CN115011695A

CN115011695A - 基于游离环状dna基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN115011695A
Application number: CN202210657236.7A
Authority: CN
Inventors: 瞿昆; 方靖文
Original assignee: Hangzhou Hanyin Life Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Hanyin Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-09-06

Abstract

本发明公开了基于游离环状DNA基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用，通过对血浆中环状DNA来研究肺癌、胃癌、淋巴癌、卵巢癌4种癌症患者与健康人的环状DNA特性差异，并筛选出具有明显差异的片段长度分布特征，和环状DNA富集基因特征，建立4癌种风险预测模型，适用于肺癌、胃癌、淋巴癌、卵巢癌的筛查与识别。

Description

基于游离环状DNA基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环状DNA标志物，尤其涉及基于游离环状DNA基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用。

背景技术

癌症，是人类健康的头号杀手。大多数早期癌症患者的五年生存率可达90％以上。因此，早期诊断是癌症患者提高治愈率，延长生存期的重要手段。

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA)，简称eccDNA，目前研究认为eccDNA 来源于基因组DNA，且不携带端粒和着丝粒，eccDNA的大小从100bp到数百万bp不等。前沿的研究表明，eccDNA的产生与扩增是肿瘤细胞的标志性事件，是肿瘤细胞中原癌基因高表达和高突变的来源。因此，针对肿瘤细胞eccDNA的鉴定方法是领域内关键技术方法。然而，目前领域内尚缺乏成熟的、稳定的从血液中提取和分离的方法。有研究表明，肿瘤组织会释放 eccDNA进入循环系统，eccDNA在循环系统中的生物稳定性优于线性DNA，且具有独特的分子结构，可以将其作为液态活检检测靶标。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种用于多癌种识别的环状DNA生物标志物检测方法、基因标志物及应用试剂盒，具有快速、无伤害、高准确率、高特异性的优点，能够辅助肺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤的识别。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了基于环状DNA长度检测方法，检测片段长度大于1000bp的长环状 DNA数目，与片段长度大于100bp但小于1000bp的短环状DNA数目，计算长环状DNA数目与短环状DNA数目之间的比值。

本发明还提供了基于上述的检测方法的肺癌环状DNA基因标志物组合，包括以下基因标记物:LRRC8B、PRKAR1B、USP46、GABPB1、CASZ1、ARID5B、PFKP、HLF、MELK与YWHAQ。

本发明还提供了基于上述的检测方法的卵巢癌环状DNA基因标志物组合，包括以下基因标记物:SCCPDH、GPR97、RTN4RL1、ANKIB1、SATB2、NOD2、IQGAP3、BRAF、SMARCA2、LIPE与COL6A3。

本发明还提供了基于上述的检测方法的胃癌环状DNA基因标志物组合，包括以下基因标记物:C8orf37、KIN、IMPG1、EBPL、MDM1、HOXC-AS5、EXOC1、STX1A、RRM2B与XKR3。

本发明还提供了基于上述的检测方法的淋巴瘤环状DNA基因标志物组合，包括以下基因标记物:HFM1、TRIO、WISP2、TTLL3、ANKRD30B、ZNF320、GPR160、CRYGC、C2CD2与STX11。

本发明还提供了用于多癌种识别的环状DNA标志物组合，包括上述的环状DNA长度检测方法与选自肺癌环状DNA基因标志物组合，卵巢癌环状DNA基因标志物组合，胃癌环状DNA 基因标志物组合，淋巴瘤环状DNA基因标志物组合中至少一种环状DNA基因标志物组合。

作为本发明的一种优选方案，包括上述的环状DNA长度检测方法与上述全部的环状DNA 基因标志物组合。

本发明还提供了基于上述的检测方法的环状DNA标志物的检测方法，包括以下步骤：

S1：提取待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；

S2：对S1的DNA进行线性DNA去除处理；

S3：对S2经过线性DNA去除处理的DNA进行富集纯化环状DNA；

S4:对S3纯化后的环状DNA进行片段长度比检测；包括磁珠分选后DNA定量检测或二代测序。

S5:对S3纯化后的环状DNA进行如上述环状DNA基因标记物组合检测。

本发明还提供了检测上述环状DNA长度检测方法的试剂在制备肺癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述肺癌环状DNA基因标志物组合的试剂在制备肺癌检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述卵巢癌环状DNA基因标志物组合的试剂在制备卵巢癌检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述胃癌环状DNA基因标志物组合的试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述淋巴瘤环状DNA基因标志物组合的试剂在制淋巴瘤检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述环状DNA标志物组合的试剂在制备泛癌识别试剂盒中的应用。

本发明还提供了识别肺癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤的试剂盒，包括检测上述环状DNA长度的试剂。

本发明还提供了检测肺癌瘤的试剂盒，包括检测肺癌环状DNA基因标记物的试剂。

本发明还提供了检测卵巢癌的试剂盒，包括检测卵巢癌环状DNA基因标记物的试剂。

本发明还提供了检测胃癌的试剂盒，包括检测胃癌环状DNA基因标记物的试剂。

本发明还提供了检测淋巴瘤的试剂盒，包括检测淋巴瘤所述环状DNA基因标记物的试剂。

本发明还提供了识别多癌种的试剂盒，包括检测上述环状DNA标志物组合的检测试剂。

作为本发明的一种优选方案，所述生物样品为血液、粪便、组织、尿液或其它可提取DNA 的生物样本。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过环状DNA数目及长度比值，构建健康人与肺癌、卵巢癌、淋巴瘤、胃癌患者样本的模型，通过比对，可以判断识别受试者是否存在患癌风险与所述癌症种类，为进一步诊断确认提供支持，具有快速、无伤害、高准确率、高特异性的优点。

附图说明

图1是健康人与癌症患者的环状DNA长度比值分布差异。

图2是健康人与癌症患者筛查模型的三折交叉检验ROC曲线。

图3是健康人与癌症患者组间显著差异的环状DNA基因富集分布。

图4是癌种区分模型以判断受试者是否是健康人的ROC曲线。

图5是肺癌的ROC曲线。

图6是卵巢癌的ROC曲线。

图7是胃癌的ROC曲线。

图8是淋巴瘤的ROC曲线。

图9是受试者是否准确识别的ROC曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

从2021.5-2022.5收集了191例肺癌，67例卵巢癌，46例淋巴瘤和43例胃癌患者，和52例健康人对照，所有入组的患者签署知情同意书。肿瘤患者均为活体组织经病理学确认结果，健康人为常规体检正常。

实施例1

1.血液采集、保存及游离DNA提取

1.1.样本准备

1.1.1样本采集要求：

EDTAK2抗凝管采集10mL外周血，血液样本采集后立即轻微颠倒采集管8-10次混匀(混匀切勿剧烈，防止溶血)。

1.1.2样本保存及运输：

标本采集后，放置4℃保存；采血完毕后务必4h内到达检验实验室，运输过程切记冰袋低温防震运输，冰袋不可与血样直接接触。

1.1.3样本状态：

标本到达实验室后，应观察样本外观无明显溶血和凝固现象。

1.2.1血浆收集

(1)将全血500g，25℃，离心10min，转移上层血浆至新的EP管中；

(2)将血浆1600g，4℃，离心10min，转移上层血浆至新的EP管中；

(3)将血浆再次16000g，4℃，离心10min，转移上层血浆至新的EP管中，冻存。

1.3游离核酸(cfDNA)提取

按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)说明书，使用4mL血浆提取游离 DNA，提取游离DNA后，应用Agilent 2100仪器检测游离DNA的片段大小分布。

1.4主要试剂和仪器

试剂：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(55114)、NEB Exonuclease V(M0345S)、 MinElute Reaction Cleanup Kit(28206)、Vazyme Tn5(TD501-2)、NEBnext2xHifi PCR mix、 Agilent 2100及Qubit4.0试剂。

仪器：Applied Biosystems ProFlex^TM 3x32-孔PCR系统、Roche-LightCycler-480、Agilent 2100、Qubit4.0。

2.环状DNA富集

(1)环状DNA富集(消化线性DNA)反应体积见表1：

表1.反应体系

组分	50μL体系	终浓度
			血浆cfDNA	25ng	/
NEBuffer4(10X)	5μL	1X
			ATP(10mM)	5μL	1mM
Exonuclease V	0.5μL	5units
			Nuclease-free H2O	to 50μL	/

(2)放入PCR仪中，37℃孵育30min；

(3)取1.1μL的EDTA(0.5M)加入到EP管中；

(4)放入PCR仪中，70℃孵育30min；

(5)按照MinElute Reaction Cleanup Kit纯化样本。

(6)紫外分光光度计法测定DNA量(NanoDrop测定OD260值)，如cfDNA有基因组污染，理论上，要求重复以上步骤，多次消化，直至OD260值不变。

3.基于Tn5酶的环状DNA文库构建

(1)50μL反应体系见表2：

表2.反应体系

(2)片段化产物纯化

a.取出Qiagen Minelute PCR Purification Kit中相应试剂。

b.加入250μL PB buffer，和Tn5酶切mix混合均匀后上柱，17900g离心1min。

c.弃去管中液体，加入750μLPE，17900g，离心1min。

d.弃去管中液体，17900g，空离1min。

e.换新的EP管，加入22μL buffer EB，室温静置5min，17900g离心1min，此步可暂停，产物保存于-20℃。

(3)PCR扩增，PCR扩增体系与反应程序见表3。

表3.PCR扩增体系与反应程序

(4)qPCR扩增(确定继续PCR循环数)，qPCR扩增体系与反应程序见表4。

表4.qPCR扩增体系与反应程序

qPCR结束后，分析结果，确定每个样本最大荧光值的二分之一时，扩增循环数，即为N， N是剩余PCR产物继续进行PCR扩增的循环数。

(5)继续PCR扩增

将剩余45μl产物进行后续PCR，反应程序：98℃30s，[98℃10s，63℃30s，72℃1min]N cycles；4℃hold(N由qPCR结果决定)。

(6)PCR产物纯化

a.取出Qiagen Minelute PCR Purification Kit中相应试剂。

b.加入250μL PB buffer，和PCR产物均匀后上柱，17900g离心1min。

c.弃去管中液体，加入750μL PE，17900g，离心1min。

d.弃去管中液体，17900g，空离1min。

e.换新的EP管，加入25μL buffer EB，室温静置5min，17900g离心1min。

f.分别取1μL进行Agilent2100检测文库片段大小和Qubit浓度，其余可保存于 -20℃。

4.环状DNA测序及数据分析

(1)数据比对

将上述文库DNA进行二代测序(NGS)，获得下机数据后，将数据比对至人类参考基因组上(hg19)中，优选为bwa比对方法。

(2)断点序列寻找：

寻找存在断点(breakpoint)的读段进行拆分重比对以寻找环状DNA起始、终止位点；对可能的环状DNA断点附近序列进行进一步质量控制以筛选高质量环状DNA；优选为Circle-Map 方法。

(3)环状DNA长度统计：

根据(2)鉴定的环状DNA，统计相应起始、终止位点的距离定义为环状DNA长度，并将长度>1000bp的定义为长环状DNA，长度大于100bp但小于1000bp的定义为短环状DNA。并计算每个样本的长/短环状DNA比值。

如图1所示为4种癌症样本与健康人样本的比值分布。

(4)环状DNA基因统计：

根据(2)鉴定的环状DNA，通过比对环状DNA所在基因位置的基因注释信息(优选为GRch37.gtf)，将环状DNA注释到相应基因，并统计每个样本的基因丰度。

5.基于环状DNA长度特征的泛癌筛查模型建立

统计所有样本的长环状DNA数目，短环状DNA数目以及二者比值，整理成样本*特征矩阵。利用adaboost机器学习模型构建泛癌筛查模型，利用3-折交叉检验重复10次，确认相应模型的表现，并绘制ROC曲线如图2。

6.环状DNA基因特征筛选：

使用多变量相关线性模型(Multivariate association with linear models,Maaslin) 来计算每组(健康人、肺癌、卵巢癌、胃癌、淋巴癌)之间环状DNA基因丰度差异，以P-Value <0.05，为标准筛选差异基因如图3。

7.基于环状DNA基因标记物特征的癌种诊断模型建立

挑选每组中P-Value最小的10个基因，统计所有样本的相应环状DNA基因丰度，整理成样本*特征矩阵。

利用多分类器机器学习模型构建泛癌筛查模型，利用3-折交叉检验重复10次，确认相应模型的表现，针对健康人诊断的ROC曲线如图4，针对肺癌诊断的ROC曲线如图5，针对卵巢癌诊断的ROC曲线如图6，针对胃癌诊断的ROC曲线如图7，针对淋巴瘤诊断的ROC曲线如图8，诊断的平均准确率ROC曲线如图9。

由此可见，本发明提供一种环状DNA的检测方法，可用于多癌种识别的环状DNA生物标志物检测方法，基因标志物及应用试剂盒，具有快速、无伤害、高准确率、高特异性的优点，能够辅助肺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤的识别。

该检测方法主要包含：1)用于区分癌症和健康人的环状DNA长短片段数目及比值诊断模型；和2)用于区分不同癌种的环状DNA基因识别模型。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.基于环状DNA长度检测方法，其特征在于，检测片段长度大于1000bp的长环状DNA数目，与片段长度大于100bp但小于1000bp的短环状DNA数目，计算长环状DNA数目与短环状DNA数目之间的比值。

2.基于权利要求1所述的检测方法的肺癌环状DNA基因标志物组合，其特征在于，包括以下基因标记物:LRRC8B、PRKAR1B、USP46、GABPB1、CASZ1、ARID5B、PFKP、HLF、MELK与YWHAQ。

3.基于权利要求1所述的检测方法的卵巢癌环状DNA基因标志物组合，其特征在于，包括以下基因标记物:SCCPDH、GPR97、RTN4RL1、ANKIB1、SATB2、NOD2、IQGAP3、BRAF、SMARCA2、LIPE与COL6A3。

4.基于权利要求1所述的检测方法的胃癌环状DNA基因标志物组合，其特征在于，包括以下基因标记物:C8orf37、KIN、IMPG1、EBPL、MDM1、HOXC-AS5、EXOC1、STX1A、RRM2B与XKR3。

5.基于权利要求1所述的检测方法的淋巴瘤环状DNA基因标志物组合，其特征在于，包括以下基因标记物:HFM1、TRIO、WISP2、TTLL3、ANKRD30B、ZNF320、GPR160、CRYGC、C2CD2与STX11。

6.用于多癌种识别的环状DNA标志物组合，其特征在于，包括权利要求1所述的环状DNA长度检测方法与选自权利要求2-5中至少一种环状DNA基因标志物组合。

7.根据权利要求6所述的用于多癌种识别的环状DNA标志物组合，其特征在于，包括权利要求1所述的环状DNA长度检测方法与权利要求2-5中全部的环状DNA基因标志物组合。

8.基于权利要求1所述的检测方法的环状DNA标志物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；

S2：对S1的DNA进行线性DNA去除处理；

S3：对S2经过线性DNA去除处理的DNA进行富集纯化环状DNA；

S4:对S3纯化后的环状DNA进行片段长度比检测；包括磁珠分选后DNA定量检测或二代测序；

S5:对S3纯化后的环状DNA进行如权利要求2-5中任一项所述环状DNA基因标记物组合检测。

9.检测权利要求1所述环状DNA长度检测方法的试剂在制备肺癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤检测试剂盒中的应用。

10.检测权利要求2所述环状DNA基因标志物组合的试剂在制备肺癌检测试剂盒中的应用。

11.检测权利要求3所述环状DNA基因标志物组合的试剂在制备卵巢癌检测试剂盒中的应用。

12.检测权利要求4所述环状DNA基因标志物组合的试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。

13.检测权利要求5所述环状DNA基因标志物组合的试剂在制淋巴瘤检测试剂盒中的应用。

14.检测权利要求6-7任一项所述环状DNA标志物组合的试剂在制备泛癌识别试剂盒中的应用。

15.识别肺癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述环状DNA长度的试剂。

16.检测肺癌瘤的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求2所述环状DNA基因标记物的试剂。

17.检测卵巢癌的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求3所述环状DNA基因标记物的试剂。

18.检测胃癌的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求4所述环状DNA基因标记物的试剂。

19.检测淋巴瘤的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求5所述环状DNA基因标记物的试剂。

20.识别多癌种的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求6-7任一项所述环状DNA标志物组合的检测试剂。

21.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述生物样品为血液、粪便、组织、尿液或其它可提取DNA的生物样本。