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CN115010548B - 一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料 - Google Patents

一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料 Download PDF

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CN115010548B CN202210371235.6A CN202210371235A CN115010548B CN 115010548 B CN115010548 B CN 115010548B CN 202210371235 A CN202210371235 A CN 202210371235A CN 115010548 B CN115010548 B CN 115010548B
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Abstract

本发明公开了一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料包括牛粪，羊粪，油渣，矿物源腐殖酸，复合菌剂按照复合物料质量百分比0.3‑0.5％接种获得梨火病菌拮抗生防生物复合肥料，本发明创造性的提出的能够专门针对防治梨火疫病的复合菌肥，通过特定比例的菌种复配形成稳定微生态并保障较高的活菌数，不仅能够保障植株正常生长，且具有显著的梨火疫病防治效果，将其应用于库尔勒香梨的种植，增产约16.56％，能增加土壤中的有机质含量，土壤理化性质明显改善，有效改善和降解土壤农药污染、重金属污染和病菌污染等，从而提升耕地质量，提高土壤生产能力，对防治梨火疫病具有广泛的实用价值。

Description

一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料
技术领域
本发明本发明涉及微生物肥料的研发技术领域。具体地，本发明涉及一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料及其制备和应用的技术领域。
背景技术
梨火疫病(fire blight of pear)是由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)引起的毁灭性细菌病害，病原菌是我国进境检疫有害生物。被梨火疫病菌侵染的花、叶片、枝条表现出发黑、干枯的病状，看起来就像火烧一样，该病因此得名。解淀粉欧文氏菌可以侵染超过40个属的220多种植物，主要对仁果类果树造成危害。梨火疫病引起果树大量死亡，并且易传播、难防治，常造成巨大的经济损失。该病害于1883年才确定是由细菌造成，因此，梨火疫病也是世界首个细菌植物病害。E.amylovora的毒力和传播力很强，单个生长季内可以毁灭一个果园。
梨火疫病菌为直杆菌，外表附有荚膜，周生鞭毛，大小为0.9～1.8×0.6～1.5μm，多数单生。最适生长温度28℃，湿度70％，pH为6。其在气温5℃～37℃范围内都可繁殖，在25℃条件下约75min繁殖一代。梨火疫病菌可以被鸟类、昆虫以及风、雨、露等携带到邻近植株上，可以侵染寄主植物的花朵、果实、叶片、茎、活跃生长的嫩枝以及砧木等部位。由于梨火疫病菌的生存和迁移能力强，且易感品种及组织的多样性高，难以找到统一有效的根治靶标，导致梨火疫病的治理十分困难。目前，对于梨火疫病的预防和控制手段主要包括隔离检疫、施药，培育抗性品种和剪枝挖树等。在防治方面，除了不断改良和严格执行现有防治措施之外，仍需开发新的化学试剂以应对耐药性，也需要开发价格适于果园应用的生物制剂，以及培育和筛选抗性强、抗性稳定的抗性品种。鉴于易产生耐药性、海关对试剂残留物的管制以及人们对有机农产品的消费偏好等多方面因素，生物防控手段的重要性日益凸显。
中国专利(专利公布号：CN112358366A)公开了一种采用枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)按照一定比例制备的防治梨火疫病的复合菌肥，能够促进植株生长的并且具有显著的梨火疫病防治效果，在盐碱地均可适用，能够降低梨树感染梨火疫病的风险。但是在实际应用过程中，该系列复合菌肥存在制备过程复杂、生产成本高，肥效持续时间短、氮磷钾肥效差以及应用于库尔勒香梨种植中，香梨的产量有待进一步提高的问题。
发明内容
针对现有梨火疫病生防肥料制备过程复杂、成本高、肥效时间短以及库尔勒香梨产量有待进一步提高的技术现状。本发明提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料包括牛粪，羊粪，油渣，矿物源腐殖酸，复合菌剂按照复合物料质量百分比0.3-0.5％接种获得梨火病菌拮抗生防生物复合肥料，本发明创造性的提出的能够专门针对防治梨火疫病的复合菌肥，通过特定比例的菌种复配形成稳定微生态并保障较高的活菌数，菌种之间协调复配性、安全性经过验证，不仅能够保障库尔勒香梨植株正常生长，且具有显著的梨火疫病防治效果，将其应用于库尔勒香梨的种植，平均增产约16.56％，能增加土壤中的有机质含量，明显改善土壤理化性质，且有效降解土壤农药污染、重金属污染和病菌污染等土壤污染物，从而提升耕地质量，提高土壤生产能力，对防治梨火疫病具有广泛的实用价值。
本发明提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，按照重量份计，包括牛粪15-25份，羊粪15-25份，油渣30-50份，矿物源腐殖酸20-40份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.3-0.5％接种。
更进一步，本发明提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，按照重量份计，包括牛粪20份，羊粪20份，油渣40份，矿物源腐殖酸30份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.4％接种。
本发明提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料中，所述复合菌剂为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得。
同时，本发明提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料的制备方法，具体采用如下步骤获得：
(1)选取低温保存的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)CGMCC NO.1641分别接种至NA培养基平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200m LNB培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液。
(2)将步骤(1)中获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL。
(3)将步骤(2)获得的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照特定质量比进行复配，制备获得复合菌剂。
(4)收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪和油炸(1：1：2)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米，发酵时间为40天以上至物料完全腐熟；发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散。
(5)将步骤(3)中制备获得的复合菌剂，按比例与步骤(4)中制备获得完全腐熟牛羊粪和油渣物料及矿物源腐殖酸制得的复合物料混合，翻拌均匀，包装，获得专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料。
本发明提供一种梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料在制备防治梨火疫病肥料中的应用。
通过以上技术方案，本发明取得以下技术效果：
(1)本发明提供专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料中应用的三株生防菌对梨火疫病菌进行拮抗测定，解淀粉芽孢杆菌的抑菌斑直径为(9.03mm)＞巨大芽孢杆菌(4.38mm)＞胶冻样芽孢杆菌(0.78mm)，按照一定比例接种获得的生物复合肥料活菌数达3.03×108CFU/mL，与复合菌剂初始芽孢数接近，将该生物肥料稀释10倍时，抑菌效果最高，抑菌直径为5.71±0.51mm。
(2)现有技术尽管已有披露有关枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或者部分芽孢杆菌在梨火病菌拮抗生防中应用的报道，但是，微生物菌种最大的问题就是探索研究清楚如何找到适合的菌种安全、有效协调高效的配伍，这是行业的公知问题，也是制约微生物菌种应用遇到最为关键的技术问题，不是任意随便选取菌种都能配伍应用，进而在生产工业中应用。本发明选用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641三种菌种中其中两株菌种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)CGMCC NO.1641是申请人前期自主筛选的新菌种，已经在前期研究中应用，通过科研生产验证其三者间配伍的协调性、安全性复配，本发明进而通过寻找合适复合物料，在专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料研制，获得生物复合肥料，不仅能够保障库尔勒香梨植株正常生长，且具有显著的梨火疫病防治效果，将其应用于库尔勒香梨的种植，平均增产约16.56％，增加土壤中的有机质含量，明显改善土壤理化性质，能有效降解土壤农药污染、重金属污染和病菌污染等土壤污染物，从而提升耕地质量，提高土壤生产能力，对防治梨火疫病具有广泛的实用价值。
(3)本发明提供专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，通过应用生物技术，改善和降解土壤农药污染、重金属污染、病菌污染等土壤污染物，从而有效提升耕地质量，提高土壤生产能力。其中重金属汞含量降低9.09％，铅含量降低1.00％，铬含量降低80.77％，六六六含量降低77.78，滴滴涕含量降低81.25％。
(4)本发明提供专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料与市售有效成分相仿生物有机肥在模拟施肥条件设备中持续25天，本发明提供的生物复合肥料在模拟耕作层15cm处速效氮、磷、钾均显著高于对比组，具有显著的提高肥料速效氮、磷、钾利用率条件。
(5)本发明提供专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料对库尔勒香梨有明显的增产效果，平均增产约16.56％，进一步对库尔勒香梨感官、品质营养及卫生安全进行评价，结果均满足要求。
附图说明
图1为本发明提供三株生防菌的平板拮抗试验图；图中A为平板拮抗图，B为抑菌直径统计，1代表解淀粉芽孢杆菌的抑菌斑，2代表巨大芽孢杆菌的抑菌斑，3代表胶冻样芽孢杆菌的抑菌斑。
图2为试验用土柱装置示意图。
图3为不同肥料模拟施肥后土壤15cm速效氮随培养时间的变化图。
图4为不同肥料模拟施肥后土壤15cm速效磷随培养时间的变化图。
图5为不同肥料模拟施肥后土壤15cm速效钾随培养时间的变化图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及的材料和设备：
本发明所采用的材料为：营养琼脂(NA)培养基、营养肉汤(NB)培养基、MRS培养基、琼脂粉等均为国产分析纯试剂。本发明选用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ATCC NO.1978、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641三种菌种都已作为前期公知菌种，本领域普通技术人员可通过中科院微生物菌种保藏中心(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC)调用或购买获得，都已作为公知材料为本领域科研生产选用。
本发明中选用的所有材料、试剂及仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施。
实施例1：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料
一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，按照重量份计，包括牛粪15-25份，羊粪15-25份，油渣30-50份，矿物源腐殖酸20-40份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.3-0.5％接种，其中，所述复合菌剂为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得。
实施例2：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料
本实施例在实施例1的基础上，提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，包括牛粪20kg，羊粪20kg，油渣40kg，矿物源腐殖酸30kg；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.4％接种，其中，所述复合菌剂为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得。
实施例3：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料
本实施例在实施例1的基础上，提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，包括牛粪15kg，羊粪15kg，油渣30kg，矿物源腐殖酸20kg；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.3％接种，其中，所述复合菌剂为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得。
实施例4：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料
本实施例在实施例1的基础上，提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，包括牛粪25kg，羊粪15kg，油渣50kg，矿物源腐殖酸40kg；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.5％接种，其中，所述复合菌剂为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得。
实施例5：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料
本实施例在实施例1的基础上，提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，包括牛粪20kg，羊粪22kg，油渣45kg，矿物源腐殖酸35kg；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.4％接种，其中，所述复合菌剂为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得。
实施例6：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料的制备
本实施例在实施例1-5的基础上，提供一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料的制备方法，具体采用如下步骤获得：
(1)选取低温保存的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)CGMCC NO.1641分别接种至NA培养基平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200mLNB培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液。
(2)将步骤(1)中获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵灌中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/mL，获得各菌的发酵液。
(3)将步骤(2)获得的解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641发酵液按照特定质量比进行复配，制备获得复合菌剂。
(4)收集水份控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪和油炸(1：1：2)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米，发酵时间为40天以上至物料完全腐熟；发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散。
(5)将步骤(3)中制备获得的复合菌剂，按比例与步骤(4)中制备获得完全腐熟牛羊粪和油渣物料及矿物源腐殖酸制得的复合物料混合，翻拌均匀，包装，获得专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料。
实施例7：专门针对梨火病菌拮抗生防的生物复合肥料生物安全评价
按照国家《微生物肥料生物安全通用技术准则(NY 1109-2006)》，按照国家标准标准规定了微生物肥料使用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒理学试验的原则、程序、试验方法和结果评价方法。国家要求选择毒理学试验的原则是依据生产用菌种实行不同的安全评价，微生物肥料生产用菌种分为四级管理，其安全分级有目录，未列入附录中的菌种，除根瘤菌和乳杆菌(Lactobacillus)外，其余均需做毒理学试验。
第一级为免作毒理学试验的菌种。
第二级为需做急性毒性试验的菌种。
第三级为需做致病性试验的菌种。
第四级为禁用菌种。
本发明中选用的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641都属于第一级中“1.4分解磷钾化合物细菌类”免作毒理学试验的菌种，不属于第二级需做急性毒性(LD50)试验的菌种；不属于第三级需做致病性试验的菌种；不属于第四级禁用菌种。
在上述实施例1至实施例5基础上，进一步提供制备的生物复合肥料做急性毒性试验如下。
(一)产毒液体培养基的制备
1.马铃薯-酵母膏-蔗糖培养基
取去皮马铃薯200-300g，切成小块，加水1000mL，煮沸20min，纱布过滤，制成马铃薯汁并补充水分至1000mL，加入10g酵母膏，100g蔗糖，分装后121℃高压灭菌15min。
2.麦芽汁-酵母膏培养基
1000mL麦芽汁中加入10g酵母膏，分装后121℃高压灭菌15min。
麦芽汁-蛋白胨培养基
1000mL麦芽汁中加入1g蛋白胨，分装后121℃高压灭菌15min。
3.葡萄糖天门冬素培养基
调pH 7.2-7.4，分装后121℃高压灭菌15min。
4.高氏合成1号培养基
调pH 7.2-7.4，分装后121℃高压灭菌15min。
5.麦芽汁培养基
200mL麦芽汁分装后，121℃高压灭菌15min。
0.5％蛋白胨培养基
取2.0g葡萄糖，0.6g酵母膏，1.0g蛋白胨，4.0g琼脂，加蒸馏水至200mL，分装后121℃高压灭菌15min。
6.培养物制备
将送检菌种或转种的纯培养物(适宜的培养基斜面，28±1℃培养5-7d)，确证为纯培养物后，分别接种于适宜的产毒培养基中，一般菌种接种于麦芽汁-酵母膏、麦芽汁-蛋白胨及马铃薯-酵母膏-蔗糖三种产毒培养基中，放线菌接种于葡萄糖天门冬素培养基和高氏合成1号培养基中，红发夫酵母接种于麦芽汁培养基和0.5％蛋白胨培养基中，置28±1℃培养14d。将培养物经流动蒸汽1h后，过滤，所得滤液部分于80℃恒温下浓缩2.5倍备用，余者直接供实验用。
(二)小鼠毒力实验
每种产毒液体培养基需小鼠80只，雌雄各半，分别随机分为4组，每组10只。剂量组设置为：培养基空白对照组、培养基2.5倍浓缩空白对照组、培养物原液组、培养物2.5倍浓缩组。将受试物以20.0mL/kg BW的剂量给小鼠一次性灌胃后观察14d，记录实验过程中小鼠的中毒表现及死亡情况。
(三)试验数据统计
对小鼠的初始体重、终体重各实验原始数据进行方差齐性检验，满足“方差齐”要求的数据资料用两样本均数比较的t检验进行统计处理；对方差不齐的数据资料用t’检验进行统计处理。
(四)结果判定
小鼠的初始体重各组间均衡，受试物对终体重无不良影响，实验过程中小鼠未出现毒性反应或死亡，可判定受试菌种安全。
通过上述试验证实上述实施1至实施例6提供的生物复合肥料中选用的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCCNO.1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO.1641三种菌种作为受试菌种安全，其配伍符合生物安全性标准，在梨火病菌拮抗生防的应用是安全的，这实际上也是解决目前微生物肥料普遍存在所选用的菌种是否安全，选用的菌种是否经过安全性评价和试验验证，利用选用的菌种制备相应的生物肥料是否安全的关键。
实施例8：专门针对梨火病菌拮抗生防的生物复合肥料生物安全性检测试验
生物有机肥成品安全性结果如表1所示。由表1结果可知，该生物复合肥料符合中华人民共和国国家准《肥料登记急性经口毒性试验及评价要求》(NY1980-2010)中实际无毒级别。
表1：本发明生物复合肥料急性经口毒性试验结果
通过上述试验证实上述实施1至实施例6提供的生物复合肥料是符合生物安全性，在梨火病菌拮抗生防的应用是安全的，这实际上也是解决目前微生物肥料普遍存在生物安全性的关键。
实施例9：专门针对梨火病菌拮抗生防的生物复合肥料的性能测试
本实施例在实施例1-6的基础上，考察本发明所筛选的菌株及复配后制备的生物复合肥料对梨火疫病菌的抑制作用。
(1)试验方案
巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌由新疆惠森生物技术有限公司提供，梨火疫病菌株NCPPB1665，来自南京农业大学植物检疫实验室，LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，纯水1000mL。调pH值至7.0，121℃灭菌20min，加入琼脂即为固体培养基：0.8-0.9g/50mL。
(2)试验方法
用接种环蘸取少量梨火疫病在LB固体培养基上划线，然后置于28℃恒温培养箱中培养24h；挑取单菌落接种于装有25mL LB液体培养基的培养瓶中，在28℃，220r/min恒温摇床中震荡培养24h，将摇好的菌液调至OD600＝0.3(约1×108cfu/mL)备用；将待测生防菌接种于LB液体培养基中，在28℃，220r/min恒温摇床中震荡培养，将摇好的菌液调至OD600＝0.3(约1×108cfu/mL)备用；称取生物复合肥料10g，溶解在100mL无菌水中，得到稀释10倍的菌悬液，倍比稀释至10倍、100倍和500倍菌悬液用于活性测定；本试验采用平板涂布法，将稀释的菌悬液吸取100μL在LB固体培养基涂布，每个稀释倍数3个重复，28℃恒温培养24h后观测结果，统计每个稀释倍数涂板长出的菌落数，计算复合菌剂的活菌数，与初始芽孢数进行对比，复合菌剂的活菌数(CFU/mL)＝(菌落数×稀释倍数)/0.1mL；在含菌平板上滴加10μL拮抗细菌菌悬液，设置空白对照，每个处理重复3次，28℃恒温培养48h，观察抑菌效果，用十字交叉法测量抑菌圈直径和菌落直径，拮抗细菌的抑菌直径(mm)＝抑菌圈直径-菌落直径。具体测试结果参见附图1和表2-3所示。
(3)试验结果
由附图1数据可知，通过平板对峙法，对3株有生防细菌进行拮抗作用测定，其拮抗效果大小顺序为解淀粉芽孢杆菌(9.03mm)＞巨大芽孢杆菌(4.38mm)＞胶冻样芽孢杆菌(0.78mm)；由表2-3数据可知，生物肥料的活菌数为3.03×108CFU/g与制剂的初始芽孢数十分接近，由此可见，制剂中生防菌能较长时间保持活性，在稀释10、100和500倍的浓度下，生物肥料对梨火疫病菌有很好的抑制作用，其中稀释10倍时的效果最好，抑菌直径为5.71±0.51mm。
表2：不同稀释倍数的复合菌剂的活菌数
稀释倍数 复合菌制剂菌落数(个/mL)
107 4、3、1
106 30、35、27
105 351、341、337
活菌数(CFU/mL) 3.03×108
表3：生物肥料对梨火疫病菌的抑制作用
生物肥料浓度(倍数) 抑菌直径(mm)
10 5.71±0.51
100 3.83±0.31
500 0.81±0.14
实施例10：专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料的应用
本实施例在实施例1-7的基础上，对本发明实施例2配方和实施例6制备方法提供的专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料在新疆库尔勒香梨种植中的应用。对比不同处理对土壤中农药、重金属及病菌变化的影响，考察本发明生物复合肥对提升耕地质量，提高土壤生产能力的影响。
(1)试验方案
试验地点：新疆库尔勒沙依东园艺场十六分场冯乃德梨园
试验时间：2018年10月到2019年9月
对照产品：“惠森”商品有机肥(对照1)，市售某厂家生物有机肥(对照2)，市售某厂家商品有机肥(对照3)
试验田土壤情况：本试验土壤类型为灰漠土(2018年10月21日取样)，试验前土壤基本状况为：有机质11.6g/kg、水解氮58.3mg/kg、速效磷11.8mg/kg、速效钾142.1mg/kg、pH值7.42；试验前试验地土壤重金属及农残情况：铅15.237mg/kg、汞0.011mg/kg、砷0.056mg/kg、镉0.043mg/kg、铬46.377mg/kg、有机磷农残总量0.26mg/kg、六六六0.18mg/kg、滴滴涕0.16mg/kg。
供试作物品种：库尔勒香梨。2002年3月种植，定植穴直径0.8米，深度0.6米，4.5×3.5米的株行距，2018年已有16年树龄，树冠直径约3.2米，进入盛果期。试验四个处理，三次重复，设12个小区，随机区组排列，每个试验小区1亩，其中每小区随机划定10棵树，长22.5米，宽7米，面积为157.5平方米作对照，小区之间设有30cm畦埂，田间管理一致。
表4：不同处理对香梨产量的影响
由表4数据可知，施用本发明提供的生物复合肥，香梨的产量最高，平均亩产量达到923.6kg，比本公司“惠森”有机肥平均亩产增产67.7kg，增产7.91％；较市售某厂家生物有机肥平均亩增产117.2kg，增产14.53％；与市售某厂家生物商品肥相比，平均亩增产131.2kg，增产16.56％。
表5：方差分析
由表5对不同处理产量进行方差分析可知，处理F＝48.64954，F＞F0.01(3,6)，说明不同处理间差异达到1％的极显著水平。
表6：多重比较
由表6多重比较结果可知，本发明比其他处理产量差异数均达到显著水平，说明本发明提供的生物复合肥料有明显的增产效果，与“惠森”商品有机肥相比，说明微生物活菌对香梨产量指标差异明显。
(2)不同肥料对土壤养分变化的影响试验
表7：不同肥料处理对土壤养分变化的影响
由表7数据可知，本发明提供的生物复合肥料处理后，土壤有机质提高2.3g/kg，水解氮提高2.1mg/kg，有机磷提高0.8mg/kg，速效钾提高3.1mg/kg，活菌数提高0.8千万/g。
(3)不同肥料对土壤重金属和持久性有机污染物变化的影响
表8：不同肥料处理对土壤主要理化性状的影响
由表8数据可知，施用本发明提供的生物复合肥料，土壤中的汞含量降低0.001mg/kg，降低9.09％，砷含量降低0.004mg/kg，降低7.14％，镉含量降低0.010mg/kg，降低26.26％；铅含量降低0.152mg/kg，降低1.00％；铬含量降低0.928mg/kg，降低2.00％；有机磷农残总含量降低0.21mg/kg，降低80.77％；六六六含量降低0.14mg/kg，降低77.78％，滴滴涕含量降低0.13mg/kg，降低81.25％，表明本发明提供的生物复合肥料对土壤中重金属和农药残留都有显著的改善。
(4)不同肥料在耕作层停留时间试验
本试验通过对比本发明提供的生物复合肥料与市售有机肥有效成分在耕作层停留时间分布，判断在耕作层有效农作为根系层分布关系。
试验方案：本试验采用附图2所示装置，该装置由上、中、下三部分相同规格(Φ10cm×11cm)有机玻璃圆柱连接而成，其中：上、中段玻璃圆柱无地面，采用纱布隔开，防治取样时土壤从培养柱中漏出，最下面一段玻璃圆柱底部开有均匀小孔，以利径流水分的顺利流出，具体测试结果见附图3-5所示。
由附图3数据可知，在模拟施肥条件下从施入土地到25天的试验段中，其他表下15cm(模拟耕作层植物根系层)B3、B4组比对比组B0、B1、B2速效氮随培养时间的变化含量菌高出25-400％。
由附图4数据可知，在模拟施肥条件下从施入土地到25天的试验段中，其他表下15cm(模拟耕作层植物根系层)B3、B4组比对比组B0、B1、B2速效磷随培养时间的变化含量菌高出12-210％。
由附图5数据可知，在模拟施肥条件下从施入土地到25天的试验段中，其他表下15cm(模拟耕作层植物根系层)B3、B4组比对比组B0、B1、B2速效钾随培养时间的变化含量菌高出6-170％。
以上数据表明，本发明提供的生物复合肥料与市售有效成分相当生物有机肥料在模拟施肥条件下设备中持续25天，三个重读试验数据表明，本发明提供的生物复合肥料在模拟耕作层15cm(模拟植物根系层)处速效氮、磷、钾均显著高于对比组。具有显著的提高肥料速效氮、磷和钾利用率条件。
(5)施用本发明生物复合肥对库尔勒香梨品质的影响
本试验在试验1-4的基础上，对施用本发明实施例2配方和实施例6制备方法提供的生物复合肥料生产的库尔勒香梨进行营养品质鉴定，依据CAQS/MTYX2004-2019，GB/T21488-2008，GB/T12947-2008，GB/T5009.268-2016，GB2762-2017，GB2763-2019等检验标准，对库尔勒香梨的感官、营养品质和卫生指标进行评价，具体结果参见表9所示。
表9：不同肥料处理对库尔勒香梨品质的影响
由表9部分测试数据可知，本试验通过对库尔勒香梨感官、营养品质及卫生安全指标进行测试，本发明提供的生物复合肥料应用于库尔勒香梨种植，香梨果形端正、大小均匀，果皮青绿色，有光泽，与对同类产品的参照相比，本发明所得的库尔勒香梨可溶性固形物含量提高11.1％，固酸比提高45％，糖酸比提高47.9％，总酸含量降低23.1％，VC(提高7.1％)、钾(提高14.9％)、钙(提高18.2％)、铁(提高33.5％)、锌(提高60.0％)含量均有提高，因此本发明产品口感更佳，营养更丰富，风味更佳；进一步对有害重金属和农药残留含量进行了测定，测定结果均在限量以下，食用安全，2020年4月14日，本发明获得库尔勒香梨产品经农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量碱度检验测试中心全国名特优新农产品营养品质评价鉴定机构检测，最终给出本发明产品的综合评价为：施用本发明生物复合肥料产出的库尔勒香梨具有感官品质佳、营养品质优、安全健康的特征，综合评价优级。
综上所述，本发明创造性的提出的能够用于防治梨火疫病的生物复合肥料的技术方案，通过特定比例的菌种复配在形成稳定微生态并保障较高的活菌数，不仅能够保障植株正常生长的并且具有显著的梨火疫病防治效果，将其应用于库尔勒香梨的种植，平均增产约16.56％，能增加土壤中的有机质含量，土壤理化性质有了明显改善，能有效改善和降解土壤农药污染、重金属污染和病菌污染等土壤污染物的能力，提升耕地质量，提高土壤生产能力，对防治梨火疫病具有广泛的实用价值。
本发明不仅局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方案实施本发明。因此，凡采用本发明的自动快速搜索技术方案和思路，做一些简单的变化或更改的设计，都落入本发明保护范围。

Claims (2)

1.一种专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料，其特征在于，该生物复合肥料包括复合菌剂和复合物料，所述复合物料，按照重量份计，包括牛粪20份，羊粪20份，油渣40份，矿物源腐殖酸30份；复合菌剂按照复合物料质量百分比0.4％接种；所述复合菌剂为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ATCC NO. 1978，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO. 1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO. 1641发酵液按照质量比1:1:1混合获得；
该复合肥料具体采用如下步骤获得：
(1)选取低温保存的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ATCC NO. 1978，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO. 1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO. 1641分别接种至NA培养基平板，30℃培养12h左右，待长出单菌落，挑取单菌落分别接种至200m LNB培养液中，于30℃160rpm恒温摇床中活化培养12h或24h，作为种子液；
(2)将步骤(1)中获得的种子液分别接种至装有7L相应液体培养基的发酵罐中，发酵培养10-15h，活菌数达到5×109cfu/m L，获得各菌的发酵液；
(3)将步骤(2)获得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ATCC NO.1978、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC NO. 1640和胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC NO. 1641发酵液按照质量比进行复配，制备获得复合菌剂；
(4)收集水分控制在85％以下并且无明显其它杂质的牛粪、羊粪和油渣(1：1：2)，堆置成高1-1.5米、宽1.5-2米、长度4米，发酵时间为40天以上至物料完全腐熟；发酵过程中控制水分含量在60-65％，水分判断：手抓紧一把物料，指缝见水但不滴水，落地即散；
(5)将步骤(3)中制备获得的复合菌剂，按比例与步骤(4)中制备获得完全腐熟牛羊粪和油渣物料及矿物源腐殖酸制得的复合物料混合，翻拌均匀，包装，获得专门针对梨火病菌拮抗生防中应用的生物复合肥料。
2.如权利要求1所述的生物复合肥料在制备专门针对防治梨火疫病肥料中的应用。
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