgtaggtctt 1020
gcaccacccc accactgaga tttgttacaa aaagtggatg ctggtatggg atggaaattc 1080
ggccaactgc tcacggagac gacatgttga tcaaatcaaa ggtcatggct gactacaagg 1140
atgacgatga caaggattac aaagacgacg atgataagga ctataaggat gatgacgaca 1200
aataactcga gactagtatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 1260
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttg 1308

Claims (10)

1.一种用于钓取鸭坦布苏病毒中NS1基因的引物组合，其特征在于，包括引物一和引物二，所述引物一为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；所述引物二为核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
2.一种稳定表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的细胞系的构建方法，其特征在于，包括：
(1)采用如权利要求1所述的引物组合构建重组质粒；
(2)采用所述重组质粒转染细胞，得到重组细胞；
(3)将重组细胞和慢病毒包装质粒共同培养，得到慢病毒样颗粒的培养液；
(4)将慢病毒样颗粒的培养液感染宿主细胞，筛选得到稳定株，培养后获得细胞系。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括：
(1.1)采用如权利要求1或如权利要求2所述的引物组合对NS1基因进行PCR扩增；
(1.2)将PCR扩增产物与经过酶切得到的PSE5519载体同源重组，并转化进入DH5α感受态细菌；
(1.3)将DH5α感受态细菌进行单克隆细菌扩增培养，分离得到PSE5519-NS1重组质粒。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1.2)中，采用BamHI-HF和XhoI对PMT406载体进行酶切，回收8537bp载体片段，得到PSE5519载体。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞为BHK-21细胞。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述慢病毒包装质粒为pCMV-dR8.9质粒和pCMV-VSV-G质粒。
7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述宿主细胞为BHK-21细胞。
8.质粒，其特征在于，其为如权利要求3所述的PSE5519-NS1重组质粒。
9.成套质粒，其特征在于，其包括如权利要求3所述的PSE5519-NS1重组质粒和如权利要求6所述的pCMV-dR8.9质粒、pCMV-VSV-G质粒。
10.如权利要求2所述的构建方法构建得到的细胞亚系下述(1)～(3)任一项中的应用：
(1)制备和/或筛选治疗鸭坦布苏病毒的药物；
(2)制备用于预防鸭坦布苏病毒的疫苗；
(3)用于检测鸭坦布苏病毒病毒的试剂盒。
CN202210661981.9A 2022-06-13 2022-06-13 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用 Pending CN115074389A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210661981.9A CN115074389A (zh) 2022-06-13 2022-06-13 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210661981.9A CN115074389A (zh) 2022-06-13 2022-06-13 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115074389A true CN115074389A (zh) 2022-09-20

Family

ID=83251977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210661981.9A Pending CN115074389A (zh) 2022-06-13 2022-06-13 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115074389A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1757934A1 (en) * 2005-08-26 2007-02-28 Buddhist Tzu Chi General Hospital Method for screening compounds against flaviviruses by using persistent virus-infected cell system
CN106085964A (zh) * 2016-06-03 2016-11-09 山东农业大学 一种鸭坦布苏病毒ns1蛋白单克隆抗体及其识别的b细胞表位及其应用
CN107190024A (zh) * 2017-06-07 2017-09-22 辽宁大学 一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法
CN109468281A (zh) * 2018-11-19 2019-03-15 安徽农业大学 一种能够稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的bhk-21细胞系及其构建方法
CN111727259A (zh) * 2017-12-01 2020-09-29 编码治疗公司 工程化的dna结合蛋白
CN113322282A (zh) * 2021-04-20 2021-08-31 华南农业大学 稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1及其构建方法和应用
CN114196683A (zh) * 2021-12-13 2022-03-18 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1757934A1 (en) * 2005-08-26 2007-02-28 Buddhist Tzu Chi General Hospital Method for screening compounds against flaviviruses by using persistent virus-infected cell system
CN106085964A (zh) * 2016-06-03 2016-11-09 山东农业大学 一种鸭坦布苏病毒ns1蛋白单克隆抗体及其识别的b细胞表位及其应用
CN107190024A (zh) * 2017-06-07 2017-09-22 辽宁大学 一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法
CN111727259A (zh) * 2017-12-01 2020-09-29 编码治疗公司 工程化的dna结合蛋白
CN109468281A (zh) * 2018-11-19 2019-03-15 安徽农业大学 一种能够稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的bhk-21细胞系及其构建方法
CN113322282A (zh) * 2021-04-20 2021-08-31 华南农业大学 稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1及其构建方法和应用
CN114196683A (zh) * 2021-12-13 2022-03-18 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINFENG TI等: "Identification of one B-cell epitope from NS1 protein of duck Tembusu virus with monoclonal antibodies", PLOS ONE *
张帆帆等: "鸭坦布苏病毒病的研究进展", 畜牧兽医学报 *
提金凤等: "坦布苏病毒ＮＳ１蛋白的表达及ＥＬＩＳＡ 检测方法的建立", 畜牧兽医学报 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111172114B (zh) 一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用
CN112410290B (zh) 一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用
TW201105794A (en) Reversibly immortalized cells as well as methods relating thereto
CN107190024A (zh) 一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法
CN107164409B (zh) 犬瘟热病毒敏感细胞系slam-mdck及其构建方法和应用
CN104694576B (zh) 一种沉默df‑1细胞系中ifnar1基因的方法
CN111549059A (zh) Tpl2基因敲除hek293t细胞系及其构建方法和应用
CN108486156B (zh) 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
Pu et al. Development of pseudotyped retroviral system for effective gene transfer and expression in penaeid shrimp cells
CN104212837B (zh) 表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法
CN113322282A (zh) 稳定表达NS1蛋白的犬肾细胞系MDCK-pCDH-NS1及其构建方法和应用
CN105039268A (zh) 表达鸭坦布苏病毒e蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用
CN110577934B (zh) 敲低tlr4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用
CN115074389A (zh) 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用
Sid et al. Reinstatement of RIG-I in chickens via genetic modification reveals new insights into the dynamic evolution of avian immune sensors
CN117448329A (zh) 一种干扰小胶质细胞中NLRP3蛋白表达的shRNA及其应用
CN110129272A (zh) 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
CN106065401B (zh) 慢病毒介导cxcr7高表达工程化内皮祖细胞在缺血性疾病中的治疗应用
CN104726490A (zh) 表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法
CN114836474A (zh) 草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用
CN103695427B (zh) 用于敲低vps11的小分子干扰rna、重组载体及其应用
CN114672460A (zh) 一种靶向cd44的异质型cic细胞模型的制备方法及应用
CN112980887A (zh) 一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途
CN104762325B (zh) 一种沉默df‑1细胞系中ifnar2基因的方法
CN117887765B (zh) 一种慢病毒介导的稳定表达irf2细胞系及其构建方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220920