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CN115054733B - 丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法及其应用 - Google Patents

丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法及其应用 Download PDF

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CN115054733B CN202210785355.0A CN202210785355A CN115054733B CN 115054733 B CN115054733 B CN 115054733B CN 202210785355 A CN202210785355 A CN 202210785355A CN 115054733 B CN115054733 B CN 115054733B
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Abstract

本发明提供了一种丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，通过先将丝素蛋白纳米颗粒粉体依次浸泡于含钙离子和磷酸根离子的溶液中进行辅助矿化反应，辅助矿化反应过程中丝素蛋白纳米颗粒表面产生成核位点，可促进羟基磷灰石在丝素蛋白纳米颗粒上生长，同时，也有利于后续矿化过程的进行；然后，将辅助矿化后的丝素蛋白纳米颗粒粉体浸泡于模拟体液中进行矿化反应，即可在丝素蛋白纳米颗粒粉体上自组装形成羟基磷灰石晶体，冷冻干燥后最终制得丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。本发明制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料可直接应用于人体体内，且具有生物相容性好、稳定性好及可诱导骨修复的特性。

Description

丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法及其应用。
背景技术
人体骨中羟基磷灰石占据了很大一部分，其中人体骨骼中含羟基磷灰石60％，牙釉质中含97％，牙本质中含70％。因其优异的生物学性能而被用于生物医用材料，由于羟基磷灰石与牙釉质中天然的棒状纳米羟基磷灰石的成分和结构几乎相同，并易与牙釉质/牙本质相容，因而羟基磷灰石能直接替代丢失的矿物质，填充牙釉质表面微观裂痕，促进牙齿微观损伤自然愈合，恢复牙齿表面光滑也被用于口腔护理材料，是一种非磨蚀性矿物，以微纳米颗粒呈现，粒径越小，口腔护理效果越显著；与色素结合力强，能吸附/抑制细菌和牙菌斑碎片，消炎止血效果显著；亦能渗透到牙齿脱矿病变的底部，补充被牙菌斑酸溶解的矿物质，恢复牙齿矿物质密度，并封闭牙本质小管，实现抑菌、再矿化修复和脱敏，有效预防龋齿，增强牙釉质半透明性、光泽度和白度。在载药上，与有机材料复合后载药可直接用于骨缺损部位，不仅可以起到支撑骨缺损的目的，还可通过药物的缓慢释放抑制细菌及肿瘤细胞生长，促进骨愈合。
现有技术中，申请号为202010962656.7，公开日为2021年1月1日，名称为“一种骨组织修复材料及其制备方法和应用”的发明专利中公开了先在天然高分子上沉积羟基磷灰石，得到羟基磷灰石-天然高分子纳米复合颗粒，然后使上述混合颗粒与天然高分子溶液混合，再经冷冻干燥得到骨组织修复材料。但是，上述技术方案中在天然高分子表面直接原位矿化，由于制备过程中是使用化学试剂进行的，因而在应用于人体时易出现异体反应，另外，上述矿化过程时间长，制备效率低。
现有技术中，申请号为201410372692.2，公开日为2021年1月1日，名称为“一种通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法”的发明专利中公开了先将丝素蛋白膜浸泡于CaCl2溶液中对丝素蛋白膜进行预矿化，然后再将预矿化后的丝素蛋白膜浸泡于羟基磷灰石溶液中进行矿化。上述制备过程中可有效避免羟基磷灰石副产物的生成，并能提高丝蛋白膜的力学性能，但是，上述丝蛋白膜矿化后需经过繁琐的后处理过程，才能够应用于体内；另外，上述制备过程中先利用含钙离子的溶液进行预矿化，后续加入羟基磷灰石溶液的矿化液后，矿化液中的羟基磷灰石可直接与吸附在丝素蛋白上的钙离子结合，该过程有利于羟基磷灰石在沉积丝蛋白膜上沉积，但是上述过程得到的丝蛋白膜上的羟基磷灰石的钙磷比与人体正常骨相比更大，因而在用于人体体内时与人体组织的相容性不高。
有鉴于此，有必要设计一种改进的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法及其应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法及其应用。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、将一定质量浓度的丝素蛋白溶液冷冻固化得到丝素蛋白冷冻体，再经退火处理、解冻过滤及冷冻干燥后，制得丝素蛋白纳米颗粒粉体；
S2、在一定的浴比下，使步骤S1中制得的所述丝素蛋白纳米颗粒粉体与模拟体液进行矿化反应，即制得丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。
优选的，在步骤S2中，进行所述矿化反应之前，需对所述丝素蛋白纳米颗粒粉体进行辅助矿化处理，具体通过如下步骤进行：将所述丝素蛋白纳米颗粒粉体依次浸泡于含钙离子和含磷酸根离子的溶液中。
优选的，在步骤S2中，所述浴比为(1：500)～(1：1500)。
优选的，在步骤S2中，所述丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的尺寸为30～3000nm；所述矿化反应的时间为2～7天。
优选的，在步骤S1中，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.05～0.8wt％；所述退火处理的温度为-20～0℃，处理时间为12～96h。
优选的，在步骤S1中，所述模拟体液按人体体液的成分的1～5倍进行配制。
优选的，所述含钙离子溶液为浓度为100～200mM的CaCl2的水溶液，所述含磷酸根离子溶液为浓度为100～200mM的Na2HPO4水溶液；优选的，在所述含钙离子溶液中浸泡的时间为5～30min，在所述含磷酸根离子溶液中浸泡的时间为5～30min。
优选的，在步骤S2中，所述矿化反应在37～40℃的振荡箱中进行，且每隔12～36h需对反应液进行离心换液；优选的，所述矿化反应在恒温的条件下进行。
优选的，在步骤S2中，所述丝素蛋白纳米颗粒浸泡于所述含钙离子溶液和所述含磷酸根离子溶液中后均需经离心和清洗后再进行后续步骤，所述离心过程的转速为4000～8000r/min，离心时间为5～10min，离心温度为25～37℃。
特别的，本发明还提供了所述的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的应用，所述丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料能够被用于牙修复、口腔护理及载药上。
本发明的有益效果是：
1、本发明提出的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，通过先将丝素蛋白纳米颗粒粉体依次浸泡于含钙离子和磷酸根离子的溶液中进行辅助矿化反应，辅助矿化反应过程中丝素蛋白纳米颗粒表面产生成核位点，可促进羟基磷灰石在丝素蛋白纳米颗粒上生长，同时，也有利于后续矿化过程的进行；然后，将辅助矿化后的丝素蛋白纳米颗粒粉体浸泡于模拟体液中进行矿化反应，即可在丝素蛋白纳米颗粒粉体上自组装形成羟基磷灰石晶体，冷冻干燥后最终制得丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。通过上述方式，制得无需进行后处理即可直接应用于人体体内的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料，有效解决了现有技术中复合微纳米颗粒材料用于体内前需进行处理的问题。
2、本发明提出的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，以丝素蛋白分子作为羟基磷灰石组装的模板可促进羟基磷灰石晶体的生长，并能充分利用丝素蛋白良好生物相容性、生物活性及生物可降解性等优势，制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料可诱导骨修复；通过先进行辅助矿化反应再进行矿化反应，辅助矿化反应过程中矿化液中的钙离子会优先吸附到丝素蛋白上与丝素蛋白氨基酸侧链上的羧基进行结合，随着磷酸根离子的引入磷酸根离子与丝素蛋白表面的钙离子进一步结合生成羟基磷灰石晶体，该过程可使丝素蛋白上的羧基和钙离子结合得更充分，有效提高了复合纳米颗粒中的羟基磷灰石的钙磷比，且上述辅助矿化产生了成核位点，进而加快了羟基磷灰石的形成与结晶，有效缩短了矿化反应的反应时间，同时，也有利于后续仿生矿化过程的进行；另外，通过预矿化处理可改变丝素蛋白的表面结构，从而调控羟基磷灰石的形貌和生长，以加快羟基磷灰石的形成和结晶；通过利用模拟体液进行矿化处理，可使最终制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的性能更为接近人体正常骨，使其能够更好地与人体组织相容，有效地避免了材料在应用的过程中发生异体反应。通过上述方式，制得具有生物相容性好、稳定性好及可诱导骨修复的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料，并能有效解决现有技术中制得的羟基磷灰石的复合材料与人体相容性不高和矿化过程耗时长的问题。
附图说明
图1为本发明的实施例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的SEM图；
图2为本发明的实施例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的XRD图；
图3为本发明的实施例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的IR图；
图4为本发明的实施例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的TG图；
图5为本发明的实施例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的细胞毒性检测数据图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
请参阅图1所示，本发明提供的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、丝素蛋白纳米颗粒粉体的制备：将一定质量浓度的丝素蛋白溶液冷冻固化得到丝素蛋白冷冻体后，再经退火处理、解冻过滤及冷冻干燥后，制得丝素蛋白纳米颗粒粉体；
S2、丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的生成：在搅拌的条件下，将步骤S1中制得的丝素蛋白纳米颗粒依次浸泡于含钙离子和磷酸根离子的溶液中5～30min，利用上述预处理对丝素蛋白纳米颗粒粉体进行辅助矿化反应；然后，在一定的浴比下，使预处理后的丝素蛋白纳米颗粒粉体与模拟体液进行矿化反应，即制得丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。
优选的，在步骤S1中，丝素蛋白溶液的质量浓度为0.05～0.8wt％，当丝素蛋白的浓度处于上述范围时，得到的丝素蛋白纳米颗粒的大小均一、颗粒完整；其中，丝素蛋白溶液通过如下方式制得：
将100g生丝浸入5L质量百分数为0.1％的碳酸钠溶液中，于100℃煮沸处理30min，重复两次，第三次将前两次处理后的丝浸入5L质量百分数为0.05％的碳酸钠溶液中，于100℃煮沸处理30min，使生丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；接着，将处理好的丝素纤维浸入到配好的摩尔比为1：2：8的无水氯化钙/无水乙醇/去离子水三元溶液中，72℃溶解一个小时；冷却后，将溶解后的溶液倒入截留分子量为9～14kDa的透析袋中，用去离子水透析，除去分子量小于9～14kDa的分子；透析结束后用纱布过滤即得到丝素溶液；然后，将制得的丝素蛋白溶液倒入离心管内，离心以除去聚集物和气泡，置于4℃冰箱中储存备用，并且通过干燥质量法测定其浓度，最后将丝素溶液稀释至所需浓度。
优选的，在步骤S1中，退火处理的温度为-20～0℃，处理时间为12～96h，退火处理的目的在于诱导丝素蛋白的组装和结构转变。
优选的，在步骤S2中，模拟体液按人体体液的成分的1～5倍进行配制。
优选的，在步骤S2中，含钙离子溶液为浓度为100～200mM的CaCl2的水溶液；含磷酸根离子溶液为浓度为100～200mM的Na2HPO4水溶液。
优选的，在步骤S2中，丝素蛋白纳米颗粒浸泡于含钙离子溶液和含磷酸根离子溶液中后均需经离心和清洗后再进行后续步骤，离心过程的转速为4000～8000r/min，离心时间为5～10min，温度为25～37℃。
优选的，在步骤S2中，制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的尺寸为30～3000nm。
优选的，在步骤S2中，矿化反应在37～40℃的振荡箱中进行，矿化反应过程在恒温的条件下进行，且每隔12～36h需对反应液进行离心换液。
优选的，在步骤S2中，浴比为(1：500)～(1：1500)，本发明中的浴比指颗粒粉体的质量与模拟体液的体积的比，单位为g/mL；当浴比处于上述范围时，可使矿化时间和矿化度均能保持在合适的水平。
优选的，在步骤S2中，矿化时间为2～7天。
特别地，本发明提供的方法制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料，可被用于牙修复、口腔护理及载药上。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
S1、丝素蛋白纳米颗粒粉体的制备：
将质量浓度为0.4wt％的丝素蛋白溶液置于液氮条件下冷冻固化得到丝素蛋白冷冻体后，然后将丝素蛋白冷冻体经退火处理、解冻过滤及冷冻干燥后，制得丝素蛋白纳米颗粒粉体；其中，退火处理在-4℃冰箱中进行，退火处理的时间为48h，退火处理过程中可诱导丝素蛋白发生结构转变；
其中，丝素蛋白溶液通过如下方式制得：将100g生丝浸入5L质量百分数为0.1％的碳酸钠溶液中，于100℃煮沸处理30min，重复两次，第三次将前两次处理后的丝浸入5L质量百分数为0.05％的碳酸钠溶液中，于100℃煮沸处理30min，使生丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；接着，将处理好的丝素纤维浸入到配好的摩尔比为1：2：8的无水氯化钙/无水乙醇/去离子水三元溶液中，72℃溶解一个小时；冷却后，将溶解后的溶液倒入截留分子量为9～14kDa的透析袋中，用去离子水透析，除去分子量小于9～14kDa的分子；透析结束后将用纱布过滤后得到丝素溶液，然后，将制得的丝素蛋白溶液倒入离心管内，离心以除去聚集物和气泡，置于4℃冰箱中储存备用，并且通过干燥质量法测定其浓度，最后将丝素溶液稀释浓度至0.4wt％；
S2、丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的生成
在搅拌的条件下，将步骤S1中制得的丝素蛋白纳米颗粒先浸泡于质量浓度为150mM的CaCl2溶液中5～30min，离心后取出用去离子水将多于的CaCl2溶液除去，然后再将洗净的丝素蛋白纳米颗粒浸泡于质量浓度为150mM的Na2HPO4溶液中5～30min，并重复上述清洗和离心的步骤，得到预处理的丝素蛋白纳米颗粒，其中，离心过程的转速为8000r/min，离心时间为5min，温度为25℃；完成上述步骤后，使预处理的丝素蛋白纳米颗粒和1.5倍的模拟体液在37℃的恒温振荡箱中进行矿化反应，预处理的丝素蛋白纳米颗粒与模拟体液的浴比为1：1000，反应时间为2天，反应结束后冷冻干燥即制得丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。实施例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的XRD图和IR图如图2和图3所示，从图2中可以看到，丝素蛋白纳米颗粒上自组装形成羟基磷灰石晶体后，丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料内保留了丝素蛋白纳米颗粒的特征衍射峰，同时还出现羟基磷灰石的特征峰，结果表明丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的成功制备；从图3中可以看到，在丝素蛋白纳米颗粒上自组装形成羟基磷灰石晶体前后，图谱的峰型未发生大的变化，表明丝素蛋白纳米颗粒上自组装形成的羟基磷灰石后未改变丝素蛋白纳米颗粒的结构。图4为丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的TG图，结果表明在丝素蛋白上自组装形成的羟基磷灰石后，可提升纳米颗粒的热稳定性与氧化稳定性。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于：不经过辅助矿化反应，使丝素蛋白纳米颗粒粉体在模拟体液中矿化形成丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒，其他步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。实施例2中的矿化时间为5天，较实施例1的2天更长，且得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒中的羟基磷灰石的矿化度、均匀度及稳定性均不如实施例1中制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于：不在丝素蛋白纳米颗粒上自组装羟基磷灰石，其他步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。
为比较实施例1与对比例1制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的毒性，利用上述复合微纳米颗粒在同一条件下对骨细胞进行无毒性测试，另外，测试过程中还考虑了复合微纳米颗粒材料的浓度对细胞毒性的影响。测试结果如图5所示，本发明采用吸光度值的差异比值来反应骨细胞的活力，从图中可以看到，在实施例1和对比例1的纳米颗粒存在的条件下，两个测试中的细胞活性均在80％以上，说明实施例1和对比例1中制得的纳米颗粒均不具有细胞毒性；随着浓度的增加，细胞活性都逐渐提高，浓度为0.1mg/mL和0.5mg/mL时，复合纳米颗粒的细胞活性略高于纯的丝素蛋白纳米颗粒的细胞活性，但当浓度达到1mg/mL时，复合纳米颗粒的细胞活性明显高于纯的丝素蛋白纳米颗粒的细胞活性，结果表明：与纯的丝素蛋白纳米颗粒相比丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒更能促进成骨细胞的生长，且随着浓度的增加，丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒更利于骨细胞生长。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于：对比例2中仅将丝素蛋白纳米颗粒粉体浸泡于CaCl2溶液中进行辅助矿化反应，其他步骤与实施例1基本相同，在此不再赘述。上述辅助矿化过程中，Ca2+离子先吸附于丝素蛋白上，而后体液中的Ca2+和HPO4 2-进一步在丝素蛋白上自组装形成羟基磷灰石，该过程制得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的钙磷比低于实施例1制得的复合微纳米颗粒材料。因此，对比例2中制得的复合微纳米颗粒的骨细胞细胞活性低于实施例1制得的复合微纳米颗粒的骨细胞细胞活性。
综上所述，本发明提供的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，通过先将丝素蛋白纳米颗粒粉体依次浸泡于含钙离子和磷酸根离子的溶液中进行辅助矿化反应，辅助矿化反应过程中丝素蛋白纳米颗粒表面产生成核位点，可加快羟基磷灰石晶体的形成和结晶，有效缩短了矿化反应的反应时间，同时，也有利于后续矿化过程的进行；然后，使矿化后的丝素蛋白纳米颗粒粉体与模拟体液进行矿化反应，即可在丝素蛋白纳米颗粒粉体上自组装形成羟基磷灰石，冷冻干燥后最终制得丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。通过上述方式，制得具有生物相容性好、稳定性好及可诱导骨修复的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将一定质量浓度的丝素蛋白溶液冷冻固化得到丝素蛋白冷冻体，再经退火处理、解冻过滤及冷冻干燥后，制得丝素蛋白纳米颗粒粉体，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.05~0.8wt%；所述退火处理的温度为-20~0℃，处理时间为12~96h；
S2、先将所述丝素蛋白纳米颗粒粉体依次浸泡于含钙离子和含磷酸根离子的溶液中，进行辅助矿化处理，所述含钙离子溶液为浓度为100~200mM的CaCl2的水溶液，所述含磷酸根离子溶液为浓度为100~200mM的Na2HPO4水溶液，所述丝素蛋白纳米颗粒粉体在所述含钙离子溶液中浸泡的时间为5~30min，所述丝素蛋白纳米颗粒粉体在所述含磷酸根离子溶液中浸泡的时间为5~30min；再在一定的浴比下，使步骤S1中制得的所述丝素蛋白纳米颗粒粉体与模拟体液进行矿化反应，冷冻干燥后即制得尺寸为30~3000nm的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料，所述模拟体液按人体体液的成分的1~3倍进行配制。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述浴比为（1：500）~（1：1500）。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述矿化反应的时间为2~7天。
4.根据权利要求1所述的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述矿化反应在37~40℃的振荡箱中进行，且每隔12~36h需对反应液进行离心换液；所述矿化反应在恒温的条件下进行。
5.根据权利要求4所述的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述丝素蛋白纳米颗粒浸泡于所述含钙离子溶液和所述含磷酸根离子溶液中后均需经离心和清洗后再进行后续步骤，所述离心过程的转速为4000~8000r/min，离心时间为5~10min，离心温度为25~37℃。
6.根据权利要求1~5中任一权利要求所述的丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料的应用，其特征在于，所述丝素蛋白/羟基磷灰石复合微纳米颗粒材料能够被用于制备牙修复、口腔护理及载药材料上。
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