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CN115060905B - 瓜尔豆胶的应用、荧光增强型金纳米簇和α-葡萄糖苷酶检测及酶抑制剂筛选的方法 - Google Patents

瓜尔豆胶的应用、荧光增强型金纳米簇和α-葡萄糖苷酶检测及酶抑制剂筛选的方法 Download PDF

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CN115060905B CN202210655257.5A CN202210655257A CN115060905B CN 115060905 B CN115060905 B CN 115060905B CN 202210655257 A CN202210655257 A CN 202210655257A CN 115060905 B CN115060905 B CN 115060905B
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Abstract

本发明提供了瓜尔豆胶的应用、荧光增强型金纳米簇和α‑葡萄糖苷酶检测及酶抑制剂筛选的方法，属于纳米生物传感技术领域。本发明提供了瓜尔豆胶在提高金纳米簇荧光强度中的应用。在本发明中，瓜尔豆胶是一种从豆科植物瓜尔豆种子中提取的天然高分子聚合物，具有价格低廉、无毒以及生物相容性好的优点；瓜尔豆胶主要由半乳糖和甘露糖组成，其分子骨架中富含大量的羟基，可以提高金纳米簇荧光发射强度，在此基础上能够高灵敏度、低成本实现α‑葡萄糖苷酶活性检测及α‑葡萄糖苷抑制剂筛选，且环境友好，操作简单，避免了荧光探针的修饰以及大量有机试剂的使用，在糖尿病的预防和治疗中具有广阔的应用前景。

Description

瓜尔豆胶的应用、荧光增强型金纳米簇和α-葡萄糖苷酶检测 及酶抑制剂筛选的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物传感技术领域，尤其涉及瓜尔豆胶的应用、荧光增强型金纳米簇和α-葡萄糖苷酶检测及酶抑制剂筛选的方法。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，会对眼、肾脏、心脏和血管造成持续性损害。糖尿病可分为I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠期糖尿病。II型糖尿病与胰岛素分泌不足或抵抗有关，占目前糖尿病患者的90％以上，影响全球约4.63亿人。α-葡萄糖苷酶(α-Glu)是一种碳水化合物水解酶，能促进小肠内低聚糖和双糖转化为葡萄糖，过量的α-Glu会导致高血糖。近年来研究发现，α-Glu抑制剂可以有效降低α-Glu活性，从而有效抑制血糖水平升高。目前，α-Glu成为预防和治疗II型糖尿病的重要酶靶点，阿卡波糖等α-Glu抑制剂已成为治疗II型糖尿病的少数口服药物。因此，α-Glu活性检测和α-Glu抑制剂筛选，特别是从天然产物中筛选廉价、副作用小的α-Glu抑制剂对于II型糖尿病的预防和治疗具有极为重要的意义。
α-Glu活性检测和α-Glu抑制剂筛选的经典方法是对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷比色法，此方法的缺点是灵敏度低、干扰大。新型的α-Glu活性测定方法包括高效液相色谱法、表面等离子体共振法、电化学法以及荧光法等，其中，以纳米探针(如半导体量子点、碳量子点或铜纳米簇)为基础的荧光法因具有高灵敏度和快速检测的特点而备受关注。但此类方法往往存在荧光探针制备复杂、测量范围窄、稳定性差、易氧化以及易受干扰等问题。因此，开发更高效的α-Glu荧光检测和α-Glu抑制剂筛选方法仍然是一个巨大的挑战。
金纳米簇是一种新型的荧光纳米材料，其尺寸通常小于3nm，由几个到几百个金原子(或金离子)和保护配体构成。金纳米簇具有制备简单、生物相容性好、稳定性好、水溶性好等特点，在荧光传感、生物成像、药物传递和疾病治疗等领域具有广阔的应用前景。然而，与经典荧光染料和半导体量子点相比，金纳米簇的荧光量子产率和荧光强度普遍偏低，限制了金纳米簇的应用范围。目前，金属掺杂、聚集诱导荧光增强、基质包覆域等方法已用于改善金纳米簇的荧光性能，然而这些方法多需使用大量有机溶剂、重金属离子等，存在污染环境的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供瓜尔豆胶的应用、荧光增强型金纳米簇和检测α-Glu及筛选α-Glu抑制剂的方法，本发明利用瓜尔豆胶可以提高金纳米簇荧光发射强度，在此基础上能够实现高灵敏度、低成本检测α-Glu活性及筛选α-Glu抑制剂，且环境友好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种瓜尔豆胶在提高金纳米簇荧光强度中的应用。
优选地，所述金纳米簇的保护配体为谷胱甘肽。
本发明提供了一种荧光增强型金纳米簇，制备原料包括金纳米簇、瓜尔豆胶和水。
本发明提供了一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，包括以下步骤：
提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中荧光增强型金纳米簇为上述技术方案所述荧光增强型金纳米簇；
将待测α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第一孵育，得到第一孵育液；
将所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第二孵育，得到第二孵育液；
将所述第二孵育液进行荧光检测，根据α-葡萄糖苷酶活性的工作曲线与荧光检测所得荧光强度，得到待测α-葡萄糖苷酶的活性。
优选地，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中金纳米簇的浓度为10～90μg/mL，瓜尔豆胶的浓度为0.05～1.0wt.％，Fe3+的浓度为0.1～100μmol/L；所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的pH值为4.0～9.0。
优选地，所述第一孵育的温度为30～50℃，时间为40～60min；进行所述第一孵育时体系的pH值为6.0～8.0，L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的浓度为1～20mmol/L。
优选地，所述第二孵育的温度为20～30℃，时间为10～60min；所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的体积比为1：(1～10)。
优选地，所述荧光检测在波长为610nm条件下进行。
本发明提供了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中荧光增强型金纳米簇为上述技术方案所述荧光增强型金纳米簇；
将待测α-葡萄糖苷酶抑制剂溶液、α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第三孵育，得到第三孵育液；
将所述第三孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第四孵育，得到第四孵育液；
将所述第四孵育液进行荧光检测，根据荧光检测所得荧光强度绘制待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线，根据待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线得到待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的半抑制浓度，实现α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。
优选地，所述待测α-葡萄糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖或植物提取物α-葡萄糖苷酶抑制剂。
本发明提供了一种瓜尔豆胶在提高金纳米簇荧光强度中的应用。在本发明中，瓜尔豆胶是一种从豆科植物瓜尔豆种子中提取的天然高分子聚合物，具有价格低廉、无毒以及生物相容性好的优点；瓜尔豆胶主要由半乳糖和甘露糖组成，其分子骨架中富含大量的羟基，可以提高金纳米簇荧光发射强度，在此基础上能够高灵敏度、低成本实现α-葡萄糖苷酶活性检测及α-葡萄糖苷抑制剂筛选，且环境友好，操作简单，避免了荧光探针的修饰以及大量有机试剂的使用，在糖尿病的预防和治疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中金纳米簇分散液与瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液(所用瓜尔豆胶分散液的pH＝8.0，浓度为0.6wt.％)的荧光光谱；
图2为实施例2中不同浓度瓜尔豆胶分散液对金纳米簇荧光发射强度的影响结果图；
图3为实施例2中不同pH值瓜尔豆胶分散液对金纳米簇荧光发射强度的影响结果图；
图4为实施例3中不同浓度Fe3+对瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液的荧光发射强度的影响结果图；
图5为实施例4中瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的荧光光谱图；
图6为实施例4中检测α-Glu活性的工作曲线；
图7为实施例5中不同干扰物(阳离子、阴离子、葡萄糖、果糖、蔗糖以及胆固醇)对瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的影响结果图；
图8为实施例5中不同干扰物(氨基酸以及蛋白质)对瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的影响结果图；
图9为实施例6中筛选α-Glu抑制剂(阿卡波糖)的校正曲线；
图10为实施例7中筛选α-Glu抑制剂(槲皮素)的校正曲线；
图11为实施例7中筛选α-Glu抑制剂(芦丁)的校正曲线；
图12为实施例7中筛选α-Glu抑制剂(橘皮苷)的校正曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种瓜尔豆胶在提高金纳米簇荧光强度中的应用。
在本发明中，若无特殊说明，所涉及的原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。
在本发明中，所述金纳米簇的保护配体优选为谷胱甘肽。在本发明中，所述金纳米簇与瓜尔豆胶的质量比优选为1：(2～60)，更优选为1：(5～30)，进一步优选为1：10。本发明利用瓜尔豆胶能够提高金纳米簇的荧光强度，具体的，在含金纳米簇的水分散体系中添加瓜尔豆胶，能够提高金纳米簇的荧光强度。在本发明中，瓜尔豆胶是一种从豆科植物瓜尔豆种子中提取的天然高分子聚合物，具有价格低廉、无毒以及生物相容性好的优点；瓜尔豆胶主要由半乳糖和甘露糖组成，其分子骨架中富含大量的羟基，在水中极易形成氢键，从而能够有效改变水分散体系的性质，具体能够通过延长溶剂重新定向时间以及抑制金纳米簇保护配体的分子内振动和转动，使得金纳米簇的辐射跃迁速率升高、非辐射跃迁速率降低，进而有效提升金纳米簇的荧光发射强度。
本发明优选将瓜尔豆胶分散液与金纳米簇分散液混合，以此通过瓜尔豆胶提高金纳米簇的荧光强度。
在本发明中，所述瓜尔豆胶分散液中瓜尔豆胶的浓度优选为0.05～1.0wt.％，具体可以为0.1wt.％、0.2wt.％、0.3wt.％、0.4wt.％、0.5wt.％、0.6wt.％、0.7wt.％、0.8wt.％、0.9wt.％或1.0wt.％；所述瓜尔豆胶分散液的溶剂优选包括水，为了便于调控pH值，所述瓜尔豆胶分散液的溶剂更优选为Tris缓冲溶液，所述Tris缓冲溶液的浓度优选为10mmol/L，pH值优选为4.0～9.0，具体可以为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0。本发明优选在室温(25℃)条件下，将瓜尔豆胶与Tris缓冲溶液混合，搅拌均匀，得到瓜尔豆胶分散液。
在本发明中，所述金纳米簇分散液中金纳米簇的浓度优选为0.1～1mg/mL，更优选为0.6mg/mL；所述金纳米簇分散液的溶剂优选为水。在本发明中，所述金纳米簇分散液的制备方法，优选包括以下步骤：将四氯金酸水溶液、保护配体水溶液与水混合，在搅拌条件下进行反应，得到金纳米簇分散液。在本发明中，所述四氯金酸水溶液优选为新配制的四氯金酸水溶液，所述四氯金酸水溶液的浓度优选为20μmol/L；所述保护配体水溶液的浓度优选为100μmol/L；所述四氯金酸水溶液、保护配体水溶液与水的体积比优选为0.5：0.15：4.35，所述水优选为超纯水，所述四氯金酸水溶液、保护配体水溶液与水混合优选在室温条件下进行。在本发明中，所述反应的温度优选为70℃，时间优选为12h；所述搅拌的转速优选为500rpm。在本发明中，所述反应过程中，反应体系的颜色由淡黄色渐变为亮黄色。在本发明中，当采用谷胱甘肽作为保护配体时，其同时还起到还原剂的作用，无需使用昂贵的蛋白保护配体以及外加还原剂。
得到瓜尔豆胶分散液与金纳米簇分散液后，本发明优选将所述瓜尔豆胶分散液与金纳米簇分散液混合，得到瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液。将所述瓜尔豆胶分散液与金纳米簇分散液混合后，本发明优选将所得体系静置，以实现各组分充分混合，得到均一、稳定的瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液。在本发明中，所述静置优选在室温条件下进行，所述静置的时间优选为10min。
得到瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液后，本发明对所述瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液进行荧光检测。在本发明中，所述荧光检测优选在波长为610nm的条件下进行。本发明通过采用瓜尔豆胶可以显著增强金纳米簇的荧光发射强度；在本发明的实施例中，以50μL金纳米簇分散液(浓度为0.6mg/mL)与500μL瓜尔豆胶分散液混合后所得瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液为例，当瓜尔豆胶分散液的浓度为0.6wt.％、pH值为8.0时，金纳米簇的荧光发射强度提高近4倍，荧光量子产率由0.96％提高到2％。
本发明提供了一种荧光增强型金纳米簇，制备原料包括金纳米簇、瓜尔豆胶和水；为了便于调控pH值，所述制备原料优选包括金纳米簇、瓜尔豆胶和Tris缓冲溶液。在本发明中，所述荧光增强型金纳米簇优选为上述技术方案所述瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液，在此不再赘述。
本发明提供了一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，包括以下步骤：
提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中荧光增强型金纳米簇为上述技术方案所述荧光增强型金纳米簇；
将待测α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第一孵育，得到第一孵育液；
将所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第二孵育，得到第二孵育液；
将所述第二孵育液进行荧光检测，根据α-葡萄糖苷酶活性的工作曲线与荧光检测所得荧光强度，得到待测α-葡萄糖苷酶的活性。
本发明提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液。在本发明中，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中金纳米簇的浓度优选为10～90μg/mL，更优选为40～60μg/mL，进一步优选为54μg/mL；瓜尔豆胶的浓度优选为0.05～1.0wt.％，更优选为0.2～0.6wt.％；Fe3+的浓度优选为0.1～100μmol/L，更优选为0.36～90μM，进一步优选为18μmol/L；所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的pH值优选为4.0～9.0，更优选为6.0～8.0。本发明优选将瓜尔豆胶分散液、金纳米簇分散液与Fe3+溶液混合，得到荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液。在本发明中，所述瓜尔豆胶分散液与金纳米簇分散液优选为上述技术方案所述瓜尔豆胶分散液与金纳米簇分散液，在此不再赘述。在本发明中，所述Fe3+溶液中Fe3+的浓度优选为0.1～10mmol/L，更优选为0.5～1mmol/L；所述Fe3+溶液的溶质优选为FeCl3·6H2O，溶剂优选为盐酸，所述盐酸的浓度优选为0.1～1mol/L，更优选为0.1～0.5mol/L，本发明优选采用盐酸作为溶剂，目的是抑制Fe3+在水溶液中的水解。在本发明的实施例中，具体是将50μL金纳米簇分散液(浓度为0.6mg/mL)与500μL瓜尔豆胶分散液(pH＝8.0，浓度为0.6wt.％)混合，室温条件下静置10min，然后加入10μL浓度为1mmol/L的Fe3+溶液(溶质为FeCl3·6H2O，溶剂为浓度为0.1mol/L的盐酸)，室温条件下孵育10min，得到荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液。在本发明中，所述Fe3+的存在会使金纳米簇荧光淬灭。
本发明将待测α-葡萄糖苷酶(α-Glu)溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷(AAG)溶液与磷酸缓冲液混合，进行第一孵育，得到第一孵育液。在本发明中，进行所述第一孵育时体系的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0；AAG的浓度优选为1～20mmol/L，更优选为2～7mmol/L，进一步优选为3～5mmol/L。在本发明中，所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.05～0.2mol/L，更优选为0.1mol/L，pH值优选为7.0。在本发明的实施例中，具体是将100μL待测α-Glu溶液、150μLAAG溶液(浓度为10mmol/L)与200μL磷酸缓冲溶液(浓度为0.1mol/L，pH＝7.0)混合，进行第一孵育。在本发明中，所述第一孵育的温度优选为30～50℃，更优选为37℃；时间优选为40～60min，更优选为40～50min；所述第一孵育优选在静置条件下进行。在本发明中，所述第一孵育过程中，AAG在α-Glu的催化下产生抗坏血酸。
得到第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液后，本发明将所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第二孵育，得到第二孵育液(即瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液)。在本发明中，所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的体积比优选为1：(1～10)，更优选为1：(1～3)，进一步优选为1：(1.2～1.5)。在本发明中，所述第二孵育的温度优选为20～30℃，更优选为室温；时间优选为10～60min，更优选为10～20min。在本发明中，抗坏血酸能有效恢复被Fe3+淬灭的金纳米簇荧光。
得到第二孵育液后，本发明将所述第二孵育液进行荧光检测，根据α-葡萄糖苷酶活性的工作曲线与荧光检测所得荧光强度，得到待测α-葡萄糖苷酶的活性。在本发明中，所述荧光检测优选在波长为610nm条件下进行。在本发明中，Fe3+通过动态猝灭会使得金纳米簇荧光淬灭，在α-Glu及其底物AAG的存在下，α-Glu催化AAG水解产生抗坏血酸，能够部分恢复被Fe3+猝灭的金纳米簇的荧光发射，因此可以基于荧光方法检测α-Glu活性。在本发明中，所述α-葡萄糖苷酶活性的工作曲线具体为荧光强度比值(I/I0)与α-葡萄糖苷酶活性(logCα-Glu)的线性曲线，其中，I为第二孵育液的荧光强度(即第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合经第二孵育后的荧光强度)，I0为空白分散液的荧光强度，所述空白分散液具体是将待测α-Glu溶液以及AAG溶液替换成等体积水，然后按照上述方法依次经第一孵育以及第二孵育制备得到。本发明根据第二孵育液的荧光强度可以获知荧光强度比值(I/I0)，进而能够得到待测α-葡萄糖苷酶的活性。采用本发明提供的方法检测α-葡萄糖苷酶的活性，检测范围为2～4000U/L，检测限为0.13U/L，具有较宽的检测范围和较低的检测限，而且本发明提供的方法避免了荧光探针的修饰以及大量有机试剂的使用。
本发明提供了一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中荧光增强型金纳米簇为上述技术方案所述荧光增强型金纳米簇；
将待测α-葡萄糖苷酶抑制剂溶液、α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第三孵育，得到第三孵育液；
将所述第三孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第四孵育，得到第四孵育液；
将所述第四孵育液进行荧光检测，根据荧光检测所得荧光强度绘制α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线，根据α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线得到待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的半抑制浓度，实现α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。
本发明提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，在本发明中，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液优选为上述技术方案所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，在此不再赘述。
本发明将待测α-葡萄糖苷酶抑制剂溶液、α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第三孵育，得到第三孵育液。在本发明中，进行所述第三孵育时体系的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0；α-Glu的浓度优选为1～10U/mL，更优选为2～4U/mL；AAG的浓度优选为1～20mmol/L，更优选为2～7mmol/L，进一步优选3～5mmol/L。在本发明中，所述磷酸缓冲液的浓度优选为0.05～0.2mol/L，更优选为0.1mol/L，pH值优选为7.0。在本发明的实施例中，具体是将20μL待测α-Glu抑制剂溶液、100μLα-Glu溶液(浓度为10U/mL)、150μLAAG溶液(浓度为10mmol/L)与200μL磷酸缓冲溶液(浓度为0.1mol/L，pH＝7.0)混合，进行第三孵育。在本发明中，所述第三孵育的条件优选与第一孵育的条件相同，在此不再赘述。
得到第三孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液后，本发明将所述第三孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第四孵育，得到第四孵育液。在本发明中，所述第三孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的体积比优选为1：(1～10)，更优选为1：(1～3)，进一步优选为1：(1～1.2)。在本发明中，所述第四孵育的条件优选与第二孵育的条件相同，在此不再赘述。
得到第四孵育液后，本发明将所述第四孵育液进行荧光检测，根据荧光检测所得荧光强度绘制待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线，根据待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线得到待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的半抑制浓度，实现α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。在本发明中，所述荧光检测优选在波长为610nm条件下进行。在本发明中，所述待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线优选为待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效率(％)与待测α-葡萄糖苷酶抑制剂浓度的线性曲线。本发明根据第四孵育液的荧光强度可以获知α-葡萄糖苷酶的活性，进而能够得到待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效率，之后优选以待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的浓度为横坐标、对应的抑制效率为纵坐标，绘制待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线，从所述待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线中读取抑制50％α-葡萄糖苷酶活性时对应的待测α-葡萄糖苷酶抑制剂浓度，即半抑制浓度(IC50)，在此基础上可以实现α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。在本发明中，所述待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效率优选参照式A计算得到：
抑制效率＝[IAuNCs+α-Glu–IAuNCs+α-Glu+待测α-葡萄糖苷酶抑制剂]/[IAuNCs+α-Glu–IAuNCs] 式A；
式A中，IAuNCs+α-Glu表示瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的荧光强度；
IAuNCs+α-Glu+待测α-葡萄糖苷酶抑制剂表示第四孵育液的荧光强度；
IAuNCs表示荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的荧光强度。
本发明提供的方法适用于多种α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选，所述α-葡萄糖苷酶抑制剂优选包括阿卡波糖或植物提取物α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述植物提取物α-葡萄糖苷酶抑制剂优选包括槲皮素、芦丁、橙皮苷、黄芩苷或茶黄素。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1金纳米簇分散液和瓜尔豆胶分散液的制备
制备金纳米簇分散液，包括以下步骤：
将新配制的0.50mL浓度为20μmol/L的四氯金酸水溶液、0.15mL浓度为100μmol/L的谷胱甘肽(GSH)水溶液和4.35mL超纯水在室温(25℃)条件下混合，在500rpm搅拌速率条件下，将所得混合物料加热至70℃，保温反应12h，反应体系的颜色由淡黄色渐变为亮黄色，得到金纳米簇分散液，所述金纳米簇分散液中金纳米簇(GSH-AuNCs)以谷胱甘肽作为保护配体，所述金纳米簇分散液中金纳米簇的浓度为0.6mg/mL。
配制不同浓度以及pH值的瓜尔豆胶分散液，包括以下步骤：
称取0、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg瓜尔豆胶粉末(GG，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，在室温条件下与100mL浓度为10mM且pH值为8.0的Tris缓冲溶液混合，搅拌均匀，得到pH值为8.0且瓜尔豆胶浓度分别为0、0.1wt.％、0.2wt.％、0.3wt.％、0.4wt.％、0.5wt.％、0.6wt.％、0.7wt.％、0.8wt.％、0.9wt.％、1.0wt.％的瓜尔豆胶分散液；
称取6份质量为600mg的瓜尔豆胶粉末，在室温条件下，将其与100mL浓度为50mM且pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的Tris缓冲溶液混合，搅拌均匀，得到瓜尔豆胶浓度为0.6wt.％且pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的瓜尔豆胶分散液。
以下实施例中采用的金纳米簇分散液以及瓜尔豆胶分散液均来自本实施例，后续不再特殊说明。
实施例2荧光增强型金纳米簇分散液的制备
将50μL金纳米簇分散液分别与500μL不同浓度或pH值的瓜尔豆胶分散液混合，室温条件下静置10min，测定所得瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液的荧光光谱，记录在610nm处的荧光发射强度，并与金纳米簇分散液的荧光发射强度进行比较。
图1为金纳米簇分散液与瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液(所用瓜尔豆胶分散液的pH＝8.0，浓度为0.6wt.％)的荧光光谱，其中，a为金纳米簇分散液的荧光光谱，b为瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液的荧光光谱。结果显示，瓜尔豆胶的加入能够显著增强金纳米簇的荧光发射强度。
图2为不同浓度瓜尔豆胶分散液对金纳米簇荧光发射强度的影响结果图，其中I0为金纳米簇分散液在610nm处的荧光强度，I为瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液在610nm处的荧光强度。结果显示，当瓜尔豆胶分散液浓度在0.1～0.6wt.％范围内时均可增强金纳米簇的荧光强度，最佳的荧光增强效应是浓度为0.6wt.％的瓜尔豆胶分散液，此时金纳米簇的荧光强度提高近4倍，荧光量子产率由0.96％提高到2％；之后进一步增加瓜尔豆胶浓度，金纳米簇的荧光增强效应略有减弱。
图3为不同pH值瓜尔豆胶分散液对金纳米簇荧光发射强度的影响结果图，其中I0为金纳米簇分散液在610nm处的荧光强度，I为瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液在610nm处的荧光强度。结果显示，当瓜尔豆胶分散液的pH值在4.0～9.0范围内时，瓜尔豆胶可以提高金纳米簇的荧光发射强度，瓜尔豆胶分散液最适宜的pH值为8.0。
综上，所优选的荧光增强型金纳米簇分散液的制备方法为：将50μL金纳米簇分散液与500μL瓜尔豆胶分散液(pH＝8.0，浓度为0.6wt.％)混合，室温条件下静置10min，得到荧光增强型金纳米簇分散液。
实施例3荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的制备
向实施例2制备的550μL荧光增强型金纳米簇分散液中加入10μL不同浓度的Fe3+溶液(溶质为FeCl3·6H2O，溶剂为浓度为0.1M的盐酸)，室温条件下孵育10min，得到瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液；所述瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液中Fe3+的浓度分别为0.36μM、1.1μM、1.6μM、3.6μM、10μM、14μM、18μM、36μM、54μM、72μM、90μM。
Fe3+通过动态猝灭会使得金纳米簇荧光淬灭。图4为不同浓度Fe3+对瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液的荧光发射强度的影响结果图，其中I0为瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液在610nm处的荧光强度，I为瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液在610nm处的荧光强度。由图4可知，瓜尔豆胶-金纳米簇混合分散液的发射强度随着Fe3+浓度的增加而逐渐降低，并在Fe3+的浓度为18μM时达到平台期。
综上，所优选的荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的制备方法为：将50μL金纳米簇分散液与500μL瓜尔豆胶分散液(pH＝8.0，浓度为0.6wt.％)混合，室温条件下静置10min，向所得荧光增强型金纳米簇分散液中加入10μL浓度为1mM的Fe3+溶液(溶质为FeCl3·6H2O，溶剂为浓度为0.1M的盐酸)，室温条件下孵育10min，得到荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液。
实施例4 α-Glu活性检测方法
将100μL不同浓度的α-Glu水溶液、150μLAAG(10mM)水溶液与200μL磷酸缓冲溶液(0.1M，pH＝7.0)混合，在37℃静置40min进行第一孵育，将所得第一孵育液与实施例3制备的560μL荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液(即瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液)混合，室温条件下静置10min进行第二孵育，测定所得瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液(即第二孵育液)的荧光光谱，记录610nm处的荧光强度；所述瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液中α-Glu浓度分别为2×10-4U/mL、2×10-3U/mL、0.1U/mL、0.25U/mL、1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL和5U/mL。
同时，制备空白样品，具体是将250μL水与200μL磷酸缓冲溶液(0.1M，pH＝7.0)混合，在37℃静置40min，之后将所得溶液与实施例3制备的560μL荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，室温条件下静置10min，得到空白样品。
在α-Glu及其底物AAG的存在下，α-Glu催化AAG水解产生抗坏血酸，能够部分恢复被Fe3+猝灭的金纳米簇的荧光发射，因此可以基于荧光方法检测α-Glu活性。图5为瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的荧光光谱图，图6为检测α-Glu活性的工作曲线(I0为空白样品在610nm处的荧光强度，I为瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液在610nm处的荧光强度)。由图6可知，瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的荧光强度随α-Glu活性增高而上升，α-Glu活性的检测范围为2～4000U/L，检测限为0.13U/L。α-Glu活性检测的经典方法为对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷比色法，其检测限为2.5～50U/L，线性范围为1U/L。与经典方法相比，本发明提供的方法具有更宽的检测范围和更低的检测限，而且本发明提供的方法避免了荧光探针的修饰以及大量有机试剂的使用。
实施例5 α-Glu活性检测方法的选择性验证
为了验证α-Glu活性检测方法的选择性，本实施例测试了生物样品中可能存在的多种干扰物质对检测体系的影响，所述干扰物质包括氨基酸(Ala、Arg、Gly、His、Lys、Ser以及Cys)、阳离子(Na+、K+、Ca2+以及Fe2+)、阴离子(Cl-、NO3 -、SO4 2-以及PO4 3-)、蛋白质(BSA、HSA、ACP以及pap)、葡萄糖(Glu)、果糖(Fru)、蔗糖(Suc)以及胆固醇(Chol)。
将实施例4制备的450μL第一孵育液与实施例3制备的560μL荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，再加入10μL上述各种干扰物质的水分散液，所得混合料液中各种干扰物质的浓度均为10mmol/L；将所述混合料液在室温条件下静置10min进行孵育，测定所得孵育液的荧光光谱，记录610nm处的荧光强度。
同时，制备空白样品，具体是将实施例4制备的450μL第一孵育液与实施例3制备的560μL荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，再加入10μL水，室温条件下静置10min，得到空白样品。
图7和图8为空白样品和不同干扰物存在条件下瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液在610nm处的荧光强度，由图可知，各干扰物质对本发明所述的荧光增强型金纳米簇对α-Glu的荧光检测均不会产生明显的干扰作用，表明本发明方法具有优异的选择性。
实施例6 α-Glu抑制剂筛选
阿卡波糖是一种常见的α-Glu抑制剂，也是少数几种能用于治疗II型糖尿病治疗的口服药物。本实施例以阿卡波糖为例，研究本发明方法在α-Glu抑制剂筛选中的应用，具体步骤如下：
将100μLα-Glu(10U/mL)水溶液、150μLAAG(10mM)水溶液、200μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.0)与20μL不同浓度的α-Glu抑制剂(阿卡波糖)混合，于37℃静置40min进行第三孵育；将所得第三孵育液与实施例3制备的560μL荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液(即瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液)混合，室温条件下静置10min进行第四孵育，测定所得瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu-阿卡波糖混合分散液(即第四孵育液)的荧光光谱，记录610nm处的荧光强度；所述瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu-阿卡波糖混合分散液中阿卡波糖的浓度分别为20μM、50μM、80μM、120μM、180μM和200μM。
根据不同浓度阿卡波糖条件下第四孵育液的荧光强度，按照式B计算阿卡波糖的抑制效率：
抑制效率＝[IAuNCs+α-Glu–IAuNCs+α-Glu+阿卡波糖]/[IAuNCs+α-Glu–IAuNCs] 式B；
式B中，IAuNCs+α-Glu表示瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3++α-Glu混合分散液的荧光强度；
IAuNCs+α-Glu+阿卡波糖表示第四孵育液的荧光强度；
IAuNCs表示瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液的荧光强度。
图9为筛选α-Glu抑制剂(阿卡波糖)的校正曲线，如图所示，阿卡波糖能够抑制α-Glu的活性，随着阿卡波糖浓度的增加，体系的荧光强度逐渐降低。
由图9可知，阿卡波糖的IC50(抑制50％α-Glu活性时所需的待测抑制剂浓度)为87.3μM，与现有文献资料(Li,C.；etal.Anal.Bioanal.Chem.2021,413(9):2553-2563)一致。这说明本发明提供的方法能够有效用于阿卡波糖的筛选。
实施例7植物提取物α-Glu抑制剂筛选
槲皮素、芦丁以及橙皮苷(市售商品)为植物提取物α-Glu抑制剂，本发明提供的方法可以用于植物提取物α-Glu抑制剂的筛选。本实施例首先以槲皮素为例，研究本发明方法在植物提取物α-Glu抑制剂筛选中的应用，具体步骤如下：
将100μLα-Glu(10U/mL)水溶液、150μLAAG(10mM)水溶液、200μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.0)与20μL不同浓度的α-Glu抑制剂(槲皮素)混合，于37℃静置40min进行第三孵育；将所得第三孵育液与实施例3制备的560μL荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液(即瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液)混合，室温条件下静置10min进行第四孵育，测定所得瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu-槲皮素混合分散液(即第四孵育液)的荧光光谱，记录610nm处的荧光强度；所述瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu-槲皮素混合分散液中槲皮素浓度分别为6μM、8μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM。
根据不同浓度槲皮素条件下第四孵育液的荧光强度，按照式C计算槲皮素的抑制效率：
抑制效率＝[IAuNCs+α-Glu–IAuNCs+α-Glu+槲皮素]/[IAuNCs+α-Glu–IAuNCs] 式C；
式C中，IAuNCs+α-Glu表示瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+-α-Glu混合分散液的荧光强度；
IAuNCs+α-Glu+槲皮素表示第四孵育液的荧光强度；
IAuNCs表示瓜尔豆胶-金纳米簇-Fe3+混合分散液的荧光强度。
图10为筛选α-Glu抑制剂(槲皮素)的校正曲线，如图所示，槲皮素能够抑制α-Glu的活性，随着槲皮素浓度的增加，体系的荧光强度逐渐降低。
由图10可知，槲皮素的IC50为33.4μM，与现有文献资料(Liu，D.；etal.2020.Colloids Surf.,B)一致。这说明本发明提供的方法能够有效用于槲皮素的筛选。
按照上述方法计算芦丁和橙皮苷的抑制效率并绘制校正曲线，如图11～12所示，根据图11～12可知，芦丁和橙皮苷的IC50分别为56.43μM和101.2μM，这些结果与文献报道(Liu，D.；etal.2020.Colloids Surf.,B)非常吻合，进一步证明了本发明方法的可靠性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，包括以下步骤：
提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中荧光增强型金纳米簇的制备原料包括金纳米簇、瓜尔豆胶和水；
将待测α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第一孵育，得到第一孵育液；
将所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第二孵育，得到第二孵育液；
将所述第二孵育液进行荧光检测，根据α-葡萄糖苷酶活性的工作曲线与荧光检测所得荧光强度，得到待测α-葡萄糖苷酶的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中金纳米簇的浓度为10~90 μg/mL，瓜尔豆胶的浓度为0.05~1.0 wt.%，Fe3+的浓度为0.1~100 μmol/L；所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的pH值为4.0~9.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一孵育的温度为30~50℃，时间为40~60 min；进行所述第一孵育时体系的pH值为6.0~8.0，L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的浓度为1~20 mmol/L。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，所述第二孵育的温度为20~30℃，时间为10~60 min；所述第一孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液的体积比为1：（1~10）。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光检测在波长为610 nm条件下进行。
6.一种筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
提供荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液，所述荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液中荧光增强型金纳米簇的制备原料包括金纳米簇、瓜尔豆胶和水；
将待测α-葡萄糖苷酶抑制剂溶液、α-葡萄糖苷酶溶液、L-抗坏血酸-2-O-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液与磷酸缓冲液混合，进行第三孵育，得到第三孵育液；
将所述第三孵育液与荧光增强型金纳米簇-Fe3+混合分散液混合，进行第四孵育，得到第四孵育液；
将所述第四孵育液进行荧光检测，根据荧光检测所得荧光强度绘制待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线，根据待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的校正曲线得到待测α-葡萄糖苷酶抑制剂的半抑制浓度，实现α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测α-葡萄糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖或植物提取物α-葡萄糖苷酶抑制剂。
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