CN115011491B - 一种产朊假丝酵母菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产朊假丝酵母菌的培养工艺，包括以下步骤，S1：制备出固体培养基，高压蒸汽灭菌，灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2。本发明中优化条件为培养时间13h、温度30℃、摇床转速为180r/min、碳氮比（葡萄糖和蛋白胨质量比）为3:1时菌体密度最高，即生长效果最好，故本培养工艺基于以上参数，保证了产朊假丝酵母菌的菌群活力和菌种繁衍效率。
Description
技术领域
本发明涉及菌种培养技术领域，尤其涉及一种产朊假丝酵母菌的培养方法。
背景技术
产朊假丝酵母（Candida utilis）又叫产朊圆酵母或食用圆酵母。其蛋白质和维生素B的含量都比啤酒酵母高，它能以尿素和硝酸作为氮源，在培养基中不需要加入任何生长因子即可生长。它能利用五碳糖和六碳糖，既能利用造纸工业的亚硫酸废液，还能利用糖蜜、木材水解液等生产出人畜可食用的蛋白质。
菌种的活性和菌群数量繁殖对培养方法的要求较高，现有的培养中对菌种的各种参数的限定不准确，造成菌种活性和菌群繁衍均达不到最佳，影响其应用。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种产朊假丝酵母菌的培养方法。
本发明提出的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，包括以下步骤：
S1：制备出固体培养基，高压蒸汽灭菌，灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2；
S2：从产朊假丝酵母菌的菌种中挑取一环菌体，置入已制备完毕的液体培养基中，摇匀，培养条件为30-32℃，转速为160-180r/min，培养时间为12-13小时；
S3：对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，从液体培养基中取出一定量具有一定浓度的菌液注射到固体培养基表面，然后用涂布棒将接种的菌液在培养基表面均匀涂开；
S4：培养时间为36-48小时，操作之后，取出的平板上会出现错落的菌落，供以后培养取种操作应用。
优选地，所述固体培养基的配方及其重量比为，葡萄糖2-5%，蛋白胨2-3%，酵母浸粉1-2%，琼脂2-3%以及蒸馏水。
优选地，所述产朊假丝酵母菌在培养基中培养时间13 h、温度30 ℃、摇床转速为160 r/min、碳氮比(葡萄糖和蛋白胨质量比)约为3:1时菌体密度最高。
优选地，在产朊假丝酵母菌培养方法后期，还采用了酵母培养增殖装置进行培养增殖，所述装置包括多个串联的环形管道式培养腔体，相邻两培养腔体之间的通路通过可开闭的第一挡板控制开闭；所述培养腔体包括外壁和套设在外壁内的内壁；所述外壁与内壁之间设置有第一温度调节层；所述外壁和内壁均为导热材料；所述第一温度调节层包括密集排列的多个第一半导体制冷片；所述培养腔体内部中心沿其长度方向设置有空心的内温度调节棒；所述内温度调节棒内部填充有固-液相变材料；所述内温度调节棒可连通外界循环其内部的固-液相变材料；所述固-液相变材料的相变温度在酵母菌的安全温度范围内；所述内温度调节棒外表面设置有第二温度调节层；所述第二温度调节层也包括密集排列的多个第二半导体制冷片；所述内温度调节棒棒体为导热材料；所述培养腔体的外壁上分别沿其切线方向设置有分别可开闭的用于补充所需无菌气体的进气管以及用于补充所需培养液及菌体的进料管。
其中，相邻两培养腔体之间通过连接管连通，所述连接管同时与两培养腔体的外壁相切；所述第一挡板铰接在前一道培养腔体的出料口处，通过转动实现在闭合连接管的同时使前一道培养腔体保持循环通路，而在打开连接管的同时使前一道培养腔体的循环通路闭合。
其中，后一道培养腔体的进料口处铰接有第二挡板；所述第二挡板通过转动实现在闭合连接管的同时使后一道培养腔体保持循环通路，而在打开连接管的同时使后一道培养腔体的循环通路闭合。
其中，所述第一挡板为多孔结构，且表面蒙附有防水透气膜；一抽气管连通连接管向外抽气使连接管内保持负压。
其中，所述外壁外表面均匀设置有多片环形导热片；所述环形导热片与外壁长度方向垂直。
其中，多个培养腔体整体上下分布。
其中，所述内壁内表面设置有螺旋膛线或圆滑凸起；
其中，所述酵母培养增殖方法为：
①将初始酵母菌混合培养液通过进料管以一定的速度注入培养腔体中，同时以连续或脉冲的形式通过进气管向培养腔体内注入压缩的利于酵母菌培养的无菌气体，由于进气管与进料管均与培养腔体相切，因此可使酵母菌混合培养液在培养腔体内循环流动，同时内壁内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于其中的培养液和气体更新以及温度的均匀；培养腔体中的多余气体和废弃穿过防水透气膜和第一挡板通过抽气管抽出，从而保障培养腔体中的气压稳定和气体新鲜度；
②通过第一半导体制冷片和第二半导体制冷片从内外两个方向同时对培养腔体内的酵母菌混合培养液的温度进行精确的控制，以保障酵母菌高效的培养增殖，固-液相变材料不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡；
③在设定培养时间达成后，第一挡板和第二挡板分别向前一道培养腔体和后一道培养腔体内旋转，使流动的酵母菌培养液在惯性作用下从上一道培养腔体通过连接管进入下一道培养腔体内，完成后，第一挡板和第二挡板重新闭合，前一道培养腔体继续注入新的酵母菌混合培养液或更之前一道培养腔体的酵母菌混合培养液，后一道培养腔体继续培养之前的酵母菌培养液，直至在进行N道培养后达成培养增殖目标后排出。
本发明中的有益效果为：
本发明通过统计学分析各个因素对此酵母菌的生长影响并不显著(p>0.05)，最终的优化条件为培养时间13h、温度30℃、摇床转速为180r/min、碳氮比（葡萄糖和蛋白胨质量比）为3:1时菌体密度最高，即生长效果最好，故本培养方法基于以上参数，保证了产朊假丝酵母菌的菌群活力和菌种繁衍效率。
本发明设置多级串联可循环动态培养的培养腔体，相比传统的采用罐体进行静态培养增殖，能够实现连续脉动且动态的培养增殖，显著提高生产效率和生产连贯性，减少菌体在培养增殖完成后到后道工序之间所需的停留时间，提高菌体成品成活率和培养效率；将菌体的培养增殖过程分割成多段连续进行，从而实现连续性、可控性、且能减少部分菌体不合格对整体的影响，减少废弃率。
3、本发明的培养腔体采用内外设置半导体制冷片，不仅能够增加与酵母菌混合培养液的接触面积，提高热传导率和传导均匀性，而且能够通过控制电流大小和方向精确双向控制温度，从而保障酵母菌处于最适宜的培养温度，以保障酵母菌高效的培养增殖，同时通过固-液相变材料不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡。
4、本发明利用进气管与进料管均与培养腔体相切的特点，不仅可以根据设计和计算结构向培养腔体内进给酵母菌和培养液以及补充酵母菌所需气体，而且利用冲击的进液和进气，能够为培养腔体内的混合培养液提供循环转动的动力，可使酵母菌混合培养液在培养腔体内循环流动，同时内壁内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于进一步的的培养液和气体更新以及温度的均匀；且培养腔体中的多余气体和废弃穿过防水透气膜和第一挡板通过抽气管抽出，从而保障培养腔体中的气压稳定和气体新鲜度。
附图说明
图1为本发明的方法示意图；
图2为本发明酵母培养增殖装置的结构示意图；
图3为本发明内温度调节棒的径向剖视示意图；
图4为本发明第二挡板的剖视示意图。
图中：1、培养腔体；11、外壁；12、内壁；13、第一温度调节层；14、第一半导体制冷片；15、内温度调节棒；16、固-液相变材料；17、第二温度调节层；18、第二半导体制冷片；2、第一挡板；21、防水透气膜；22、抽气管；3、进气管；4、进料管；6、连接管；7、第二挡板。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参见图1，一种产朊假丝酵母菌的培养方法，包括以下步骤：
S1：制备出固体培养基，高压蒸汽灭菌，灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2；
S2：从产朊假丝酵母菌的菌种中挑取一环菌体，置入已制备完毕的液体培养基中，摇匀，培养条件为30-32℃，转速为160-180r/min，培养时间为12-13小时；
S3：对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，从液体培养基中取出一定量具有一定浓度的菌液注射到固体培养基表面，然后用涂布棒将接种的菌液在培养基表面均匀涂开；
S4：培养时间为36-48小时，操作之后，取出的平板上会出现错落的菌落，供以后培养取种操作应用。
其中，固体培养基的配方及其重量比为，葡萄糖2-5%，蛋白胨2-3%，酵母浸粉1-2%，琼脂2-3%以及蒸馏水。
其中，产朊假丝酵母菌在培养基中培养时间13 h、温度30 ℃、摇床转速为160 r/min、碳氮比(葡萄糖和蛋白胨质量比)约为3:1时菌体密度最高。
具体的，本发明中，酵母浸出粉陈葡萄糖培养基(亦称YPD培养基)，其中液体培养基配置的原料有：葡萄糖2-5%，蛋白胨2-3%，酵母浸粉1-2%，以及蒸馏水；固体培养基制备在液体培养基的基础之上加入琼脂2-3%即可。
分装量视具体情况而定，通常试管中的固体培养基以管高的1/5为宜，装入三角瓶的培养基不宜超过容积的1/2。
然后对上述制备好的培养基进行高压蒸汽灭菌，此法是将待灭菌物品放在高压蒸汽灭菌锅内，利用高压时水的沸点上升，从而造成蒸汽温度升高，由此产生高温达到杀灭杂菌的目的。
由于培养基含有糖类物质，因此一般采用7×104Pa(表压)(115℃)20-30分钟，以免糖类因高温而分解。
由于高压蒸汽灭菌是通过提高蒸汽压力而使其升高温度以杀死微生物，所以加压前应尽量排尽锅内的空气。
灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2。
摇床培养：从已购的菌种中挑取一环菌体，置入已制备完毕的液体培养基中，摇匀。
将盛有液体培养基的三角瓶放置于振荡培养箱中摇床培养，培养条件为30-32℃，转速为160-180r/min，培养时间为12-13小时。
在以上培养条件下，可使菌体生长迅速，并处于对数生长期内，为以后的培养做好基础。
恒温恒湿培养：对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，将制备好的固体培养基趁热倒入平板之中,之后待所有平板中的培养基温度降至室温且已凝固。
此时，进行接种操作，从液体培养基中取出一定量具有一定浓度的菌液注射到固体培养基表面，然后用涂布棒将接种的菌液在培养基表面均匀涂开。
最后，把平板放入到恒温恒湿培养箱中避光培养，培养时间为36-48小时，操作之后，取出的平板上会出现错落的菌落，供以后培养取种操作应用。
培养后，从中取出1mL菌液，蒸馏水稀释5倍，用紫外可见分光光度计在600nm处测定其吸光度值，作为初始值。
再将盛有液体培养基的三角瓶置于温度为30℃，转速为160r/min的恒温振荡培养箱中振荡培养，用相同的方法每隔1小时测定菌液的吸光度值（OD值)，连续测定24小时。
根据数据，做出酵母菌的生长曲线(吸光度/时间)，并找出对数期。
在碳源方面，选取了三种原料，分别是葡萄糖、麦芽糖和蔗糖；在氮源方面也选取了三种原料，分别是蛋白胨、硫酸铵和氯化铵。
酵母菌对不同碳源利用是有一定的顺序的。
在间歇发酵时，首先被利用的是葡萄糖和果糖，只有在培养基中没有葡萄糖和果糖时，酵母菌才发酵麦芽糖，哪一种碳源能保证最大的酵母菌生长繁殖速度，酵母菌就首先利用它。
再是氮源，酵母菌只能利用两种形式的氮：氨类和有机氮。
在微生物培养基成分中，最常用的有机氨源是酵母浸粉及由动、植物蛋白质经酶消化后的各种蛋白胨。
依据产肮假丝酵母的最适生长温度，根据之前的优化条件，培养温度也设为三组条件，分别是28℃、30℃、32℃。
对培养中溶氧情况的研究，菌种产肮假丝酵母是兼性厌氧菌，且更适合有氧条件的培养。
根据之前对摇床转速的影响条件的确定,对摇床培养箱的转速，设定为140r/min、160r/min、180r/min三组条件。
对以上三个因素、三个水平分别进行单一因素和正交处理，对各影响因素对酵母菌生长情况进行对比和分析，从而得到最优的诱变后再生长的条件。
最终的优化条件为培养时间13 h、温度30 ℃、摇床转速为160 r/min、碳氮比(葡萄糖和蛋白胨质量比)约为3:1时菌体密度最高，即生长效果最好。
进一步的，参见图2至4，为了使产肮假丝酵母能够快速增殖，设计了酵母培养增殖装置，该装置包括多个串联的环形管道式培养腔体1，相邻两培养腔体1之间的通路通过可开闭的第一挡板2控制开闭；培养腔体1包括外壁11和套设在外壁11内的内壁12；外壁11与内壁12之间设置有第一温度调节层13；外壁11和内壁12均为导热材料；第一温度调节层13包括密集排列的多个第一半导体制冷片14；培养腔体1内部中心沿其长度方向设置有空心的内温度调节棒15；内温度调节棒15内部填充有固-液相变材料16；内温度调节棒15可连通外界循环其内部的固-液相变材料16；固-液相变材料16的相变温度在酵母菌的安全温度范围内；内温度调节棒15外表面设置有第二温度调节层17；第二温度调节层17也包括密集排列的多个第二半导体制冷片18；内温度调节棒15棒体为导热材料；培养腔体1的外壁11上分别沿其切线方向设置有分别可开闭的用于补充所需无菌气体的进气管3以及用于补充所需培养液及菌体的进料管4。
进一步的，相邻两培养腔体1之间通过连接管6连通，连接管6同时与两培养腔体1的外壁11相切；第一挡板2铰接在前一道培养腔体1的出料口处，通过转动实现在闭合连接管6的同时使前一道培养腔体1保持循环通路，而在打开连接管6的同时使前一道培养腔体1的循环通路闭合。
进一步的，后一道培养腔体1的进料口处铰接有第二挡板7；第二挡板7通过转动实现在闭合连接管6的同时使后一道培养腔体1保持循环通路，而在打开连接管6的同时使后一道培养腔体1的循环通路闭合。
进一步的，第一挡板2为多孔结构，且表面蒙附有防水透气膜21；一抽气管22连通连接管6向外抽气使连接管6内保持负压。
进一步的，外壁11外表面均匀设置有多片环形导热片；环形导热片与外壁11长度方向垂直。
进一步的，多个培养腔体1整体上下分布。
进一步的，内壁12内表面设置有螺旋膛线或圆滑凸起；
酵母培养增殖方法为：
①将初始酵母菌混合培养液通过进料管4以一定的速度注入培养腔体1中，同时以连续或脉冲的形式通过进气管3向培养腔体1内注入压缩的利于酵母菌培养的无菌气体，由于进气管3与进料管4均与培养腔体1相切，因此可使酵母菌混合培养液在培养腔体1内循环流动，同时内壁12内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于进一步的的培养液和气体更新以及温度的均匀；培养腔体1中的多余气体和废弃穿过防水透气膜21和第一挡板2通过抽气管22抽出，从而保障培养腔体1中的气压稳定和气体新鲜度；
②通过第一半导体制冷片14和第二半导体制冷片18从内外两个方向同时对培养腔体1内的酵母菌混合培养液的温度进行精确的控制，以保障酵母菌高效的培养增殖，固-液相变材料16不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡；
③在设定培养时间达成后，第一挡板2和第二挡板7分别向前一道培养腔体1和后一道培养腔体1内旋转，使流动的酵母菌培养液在惯性作用下从上一道培养腔体1通过连接管6进入下一道培养腔体1内，完成后，第一挡板2和第二挡板7重新闭合，前一道培养腔体1继续注入新的酵母菌混合培养液或更之前一道培养腔体1的酵母菌混合培养液，后一道培养腔体1继续培养之前的酵母菌培养液，直至在进行N道培养后达成培养增殖目标后排出。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备出固体培养基，高压蒸汽灭菌，灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2；
S2：从产朊假丝酵母菌的菌种中挑取一环菌体，置入已制备完毕的液体培养基中，摇匀，培养条件为30-32℃，转速为160-180r/min，培养时间为12-13小时；
S3：对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，从液体培养基中取出一定量具有一定浓度的菌液注射到固体培养基表面，然后用涂布棒将接种的菌液在培养基表面均匀涂开；
S4：培养时间为36-48小时，操作之后，取出的平板上会出现错落的菌落，供以后培养取种操作应用；
S5：酵母菌培养增殖，所述培养增殖采用酵母培养增殖装置进行，所述装置包括多个串联的环形管道式培养腔体(1)，相邻两培养腔体(1)之间的通路通过可开闭的第一挡板(2)控制开闭；所述培养腔体(1)包括外壁(11)和套设在外壁(11)内的内壁(12)；所述外壁(11)与内壁(12)之间设置有第一温度调节层(13)；所述外壁(11)和内壁(12)均为导热材料；所述第一温度调节层(13)包括密集排列的多个第一半导体制冷片(14)；所述培养腔体(1)内部中心沿其长度方向设置有空心的内温度调节棒(15)；所述内温度调节棒(15)内部填充有固-液相变材料(16)；所述内温度调节棒(15)可连通外界循环其内部的固-液相变材料(16)；所述固-液相变材料(16)的相变温度在酵母菌的安全温度范围内；所述内温度调节棒(15)外表面设置有第二温度调节层(17)；所述第二温度调节层(17)也包括密集排列的多个第二半导体制冷片(18)；所述内温度调节棒(15)棒体为导热材料；所述培养腔体(1)的外壁(11)上分别沿其切线方向设置有分别可开闭的用于补充所需无菌气体的进气管(3)以及用于补充所需培养液及菌体的进料管(4)。
2.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述固体培养基的配方及其重量比为，葡萄糖2-5%，蛋白胨2-3%，酵母浸粉1-2%，琼脂2-3%以及蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母菌在培养基中培养时间13 h、温度30 ℃、摇床转速为160 r/min、碳氮比为3:1时菌体密度最高。
4.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，相邻两培养腔体(1)之间通过连接管(6)连通，所述连接管(6)同时与两培养腔体(1)的外壁(11)相切；所述第一挡板(2)铰接在前一道培养腔体(1)的出料口处，通过转动实现在闭合连接管(6)的同时使前一道培养腔体(1)保持循环通路，而在打开连接管(6)的同时使前一道培养腔体(1)的循环通路闭合。
5.根据权利要求4所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，后一道培养腔体(1)的进料口处铰接有第二挡板(7)；所述第二挡板(7)通过转动实现在闭合连接管(6)的同时使后一道培养腔体(1)保持循环通路，而在打开连接管(6)的同时使后一道培养腔体(1)的循环通路闭合。
6.根据权利要求5所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述第一挡板(2)为多孔结构，且表面蒙附有防水透气膜(21)；一抽气管(22)连通连接管(6)向外抽气使连接管(6)内保持负压。
7.根据权利要求6所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述外壁(11)外表面均匀设置有多片环形导热片；所述环形导热片与外壁(11)长度方向垂直；所述内壁(12)内表面设置有螺旋膛线或圆滑凸起。
8.根据权利要求7所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，多个培养腔体(1)整体上下分布。
9.根据权利要求8所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述酵母培养增殖方法为：
①将初始酵母菌混合培养液通过进料管(4)以一定的速度注入培养腔体(1)中，同时以连续或脉冲的形式通过进气管(3)向培养腔体(1)内注入压缩的利于酵母菌培养的无菌气体，由于进气管(3)与进料管(4)均与培养腔体(1)相切，因此可使酵母菌混合培养液在培养腔体(1)内循环流动，同时内壁(12)内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于其中的培养液和气体更新以及温度的均匀；培养腔体(1)中的多余气体和废弃穿过防水透气膜(21)和第一挡板(2)通过抽气管(22)抽出，从而保障培养腔体(1)中的气压稳定和气体新鲜度；
②通过第一半导体制冷片(14)和第二半导体制冷片(18)从内外两个方向同时对培养腔体(1)内的酵母菌混合培养液的温度进行精确的控制，以保障酵母菌高效的培养增殖，固-液相变材料(16)不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡；
③在设定培养时间达成后，第一挡板(2)和第二挡板(7)分别向前一道培养腔体(1)和后一道培养腔体(1)内旋转，使流动的酵母菌培养液在惯性作用下从上一道培养腔体(1)通过连接管(6)进入下一道培养腔体(1)内，完成后，第一挡板(2)和第二挡板(7)重新闭合，前一道培养腔体(1)继续注入新的酵母菌混合培养液或更之前一道培养腔体(1)的酵母菌混合培养液，后一道培养腔体(1)继续培养之前的酵母菌培养液，直至在进行N道培养后达成培养增殖目标后排出。
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