[go: up one dir, main page]

CN114990164B - 中介体复合物亚基抑制剂及其应用 - Google Patents

中介体复合物亚基抑制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114990164B
CN114990164B CN202210685944.1A CN202210685944A CN114990164B CN 114990164 B CN114990164 B CN 114990164B CN 202210685944 A CN202210685944 A CN 202210685944A CN 114990164 B CN114990164 B CN 114990164B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
med16
expression
activity
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210685944.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114990164A (zh
Inventor
李湘盈
谢思
赵欣滢
吴帆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Priority to CN202210685944.1A priority Critical patent/CN114990164B/zh
Publication of CN114990164A publication Critical patent/CN114990164A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114990164B publication Critical patent/CN114990164B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

本公开涉及促进造血干细胞或血液祖细胞分化为红细胞或其前体细胞的方法，所述方法包括使所述造血干细胞或血液祖细胞与抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂接触的步骤。本公开还涉及抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂在制备用于治疗受试者中与造血功能异常相关的疾病的药物中的用途，以及检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂在制备用于对受试者中与造血功能异常相关的疾病进行诊断或预后的试剂盒中的用途。

Description

中介体复合物亚基抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及抑制中介体复合物的尾部亚基例如MED16的表达和/或活性的抑制剂在促进造血干细胞或血液祖细胞分化为红细胞或其前体细胞，以及在相关疾病治疗中的用途。
背景技术
造血在脊椎动物进化过程中是保守的。造血干细胞(HSC)存在于成人骨髓中，可以维持所有血细胞的持续产生，并在稳定状态下作为可逐渐发育为多个或单个谱系的祖细胞。祖细胞产生负责单谱系分化和成熟血细胞产生的血液前体，包括骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)、红细胞、巨核细胞和淋巴细胞(Bryder,D.等人,I.L.Hematopoietic stem cells:the paradigmatic tissue-specific stem cell.Am JPathol 169,338-346)。红细胞生成是造血干细胞(HSC)增殖和分化以产生成熟红细胞(RBC)的过程(Orkin,S.H.和Zon,L.I.Hematopoiesis:an evolving paradigm for stemcell biology.Cell132,631-644；Dzierzak,E.和Philipsen,S.Erythropoiesis:development and differentiation.Cold Spring Harb Perspect Med 3,a011601)。机体以多种复杂机制在狭窄的正常范围内调节RBC的数量(Hattangadi,S.M.等人，From stemcell to red cell:regulation of erythropoiesis at multiple levels by multipleproteins,RNAs,and chromatin modifications.Blood 118,6258-6268)。
一旦造血功能失控，就会导致各类疾病和发育障碍，例如骨髓增生异常综合征(MDS)。MDS主要发生在70岁左右的患者中，发病率最高达每年每10万人4-5例(Cazzola,M.Myelodysplastic Syndromes.N Engl J Med 383,1358-1374)。MDS是常见的髓系恶性肿瘤，定义为骨髓发育不良、血细胞减少、造血效率低下以及进展为急性髓性白血病(Chen,B.Y.等人，SETD2 deficiency accelerates MDS-associated leukemogenesis viaS100a9 in NHD13 mice and predicts poor prognosis in MDS.Blood 135,2271-2285)。包括涉及RNA剪接、转录调节、DNA修复的控制、DNA甲基化、信号传导、组蛋白修饰和黏连蛋白复合物在内的一些突变驱动基因可导致MDS(Ogawa,S.Genetics of MDS.Blood 133,1049-1059)。已有一些治疗MDS的方法，例如异基因干细胞移植和药物治疗。尽管近年来对MDS病理生理学的认识有了显著提高，但仍需要更多的努力来寻找新的生物标志物以取得治疗进展(Cazzola,M，如上引用)。
在造血过程中，依赖于细胞特异性转录因子的调节活性来精细地自我更新和分化。转录因子使用辅助调节因子通过一般转录机制传递信息，并确保特定基因表达程序的正确和适当输出(Aranda-Orgilles,B.等人，MED12 Regulates HSC-Specific EnhancersIndependently of Mediator Kinase Activity to Control Hematopoiesis.Cell StemCell 19,784-799,)。
中介体复合物(mediator complex)是进化上保守的复合物，其作为转录因子活性的关键共同调节因子以及增强子和启动子之间的功能桥梁发挥作用。中介体是包括头部、中间、尾部和激酶模块的大型多蛋白复合物(Allen,B.L.和Taatjes,D.J.The Mediatorcomplex:a central integrator of transcription.Nature reviews.Molecular cellbiology 16,155-166；Jeronimo,C.和Robert,F.The Mediator Complex:At the Nexus ofRNA Polymerase II Transcription.Trends in cell biology 27,765-783；Soutourina,J.Transcription regulation by the Mediator complex.Nature reviews.Molecularcell biology 19,262-274；Soutourina,J.Mammalian Mediator as a Functional Linkbetween Enhancers and Promoters.Cell 178,1036-1038；Andre,K.M.等人,MediatorRoles Going Beyond Transcription.Trends Genet 37,224-234)。中介体在例如转录起始、延伸、暂停释放、相分离和染色质结构的各种基本过程中发挥着重要作用(Allen,B.L.和Taatjes,D.J.，如上引用)。然而每个模块和每个子单元对中介体功能的贡献在很大程度上仍未得到探索。
核心中介体(头部和中间模块，以及骨架亚基MED14)足以在体外发挥中介体功能(Cevher,M.A.等人，Reconstitution of active human core Mediator complex revealsa critical role of the MED14 subunit.Nat Struct Mol Biol 21,1028-1034)。与核心中介体不同，中介体的尾部模块是转录因子的主要靶点，可以导致诱导型基因调控。尾部模块的亚基可以以环境依赖的方式作为转录功能的激活剂或阻遏剂发挥作用(Ding,N.等人，Mediator links epigenetic silencing of neuronal gene expression with x-linkedmental retardation.Molecular cell 31,347-359；Tsutsui,T.等人，Mediator complexrecruits epigenetic regulators via its two cyclin-dependent kinase subunitsto repress transcription of immune response genes.The Journal of biologicalchemistry 288,20955-20965；Chen,X.等人，Med23 serves as a gatekeeper of themyeloid potential of hematopoietic stem cells.Nature communications 9,3746；Liu,Z.等人，Mediator MED23cooperates with RUNX2 to drive osteoblastdifferentiation and bone development.Nature communications 7,11149；Sun,Y.等人，The mediator subunit Med23 contributes to controlling T-cell activationand prevents autoimmunity.Nature communications 5,5225；Yin,J.-w.等人，MediatorMED23 plays opposing roles in directing smooth muscle cell and adipocytedifferentiation.Genes Dev 26,2192-2205；Wang,W.等人，Mediator MED23 LinksInsulin Signaling to the Adipogenesis Transcription Cascade.Developmentalcell 16,764-771)。然而，尾部模块的作用在很大程度上仍然是未知的，尤其是在细胞发育过程中其扮演的角色。
中介体的亚基与不同的转录因子协同作用，与转录因子的相互作用和模块的稳定性可归因于MED16。在酵母中，MED16缺失可以将中介体分成两个稳定的亚复合体(Saleh,M.M.等人,Connection of core and tail Mediator modules restrains transcriptionfrom TFIID-dependent promoters.PLoS Genet 17,e1009529)。MED16在人类细胞系统中显示出在抗氧化基因表达中的潜在作用(Sekine,H.等人，The Mediator Subunit MED16Transduces NRF2-Activating Signals into Antioxidant Gene Expression.Mol CellBiol 36,407-420；Lu,Y.等人，Activation of NRF2 ameliorates oxidative stress andcystogenesis in autosomal dominant polycystic kidney disease.Sci Transl Med12)。MED16可以与STAT1相互作用以调节IFNγ诱导的MHCII表达，从而激活巨噬细胞中的T细胞(Kiritsy,M.C.等人，A genetic screen in macrophages identifies newregulators of IFNgamma-inducible MHCII that contribute to T cellactivation.eLife 10)。最近发现MED16在甲状腺乳头状癌中低表达，可导致TGF-β信号传导和放射性碘抵抗增加(Gao,H.等人，Mediator complex subunit 16is down-regulatedin papillary thyroid cancer,leading to increased transforming growth factor-beta signaling and radioiodine resistance.The Journal of biological chemistry295,10726-10740)。然而对MED16或其它中介体尾部模块在细胞发育过程，尤其在生理和病理条件下的造血系统中的功能是未知的。
发明内容
本发明人令人惊讶的发现，中介体复合物尾部模块的亚基在造血发育过程中抑制红细胞和髓系细胞的发育。对尾部模块的亚基例如MED16的抑制(例如敲低其表达)可以促进造血干细胞和血液祖细胞向红细胞分化，验证了其可以作为造血功能异常相关疾病例如MDS的治疗靶点。并且，中介体复合物尾部模块的亚基例如MED16的高表达可以作为与造血功能异常相关的疾病例如MDS的生物标志物，对患者进行诊断和预后。
相应地，在第一方面，本公开涉及一种促进造血干细胞或血液祖细胞分化为红细胞或其前体细胞的方法，所述方法包括使所述造血干细胞或血液祖细胞与抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂接触的步骤。
红系发育是造血发育的重要分支，其中红细胞是血液中数量最多的细胞类型，同时是人体含量最丰富的细胞，在红细胞120天的生命周期内，其能够穿梭于身体内各个组织和器官行使输送氧气这一生理功能。在成年人中，成熟的红细胞是源自HSC的终末分化产物。Weissman研究组提出的经典造血分化模型认为HSC经历了一系列谱系选择的命运决定，潜力越来越有限，造血干细胞生成多能祖细胞(Multipotent progenitor，MPP)，MPP产生了淋巴细胞祖细胞(Lymphocyte progenitor cell，LPP)或髓样祖细胞(Myeloid progenitorcell，MyP)，MyP生成粒细胞巨噬细胞祖细胞(Granulocyte macrophage progenitor cell，GMP)或巨核细胞-红系祖细胞(Megakaryocytes-erythroid progenitor，MEP)，最终致力于红细胞生成(Dzierzak and Philipsen 2013,An,Schulz et al.2014)。
传统上，红细胞生成分为三个阶段：早期红细胞生成，红系终末分化和网织红细胞成熟。早期红细胞生成涉及将多谱系祖细胞定型为红细胞祖细胞，然后增殖和分化为早期红系祖细胞集落形成单位(Burst forming unit-erythroid，BFU-E)和晚期红系祖细胞克隆形成单位(Colony forming unit-erythroid，CFU-E)，再分化为原红细胞(Proerythroblast，Pro)。红系终末分化开始于Pro分化为早幼红细胞(Basophilicerythroblast，Baso)，然后是多色的成红细胞(Polychromatic erythroblast，Poly)，再分化为原色的成红细胞(Orthochromatic erythroblast，Ortho),其逐渐成为网织红细胞(Reticulocyte)，红系终末分化期间发生许多变化。红系细胞的体积减小，血红蛋白的合成增加，经历膜重组和染色质浓缩,然后去核(Hattangadi,Wong et al.2011,Wong,Hattangadi et al.2011)。在红细胞生成的最后阶段,网织红细胞成熟为红细胞，丧失细胞内细胞器，减少细胞体积和表面积，并且重新组织红细胞膜。因此，红系发育需要精细而复杂的调控,这个过程会受到多种因素的严格调控。
在一些实施方案中，其中所述血液祖细胞选自多能祖细胞(MPP)、髓样祖细胞(MyP)、巨核细胞-红系祖细胞(MEP)或红系祖细胞。
在一些实施方案中，所述红细胞的前体细胞选自早期红系祖细胞集落形成单位(BFU-E)、晚期红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)、原红细胞(Pro)、早幼红细胞(Baso)、成红细胞(Ortho)和网织红细胞。
哺乳动物中的转录中介体复合物包括33个亚基，在结构上分成头部、中部、尾部和CDK8激酶等模块。MED14作为转录中介体复合物的骨架，具有促进模块之间相互作用，稳定复合物的功能。头部亚基包括MED6、MED8、MED11、MED17、MED18、MED20、MED22，中部亚基包括MED1、MED4、MED7、MED9、MED10、MED19、MED21、MED26、MED31，尾部亚基包括MED15、MED27、MED28、MED29、MED30、MED16、MED23、MED24、MED25，CDK8激酶模包括MED12/12L、MED13/13L、CCNC、CDK8/19。头部和中部模块的亚基通过MED14形成一个功能性和结构性的核心，与PolⅡ相互作用；CKD8激酶模块通过与核心中介体相互作用，抑制转录中介体复合物与PolⅡ相互作用，转录的起始伴随着CDK8激酶从转录中介体复合物的解离，尾部具有可变性，包含与激活因子和抑制因子作用的亚基(Tsai et al.,2014)。研究表明，尾部模块的MED25通过阻断PRC2结合到HFN4a基因上，解除Polycomb的抑制作用(Englert et al.,2015)
在一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以选自MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中的一种或多种。在一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中任一种。在另一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中的两种或更多种。
在一些优选的实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基包括MED16。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以选自抑制性RNA分子、其编码序列、包含所述编码序列的载体(vector)和小分子化合物。
在一些实施方案中，所述抑制性RNA分子或其编码序列(DNA序列)可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，其中所述抑制性RNA分子可以选自siRNA、shRNA和microRNA。
任何载体都可以适用于本公开。在一些实施方案中，载体可以是表达载体。表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括被设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者的载体，例如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)和pEX系列(Clontech，PaloAlto，Calif.)。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或其任意组合。在一些实施方案中，所述载体选自慢病毒载体和腺相关病毒载体。
在本公开第一方面的一些实施方案中，所述方法是体外方面。在另一些实施方案中，所述方法是体内方法，例如在受试者体内进行。
在第二方面，本公开涉及一种治疗或预防受试者中与造血功能异常相关的疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂的步骤。
在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本发明的病毒载体或病毒颗粒或组合物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物。
在一些实施方式中，受试者是非人哺乳动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等)。在一些实施方式中，受试者是灵长类动物例如非人灵长类动物。在一些实施方式中，受试者是人。
在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。
在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。
在另一些实施方案中，所述方法包括：
a.从受试者或来自受试者的样品分离造血干细胞或血液祖细胞；
b.使所述造血干细胞或血液祖细胞与抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂接触；
c.将b中获得的接触后的造血干细胞或血液祖细胞输注回所述受试者。
在一些实施方案中，来自受试者的样品选自骨髓样品和外周血。
在第三方面，本公开涉及抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂，其用于治疗受试者中与造血功能异常相关的疾病的方法中。在一些实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂的步骤。
在另一些实施方案中，所述方法包括：
a.从受试者或来自受试者的样品分离造血干细胞或血液祖细胞；
b.使所述造血干细胞或血液祖细胞与抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂接触；
c.将b中获得的接触后的造血干细胞或血液祖细胞输注回所述受试者。
在一些实施方案中，来自受试者的样品选自骨髓样品和外周血。
在第四方面，本公开涉及抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂在制备用于治疗受试者中与造血功能异常相关的疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述药物用于以下方法，所述方法包括对所述受试者施用抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂。
在另一些实施方案中，所述药物用于以下方法，所述方法包括：
a.从受试者或来自受试者的样品分离造血干细胞或血液祖细胞；
b.使所述造血干细胞或血液祖细胞与抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂接触；
c.将b中获得的接触后的造血干细胞或血液祖细胞输注回所述受试者。
在一些实施方案中，来自受试者的样品选自骨髓样品和外周血。
在本公开的第二方面、第三方面、第四方面的一些实施方案中，所述与造血功能异常相关的疾病可以选自骨髓增生异常综合征(MDS)和白血病，例如慢性粒细胞白血病(CML)或急性髓性白血病(AML)。
慢性粒细胞白血病(CML)是一种白细胞癌症，其特征是骨髓中髓细胞的生长增加且不受调节，以及这些细胞在血液中的积累。CML是一种克隆性骨髓干细胞疾病，其中发现成熟粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)及其前体的增殖，干扰正常红细胞生成，导致红细胞数量减少和造血不足。
急性髓性白血病(AML)是一种髓系血细胞癌症，其特征是异常细胞快速生长。类似的，这些细胞在骨髓和血液中积聚并干扰正常血细胞生成.
在本公开的第二方面、第三方面、第四方面的一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以选自MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30的一种或多种。在一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中任一种。在另一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中的两种或更多种。
在一些优选的实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基包括MED16。
在本公开的第二方面、第三方面、第四方面的一些实施方案中，所述抑制剂可以选自抑制性RNA分子、其编码序列、包含所述编码序列的载体和小分子化合物。
在一些实施方案中，所述抑制性RNA分子或其编码序列(DNA序列)可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，所述抑制性RNA分子可以选自siRNA、shRNA和microRNA。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或其任意组合。在一些实施方案中，所述载体选自慢病毒载体和腺相关病毒载体。
在本公开的第二方面、第三方面、第四方面的一些实施方案中，所述受试者可以是人类或非人灵长类动物。
在第五方面，本公开涉及一种诊断受试者中与造血功能异常相关的疾病的方法，所述方法包括：
a.将检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂与来自所述受试者的样品接触；
b.对所述样品中的中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述受试者的样品中，中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性高指示所述疾病的存在或风险。
在第六方面，本公开涉及检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂，其用于诊断受试者中与造血功能异常相关的疾病的方法，所述方法包括：
a.将所述试剂与来自所述受试者的样品接触；
b.对所述样品中的中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述受试者的样品中，中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性高指示所述疾病的存在或风险。
在第七方面，本公开涉及检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂在制备用于诊断受试者中与造血功能异常相关的疾病的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于以下方法：
a.将所述试剂与来自所述受试者的样品接触；
b.对所述样品中的中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述受试者的样品中，中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性高指示所述疾病的存在或风险。
在第八方面，本公开涉及一种对患有造血功能异常相关的疾病的患者进行预后的方法，所述方法包括：
a.将检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂与来自所述受试者的样品接触；
b.对所述样品中的中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述患者的样品中，中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性高指示预后差。
在第九方面，本公开涉及检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂，其用于对患有造血功能异常相关的疾病的患者进行预后的方法，所述方法包括：
a.将所述试剂与来自所述患者的样品接触；
b.对所述样品中的中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述患者的样品中，中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性高指示预后差。
在第十方面，本公开涉及检测中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的试剂在制备用于对患有造血功能异常相关的疾病的患者进行预后的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于以下方法：
a.将所述试剂与来自所述患者的样品接触；
b.对所述样品中的中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述患者的样品中，中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性高指示预后差。
在本公开的第五方面至第十方面的一些实施方案中，所述在一些实施方案中，来自受试者的样品选自骨髓样品和外周血。
在本公开的第五方面至第十方面的一些实施方案中，所述与造血功能异常相关的疾病可以选自骨髓增生异常综合征(MDS)和白血病，例如慢性粒细胞白血病(CML)或急性髓性白血病(AML)。
在本公开的第五方面至第十方面的一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以选自MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30的一种或多种。在一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中任一种。在另一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中的两种或更多种。
在一些优选的实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基包括MED16。
在本公开的第五方面至第十方面的一些实施方案中，所述试剂可以是用于选自下组的方法的检测试剂：流式细胞术、ELISA、免疫组化分析、基于PCR的定量方法、原位杂交、转录组分析、基于微阵列的基因表达谱分析。
在一些实施方案中，所述试剂可以是特异性结合中介体复合物的尾部亚基中的任一种的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与可检测部分偶联，例如所述可检测部分可以选自生物素、链霉抗生物素蛋白、酶或其催化活性片段、放射性核素、纳米颗粒、顺磁性金属离子或荧光、磷光，或化学发光分子。用于诊断目的的可检测部分包括例如荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂等。
在另一些实施方案中，所述试剂是与编码所述中介体复合物的尾部亚基中的任一种的核苷酸序列(例如基因序列或mRNA序列)的至少一部分杂交的核苷酸序列，例如引物或探针。
在本公开的第五方面至第十方面的一些实施方案中，所述受试者可以是人类或非人灵长类动物。
在第十一方面，本公开涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含抑制中介体复合物的尾部亚基的表达和/或活性的抑制剂，和任选的药学上可接受的载体(carrier)和/或赋形剂，所述药物组合物用于治疗受试者中与造血功能异常相关的疾病。
术语“药学上可接受”是指载体或赋形剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或这些载体或佐剂被批准或可用于包含在对人类肠胃外给药的药物组合物中。
在一些实施方案中，所述与造血功能异常相关的疾病可以选自骨髓增生异常综合征(MDS)和白血病，例如慢性粒细胞白血病(CML)或急性髓性白血病(AML)。
在一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以选自MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30的一种或多种。在一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中任一种。在另一些实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基可以包括MED15，MED16，MED23、MED24、MED25、MED27、MED28、MED29和MED30中的两种或更多种。
在一些优选的实施方案中，所述中介体复合物的尾部亚基包括MED16。
在一些实施方案中，所述抑制性RNA分子或其编码序列(DNA序列)可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，所述抑制性RNA分子可以选自siRNA、shRNA和microRNA。
在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、鼠白血病病毒载体、SFG载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein Barr病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或其任意组合。在一些实施方案中，所述载体选自慢病毒载体和腺相关病毒载体。
附图说明
图1：图1A.编码MED16 shRNA(shMED16-1)的慢病毒感染的敲低效率。图1B.细胞的荧光激活细胞分选(FACS)表面标志物分析。CD235+细胞百分比统计图(左)。shSCR和shMED16转导培养的CD34+细胞在第5天的代表性FACS分析图(右)。图1C.细胞的荧光激活细胞分选(FACS)表面标志物分析。shSCR、shMED15和shMED23转导培养的CD34+细胞在第5天的代表性FACS分析图。图1D.细胞的FACS表面标志物分析。去核网织红细胞为CD235a+Hoechst-。去核网织红细胞百分比的统计图(左)。shSCR和shMED16转导培养的CD34+细胞在第12天的代表性FACS分析图(右)。
图2显示了CD34+细胞中的Annexin V染色结果。
图3显示了集落形成测定结果。图3A显示了shSCR和shMED16转导培养的CD34+中早期红系祖细胞集落形成单位(Burst forming unit-erythroid，BFU-E)和晚期红系祖细胞克隆形成单位(Colony forming unit-erythroid，CFU-E)的细胞集落计数。图3B显示了BFU-E和CFU-E的集落面积统计图。
图4：图4A.MED16 siRNA核转染的敲低效率。图4B.细胞的代表性FACS表面标志物分析。
图5：图5A.shSCR和shMED16转导的K562细胞沉淀的颜色。图5B.K562细胞中的联苯胺染色显示。图5C.细胞的代表性FACS表面标志物分析。
图6：图6A.来自外周血单核细胞(PBMC)和骨髓单核细胞(BMMNC)的人原代造血干细胞和祖细胞系统中的敲低效率。图6B.细胞的代表性FACS表面标志物分析(左)。CD235+细胞百分比的统计图(右)。数据代表平均值±SD；p值由双尾学生t检验确定(p＜0.001***，p＜0.01**，p＜0.05*)。
图7显示了移植实验中流式细胞术的门控策略。
图8显示了MED16敲低促进体内髓系和红系谱系重建的结果：图8A.来自骨髓的红系细胞的代表性FACS表面标志物分析(左)和统计图(右)，n＝4只小鼠。图8B.来自骨髓的髓系细胞的代表性FACS表面标志物分析(左)和的统计图(右)，n＝4只小鼠。髓系细胞为hCD33+细胞。图8C.来自骨髓的B细胞的代表性FACS表面标志物分析(左)和的统计图(右)，n＝4只小鼠。B细胞为hCD19+细胞。图8D.来自骨髓的T细胞的代表性FACS表面标志物分析(左)和统计图(右)，n＝4只小鼠。T细胞为hCD3+细胞。数据代表平均值±SEM；p值由双尾学生t检验确定(p＜0.001***，p＜0.01**，p＜0.05*)。
图9：图9A.来自脾脏(左)的髓系细胞(上)和B细胞(下)的代表性FACS表面标志物分析和统计图(右)，n＝4只小鼠。图9B.来自外周血(左)的髓系细胞(上)和B细胞(下)的代表性FACS表面标志物分析和统计图(右)，n＝4只小鼠。数据代表平均值±SEM；p值由双尾学生t检验确定(p＜0.001***，p＜0.01**，p＜0.05*)。
图10显示了MED16在第0天抑制先天免疫基因表达：图10A.显示第0天差异表达基因的热图(|倍数变化|>1.5，p值<0.05)。图10B.上调(顶部)和下调(底部)基因的GO术语的分别富集。图10C.GSEA分析显示MED16敲低富集的IL-22特征，这与第0天的应激造血有关。右热图代表IL-22特征基因集。
图11显示了来自人原代造血干细胞和祖细胞系统的培养第4天的CD34+细胞的shSCR/shMED16的Bulk RNA-seq分析。图11A.显示第4天差异表达基因的热图(|倍数变化|>1.5,p值<0.05)。右边的数据条代表不同的组别。图11B.来自(a)的上调和下调基因的GO术语的富集。图11C.GSEA分析说明MED16敲低在第4天富集应激造血。图11D.显示代表性红系细胞基因组(左)和先天免疫基因组(右)的热图。
图12显示了MED16抑制scRNA-seq中先天免疫基因和红系基因的表达。图12A.t-SNE图显示了第4天合并的shSCR(n＝17674)和shMED16(n＝14935)细胞的8个细胞簇。图12B.不同簇中的代表性标志物基因。图12C.t-SNE图显示了基于细胞周期的细胞簇。
图13显示了人原代造血干细胞和祖细胞系统在培养第4天的shSCR/shMED16细胞的单细胞RNA-seq分析。图13A.红系细胞和髓系细胞上调基因的GO术语的分别富集。图13B.直方图显示鉴定的红系细胞、髓系细胞和其他细胞群的比例。图13C.代表基因在shSCR和shMED16之间不同簇中的表达。
图14：图14A.来自脐带血的MED16过表达培养的CD34+细胞在第12天的代表性FACS表面标志物分析。去核网织红细胞为CD235a+Hoechst-。图14B.来自脐带血的人原代造血干细胞和祖细胞系统中MED16过表达后MED16基因相对表达的qRT-PCR分析。
图15：图15A.健康受试者和MDS患者的CD34+细胞中MED16的差异表达。图15B.不同亚型的健康受试者和MDS患者CD34+细胞中MED16的表达水平。表达微阵列数据下载自GEO数据库(GSE19429)。图15C.来自健康受试者和来自不同数据库的AML和MDS患者的CD34+细胞中不同模块的中介体亚基的差异表达。
图16：图16A.来自健康受试者(n＝9)和MDS患者(n＝11)的骨髓单核细胞中MED16表达的qPCR分析。图16B.MED16敲低后患者细胞的代表性FACS表面标志物分析。图16C.MED16敲低后CD235+细胞统计图。图16D.MED16敲低后患者细胞颗粒的颜色。数据代表平均值±SD；p值由双尾学生t检验确定(p＜0.0001****，p＜0.001***，p＜0.01**，p＜0.05*)。
图17显示了MED16敲低后的代表性上调基因列表。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
通过结合附图对以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和优点将在下文中得到更清楚的理解。
此处参照附图描述的实施方案是解释性的，说明性的，并用于普遍理解本发明。实施方案不应解释为限制本发明的范围。相同或相似的要素和具有相同或相似功能的要素在整个描述中使用相同的附图标记表示。
本申请实施例中使用的各个shRNA和siRNA的序列如下。
shMED16-1(SEQ ID NO:1)：
TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCGACATTGACAAGGTCATGATTAGTGAAGCCACAGATGTAATCATGACCTTGTCAATGTCGATGCCTACTGCCTCGG
shMED16-2(SEQ ID NO:2)：
TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGATGGCTGCACAATGGTGTGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCACACCATTGTGCAGCCATTGCCTACTGCCTCGG
shMED15(SEQ ID NO:3)：
TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCGACAAGAACGAAGACAGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCTGTCTTCGTTCTTGTCGGTGCCTACTGCCTCGG
shMED23(SEQ ID NO:4)：
TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCTGCTTATTACCAGCCTATTAGTGAAGCCACAGATGTAATAGGCTGGTAATAAGCAGGCGTGCCTACTGCCTCGG
对照shRNA(shSCR；SEQ ID NO:5)：
TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAATTATAATGCTTATCTATAGTGAAGCCACAGATGTATAGATAAGCATTATAATTCCTATGCCTACTGCCTCGG
实时定量PCR引物：
q-MED16-F1：5'-GCTGCACAATGGTGTGAAACT-3'(SEQ ID NO:6)
q-MED16-R1：5'-AGAACTTGACTCGGGAGAACTT-3'(SEQ ID NO:7)
q-18S-F：5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'(SEQ ID NO:8)
q-18S-R：5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'(SEQ ID NO:9)
实施例
实施例1:中介体复合物尾部亚基抑制骨髓和红系发育
为了探究中介体复合体尾部模块在造血发育过程中的功能，首先使用来自脐带血(北京脐带血造血干细胞库)的人CD34+原代造血干细胞和祖细胞系统。将编码用于敲低尾部模块亚基的shRNA或对照shRNA(shSCR)的慢病毒载体pGIPZ-EGFP转染至人CD34+原代造血干细胞和祖细胞中，并进行细胞扩增和分化培养。细胞培养系统由已发表的方法修改(Lee,H.Y.等人，PPAR-alpha and glucocorticoid receptor synergize to promoteerythroid progenitor self-renewal.Nature 522,474-477)，具体如下。
扩增阶段(第0-4天)：将细胞在含有CC100细胞因子(Beijing ZepingTechnology)和2％青霉素/链霉素的SFEM II培养基(Beijing Zeping Technology)中以105个细胞/mL的浓度培养4天；
分化阶段(第5-14天)：细胞在含有5ng/mL rIL-3(Stem cell Technologies)、100ng/mL rhSCF(Stem cell Technologies)和6U/mL rhEpo(Shenyang sanshengpharmaceutical有限公司)的基于IMDM(Gibco)的分化培养基中培养。
在细胞培养的扩增阶段(培养第2天)使用介导尾部模块亚基MED16敲低的shRNA(shMED16-1)或对照shRNA(shSCR)转染细胞，并在分化阶段(培养第5天)检测细胞中的MED16 mRNA表达水平。结果表明，相比于对照组，转染shMED16-1后，检测到MED16 mRNA水平的降低(图1A)。在培养第4天至第14天使用抗CD71抗体(eBioscience,Cat.#12-0719-42)和CD235a抗体(eBioscience,Cat.#17-9987-42)通过流式细胞术分析检测细胞的CD235a表达情况。结果表明，相比于对照组，MED16敲低细胞显示CD235a表达的显著增加，这表明造血干细胞和祖细胞的红细胞分化过程受到显著影响(图1B)。图1B中的流式门控图显示了第5天的代表性结果。
通过shRNA敲低中介体复合物的其它尾部亚基如MED15(shMED15)和MED23(shMED23)，在第5天也显示出CD235a的显著增加(图1C)。
进一步检测了MED16敲低后对红系细胞去核过程的影响。类似的，在细胞培养的扩增阶段(第2天)使用介导MED16敲低的shRNA(shMED16-1)或对照shRNA(shSCR)转染细胞，并在第9天至第14天使用抗CD235a抗体和Hoechest 33342染色检测红细胞去核过程。结果显示，MED16的敲低促进红系细胞的去核过程(图1D)，表明MED16的敲低促进红系发育过程，且不影响红细胞的正常生成。图1D中的流式门控图显示了第12天的代表性结果。
还测试了中介体尾部亚基的敲低是否会影响细胞凋亡。测试方法如下：如上所述进行shRNA转染。在培养的第5天，使用Annexin V-PE染色试剂盒(BeyotimeBiotechnology)测试细胞凋亡。具体来说，取105个CD34+细胞，加入195μl Annexin V-PE结合液轻轻悬浮细胞。随后，加入5μl Annexin V-PE和10μl碘丙啶染色液，轻轻混匀。在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后放入冰浴中。使用流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明，MED16亚基的敲低不影响细胞凋亡(图2)。
进一步进行了集落形成测试，如上所述进行shRNA转染，并将培养第5天的CD34+细胞培养于MethoCult M4435培养基中，密度为100个细胞/mL和2mL/孔。培养14天后进行早期红系祖细胞集落形成单位(Burst forming unit-erythroid，BFU-E)和晚期红系祖细胞克隆形成单位(Colony forming unit-erythroid，CFU-E)的细胞集落计数。结果显示，相比于对照shRNA，敲低MED16后，集落中的BFU-E和CFU-E的百分比上调(图3A)，而BFU-E和CFU-E的单集落面积没有变化(图3B)。BFU-E和CFU-E的单集落面积指示了其自我更新的能力。上述结果表明，MED16的敲低促进CD34+造血干细胞/祖细胞的红系发育，但不促进其集落形成和自我更新能力。
这些结果表明，中介体复合物尾部模块例如MED16、MED15或MED23的敲低，促进了骨髓细胞和红细胞的发育，尤其是加速了红细胞的发育。并且其不影响红系祖细胞的自我更新能力。
实施例2:MED16的敲低促进红细胞发育
进一步使用了siRNA介导的敲低方法研究了MED16在红细胞生成中的作用。与相对长期的shRNA介导的敲低相比，siRNA介导的敲低的优点是仅需24-72小时即可有效下调基因表达，从而可以更快地研究细胞变化。
为了检查MED16敲低对细胞分化的影响，如实施例1中所述以扩增阶段和分化阶段进行细胞培养，并在分化阶段(培养第5天)将siRNA寡核苷酸(Sigma，s19494/s19495/s19493等量混合物)转染至CD34+原代造血干细胞和祖细胞中，空白对照转染的细胞作为对照。在培养第8天评估细胞分化。与MED16 shRNA的结果类似，MED16 siRNA在mRNA水平上有效下调MED16的表达(图4A)，并且促进造血干细胞和祖细胞的红系分化(图4B)。
为了研究抑制MED16是否普遍促进红细胞发育，还在人红白血病细胞系K562细胞(购自ATCC)中敲低MED16。该细胞系是一种类似于CML的细胞系，可以在不同的化学物质诱导下进行巨核细胞分化和红细胞分化(Polfus,L.M.等人，Whole-Exome SequencingIdentifies Loci Associated with Blood Cell Traits and Reveals a Role forAlternative GFI1B Splice Variants in Human Hematopoiesis.Am J Hum Genet 99,481-488)。在体外培养的K562细胞中转染编码敲低MED 16的shRNA(shMED16-1)的慢病毒载体pGIPZ-EGFP。MED16敲低后5天，可明显观测到细胞沉淀的颜色变得更红(图5A)，且细胞的流式细胞术分析显示细胞的CD235a表达增加(图5C)。
还对细胞进行了联苯胺染色实验。简言之，在转染shRNA后5天，从每个样品中取出105个K562细胞，以200rpm的速度离心5分钟，在室温下在冷冻甲醇中固定2分钟，然后自然干燥。将1片联苯胺(Sigma，cat#D5905)溶解在加入10μL H2O2的10mL PBS中，向每个样品加入300μl，室温放置1小时。用水洗涤后，封片并在显微镜下观察。联苯胺染色结果证实了，相比于转染对照shRNA的细胞，在转染shMED16-1敲低MED16后，细胞显示更多的血红蛋白积累(图5B)。
为了测试成人红细胞发育是否需要MED16，还使用人原代外周血单核细胞系统和骨髓单核细胞系统进行了测试。骨髓单核细胞和外周血单核细胞采集自北京大学人民医院。对细胞转染MED16 shRNA(shMED16-1或shMED16-2)后，敲低效率最高达70％(图6A)。具有MED16敲低的细胞显示出红细胞发育促进(图6B)。这些结果表明，对MED16的抑制可以普遍促进体外红系细胞的发育。
实施例3.MED16敲低促进体内髓系和红系细胞谱系的重建
为了测定MED16减少在造血发育过程中的影响，使用来自脐带血的人CD34+原代造血干细胞和祖细胞系统在实验动物中进行了骨髓移植实验。脐带血来自(北京脐带血造血干细胞库)。具体来说，对每只小鼠移植来自脐带血的105个CD34+GFP+细胞，其中细胞已经如实施例1中的方法所述用对照shRNA(shSCR)或MED16 shRNA(shMED16-1)处理。
使用NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst小鼠(Beijing VitalstarBiotechnology有限公司，4周龄，雌性)，在移植前辐射24小时(1.3Gy)。移植后14周处死小鼠。从小鼠眼眶收集外周血。并在1mL PBS中通过冲洗和细胞解离制备骨髓和脾脏悬浮液。样品在总体积为200μl的染色缓冲液中染色。以每种抗体的1:100稀释度进行染色。使用的抗体组如下：人CD45-APC-A750(Beckman,Cat.#A71119)、CD33-APC(BioLegend,Cat.#366606)、CD19-PE(Biosciences,Cat.#340720)、CD3-PC5.5(Beckman,Cat.#A66327)、CD71-PE(eBioscience,Cat.#12-0719-42)、CD235a-APC(eBioscience,Cat.#17-9987-42)和小鼠CD45-PC7(BioLegend,Cat.#103114)。使用CytoFLEX流式细胞仪进行测试。图7显示了流式细胞术的门控策略。
结果显示，相比于对照小鼠，在MED16敲低后14周小鼠的骨髓细胞显示出较高的红系细胞百分比(图8A)，并且髓系细胞的百分比上调(图8B)。B细胞和T细胞的百分比没有明显变化(图8C，图8D)。由于脾脏和外周血移植后细胞定植效率低，脾脏和外周血中红系细胞和髓系细胞的百分比没有变化(图9A，图9B)。这些结果表明，MED16的抑制促进了体内髓系和红系细胞谱系的重建。
实施例4.MED16抑制先天免疫基因和红系基因的表达
如上述实施例中所示，来自MED16敲低的人原代造血干细胞和祖细胞具有促进其向红系祖细胞发育的特性，其特征在于CD235a的高表达水平。为了揭示与此表型相关的其他分子特征，使用在从MED16敲低或对照组的人原代造血干细胞和祖细胞系统中分离的mRNA进行了转录组分析。
具体而言，用TRIzol(Invitrogen Company)提取对照shRNA(shSCR)或MED16shRNA(shMED16-1)转染后培养第0天、第4天的CD34+细胞样品的RNA。对于RNA-seq，质量由Agilent 2100Bioanalyzer进行评估。1μg总RNA用于制备RNA-seq文库(Illumina，RS-122-2201)。每个样品的两个生物学重复在Novogene(北京)的HiSeq X-Ten(PE150，Illumina)中进行测序。来自培养第0天、第4天的MDS的CD34+细胞和骨髓单核细胞的shSCR和shMED16样品的RNA-seq的原始读取计数。在使用FastQC检查数据质量后，配对末端读取通过Hisat2(Kim,D.等人,HISAT:a fast spliced aligner with low memory requirements.NatMethods 12,357-360)映射到人参考基因组的hg19版本，并使用HTSeq(Anders,S.等人,HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencingdata.Bioinformatics 31,166-169)进行读取计数。使用samtools(Li,H.等人，TheSequence Alignment/Map format and SAMtools.Bioinformatics 25,2078-2079)来隐藏文件格式和索引文件。读取计数归一化为TPM(每百万转录)(Wagner,G.P.等人,Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data:RPKM measure is inconsistentamong samples.Theory Biosci 131,281-285)，作为RNA转录的测量值。DESeq2(Love,M.I.等人,Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data withDESeq2.Genome Biol 15,550)软件包用于计算差异表达基因，如果其超过阈值(|倍数变化|>1.5和FDR<0.05)，则认为其是显著的。热图和火山图是使用带有ggplot2或pheatmap软件包version 4.0.2的R版本进行的。
结果表明，观察到在MED16敲低第0天有831个上调基因和2033个下调基因(倍数变化>1.5，p<0.05)(图10A)。上调基因的基因本体分析显示，许多先天免疫的基本生物学过程得到显著表现，而下调基因显示出通常的细胞功能(图10B)。
通过Metascape(Zhou,Y.等人，Metascape provides a biologist-orientedresource for the analysis of systems-level datasets.Nature communications 10,1523)在线工具使用进行基因本体富集分析。使用GSEA软件对基因本体生物学过程(GO)或Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways(KEGG)进行基因集富集分析(GSEA)(Subramanian,A.等人，Gene set enrichment analysis:a knowledge-basedapproach for interpreting genome-wide expression profiles.Proc Natl Acad SciU S A 102,15545-15550)。分析证实了HSC谱系基因特征、细胞因子基因特征和IL22特征富集(Raundhal,M.等人，Blockade of IL-22signaling reverses erythroid dysfunctionin stress-induced anemias.Nature immunology 22,520-529)，这与应激造血有关(图10C)(Zhao,J.L.等人，Conversion of danger signals into cytokine signals byhematopoietic stem and progenitor cells for regulation of stress-inducedhematopoiesis.Cell Stem Cell 14,445-459；Zhao,J.L.和Baltimore,D.Regulation ofstress-induced hematopoiesis.Curr Opin Hematol 22,286-292；Anderson,G.等人,K.L.Regulation of stress-induced hematopoiesis.Curr Opin Hematol 27,279-287)。
更重要的是，在MED16敲低的第4天发现198个上调基因和244个下调基因(倍数变化>1.5，p<0.05)(图11A)。对MED16敲低第4天的人原代造血干细胞和祖细胞系统中上调基因的基因本体分析也表明，先天免疫基因过程有显著表达。此外，还呈现了血红蛋白代谢过程。基因集富集分析(GSEA)证实了这一点，这与表型一致(图11B，图11C)。代表性基因列表也表明了细胞的血红蛋白代谢过程(图11D)。
为了进一步表征MED16敲低在红细胞生成中的作用，在体外分化第4天的MED16敲低的人CD34+细胞或转染对照shRNA的细胞中进行了scRNA-seq分析(图12A-C)。对不同簇中RNA表达水平的分析表明了对照shRNA和MED16敲低细胞之间的差异。红细胞簇中上调基因的基因本体分析显示红细胞分化特征，GMP细胞簇中上调基因的基因本体分析显示细胞因子产生特征的调节(图13A)。红细胞基因(如GYPA、SLC4A1)在红细胞中上调。先天免疫基因(如GRN、S100A9)在GMP细胞中上调(图13B)。
结果表明，MED16敲低与红系细胞百分比的增加有关，这与表型一致(图13C)。总之，这些结果表明MED16减少导致红细胞基因特征以及先天免疫基因特征的获得，而抑制MED16的表达能够促进红细胞分化过程。
实施例5.MED16的高表达作为MDS的生物标志物，为MDS提供潜在的治疗靶点
在研究中发现MED16减少可以促进红系分化(参见实施例1-4)。并且，参照实施例1的方法将MED16过表达的慢病毒pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV转染至人CD34+原代造血干细胞和祖细胞中，结果表明MED16过表达可以抑制红系去核(图14A，图14B)。
为了研究MED16在MDS中的作用，首先使用来自183名MDS患者的原代BM CD34+细胞的基于微阵列的基因表达谱数据来研究MED16的表达是否与疾病及其预后相关(Chen,B.Y.等人，如上引用；Pellagatti,A.等人，Deregulated gene expression pathways inmyelodysplastic syndrome hematopoietic stem cells.Leukemia 24,756-764；Rhyasen,G.W.等人，Targeting IRAK1 as a therapeutic approach formyelodysplastic syndrome.Cancer cell 24,90-104)(图15A)。MDS患者的微阵列数据或RNA-seq数据来自GSE19429、GSE15061和Genomic Data Commons(GDC)(https:// gdc.cancer.gov/about-data/publications/laml_2012)。所有患者的样品均由北京大学人民医院提供。所有程序均经相关伦理委员会批准，并获得所有参与者的书面知情同意。
结果表明，MDS患者显示了高于健康人的MED16表达。该结果在不同的基因型的人群中是一致的(图15B)。与中介体复合物的其他亚基相比，MED16在不同数据库中的MDS患者中表现出更显著的高表达(图15C)。
随后，对MDS患者样品进行了定量聚合酶链反应(qPCR)分析，具体方法如下。收集106个细胞并以2000rpm的速度离心5分钟；加入500μL Trizol，混匀，室温静置2-3分钟；加入100μl氯仿，混匀，4℃13000rpm离心10分钟；离心后取上清液至新EP管中，加入异丙醇于-20℃倒置混匀20分钟。13000rpm 4℃离心10分钟；弃上清，加入500μl 75％乙醇，4℃13000RPM离心10分钟；弃上清，加入20μl无RNA酶水，备用。通过LightCycler 480Real-TimePCR System(Roche)检测实时PCR。对于每个样品，每个实验独立重复至少3次。将相对表达水平标准化为18S rRNA表达。
结果证实，MDS患者样品中MED16的表达显著高于健康受试者(图16A)。上述结果提示，抑制MDS患者造血祖细胞中的MED16可以恢复正常的红细胞生成。因此，将编码MED16shRNA的慢病毒载体转染至来自MDS患者的骨髓单核细胞中，并进行液体培养分化测定。患者1(患有MDS多谱系发育不良(MDS-MLD)的女性)中的MED16敲低导致在分化第4天处于III期(CD235+CD71+)的细胞百分比增加，而转染对照shRNA的细胞在较为不成熟的II期被部分阻断(CD235-CD71+)。并且，细胞颗粒在MED16敲低后变得更红(图16B-D)。患者2和患者3中的MED16敲低也显示红细胞分化促进(图15C)。
在分化的第4天，使用细胞样品的RNA seq方法测试了MED16敲低对红细胞分化的作用。用TRIzol(Invitrogen Company)提取对照shRNA(shSCR)或MED16 shRNA(shMED16)转染后培养第0天、第4天的MDS的骨髓单核细胞样品的RNA。对于RNA-seq，实验方法如实施例3中所述。分析结果表明，与用对照shRNA转导的细胞相比，MED16敲低增加了先天免疫基因和红细胞基因的表达(图17)。总之，这些结果表明MED16敲低恢复了MDS原代细胞样品的红细胞分化，表明MED16是用于治疗MDS的潜在靶点。
序列表
<110> 北京大学
<120> 中介体复合物亚基抑制剂及其应用
<130> C22P1388
<160> 9
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shMED16-1
<400> 1
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgccgacatt gacaaggtca tgattagtga 60
agccacagat gtaatcatga ccttgtcaat gtcgatgcct actgcctcgg 110
<210> 2
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shMED16-2
<400> 2
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgatggctgc acaatggtgt gaaatagtga 60
agccacagat gtatttcaca ccattgtgca gccattgcct actgcctcgg 110
<210> 3
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shMED15
<400> 3
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgccgacaag aacgaagaca gaaatagtga 60
agccacagat gtatttctgt cttcgttctt gtcggtgcct actgcctcgg 110
<210> 4
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shMED23
<400> 4
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgcgcctgct tattaccagc ctattagtga 60
agccacagat gtaataggct ggtaataagc aggcgtgcct actgcctcgg 110
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对照shRNA
<400> 5
tcgagaaggt atattgctgt tgacagtgag cgcaggaatt ataatgctta tctatagtga 60
agccacagat gtatagataa gcattataat tcctatgcct actgcctcgg 110
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gctgcacaat ggtgtgaaac t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
agaacttgac tcgggagaac tt 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
cagccacccg agattgagca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
tagtagcgac gggcggtgtg 20

Claims (14)

1.促进造血干细胞或血液祖细胞分化为红细胞或其前体细胞的方法，所述方法包括使所述造血干细胞或血液祖细胞与抑制中介体复合物的尾部亚基MED16的表达和/或活性的抑制剂接触的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述血液祖细胞选自多能祖细胞(MPP)、髓样祖细胞(MyP)、巨核细胞-红系祖细胞(MEP)或红系祖细胞，和/或
所述红细胞的前体细胞选自早期红系祖细胞集落形成单位(BFU-E)、晚期红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)、原红细胞(Pro)、早幼红细胞(Baso)、成红细胞(Ortho)和网织红细胞。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述抑制剂选自抑制性RNA分子、其编码序列、包含所述编码序列的载体和小分子化合物。
4.根据权利要求3的方法，其中所述抑制性RNA分子选自siRNA、shRNA和microRNA。
5.根据权利要求3的方法，其中所述载体为病毒载体。
6.根据权利要求4的方法，其中所述载体为病毒载体。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述病毒载体选自慢病毒载体和腺相关病毒载体。
8.抑制中介体复合物的尾部亚基MED16的表达和/或活性的抑制剂在制备用于治疗或预防受试者中的骨髓增生异常综合征(MDS)或慢性粒细胞白血病(CML)的药物中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述抑制剂选自抑制性RNA分子、其编码序列、包含所述编码序列的载体和小分子化合物。
10.根据权利要求9的用途，其中所述抑制性RNA分子选自siRNA、shRNA和microRNA。
11.检测中介体复合物的尾部亚基MED16的表达和/或活性的试剂在制备用于诊断受试者中的MDS的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于以下方法：
a. 将所述试剂与来自所述受试者的样品接触；
b. 对所述样品中的MED16的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述受试者的样品中，MED16的表达和/或活性高指示MDS的存在或风险。
12.检测中介体复合物的尾部亚基MED16的表达和/或活性的试剂在制备用于对患有MDS的患者进行预后的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于以下方法：
a. 将所述试剂与来自所述患者的样品接触；
b. 对所述样品中的MED16的表达和/或活性进行定量，
其中所述样品包含造血干细胞或血液祖细胞，其中相比于健康受试者，来自所述患者的样品中，MED16的表达和/或活性高指示预后差。
13.根据权利要求11或12的用途，其中所述试剂是用于选自下组的方法的检测试剂：流式细胞术、ELISA、免疫组化分析、基于PCR的定量方法、原位杂交、转录组分析、基于微阵列的基因表达谱分析。
14.药物组合物，所述药物组合物包含抑制中介体复合物的尾部亚基MED16的表达和/或活性的抑制剂，和任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述药物组合物用于治疗受试者中的MDS或CML。
CN202210685944.1A 2022-06-16 2022-06-16 中介体复合物亚基抑制剂及其应用 Active CN114990164B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210685944.1A CN114990164B (zh) 2022-06-16 2022-06-16 中介体复合物亚基抑制剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210685944.1A CN114990164B (zh) 2022-06-16 2022-06-16 中介体复合物亚基抑制剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114990164A CN114990164A (zh) 2022-09-02
CN114990164B true CN114990164B (zh) 2023-12-05

Family

ID=83034694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210685944.1A Active CN114990164B (zh) 2022-06-16 2022-06-16 中介体复合物亚基抑制剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114990164B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103656641A (zh) * 2012-08-30 2014-03-26 中国科学院上海生命科学研究院 转录中介体Med23亚基作为靶点用于预防或治疗癌症
CN106794260A (zh) * 2014-04-25 2017-05-31 儿童医疗中心有限公司 治疗血红蛋白病的组合物和方法
CN110023488A (zh) * 2016-08-29 2019-07-16 哈肯萨克大学医学中心 用含有血小板样细胞的富含血小板的血液级分使成体细胞重编程的组合物和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103656641A (zh) * 2012-08-30 2014-03-26 中国科学院上海生命科学研究院 转录中介体Med23亚基作为靶点用于预防或治疗癌症
CN106794260A (zh) * 2014-04-25 2017-05-31 儿童医疗中心有限公司 治疗血红蛋白病的组合物和方法
CN110023488A (zh) * 2016-08-29 2019-07-16 哈肯萨克大学医学中心 用含有血小板样细胞的富含血小板的血液级分使成体细胞重编程的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114990164A (zh) 2022-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Venkatraman et al. Maternal imprinting at the H19–Igf2 locus maintains adult haematopoietic stem cell quiescence
Garçon et al. Ribosomal and hematopoietic defects in induced pluripotent stem cells derived from Diamond Blackfan anemia patients
Hsu et al. Oncogenic KRAS drives lipofibrogenesis to promote angiogenesis and colon cancer progression
Marinaro et al. Unraveling the molecular signature of extracellular vesicles from endometrial-derived mesenchymal stem cells: potential modulatory effects and therapeutic applications
Swann et al. IL-33 promotes anemia during chronic inflammation by inhibiting differentiation of erythroid progenitors
Hu et al. Ythdf2 promotes pulmonary hypertension by suppressing Hmox1-dependent anti-inflammatory and antioxidant function in alveolar macrophages
Santarlasci et al. Musculin inhibits human T‐helper 17 cell response to interleukin 2 by controlling STAT5B activity
Chen et al. CDK2 inhibition enhances antitumor immunity by increasing IFN response to endogenous retroviruses
Liu et al. LncRNA IL21‐AS1 interacts with hnRNPU protein to promote IL21 overexpression and aberrant differentiation of Tfh cells in systemic lupus erythematosus
WO2019197844A1 (en) Macrophage use
Zhang et al. N6‐methyladenosine promotes osteogenic differentiation of PDLSCs from periodontitis patients
Wang et al. Single-cell transcriptomic characterization reveals the landscape of airway remodeling and inflammation in a cynomolgus monkey model of asthma
Niu et al. LncRNA NCAL1 potentiates natural killer cell cytotoxicity through the Gab2-PI3K-AKT pathway
Lu et al. The murine Pbx1-d lupus susceptibility allele accelerates mesenchymal stem cell differentiation and impairs their immunosuppressive function
JP2014507156A (ja) Ｒｕｎｘ１不活性化に起因する病理の新規診断マーカーとしてのｍｙｈ１０
Iriondo et al. Hypoxic Memory Mediates Prolonged Tumor-Intrinsic Type I Interferon Suppression to Promote Breast Cancer Progression
Han et al. Th17 cell‐derived miR‐155‐5p modulates interleukin‐17 and suppressor of cytokines signaling 1 expression during the progression of systemic sclerosis
Li et al. The potential role of exosomal miRNAs and membrane proteins in acute HIV-infected people
CN114990164B (zh) 中介体复合物亚基抑制剂及其应用
Zhang et al. FGD5 in basal cells induces CXCL14 secretion that initiates a feedback loop to promote murine mammary epithelial growth and differentiation
CN106244679A (zh) miR‑100抑制剂在降低癌症转移中的用途
TWI670080B (zh) 抑制癌細胞及/或癌症幹細胞之存活、癌化及轉移之方法
Zhou et al. PRMT1 Promotes the Self‐renewal of Leukemia Stem Cells by Regulating Protein Synthesis
US20190328791A1 (en) Enhanced hetatopoietic stem cell transplantation
US20230183697A1 (en) Compositions and methods for regulation of cell activity via modulation of beta-cytokine activity

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant