CN114949359A - 一种脱细胞基质微粒填充剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脱细胞基质微粒填充剂及其制备方法，涉及生物医用材料技术领域。所述脱细胞基质微粒填充剂，按质量分数计，包含以下成分：脱细胞基质微粒：2.50％‑60.00％；混合凝胶相15.00％‑75.00％；溶剂：7.50％‑75.00％所述混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.1：1‑1：0.1。本发明的填充剂通过多相复合体系，提供了填充剂优异的润滑性和可注射性，可均匀、连续注射，便于手术操作、适用于不同规格的注射针；交联凝胶相和非交联凝胶相作为微粒的载体，一方面起到即时体积支撑的作用，另一方面交联凝胶相在注射中期起到组织填充效果；脱细胞基质微粒一方面可以引起机体适度的免疫应答、促进胶原新生，另一方面，脱细胞基质微粒保留了生物材料天然的致密微结构和粗纤维形态，抗降解性、填充效果更加优异。

Description

一种脱细胞基质微粒填充剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种脱细胞基质微粒填充剂及其制备方法。

背景技术

随着社会发展，人们生活水平的提高及近年来微整形的普及，注射填充材料的应用在国际上和国内需求大增，在创伤、疾病或先天性畸形和美容整形(如颌面部软组织缺陷的修复治疗、隆鼻和隆下巴)等的修复治疗中也逐渐显示出其创伤小、恢复快的独特优势。无论单独使用还是作为正颌、正畸修复手术的补充，微创注射技术在创伤重建，颌面部软组织缺陷修复、隆鼻和隆下巴中具有广阔的应用前景。

目前，市面上已有多种填充材料应用到整形领域，其中，人工合成材料如羟基磷灰石钙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺水凝胶、聚乳酸等，虽然具有物理力学、可塑性和长效保持等优点，但由于存在生物相容性及安全性等方面的问题严重制约其发展。生物材料如胶原、透明质酸等目前临床应用较多。

当前市场上可注射型胶原类生物填充材料主要有两类。一是以美国巴菲特面部整容外科中心(Parfitt Facial Cosmetic Surgery Center)为代表的商品名为“Zyderm”和“Zyplast”的产品，是从牛皮提取纯化的纯胶原蛋白，经戊二醛化学交联而成，该产品降解过快，填充效果不佳，需连续多次注射，而且反弹率高；二是以美国的商品名为“MeronizedAllodermTM”为代表的微粒化人的脱细胞真皮基质，该产品由于去除了引发宿主排斥反应的细胞成分，完整地保留了真皮细胞外基质的形态结构和组成成分，力学性能好，抗原性低，能够增大软组织，刺激胶原增生，但是该材料具有一定的吸收性，而且原材料是人的尸体皮，来源十分有限，价格昂贵，没有得到普遍的应用。

脱细胞基质来源广泛，如动物皮肤、心包膜、膈膜、小肠、脑膜等，可以通过各种物理化学方法去除组织中具有免疫原性的细胞成分，尽量保留其基质成分。脱细胞基质具有天然的生物学结构，含有各类蛋白如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖，可以为细胞提供良好的微环境，调节细胞行为，促进细胞增殖和分化潜能，因此可诱导注射部位的组织再生，起到长久的填充效果。

中国专利CN200510044005.5公开了一种可注射软组织生物填充材料的制备方法，该方法采用猪皮经脱脂、脱细胞、戊二醛交联等工序，物理加工制得微粒。该专利在脱脂及二次脱脂阶段采用高浓度碱处理，严重破坏了生物材料的天然结构，且制备微粒的方法只是将交联后材料通过物理方法切制为边长为300-500μm的微粒，然而其微粒粒径过大，容易引起异物反应，且不利于临床操作，从而限制其在注射整形领域的实用价值。

中国专利CN201711004832.0公开了一种液态胶原填充剂；该填充剂采用提取的胶原蛋白进行交联后制成粉末，该方法制备的填充剂无脱细胞基质的致密结构，填充效果不佳，填充维持时间短。

因此，本领域迫切需要开发一种具有天然生物学结构、可调节细胞行为，填充效果好、维持时间长，同时微粒粒径适宜，能够方便临床使用、应用范围广的脱细胞基质微粒填充剂，同时还应保证其制备工艺操作简单、适合大规模生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种脱细胞基质微粒填充剂，具有天然的生物学结构，含有各类蛋白如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖，可以为细胞提供良好的微环境、调节细胞行为，填充效果好，填充维持时间长，同时微粒粒径适宜，便于临床使用、应用范围广。

本发明公开一种脱细胞基质微粒填充剂，按质量分数计，包含以下成分：

脱细胞基质微粒：2.50％-60.00％；

混合凝胶相：15.00％-75.00％；

溶剂：7.50％-75.00％；

所述混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.1：1-1：0.1。

优选的，所述脱细胞基质微粒粒径为30-200μm。

优选的，按质量分数计，所述交联凝胶相为凝胶相与交联剂溶液交联后得到，所述凝胶相选自0.2-5％透明质酸钠、0.2-5％聚谷氨酸钠、0.1-10％羧甲基纤维素钠、0.1-10％羟丙甲纤维素钠、0.1-10％海藻酸钠、0.1-10％琼脂糖中的至少一种，凝胶相的溶液浓度为5-17％；

所述交联剂溶液选自0.2-8％的戊二醛、0.1-1.0％的EDC、0.1-1.3％的BDDE、0.1-3％的PEGDE、0.1-0.8％的京尼平中的一种或者两种的混合溶液，所述混合溶液的质量比为1：0.1-3：1；

所述凝胶相与交联剂溶液的质量比为1：1-1：12。

优选的，所述非交联凝胶相选自0.2-5％透明质酸钠、0.2-5％聚谷氨酸钠、0.1-10％羧甲基纤维素钠、0.1-10％羟丙甲纤维素钠、0.1-10％海藻酸钠、0.1-10％琼脂糖中的至少一种，非交联凝胶相的溶液浓度为0.3-13％。

优选的，所述溶剂选自甘油、生理盐水、注射用水中的一种。

本发明还公开上述的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，依次包括以下步骤：

(1)取软组织，去除毛发和皮下组织，将软组织和料液混合进行震荡脱脂，震荡脱脂后清洗，得到脱脂后的软组织；

进一步的，软组织和料液的质量比为1：1-1：20，震荡脱脂条件为：震荡频率45-160r/min，震荡时间2-16h，震荡次数1-3次；

(2)将脱脂后的软组织先置于-15至-80℃条件中冷冻6-36h，后取出、密封，采用剂量10-40kGy的辐射处理，得到辐射后的软组织；

(3)将辐射后的软组织交替放入高渗溶液、低渗溶液中震荡，震荡后清洗，得到脱细胞的软组织；

进一步的，所述软组织和高渗溶液的质量比为1：2-1：20，软组织和低渗溶液的质量比为1：2-1：20；交替次数1-5次，震荡频率45-160r/min，震荡时间3-20min；

(4)将脱细胞的软组织与交联剂溶液以1：1-1：12的质量比震荡交联，震荡频率45-100r/min，震荡时间0.5-24h，得到交联后的软组织；

(5)将交联后的软组织进行深低温冷冻粉碎，筛分，得到脱细胞基质微粒；

(6)将凝胶相与交联剂溶液按质量比交联，交联时间2-24h，清洗去除多余的交联剂溶液，得到交联凝胶相；将交联凝胶相与非交联凝胶相以0.1：1-1：0.1的质量比混合，得到混合凝胶相；

(7)在脱细胞基质微粒中加入溶剂，得到质量百分数为10-70％的脱细胞基质微粒悬流体，将脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相按照质量比1：0.2-3混合、均质后得到脱细胞基质微粒填充剂。

优选的，步骤(1)中，所述软组织选自哺乳动物的皮、小肠、膈膜、脑膜、心包膜和筋膜、以及鱼类的皮肤中的一种。

优选的，步骤(1)中，所述料液选自酒精、异丙醇、丙酮、正丙醇、石油醚、氯仿中的至少一种。

优选的，步骤(3)中，所述高渗溶液包含质量百分数0.29-18.5％的氯化钠溶液，低渗溶液选自水、pH5.5-7.2的缓冲溶液中的一种。

优选的，步骤(5)中，深低温冷冻粉碎的工艺条件为：-20℃至-78℃冷冻4h-10h，转移至液氮中预冷1h-4h，再进行粉碎；粉碎时，加入液氮控制温度，转速为3000-30000r/min，每次5-10s，粉碎时间10s-55s。

有益效果：

(1)本发明提供的脱细胞基质微粒填充剂包括脱细胞基质微粒、交联凝胶相和非交联凝胶相，通过多相复合体系，提供了填充剂优异的润滑性和可注射性，可均匀、连续注射，便于手术操作，适用于不同规格的注射针。多相体系赋予了填充剂显著的即时效果和中长期填充效果；交联凝胶相和非交联凝胶相作为微粒的载体，一方面起到即时体积支撑的作用，另一方面交联凝胶相在注射中期起到组织填充效果；脱细胞基质微粒一方面可以引起机体适度的免疫应答、促进胶原新生，另一方面，脱细胞基质微粒保留了生物材料天然的致密微结构和粗纤维形态，抗降解性、填充效果更加优异。

(2)本发明的脱细胞基质微粒制备过程中未使用强碱液，通过混合溶液脱脂、温和的脱细胞及病毒灭活处理，有效避免了制备工艺对天然组织结构的破坏，脱细胞基质微粒具有生物材料天然的致密微孔结构和粗纤维形态，含有各类蛋白如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖，可以为细胞提供良好的微环境，调节细胞行为，且抗降解性能优异。

(3)本发明在脱细胞工序前先进行冷冻辐照，保护了生物材料的天然结构，既可杀灭病毒，达到病毒灭活目的；同时，又可破坏组织中的细胞壁及核酸结构，降低了后续脱细胞工艺处理强度，提高效率。

(4)本发明的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，制备工艺操作简单、适合大规模生产，并且为终端灭菌产品，无微生物负载，安全性更好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施1制备的脱细胞基质微粒的扫描电镜图；

图2为对比例3制备的可注射软组织生物填充材料的扫描电镜图；

图3为实施例1-3、对照例1-3的皮下注射1周后的填充效果图；

图4为实施例1-3、对照例1-3的皮下注射3月后的填充效果图。

具体实施方式

为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。

除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。除非另外指明，有关所列成分的所有质量均给予活性物质的含量，因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“质量百分比含量”可用符号“％”表示。

除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。

本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。

一种脱细胞基质微粒填充剂及制备方法，其制备步骤如下：

1、预处理：取动物新鲜皮肤、心包膜等软组织，去除毛发、皮下组织等。软组织选自哺乳动物如猪、牛、羊、驴、马、鸵鸟等的皮、小肠、膈膜、脑膜、心包膜和筋膜、以及鱼类的皮肤中的一种。

2、脱脂：取酒精、异丙醇、丙酮、正丙醇、石油醚、氯仿中一种或几种溶液混合，混合比例为1：0-3：5，按照软组织与料液质量比(以下均为质量比)为1：1-1：20进行45-160r/min震荡脱脂1-3次，每次2-16h。

3、清洗：按照软组织与水的质量比为1：5-1：10清洗残留的脱脂混合溶液，清洗2-5次，每次5-20min，震荡频率为45-160r/min。

4、冷冻辐照：将清洁后的软组织置于-15℃至-80℃中，冷冻6-36h，转移至保温盒中，加入冰盒或干冰或高分子蓄冷剂，密封，采用10-40kGy辐照处理。

在脱细胞工序前先进行冷冻辐照，保护了生物材料的天然结构，既可杀灭病毒，达到病毒灭活目的，同时又可破坏组织中的细胞壁及核酸结构，降低了后续脱细胞工艺处理强度，提高效率。

5、脱细胞：高渗溶液为0.29-18.5％的氯化钠溶液，低渗溶液为水或pH5.5-7.2的缓冲溶液，其中，高渗溶液中还可以添加0.01-0.5％的氢氧化钠或0.1-2％曲拉通100或0.01-1.0％EDTA。按照软组织与溶液质量比1：2-1：20，进行高渗溶液、低渗溶液间的交替震荡循环1-5次，3-20min/次，频率为45-160r/min。

脱细胞过程中的高低渗溶液浓度低，未使用强碱液，有效避免了制备工艺对天然组织结构的破坏。

6、清洗：按照软组织与水的质量比为1：5-1：20清洗三次，每次10-30min，频率为45-160r/min。

7、交联：按照软组织与交联剂溶液的质量比为1：1-1：12加入交联剂溶液，45-100r/min震荡交联0.5-24h。其中，交联剂为0.2-8％的戊二醛、0.1-1.0％的EDC、0.1-1.3％的BDDE、0.1-3％的PEGDE、0.1-0.8％的京尼平中的一种或两种混合溶液，混合比例为1：0.1-1：3。

软组织进行交联后，既保留了基质材料的天然多孔结构完整性，力学性能好，增强填充效果，同时，能延缓软组织降解，可较长时间保持填充效果。

8、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10-1：20清洗交联剂，45-160r/min，清洗3-8次，5-10min/次，或静置4-24h，每2-4h换一次液体，去除交联剂残留。

9、冷冻粉碎：将交联后软组织进行深低温冷冻粉碎，深冷粉碎处理的工艺条件为：-20℃至-78℃冷冻4h-10h，转移至液氮中预冷1h-4h，再进行粉碎；粉碎时，加入适量液氮控制温度，转速为3000-30000r/min，粉碎时间10s-55s，每次5-10s，停机、开机粉碎，筛分收集30-200μm的微粒，大于200μm的微粒重复步骤9。

将交联后的软组织进行深低温冷冻粉碎，而非采用常温粉碎手段，能够更好地保护脱细胞基质微粒中的天然组织结构；脱细胞基质微粒具有生物材料天然的致密微孔结构和粗纤维形态，含有各类蛋白如Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白，可以为宿主细胞长入提供良好的微环境，刺激组织形成新的胶原蛋白，且抗降解性能优异。

10、非交联凝胶相制备：称取0.2-5％透明质酸钠、0.2-5％聚谷氨酸钠、0.1-10％羧甲基纤维素钠、0.1-10％羟丙甲纤维素钠、0.1-10％海藻酸钠、0.1-10％琼脂糖中的至少一种，配制成0.3-13％的凝胶。

11、交联凝胶相制备：称取0.2-5％透明质酸钠、0.2-5％聚谷氨酸钠、0.1-10％羧甲基纤维素钠、0.1-10％羟丙甲纤维素钠、0.1-10％海藻酸钠、0.1-10％琼脂糖中的至少一种，配制成5-17％溶液，采用步骤7所用相同交联剂，按照凝胶相与交联剂的质量比为1：1-1：12，交联2-24h，按照交联的凝胶相与水的质量比为1：10-1：30静置浸泡交联的凝胶相，每1-2h更换水，更换1-10次，去除交联剂。

12、脱细胞基质微粒与凝胶相混合：用甘油或生理盐水或注射用水将脱细胞基质微粒制成10-70％的微粒悬流体，再将脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相按照质量比1：0.2-1：3混合；其中，混合凝胶相由交联凝胶相和非交联凝胶相组成，比例为0.1：1-1：0.1。

交联凝胶相和非交联凝胶相作为微粒的载体，一方面起到即时体积支撑的作用，另一方面交联凝胶相在注射中期起到组织填充效果；脱细胞基质微粒一方面可以引起机体适度的免疫应答、促进胶原新生，另一方面，脱细胞基质微粒保留了生物材料天然的致密微结构和粗纤维形态，抗降解性、填充效果更加优异。

13、均质：混合后的脱细胞基质微粒悬流体抽真空至20-95KPa，2000-11000r/min，均质10-150s，得到30-200μm的混合微粒流体。

14、灌装灭菌：将混和微粒流体灌装到预灌封注射器中并进行湿热灭菌，所述湿热灭菌条件为121℃、8-15min，得到无菌的脱细胞基质微粒填充剂。

脱细胞基质微粒填充剂中微粒粒径为30-200μm，能够起到良好的填充效果；若粒径过大，不易填充，且填充的外观和质感不好，异物感强烈；若粒径过小，则容易降解，易发生位移，难以起到长效的填充效果。

最后制得的一种脱细胞基质微粒填充剂，按质量分数计，包含以下成分：

脱细胞基质微粒：2.50％-60.00％；

混合凝胶相：15.00％-75.00％；

溶剂：7.50％-75.00％；

所述混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.1：1-1：0.1。

实施例1

一种脱细胞基质微粒填充剂，按质量分数计，包含以下成分：

脱细胞基质微粒：16％；

混合凝胶相：60％；

溶剂(注射用水)：24％

混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.7：0.3。

本实施例还提供一种脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其制备步骤如下：

1、预处理：取牛新鲜心包膜，去皮下组织等；

2、脱脂：取异丙醇、石油醚溶液混合，混合比例为1：0.5，按照软组织与料液质量比为1：5进行60r/min震荡脱脂2次，每次7h；

3、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10，清洗残留的脱脂混合溶液，清洗2次,每次20min，频率为60r/min；

4、冷冻辐照：将清洁后的软组织置于-20℃中，冷冻24h，转移至保温盒中，加入冰盒，密封，采用15kGy辐照处理；

5、脱细胞：高渗溶液为5.88％的氯化钠溶液，低渗溶液为pH5.5的PBS溶液，其中高渗溶液添加0.1％的曲拉通100。按照软组织与溶液质量比1：8，高低渗震荡循环3次，20min/次，震荡频率为65r/min；

6、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10，清洗三次，每次10min，频率为120r/min；

7、交联：按照软组织与交联剂的质量比为1：4加入交联剂溶液，50r/min震荡交联5h。其中交联剂为1％的戊二醛、0.5％的EDC混合溶液，混合比例为：1:0.1

8、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10，80r/min，清洗5次，3min/次，或静置16h，每2h换一次液体，去除交联剂残留；

9、冷冻粉碎：将软组织放入-20℃冷冻10h，转移至液氮中预冷1h，再进行粉碎，粉碎时，加入适量液氮控制温度，粉碎转速为10000r/min，粉碎时间20s，每次10s，停机、开机粉碎，筛分，重复步骤9；

10、非交联凝胶相制备：称取透明质酸钠、羧甲基纤维素钠，配制成8％凝胶。其中，透明质酸钠0.5％，羧甲基纤维素钠为7.5％；

11、交联凝胶相制备：称取透明质酸钠、羧甲基纤维素钠，配制成10％溶液；其中，透明质酸钠7.5％，羧甲基纤维素钠为2.5％；采用步骤7所用相同交联剂，按照凝胶相与交联剂的质量比为1：3，交联16h，按照交联的凝胶相与水的质量比为1：20静置浸泡，每2h更换水，更换5次，去除交联剂；

12、脱细胞基质微粒与混合凝胶相混合：用注射用水将脱细胞基质微粒制成40％的微粒悬流体，再将脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相按照质量比1：1.5混合，其中，混合凝胶相由交联凝胶相和非交联凝胶相组成，比例为0.7：0.3；

13、均质：将混合后的脱细胞基质微粒悬流体抽真空至40KPa，3500r/min，均质85s，得到30-200μm的混合微粒流体；

14、灌装：将混合微粒流体灌装至预灌封注射器中；

15、灭菌：将装有混合微粒流体的预灌封注射器置入湿热灭菌器灭菌，进行121℃、8min灭菌，得到无菌的脱细胞基质微粒填充剂。

实施例2：

一种脱细胞基质微粒填充剂，按质量分数计，包含以下成分：

脱细胞基质微粒：16.66％；

混合凝胶相：16.67％；

溶剂(甘油)：66.67％

混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.2：0.8。

本实施例还提供一种脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其制备步骤如下：

1、预处理：取猪新鲜皮肤，去除毛发、皮下组织等；

2、脱脂：取丙酮溶液，按照软组织与料液质量(以下均为质量比)比为1：5进行75r/min震荡脱脂2次，每次4h；

3、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10清洗残留的脱脂混合溶液，清洗3次,每次10min，震荡频率为75r/min；

4、冷冻辐照：将清洁后的软组织置于-40℃中，冷冻8h，转移至保温盒中，加入高分子蓄冷剂，密封，采用10kGy辐照处理；

5、脱细胞：高渗溶液为1.5％的氯化钠溶液，低渗溶液为6.8的PBS溶液。按照软组织与溶液质量比1：8高低渗循环5次，15min/次，频率为120r/min；

6、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10清洗三次，每次20min，频率为120r/min；

7、交联：按照软组织与交联剂溶液的质量比为1：2加入交联剂溶液，75r/min震荡交联4h。其中，交联剂为0.2％的EDC、0.2％的京尼平的混合溶液，混合比例为1：0.2；

8、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10清洗交联剂，静置24h，每2h换一次液体，去除交联剂残留；

9、冷冻粉碎：将软组织放入-78℃冷冻4h，转移至液氮中预冷2h，再进行粉碎，粉碎时，加入适量液氮控制温度，粉碎转速为17000r/min，粉碎时间15s，每次5s，停机、开机粉碎，筛分，重复步骤9；

10、非交联凝胶相制备：称取海藻酸钠、聚谷氨酸钠，配制成2.5％的凝胶。其中，聚谷氨酸钠为0.5％，海藻酸钠为2.0％；

11、交联凝胶相制备：称取海藻酸钠、聚谷氨酸钠，配制成7％溶液；其中，海藻酸钠4％，聚谷氨酸钠为3％；采用步骤7所用相同交联剂，按照凝胶相与交联剂的质量比为1：5，交联12h，按照交联的凝胶相与水的质量比为1：20静置浸泡交联的凝胶相，每2h更换水，更换4次，去除交联剂；

12、脱细胞基质微粒与混合凝胶相混合：用甘油将脱细胞基质微粒制成20％的微粒悬流体，再将脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相按照质量比1：0.2混合，其中，混合凝胶相由交联凝胶相和非交联凝胶相组成，比例为0.2：0.8

13、均质：将混合后的脱细胞基质微粒悬流体抽真空至25KPa，2000r/min，均质35s，得到30-200μm的混合微粒流体；

14、灌装：将混合微粒流体灌装至预灌封注射器中；

15、灭菌：将装有混合微粒流体的预灌封注射器置入湿热灭菌器灭菌，进行121℃、9min灭菌，得到无菌的脱细胞基质微粒填充剂。

实施例3

一种脱细胞基质微粒填充剂，按质量分数计，包含以下成分：

脱细胞基质微粒：21.00％；

混合凝胶相：75.00％；

溶剂(注射用水)：9.00％

混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.8：0.2。

本实施例还提供一种脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其制备步骤如下：

1、预处理：取牛隔膜，去皮下组织等；

2、脱脂：取酒精、异丙醇溶液混合，混合比例为0.4：0.6，按照软组织与料液质量(以下均为质量比)比为1：20进行140r/min震荡脱脂2次，每次4h；

3、清洗：按照软组织与水的质量比为1：10清洗残留的脱脂混合溶液，清洗2次，每次20min，震荡频率为140r/min；

4、冷冻辐照：将清洁后的软组织置于-80℃中，冷冻6h，转移至保温盒中，加入干冰，密封，采用25kGy辐照处理；

5、脱细胞：高渗溶液为3％的氯化钠溶液，低渗溶液为水。按照软组织与溶液质量比1：20高低渗循环5次，15min/次，频率为140r/min；

6、清洗：按照软组织与水的质量比为1：20清洗三次，每次10min，频率为140r/min；

7、交联：按照软组织与交联剂溶液的质量比为1：12加入交联剂溶液，75r/min震荡交联2h。其中交联剂为0.2％的戊二醛、0.8％的BDDE混合溶液，混合比例为1：3；

8、清洗：按照软组织与水的质量比为1：20清洗交联剂，140r/min，清洗8次，5min/次，去除交联剂残留；

9、冷冻粉碎：将软组织放入-40℃冷冻7h，转移至液氮中预冷3h，再进行粉碎，粉碎时，加入适量液氮控制温度，粉碎转速为25000r/min，粉碎时间55s，每次5s，停机、开机粉碎，筛分，重复步骤9；

10、非交联凝胶相制备：称取羧甲基纤维素钠、聚谷氨酸钠，配制成13％的凝胶。其中聚谷氨酸钠为1％、羧甲基纤维素钠12％；

11、交联凝胶相制备：称取羧甲基纤维素钠、聚谷氨酸钠，配制成17％溶液；其中，羧甲基纤维素钠12％，聚谷氨酸钠5％；采用步骤7所用相同交联剂，按照凝胶相与交联剂的质量比为1：12，交联21h，按照交联的凝胶相与水的质量比为1：30的水静置浸泡交联的凝胶相，每1h更换水，更换8次，去除交联剂；

12、脱细胞基质微粒与凝胶相混合：用生理盐水将脱细胞基质微粒制成70％的微粒悬流体，再将脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相按照质量比1：3混合，其中，混合凝胶相由交联凝胶相和非交联凝胶相组成，比例为0.8：0.2；

13、均质：将混合后的脱细胞基质微粒悬流体抽真空至95KPa，11000r/min，均质150s，得到30-200μm的混合微粒流体；

14、灌装：将混合微粒流体灌装至预灌封注射器中；

15、灭菌：将装有混合微粒流体的预灌封注射器置入湿热灭菌器灭菌，进行121℃、15min灭菌，得到无菌的脱细胞基质微粒填充剂。

对比例1：与实施例1的不同之处在于，混合凝胶相中不包括非交联凝胶相，即脱细胞基质微粒填充剂的组成为：16％脱细胞基质微粒、60％的交联凝胶相、溶剂(注射用水)24％。

对比例2：与实施例1的不同之处在于，脱细胞的软组织，没有与交联剂交联，即缺少步骤7。

对比例3：按照专利CN200510044005.5制备可注射软组织生物填充材料。

对比例4：与实施例1的不同之处在于，混合凝胶相中不包括交联凝胶相。

对比例5：与实施例1的不同之处在于，混合凝胶相中，交联凝胶相和非交联凝胶相的比例为1.5：0.1。

对比例6：与实施例1的不同之处在于，混合凝胶相中，交联凝胶相和非交联凝胶相的比例为0.1：2。

对比例7：与实施例1的不同之处在于，脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相的质量比为1：0.1。

对比例8：与实施例1的不同之处在于，脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相的质量比为1：5。

脱细胞基质微粒的微观结构

使用场发射扫描电子显微镜观察脱细胞基质微粒的横截面。首先，需要将样品在液氮中冷冻，然后在冻干机中干燥，样品表面需要镀金，然后用扫描电镜观察；测试结果如图1、图2所示。

图1为实施例1制备的脱细胞基质微粒扫描电镜图；图2为对比例3制备的可注射软组织生物填充材料扫描电镜图。

图1结果显示，实施例1的脱细胞基质微粒其胶原结构完整、致密，未见明显降解，脱细胞基质仍保留天然三维机构，未被破坏。而图2中，对比例3制备的可注射软组织生物填充材料，由于采用强碱液处理，脱细胞基质的天然结构被严重破坏，组织呈疏松状。采用本发明提供的技术方案，在去除免疫原性的同时，能够最大程度的保护天然组织结构不被破坏，脱细胞基质微粒具有生物材料天然的致密微孔结构和粗纤维形态。

性能测试

将本发明制备的填充剂及对比例进行溶胀度、杨氏模量和推挤力测试，采用重量法计算溶胀度；利用流变仪进行杨氏模量测定，测定参数25℃、剪切应变为0.1％、频率扫描为10-0.1Hz；按照《YY/T 0962-2021》进行推挤力测定，结果如下表1所示。

表1各实施例与对比例性能测试数据

性能测试结果说明，和对比例1相比，实施例1由于添加非交联凝胶相，其具有适宜的推挤力和润滑性，对比例1的润滑性和可注射性则大打折扣，尤其在注射时非常费力，推挤力可达25N以上，且存在瞬间推挤出大量填充剂的情况，为临床手术操作带来较大风险和难度。对比例2脱细胞的软组织未经交联，具有较多水结合基团、且其内部结构比较疏松，因此溶胀度过高，会导致植入后局部肿胀明显。对比例5非交联凝胶相少于适用比例，其推挤力增加一倍，增加了注射风险且不方便临床使用。对比例6中交联凝胶相少于适用比例，其溶胀度明显增加，降低了填充舒适性，增加了使用风险。对比例7中混合凝胶相减少，溶胀度、杨氏模量未见明显变化，但其推挤力增大，增加了操作风险。

体外降解实验

将实施例和对比例所得产品采用2500UI胶原酶降解，离心取上清液，参照《中国药典》中方法测定胶原含量，计算不同时间体外降解率。

表2实施例与对比例的体外降解率

体外降解数据说明，在短期内，本发明提供的技术方案所制备的脱细胞基质微粒填充剂未发生明显降解，对比例与实施例的体外降解程度相当；随着时间延长，对比例2、对比例3、对比例4的降解明显加快，这是因为对比例2的脱细胞基质未经交联，导致脱细胞基质微粒的抗降解性能非常差；而对比例3在制备脱细胞基质微粒的过程中，组织的天然结构遭到严重破坏，均在72h完全降解；对比例4未与交联的凝胶相混合，整体抗降解性能略差。对比例8的混合凝胶相超过适用比例，整体抗降解性能下降。而实施例1降解缓慢，说明采用本发明的脱细胞基质微粒与交联凝胶相、非交联凝胶相复配，既能够具有适度的推挤力、便于临床使用，又能有效延缓降解，增强填充效果。

充填效果测试

动物实验方案

取10只SD大鼠，雌雄各半，剃去背部毛发，间隔2cm标记个点，标记为A-F，分别皮下注射实施例1-3和对比例1-3所制备的凝胶0.5mL，于1周、3月观察填充效果，分别如图3、图4所示，其中，A：实施例1、B：实施例2、C：实施例3、D：对比例1、E：对比例2、F：对比例3。

充填效果对比如下表3所示。

表3填充效果对比

由图3、图4和表3可知，本发明的实施例1-3的填充后的外观饱满，质感柔软，且在观察期内未形成纤维囊，说明本发明提供的脱细胞基质微粒填充剂无异物反应、产品安全、填充效果良好，至3月、12月观察时，仍能保持较好的填充体积和填充效果。而采用对比例1的样品填充后，填充部位质感偏硬、与天然组织质感相差较大，易导致实际应用中填充效果僵硬、不自然，且在长期(12月)观察时，出现了明显的游走，这是因为对比例1为较硬质地的脱细胞基质微粒和交联的凝胶相，不包含相对柔软的非交联凝胶相，填充剂内聚力较差，在体内植入后出现明显游走。对比例2的样品由于脱细胞基质微粒未经交联，其抗降解性较差，在长期观察时，填充体积明显减小。而采用对比例3的填充剂，外观质感较硬、填充效果不自然，且由于其粒径大，引起异物反应、形成了纤维囊，在短期及长期观察中对比例3的填充剂出现了一定程度的游走，这在实际临床使用中容易导致其他部位不雅观的隆起、肿块等畸形，甚至严重的导致感染。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (10)

1.一种脱细胞基质微粒填充剂，其特征在于，按质量分数计，包含以下成分：

脱细胞基质微粒：2.50％-60.00％；

混合凝胶相：15.00％-75.00％；

溶剂：7.50％-75.00％；

所述混合凝胶相包含交联凝胶相和非交联凝胶相，所述交联凝胶相和非交联凝胶相的质量比为0.1：1-1：0.1。

2.根据权利要求1所述的脱细胞基质微粒填充剂，其特征在于，所述脱细胞基质微粒粒径为30-200μm。

3.根据权利要求2所述的脱细胞基质微粒填充剂，其特征在于，按质量分数计，所述交联凝胶相为凝胶相与交联剂溶液交联后得到，所述凝胶相选自0.2-5％透明质酸钠、0.2-5％聚谷氨酸钠、0.1-10％羧甲基纤维素钠、0.1-10％羟丙甲纤维素钠、0.1-10％海藻酸钠、0.1-10％琼脂糖中的至少一种，凝胶相的溶液浓度为5-17％；

所述交联剂溶液选自0.2-8％的戊二醛、0.1-1.0％的EDC、0.1-1.3％的BDDE、0.1-3％的PEGDE、0.1-0.8％的京尼平中的一种或者两种的混合溶液；

所述凝胶相与交联剂溶液的质量比为1：1-1：12。

4.根据权利要求3所述的脱细胞基质微粒填充剂，其特征在于，所述非交联凝胶相选自0.2-5％透明质酸钠、0.2-5％聚谷氨酸钠、0.1-10％羧甲基纤维素钠、0.1-10％羟丙甲纤维素钠、0.1-10％海藻酸钠、0.1-10％琼脂糖中的至少一种，非交联凝胶相的溶液浓度为0.3-13％。

5.根据权利要求4所述的脱细胞基质微粒填充剂，其特征在于，所述溶剂选自甘油、生理盐水、注射用水中的一种。

6.一种如权利要求1-5任意一项所述的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

(1)取软组织，去除毛发和皮下组织，将软组织和料液混合进行震荡脱脂；震荡脱脂后清洗，得到脱脂后的软组织；

(2)将脱脂后的软组织先置于-15至-80℃条件中冷冻6-36h，后取出、密封，采用剂量10-40kGy的辐射处理，得到辐射后的软组织；

(3)将辐射后的软组织交替放入高渗溶液、低渗溶液中震荡，震荡后清洗，得到脱细胞的软组织；

(4)将脱细胞的软组织与交联剂溶液以1：1-1：12的质量比震荡交联，震荡频率45-100r/min，震荡时间0.5-24h，得到交联后的软组织；

(5)将交联后的软组织进行深低温冷冻粉碎，筛分，得到脱细胞基质微粒；

(6)将凝胶相与交联剂溶液按质量比交联，交联时间2-24h，清洗去除多余的交联剂溶液，得到交联凝胶相；将交联凝胶相与非交联凝胶相以0.1：1-1：0.1的质量比混合，得到混合凝胶相；

(7)在脱细胞基质微粒中加入溶剂，得到质量百分数为10-70％的脱细胞基质微粒悬流体，将脱细胞基质微粒悬流体与混合凝胶相按照质量比1：0.2-3混合、均质后得到脱细胞基质微粒填充剂。

7.根据权利要求6所述的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述软组织选自哺乳动物的皮、小肠、膈膜、脑膜、心包膜和筋膜、以及鱼类的皮肤中的一种。

8.根据权利要求6所述的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述料液选自酒精、异丙醇、丙酮、正丙醇、石油醚、氯仿中的至少一种。

9.根据权利要求6所述的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高渗溶液包含质量百分数0.29-18.5％的氯化钠溶液，低渗溶液选自水、pH5.5-7.2的缓冲溶液中的一种。

10.根据权利要求6所述的脱细胞基质微粒填充剂的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，深低温冷冻粉碎的工艺条件为：-20℃至-78℃冷冻4h-10h，转移至液氮中预冷1h-4h，再进行粉碎；粉碎时，加入液氮控制温度，转速为3000-30000r/min，每次5-10s，粉碎时间10s-55s。

Images