CN115029322B - 一株多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一株多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。该噬菌体命名为Kp_phage_507，保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 20211633。本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507潜伏期短，爆发量大，能快速杀死培养基中的宿主菌，且对温度和酸碱耐受范围广，宿主谱较宽，具有良好的亲水性，易制成注射剂。经动物试验证实，该噬菌体毒副作用小，安全性高，对多药耐药肺炎克雷伯菌感染有很好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是一种条件致病性革兰氏阴性肠杆菌，常定值于人体的胃肠道、皮肤和鼻咽部，当机体免疫力低下时，可引起肺炎、肝脓肿、尿路感染、伤口感染、败血症等。肺炎克雷伯菌已经成为感染的重要病原体。
头孢菌素、氟喹诺酮和甲氧苄啶-磺胺甲氧异恶唑是抗肺炎克雷伯菌感染的常用药物，但随着大量抗生素的广泛使用，肺炎克雷伯菌对这些抗生素的耐药现象非常普遍，并出现了大量的多药耐药菌株。碳青霉烯类抗生素被认为是多药耐药肺炎克雷伯菌感染治疗的最后一道防线，但2001年首次报道了对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌。大量流行病学调查研究显示，耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌已呈世界性流行趋势，给临床治疗带来了极大挑战。肺炎克雷伯菌的耐药问题已对公共卫生构成重大威胁。
噬菌体是一种能特异性感染细菌的病毒，是一种天然抗菌物，能产生降解细菌表面多糖的蛋白酶。噬菌体对细菌感染的潜在治疗作用在1919年就首次得到确认并应用。但由于研究人员对噬菌体特性的不了解使早期的噬菌体治疗存在诸多问题，且20世纪40年代以后抗生素发展迅速，导致噬菌体治疗被逐渐忽视。1980年后，耐药性细菌不断涌现，使传统的抗生素治疗面临极大的挑战，且新型抗生素的研发速度也明显减慢。因此，噬菌体疗法再次进入研究人员的视野。噬菌体疗法，即通过裂解性噬菌体进入宿主菌并在其体内进行繁殖进而杀死宿主菌，来达到治疗该宿主菌引起的疾病的效果。噬菌体疗法或成为对抗“超级细菌”的利器。
但是由于噬菌体的宿主特异性使得其抗菌谱过窄，因此必须针对每一个病例做出个性化治疗，而不能采取单一的治疗。因此不断分离新的噬菌体并对其进行基本的生物学特性和抗菌潜力分析，是发展噬菌体生物制剂的首要前提，也只有这样，才能适应细菌生物物种的多样性和不断突变所产生的新物种。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一株多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。该噬菌体Kp_phage_507潜伏期短，爆发量大，能快速杀死培养基中的宿主菌，且对温度和酸碱耐受范围广，宿主谱较宽，具有良好的亲水性，易制成注射剂。能为多药耐药肺炎克雷伯菌感染的治疗提供新的技术手段。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供了一株多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，所述噬菌体命名为Kp_phage_507，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20211633。
进一步，所述噬菌体为长尾噬菌体。
进一步，所述噬菌体能耐受70℃高温；所述噬菌体的最适pH为4～11；所述噬菌体生长的潜伏期为0-20min，爆发期为20-100min，100min后进入平台期。
进一步，所述噬菌体的裂解谱较宽，可裂解27株临床分离多药耐药肺炎克雷伯菌中的23株。
更进一步，所述噬菌体能够裂解的23株多药耐药肺炎克雷伯菌的菌株编号分别为Kpn-ESBL-u1、507、346、676、491、Kpn-87、Kpn-90、Kpn-93、Kpn-96、Kpn-106、Kpn-110、K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9、K10、ATCC BAA-2146、ATCC BAA-1705。
进一步，所述噬菌体在感染数1～0.001的范围内均可有效的抑制其宿主菌的生长。
本发明提供了一种包含上述噬菌体的噬菌体制剂。
进一步，所述制剂为药物、清洁剂或消毒剂。
本发明还提供了一种上述噬菌体的应用，用于制备预防或治疗多药耐药肺炎克雷伯菌感染的制剂。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明提供了一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507，其潜伏期短，爆发量大，能快速杀死培养基中的宿主菌，且对温度和酸碱耐受范围广，宿主谱较宽，具有良好的亲水性，易制成注射剂。经动物试验证实，该噬菌体毒副作用小，安全性高，对多药耐药肺炎克雷伯菌感染有很好的治疗效果。
附图说明
图1是本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的噬菌斑图片。
图2是本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的透射电镜图。
图3是本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的一步生长曲线图。
图4是温度对本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的活性影响示意图。
图5是酸碱度对本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的活性影响示意图。
图6是本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507培养基中杀菌示意图。
图7是本发明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507大蜡螟治疗效果示意图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。
实施例涉及的菌株、试剂及培养基：
实验所用宿主菌均为多药耐药肺炎克雷伯菌临床株507。
脑心浸液(BHI)液体培养基：称取3.6g BHI于100mL蒸馏水中，121℃，20min高压灭菌。
脑心浸液(BHI)半固体培养基：称取3.6g BHI，0.75g琼脂于100mL蒸馏水中，121℃，20min高压灭菌。
脑心浸液(BHI)固体培养基：称取3.6g BHI，1.5g琼脂于100mL蒸馏水中，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
素琼脂固体培养基：称取1.5g琼脂于100mL蒸馏水中，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
SM缓冲液：称取6.055g Tris于20mL蒸馏水溶解，使用浓盐酸调节pH为7.5，定容至50mL，然后加入5.8g NaCl和2g MgSO4，溶解后定容至1L，121℃，20min高压灭菌。
实施例1
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的分离及纯化
(1)以多药耐药肺炎克雷伯菌临床分离株507为宿主菌进行噬菌体的分离及纯化。将宿主菌划线接种于BHI固体培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12-18h后，挑取单克隆接种于5mL BHI液体培养基中，37℃振荡培养至对数期作为宿主菌培养物备用。
(2)采集某医院未处理的污水，将污水用双层滤纸过滤，10000rpm离心20min，取上清用0.22μm的滤器过滤，收集滤液；取滤液与宿主菌于BHI液体培养基中共培养过夜后，离心取上清，用0.22μm的滤器过滤，收集滤液即得到噬菌体原液。
(3)取100μL对数生长期宿主菌，接种在55-60℃的半固体BHI培养基中充分混匀制备双层平板，待凝固后，将上述噬菌体原液滴于平板上，自然晾干后37℃倒置培养12-18h，观察点板处是否有空斑形成。若有空斑形成，显示有特异性噬菌体存在。
(4)取得到的噬菌斑，加至对数生长期的宿主菌中，37℃160rpm培养10-12h后，10000rpm离心5min，用0.22μm的滤器过滤得到噬菌体原液；用SM液将噬菌体原液连续10倍稀释，分别取10-2、10-4、10-6、10-8的稀释液100μL与对数期菌液500μL混合，室温孵育10min，加入50℃左右的半固体BHI培养基中充分混匀制备双层平板，待凝固后37℃恒温培养12-18h后，选取长有噬菌斑的平板，选取直径较大且孤立的噬菌斑继续培养。重复此步骤直至得到噬菌斑大小均一的噬菌体，4℃保存，备用。
用双层平板法检测上述备用的噬菌体，结果如图1所示，该噬菌体在琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，为典型的裂解性噬菌体。
实施例2
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的富集
取实施例1备用的噬菌体和对数生长期的宿主菌于37℃160rpm共培养至菌液变清亮，10000rpm离心5min取上清，用0.22μm的滤器过滤得到噬菌体裂解液。
PEG8000纯化噬菌体：在噬菌体裂解液中加DnaseI和RnaseA至终浓度均为1μg/mL，37℃温育3h后，加入固体NaCl至终浓度为1mol/L，冰浴1h，4℃、10000g离心15min，取上清，加固体PEG8000至终浓度为10％，冰浴3h，4℃、10000g离心15min，去上清，将噬菌体沉淀轻轻地重悬于SM液中，通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的PEG和细胞碎片，温和震荡30s，4℃、3000g离心15min以分离有机相和亲水相，回收含噬菌体颗粒的亲水相，获得高浓度富集的噬菌体悬液。
实施例3
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的透射电镜观察
用实施例2得到的高浓度噬菌体悬液做电镜观察，取1滴噬菌体悬液滴在铜网上，5min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的噬菌体悬液，用2％磷钨酸溶液对噬菌体进行染色10min，干燥后置于电镜下观察噬菌体形态；观察结果如图2所示，噬菌体Kp_phage_507为长尾噬菌体。
实施例4
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507效价的测定
将实施例1纯化的噬菌体原液进行10倍梯度稀释，分别取10-6-10-11倍稀释的噬菌体稀释液100μl和对数期的宿主菌500μl充分混匀，室温孵育10min，制备双层平板，37℃培养12-18h，对每个平板进行噬菌斑计数。重复三次，计算噬菌体的效价。噬菌体的效价(PFU/mL)＝稀释倍数×平均数/样品体积。噬菌体的效价为3.33×1011PFU/mL。
实施例5
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507最佳感染复数的测定
取对数生长期的宿主菌进行计数，将噬菌体和对数期的宿主菌以10、1、0.1、0.01以及0.001的比例混合，室温静置15min后，与BHI液体培养基混合，37℃160rpm培养5h后，12000g离心3min，取上清，用0.22μm的滤器过滤，收集滤液；每个MOI值取100μl滤液，测定噬菌体滴度。滴度最高的MOI值为噬菌体的最佳感染复数。结果如表1所示，噬菌体Kp_phage_507最佳感染复数为0.001。
表1肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的最佳感染复数
实施例5
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507一步生长曲线的测定
将实施例1中纯化的噬菌体悬液与宿主菌以MOI值0.001的比例混合，37℃孵育15min后，5000rpm离心2min，收集沉淀，用5mL的BHI液体培养基重悬沉淀，37℃160rmp培养，在0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min时间点取样，测定每个时间点的噬菌体滴度，然后绘制生长曲线。一步生长曲线。
结果如图3所示，0-20分钟为肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的潜伏期，20-100分钟为爆发期，100分钟后进入平稳期。爆发量为246PFU/细胞。
实施例6
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的温度和酸碱度耐受性实验
取5个无菌EP管，各加入0.5mL实施例1中纯化的噬菌体悬液，分别在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中作用1h，冷却至室温，然后测定经不同温度处理后噬菌体的滴度。结果如图4所示，该噬菌体能耐受70℃高温，80℃时噬菌体迅速失活。
取12份0.1mL实施例1中纯化的噬菌体悬液分别加入至pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的0.9mL的BHI液体培养基中，室温作用1h，然后测定不同pH条件作用后噬菌体的滴度。结果如图5所示，该噬菌体在pH值为4-11的环境中，活性变化较小；当pH<4或pH>11时，噬菌体的效价随酸碱性的增强极具下降；当pH＝2时，噬菌体全部失活。因此噬菌体Kp_phage_507的最适pH为4～11。
实施例7
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的宿主谱分析
选取了25株多药耐药肺炎克雷伯菌临床分离株、1株KPC阳性的肺炎克雷伯菌标准株和一株NDM阳性的肺炎克雷伯菌标准株作为待测菌株。用BHI液体培养基将待测菌株培养至对数生长期，取100μL的待测菌菌液与5mL的BHI半固体培养基混合均匀，将混合好的半固体倒在素琼脂平板上，待半固体凝固后，用移液枪吸取10μL Kp_phage_507滴在凝固的双层平板上，37℃恒温过夜培养，观察是否由噬菌斑出现。
结果如表2所示，噬菌体Kp_phage_507的裂解谱较广，可裂解27株待测菌株中的23株。
表2肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的宿主谱结果
实施例8
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507在培养基中的杀菌效果
取噬菌体悬液分别按MOI值1和0.001加入至5mL对数生长期的宿主菌中，37℃160rpm培养，每1h测一次共培养菌液的OD600，共测5h；另设只加入SM液至5mL对数生长期的宿主菌中为实验对照组。
结果如图6所示，噬菌体Kp_phage_507在体外具有较强的灭杀肺炎克雷伯菌507的能力，2h已达到较好的裂解效果，且在2-5h中培养液的OD600一直维持在极低的水平。该结果表明噬菌体Kp_phage_507在感染数1～0.001的范围内均可有效的抑制其宿主菌的生长。
实施例9
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507的安全性实验
取20只重为250–350mg的大蜡螟幼虫，随机分成2组，每组10只，实验组每只蜡螟幼虫右后足注射1×107PFU/mL的噬菌体10μL(将实施例1得到的噬菌体原液调整浓度至1×107PFU/mL后所得)，对照组注射等体积PBS，连续3天观察大蜡螟幼虫的死亡情况。重复三次。
结果显示，注射噬菌体组和注射PBS组的死亡率相当，说明噬菌体Kp_phage_507具有一定的安全性。
实施例10
肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507控制多重耐药肺炎克雷伯菌感染实验
取40只重为250–350mg的大蜡螟幼虫，随机分成4组，每组10只。第一组(Kp)每只大蜡螟幼虫右后足注射1×105CFU/mL的宿主菌10μL；第二组(phage+Kp)每只在注射1×105CFU/mL的宿主菌10μL 1小时后，再注射1×107CFU/mL的实例1中纯化的噬菌体10μL；第三组(phage)每只仅注射1×107CFU/mL的实例1中纯化的噬菌体10μL；第四组(PBS)每只注射等量的PBS。连续3天观察大蜡螟幼虫的死亡情况。重复三次。
结果如图7所示，第二组的存活率相比第一组明显提升，第三组和第四组的死亡率相当，说明肺炎克雷伯菌噬菌体Kp_phage_507能够较好地控制多药耐药肺炎克雷伯菌的感染，降低死亡率。
Claims (7)
1.一株多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于：所述噬菌体命名为Kp_phage_507，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20211633。
2.根据权利要求1所述的多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于：所述噬菌体为长尾噬菌体。
3.根据权利要求1所述的多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于：所述噬菌体能耐受70℃高温；所述噬菌体的最适pH为4~11；所述噬菌体生长的潜伏期为0-20min，爆发期为20-100min，100min后进入平台期。
4.根据权利要求1所述的多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于：所述噬菌体在感染数1~0.001的范围内均可有效的抑制其宿主菌的生长。
5.一种包含权利要求1所述噬菌体的噬菌体制剂。
6.根据权利要求5所述的噬菌体制剂，其特征在于：所述制剂为药物、清洁剂或消毒剂。
7.一种权利要求1所述噬菌体的应用，其特征在于：用于制备预防或治疗多药耐药肺炎克雷伯菌感染的制剂；所述噬菌体能够裂解的多药耐药肺炎克雷伯菌的菌株编号分别为ATCC BAA-2146、ATCC BAA-1705。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2017204331A1 (en) * | 2010-09-17 | 2017-07-13 | Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa | Antibacterial phage, phage peptides and methods of use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR20200104130A (ko) * | 2019-02-26 | 2020-09-03 | 주식회사 라이센텍 | 클렙시엘라 뉴모니아의 박테리오파아지 pbkp05 및 그 용도 |
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Non-Patent Citations (2)
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| Transformation of Streptococcus pneumoniae with S. pneumoniae-X phage hybrid DNA: Induction of deletions;J. P. CLAVERYS;《Proc. Natl. Acad. Sci.》;第77卷(第6期);3534-3538 * |
| 噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的研究进展;高雅;《微生物学通报》;第48卷(第9期);3271−3280 * |
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