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CN114958581A - 一种基于超声波液滴生成的pcr微流控芯片及其应用 - Google Patents

一种基于超声波液滴生成的pcr微流控芯片及其应用 Download PDF

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CN114958581A
CN114958581A CN202210653639.4A CN202210653639A CN114958581A CN 114958581 A CN114958581 A CN 114958581A CN 202210653639 A CN202210653639 A CN 202210653639A CN 114958581 A CN114958581 A CN 114958581A
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CN
China
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splash
cavity
pcr
sample
piston
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Pending
Application number
CN202210653639.4A
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张晓亮
罗刚银
王弼陡
吕鑫
杨天航
王进贤
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Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Original Assignee
Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
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Abstract

本发明涉及一种基于超声波液滴生成的PCR微流控芯片及其应用，属于生物检测技术领域。本发明提供了一种PCR微流控芯片，包括“L”型主片、密封活塞和活塞驱动装置，“L”型主片的竖向一侧内设有样品腔、防溅井、活塞腔和加样孔，横向一侧内设有平铺腔，样品腔位于防溅井的下方，且样品腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通，活塞腔位于防溅井的上方，且活塞腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通，加样孔靠近防溅井的一端与防溅井和/或加样孔相连通，平铺腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通，密封活塞靠近防溅井的一端经活塞腔插入防溅井，活塞驱动装置用于驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，封闭或打开防溅井与平铺腔的连通处。

Description

一种基于超声波液滴生成的PCR微流控芯片及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于超声波液滴生成的PCR微流控芯片及其应用，属于生物检测技术领域。
背景技术
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析的技术。
微滴式数字PCR在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统PCR相比，微滴式数字PCR不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低且更实用，在拷贝数变异研究、复杂来源样品中含量极低核酸分子的检测、NGS数据验证、NGS测序文库的鉴定、miRNA等差异微小的基因表达研究等方面具有极高的应用前景。
PCR微流控芯片是用于实现微滴式数字PCR的一类微流控芯片。传统的PCR微流控芯片多采用气动或液动等形式驱动核酸样本，存在气体或液体与核酸样本之间的交换和接触，尤其是在某些传染性疾病病毒检测中，容易产生气溶胶传播的风险；并且，传统的PCR微流控芯片在液滴生成的过程中，普遍是在一定时间连续生成大量离散相的过程，液滴一致性不好控制。因此，开发一种无接触、液滴一致性高的PCR微流控芯片至关重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种PCR微流控芯片，所述PCR微流控芯片包括“L”型主片、密封活塞和活塞驱动装置；所述“L”型主片的竖向一侧内设有样品腔、防溅井、活塞腔和加样孔，且所述“L”型主片的横向一侧内设有平铺腔；所述样品腔位于防溅井的下方，且所述样品腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通；所述活塞腔位于防溅井的上方，且所述活塞腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通；所述加样孔靠近防溅井的一端与防溅井和/或加样孔相连通；所述平铺腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通；所述密封活塞靠近防溅井的一端经活塞腔插入防溅井；所述活塞驱动装置用于驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，封闭或打开防溅井与平铺腔的连通处。
在本发明的一种实施方式中，所述平铺腔在“L”型主片内水平设置，或者，所述平铺腔在“L”型主片内倾斜设置。
在本发明的一种实施方式中，当平铺腔在“L”型主片内倾斜设置时，所述平铺腔与水平面之间的垂直距离沿靠近防溅井的方向逐渐变大，且所述平铺腔与水平面形成的夹角为5～30°。
在本发明的一种实施方式中，所述密封活塞靠近防溅井的一端套设有密封圈。
在本发明的一种实施方式中，所述样品腔为圆台状；所述样品腔的直径沿靠近防溅井的方向逐渐变大。
在本发明的一种实施方式中，所述防溅井和活塞腔为圆柱状。
本发明还提供了一种PCR检测装置，所述PCR检测装置包括上述PCR微流控芯片和超声波发生装置；所述超声波发生装置用于对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR检测装置还包括旋转驱动装置；所述旋转驱动装置用于驱动PCR微流控芯片旋转，使得液滴在离心力的作用下进入平铺腔，并逐渐依次向平铺腔外围移动。
在本发明的一种实施方式中，所述超声波发生装置为聚焦式超声波换能器、相控阵超声波换能器或表面声波发生器。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR微流控芯片的声学阻抗与超声耦合剂的声学阻抗接近。
本发明还提供了一种PCR检测方法，所述方法使用上述PCR检测装置，包括如下步骤：
油层预置步骤：将PCR微流控芯片倒置，并通过加样孔在防溅井内加入驱动油，使得驱动油进入平铺腔内；
微滴生成步骤：油层预置步骤结束后，封闭加样孔，并倒置PCR微流控芯片；倒置结束后，打开加样孔，并通过加样孔在样品腔内加入样品；加入结束后，再次封闭加样孔，并将PCR微流控芯片的竖向一侧浸入超声耦合剂中；浸入结束后，打开超声波发生装置，通过超声耦合剂对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴，形成的液滴在地心引力或离心力的作用下进入平铺腔；
扩增步骤：微滴生成步骤结束后，通过活塞驱动装置驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处；堵塞结束后，使用扩增工装对PCR微流控芯片进行温度循环，实现PCR扩增；
检测步骤：扩增步骤结束后，使用光学检测工装对PCR微流控芯片进行读数，实现PCR检测。
在本发明的一种实施方式中，所述超声波发生装置为聚焦式超声波换能器；所述聚焦式超声波换能器的参数为：焦距6～18mm、频率1～150MHz，但不局限于上述参数，主要考虑液体深度和微滴尺寸进行参数选择；激发功率0～50W调节；激发时长50～600μs调节，激发功率和时间不局限于上述参数，以样品特性、所需生成的微滴尺寸等参数为考虑进行调节；激发信号：采用正弦波。
在本发明的一种实施方式中，所述检测步骤为：采用LED光源进行平铺腔内的荧光激发；通过CCD或CMOS探测器进行平面拍照；通过算法处理，进行图像拼接及灰度校准，并统计微滴总个数以及阳性微滴个数；计算目标DNA分子的原始浓度。
本发明还提供了上述PCR微流控芯片或PCR检测装置或上述PCR检测方法在PCR检测中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种基于超声波液滴生成的PCR微流控芯片，包括“L”型主片、密封活塞和活塞驱动装置，其中，“L”型主片的竖向一侧内设有样品腔、防溅井、活塞腔和加样孔，横向一侧内设有平铺腔，样品腔位于防溅井的下方，且样品腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通，活塞腔位于防溅井的上方，且活塞腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通，加样孔靠近防溅井的一端与防溅井和/或加样孔相连通，平铺腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通，密封活塞靠近防溅井的一端经活塞腔插入防溅井，活塞驱动装置用于驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，封闭或打开防溅井与平铺腔的连通处。所述PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR微流控芯片利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR微流控芯片的声学阻抗与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR微流控芯片的防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏；此外，在芯片旋转时，防溅井的存在也可以防止液面的晃动导致液体飞溅到芯片顶部的微滴接收区域；并且，当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部的微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR微流控芯片的密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR微流控芯片采用外置的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)相比，所述PCR微流控芯片的超声波发生装置可多次反复使用，成本大大降低。综上，使用所述PCR微流控芯片进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
附图说明
图1：本发明PCR微流控芯片的一种实施方式的整体结构示意图。
图2：本发明PCR微流控芯片的一种实施方式的剖面结构示意图。
图3：本发明PCR微流控芯片的一种实施方式的部分结构示意图。
图4：油层预置步骤的操作示意图。
图5：微滴生成步骤的操作示意图。
图6：扩增步骤的操作示意图。
图7：实施例1-3所得液滴的检测结果。
图8：实施例2-3所得液滴的检测结果。
图1～3中，“L”型主片1、密封活塞2、活塞驱动装置3、样品腔4、防溅井5、活塞腔6、加样孔7、平铺腔8、密封圈9。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，对本发明进行进一步的阐述。
实施例1-1：一种PCR微流控芯片
如图1～3，本实施例提供了一种PCR微流控芯片，所述PCR微流控芯片包括“L”型主片1、密封活塞2和活塞驱动装置3；所述“L”型主片1的竖向一侧内设有样品腔4、防溅井5、活塞腔6和加样孔7，且所述“L”型主片1的横向一侧内设有平铺腔8；所述样品腔4位于防溅井5的下方，且所述样品腔4靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述活塞腔6位于防溅井5的上方，且所述活塞腔6靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述加样孔7靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述平铺腔8靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述密封活塞2靠近防溅井5的一端经活塞腔6插入防溅井5；所述活塞驱动装置3用于驱动密封活塞2，使得密封活塞2在活塞驱动装置3的驱动下，封闭或打开防溅井5与平铺腔8的连通处；所述平铺腔8与水平面之间的垂直距离沿靠近防溅井5的方向逐渐变大，且所述平铺腔5与水平面形成的夹角为5～30°；所述密封活塞2靠近防溅井5的一端套设有密封圈9；所述样品腔4为圆台状，且所述样品腔4的直径沿靠近防溅井5的方向逐渐变大；所述防溅井5和活塞腔6为圆柱状；所述PCR微流控芯片的声学阻抗与超声耦合剂的声学阻抗接近，以减少能量的反射。超声耦合剂一般为纯净水，纯净水的声学阻抗为1.48MRayl，综合考虑PCR微流控芯片还需具备的扩增(温度)和检测(透明度)特性，PCR微流控芯片一般采用声学阻抗为2.4～2.6Mrayl的环烯烃共聚物(COC)材料。
所述PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR微流控芯片利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR微流控芯片的声学阻抗与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR微流控芯片的防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏；此外，当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部的微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR微流控芯片的密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR微流控芯片采用外置的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)相比，所述PCR微流控芯片的超声波发生装置可多次反复使用，成本大大降低。综上，使用所述PCR微流控芯片进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
实施例1-2：一种PCR检测装置
本实施例提供了一种PCR检测装置，所述PCR检测装置包括实施例1-1的PCR微流控芯片和超声波发生装置；所述超声波发生装置用于对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴；所述超声波发生装置为聚焦式超声波换能器、相控阵超声波换能器或表面声波发生器。
超声波发生装置对样品腔内的样品发射声波时，声波聚焦在液体表面，产生震动，由于瑞利不平衡原理，液体表面将形成微小的丘，当能量足以克服液体的表面张力时，液滴将脱离液体，垂直喷射到密封活塞，喷射到密封活塞上的液滴在地心引力的作用下进入倾斜设置的平铺腔，并均匀平铺在平铺腔内。
所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR检测装置利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片在声学阻抗上与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片设有防溅井与样品腔，防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏，此外，当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片设有密封活塞，密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片采用外置的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)相比，成本大大降低。综上，使用所述PCR检测装置进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
实施例1-3：一种PCR检测方法
本实施例提供了一种PCR检测方法，所述方法使用实施例1-2的PCR检测装置，包括如下步骤：
油层预置步骤：将PCR微流控芯片(PCR微流控芯片的材料为COC)倒置，并通过加样孔在防溅井内加入驱动油，使得驱动油(选择粘度合适的驱动油，例如氟化油7500，避免PCR微流控芯片正置时，油层滴落)在地心引力的作用进入平铺腔内，并均匀平铺在平铺腔；此步骤中，驱动油用于包裹下述步骤产生的液滴，避免液滴融合和破裂，同时也作为液滴喷射的缓冲液，避免喷射时与芯片内腔顶部微滴接收区域接触而导致溅射或破碎(具体可见图4)；
微滴生成步骤：油层预置步骤结束后，封闭加样孔，并倒置PCR微流控芯片；倒置结束后，打开加样孔，并通过加样孔在样品腔内加入样品；加入结束后，再次封闭加样孔，并将PCR微流控芯片的竖向一侧浸入超声耦合剂(超声耦合剂可以为水或凝胶)中；浸入结束后，打开超声波发生装置，通过超声耦合剂对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴，形成的液滴在地心引力的作用下进入平铺腔；此步骤中，超声波发生装置对样品腔内的样品发射声波时，声波聚焦在液体表面，产生震动，由于瑞利不平衡原理，液体表面将形成微小的丘，当能量足以克服液体的表面张力时，液滴将脱离液体，垂直喷射到密封活塞，喷射到密封活塞上的液滴在地心引力的作用下进入倾斜设置的平铺腔，并均匀平铺在平铺腔内(具体可见图5)；
扩增步骤：微滴生成步骤结束后，通过活塞驱动装置驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处；堵塞结束后，使用扩增工装对PCR微流控芯片进行温度循环，实现PCR扩增(具体可见图6)；
检测步骤：扩增步骤结束后，使用光学检测工装对PCR微流控芯片进行读数，实现PCR检测。
使用显微镜结合CCD拍照算法统计使用所述方法形成的液滴(采用聚焦式超声波换能器，聚焦式超声波换能器的参数为：焦距9、12、18mm、频率10～30MHz、功率0～50W调节；激励时长50～600μs调节；激励信号：正弦波)，检测结果见图7。图7中，测量理论直径为110μm的12个微滴的尺寸，测得样品与接收板的接触角约为75°，实际换算得到平均等效直径为113μm；CV：1.63％。
所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR检测方法利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片在声学阻抗上与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片设有防溅井与样品腔，防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏，此外，当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片设有密封活塞，密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片采用外置的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)，成本大大降低。综上，使用所述PCR检测方法进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
实施例2-1：一种PCR微流控芯片
如图1～3，本实施例提供了一种PCR微流控芯片，所述PCR微流控芯片包括“L”型主片1、密封活塞2和活塞驱动装置3；所述“L”型主片1的竖向一侧内设有样品腔4、防溅井5、活塞腔6和加样孔7，且所述“L”型主片1的横向一侧内设有平铺腔8；所述样品腔4位于防溅井5的下方，且所述样品腔4靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述活塞腔6位于防溅井5的上方，且所述活塞腔6靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述加样孔7靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述平铺腔8靠近防溅井5的一端与防溅井5相连通；所述密封活塞2靠近防溅井5的一端经活塞腔6插入防溅井5；所述活塞驱动装置3用于驱动密封活塞2，使得密封活塞2在活塞驱动装置3的驱动下，封闭或打开防溅井5与平铺腔8的连通处；所述平铺腔8在“L”型主片1内水平设置；所述密封活塞2靠近防溅井5的一端套设有密封圈9；所述样品腔4为圆台状，且所述样品腔4的直径沿靠近防溅井5的方向逐渐变大；所述防溅井5和活塞腔6为圆柱状；所述PCR微流控芯片的声学阻抗与超声耦合剂的声学阻抗接近，以减少能量的反射。超声耦合剂一般为纯净水，纯净水的声学阻抗为1.48MRayl，综合考虑PCR微流控芯片还需具备的扩增(温度)和检测(透明度)特性，PCR微流控芯片一般采用声学阻抗为2.4～2.6Mrayl的环烯烃共聚物(COC)材料。
所述PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR微流控芯片利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR微流控芯片的声学阻抗与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR微流控芯片的防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏；此外，在芯片旋转时，防溅井的存在也可以防止液面的晃动导致液体飞溅到芯片内腔顶部的微滴接收区域；当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部的微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR微流控芯片的密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR微流控芯片采用外置的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)相比，所述PCR微流控芯片的超声波发生装置可多次反复使用，成本大大降低。综上，使用所述PCR微流控芯片进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
实施例2-2：一种PCR检测装置
本实施例提供了一种PCR检测装置，所述PCR检测装置包括实施例2-1的PCR微流控芯片、超声波发生装置和旋转驱动装置；所述超声波发生装置用于对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴；所述超声波发生装置为聚焦式超声波换能器、相控阵超声波换能器或表面声波发生器；所述旋转驱动装置用于驱动PCR微流控芯片旋转，使得液滴在离心力的作用下进入平铺腔，并逐渐依次向平铺腔外围移动。
超声波发生装置对样品腔内的样品发射声波时，声波聚焦在液体表面，产生震动，由于瑞利不平衡原理，液体表面将形成微小的丘，当能量足以克服液体的表面张力时，液滴将脱离液体，垂直喷射到密封活塞，喷射到密封活塞上的液滴在离心力的作用下进入倾斜设置的平铺腔，并均匀平铺在平铺腔内。
所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR检测装置利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片在声学阻抗上与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片设有防溅井与样品腔，防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏，此外，在芯片旋转时，防溅井的存在也可以防止液面的晃动导致液体飞溅到芯片内腔顶部的微滴接收区域，并且，当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR检测装置使用的PCR微流控芯片设有密封活塞，密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR检测装置采用外置PCR微流控芯片的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)相比，其超声波发生装置可多次反复使用，成本大大降低。综上，使用所述PCR检测装置进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
实施例2-3：一种PCR检测方法
本实施例提供了一种PCR检测方法，所述方法使用实施例2-2的PCR检测装置，包括如下步骤：
油层预置步骤：将PCR微流控芯片(PCR微流控芯片的材料为COC)倒置，并通过加样孔在防溅井内加入驱动油；加入结束后，打开旋转驱动装置控制PCR微流控芯片旋转(转速1～10rpm)，使得驱动油(选择粘度合适的驱动油，例如氟化油7500，避免PCR微流控芯片正置时，油层滴落)在离心力的作用下进入平铺腔，并均匀平铺在平铺腔内；此步骤中，驱动油用于包裹下述步骤产生的液滴，避免液滴融合和破裂，同时也作为液滴喷射的缓冲液，避免喷射时与芯片内腔顶部微滴接收区域接触而导致溅射或破碎(具体可见图4)；
微滴生成步骤：油层预置步骤结束后，封闭加样孔，并倒置PCR微流控芯片；倒置结束后，打开加样孔，并通过加样孔在样品腔内加入样品；加入结束后，再次封闭加样孔，并将PCR微流控芯片的竖向一侧浸入超声耦合剂(超声耦合剂可以为水或凝胶)中；浸入结束后，打开超声波发生装置，通过超声耦合剂对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴，同时，打开旋转驱动装置控制PCR微流控芯片旋转(转速1～10rpm)，使得形成的液滴在离心力的作用下进入平铺腔；此步骤中，超声波发生装置对样品腔内的样品发射声波时，声波聚焦在液体表面，产生震动，由于瑞利不平衡原理，液体表面将形成微小的丘，当能量足以克服液体的表面张力时，液滴将脱离液体，垂直喷射到密封活塞，喷射到密封活塞上的液滴在离心力的作用下进入水平设置的平铺腔，并均匀平铺在平铺腔内(具体可见图5)；
扩增步骤：微滴生成步骤结束后，通过活塞驱动装置驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处；堵塞结束后，使用扩增工装对PCR微流控芯片进行温度循环，实现PCR扩增(具体可见图6)；
检测步骤：扩增步骤结束后，使用光学检测工装对PCR微流控芯片进行读数，实现PCR检测。
使用显微镜结合CCD拍照算法统计使用所述方法形成的液滴(采用聚焦式超声波换能器，聚焦式超声波换能器的参数为：焦距9、12、18mm、频率10～30MHz、功率0～50W调节；激励时长50～600μs调节；激励信号：正弦波)，检测结果见图8。图8中，测量理论直径为120μm的12个微滴的尺寸，测得样品与接收板的接触角约为75°，实际换算得到平均直径为122μm；CV：1.31％。
所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片设计、工艺简单，无需设计复杂的流道，成本低；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片完全封闭，微滴生成、PCR扩增以及读数步骤均在密封的PCR微流控芯片内进行，避免了气溶胶污染；所述PCR检测方法利用外置的超声波发生装置生成微滴，可以通过控制超声波发生装置的距离、频率、功率、激励时长或对激励信号的特殊控制等，对单个微滴进行控制，使得单个微滴的尺寸可控，一致性高；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片在声学阻抗上与超声耦合剂的声学阻抗接近，使得利用外置的超声波发生装置生成微滴时，超声波发生装置产生的能量能够传递多、反射少；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片设有防溅井与样品腔，防溅井与样品腔具有一定长度，能够降低微滴到达接触到芯片内腔顶部微滴接收区域时的速度，避免因过大的动能而导致微滴形态的损坏，此外，在芯片旋转时，防溅井的存在也可以防止液面的晃动导致液体飞溅到芯片内腔顶部的微滴接收区域，并且，当样本量较大时，防溅井的存在也可以防止利用外置的超声波发生装置生成微滴时，液体表面因声波形成的丘接触到芯片内腔顶部微滴接收区域而形成不可控的液滴；所述PCR检测方法使用的PCR微流控芯片设有密封活塞，密封活塞能够在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处，使得平铺腔形成一个封闭的空间，避免样品腔和防溅井内空间导致扩增时液体挥发；所述PCR检测方法采用外置PCR微流控芯片的超声波发生装置，通过超声波发生装置与PCR微流控芯片之间的耦合接触生成微滴，与片上换能器(片上换能器需要将铌酸锂和金属电极加工到微流控芯片上，成本和工艺要求都比较高，且单个芯片为一次性使用，因此声波发生装置也是一次性使用)相比，其超声波发生装置可多次反复使用，成本大大降低。综上，使用所述PCR检测方法进行PCR检测能够对单个液滴单元进行控制、编码，适用于单分子诊断、单分子测序等分子诊断领域。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种PCR微流控芯片，其特征在于，所述PCR微流控芯片包括“L”型主片、密封活塞和活塞驱动装置；所述“L”型主片的竖向一侧内设有样品腔、防溅井、活塞腔和加样孔，且所述“L”型主片的横向一侧内设有平铺腔；所述样品腔位于防溅井的下方，且所述样品腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通；所述活塞腔位于防溅井的上方，且所述活塞腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通；所述加样孔靠近防溅井的一端与防溅井和/或加样孔相连通；所述平铺腔靠近防溅井的一端与防溅井相连通；所述密封活塞靠近防溅井的一端经活塞腔插入防溅井；所述活塞驱动装置用于驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，封闭或打开防溅井与平铺腔的连通处。
2.如权利要求1所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述平铺腔在“L”型主片内水平设置，或者，所述平铺腔在“L”型主片内倾斜设置。
3.如权利要求2所述的PCR微流控芯片，其特征在于，当平铺腔在“L”型主片内倾斜设置时，所述平铺腔与水平面之间的垂直距离沿靠近防溅井的方向逐渐变大，且所述平铺腔与水平面形成的夹角为5～30°。
4.如权利要求1～3任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述密封活塞靠近防溅井的一端套设有密封圈。
5.如权利要求1～4任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述样品腔为圆台状；所述样品腔的直径沿靠近防溅井的方向逐渐变大。
6.如权利要求1～5任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述防溅井和活塞腔为圆柱状。
7.一种PCR检测装置，其特征在于，所述PCR检测装置包括权利要求1～6任一项所述的PCR微流控芯片和超声波发生装置；所述超声波发生装置用于对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴。
8.如权利要求7所述的PCR检测装置，其特征在于，所述PCR检测装置还包括旋转驱动装置；所述旋转驱动装置用于驱动PCR微流控芯片旋转，使得液滴在离心力的作用下进入平铺腔，并逐渐依次向平铺腔外围移动。
9.一种PCR检测方法，其特征在于，所述方法使用权利要求7或8所述的PCR检测装置，包括如下步骤：
油层预置步骤：将PCR微流控芯片倒置，并通过加样孔在防溅井内加入驱动油，使得驱动油进入平铺腔内；
微滴生成步骤：油层预置步骤结束后，封闭加样孔，并倒置PCR微流控芯片；倒置结束后，打开加样孔，并通过加样孔在样品腔内加入样品；加入结束后，再次封闭加样孔，并将PCR微流控芯片的竖向一侧浸入超声耦合剂中；浸入结束后，打开超声波发生装置，通过超声耦合剂对样品腔内的样品发射声波，使得样品在声波的作用下形成液滴，形成的液滴在地心引力或离心力的作用下进入平铺腔；
扩增步骤：微滴生成步骤结束后，通过活塞驱动装置驱动密封活塞，使得密封活塞在活塞驱动装置的驱动下，堵塞防溅井与平铺腔的连通处；堵塞结束后，使用扩增工装对PCR微流控芯片进行温度循环，实现PCR扩增；
检测步骤：扩增步骤结束后，使用光学检测工装对PCR微流控芯片进行读数，实现PCR检测。
10.权利要求1～6任一项所述的PCR微流控芯片或权利要求7或8所述的PCR检测装置或权利要求9所述的PCR检测方法在PCR检测中的应用。
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