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CN114948850B - 可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用 - Google Patents

可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用 Download PDF

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CN114948850B CN202210579633.7A CN202210579633A CN114948850B CN 114948850 B CN114948850 B CN 114948850B CN 202210579633 A CN202210579633 A CN 202210579633A CN 114948850 B CN114948850 B CN 114948850B
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Abstract

本发明公开了一种可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用，所述携载卡托普利寡肽的制备方法：(1)连接保护氨基，(2)连接小分子，(3)携载药物，(4)切肽反应和纯化；本发明实现了一步法合成寡肽载药策略，缩短了分步合成的流程，减少了中间产物的生成以及物料的使用，对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案。本发明的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器进行缩合反应。而且本发明将携载卡托普利的寡肽装载在分层微针中，通过体内存在的脂肪酶将药物从寡肽上水解下来实现了持续释放的目的，延长了药物的作用时间同时缓解了口服药物的首过效应。

Description

可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种可载药寡肽及其可溶性分层微针的制备方法和应用。
背景技术
高血压是心脑血管疾病的重要病因及危险因素，会影响心、脑、肾的功能，能显著增加卒中、心衰、终末期肾病的发病风险。目前药物治疗是治疗高血压的主要方法，其中卡托普利(Cap)为一种常用的降压药物。卡托普利为竞争性血管紧张素转换酶抑制剂，使血管紧张素Ⅰ不能转化为血管紧张素Ⅱ，从而降低外周阻力，并通过抑制醛固酮分泌，减少水钠潴留。但几乎所有降压药为短效药物，需要每天不间断口服药物来控制血压，这样就导致患者频繁用药，并且口服药物使得生物利用度相对较低，目前有团队报道将药物与寡肽通过化学键键合能够实现药物的缓释，延长药效。
寡肽是肽类的一种,由2-10个氨基酸组成,比蛋白质、多肽和氨基酸更容易被人体吸收,且具有多种生理活性,是生物技术新药的潜力股。寡肽的化学合成目前主要有液相合成和固相合成两种方法。液相合成的优点是每步中间产物的合成可以直接进行过程控制；缺点是工艺复杂，占用较多工时与人力，需要较多设备胡场地；固相合成法工艺简单，占用工时与人力较少，物料转移较少而节省设备与场地；但是每步中间产物不可纯化，必须优化各步反应条件使得转化率接近100％，而且尽可能避免副反应的发生。
尽管目前市面上有多种降血压药物，但所有药物均为口服使用，一旦口服使用就不可避免的存在“首过效应”，且所有降压药均为短效药物，需要每天不间断口服药物来控制血压，这样就导致患者频繁用药并且口服药物生物利用度相对较低。经皮药物递送系统是一种非侵入性和无痛给药系统，目前作为一种安全有效的给药方式被广泛应用于临床。微针是经皮药物递送系统的一种，由一系列微米的微型针头组成，将其施于皮肤时，微针支撑膜上的微米级针头会刺穿角质层并进入真皮层上层，从而避免与位于真皮层下层密布的血管和神经纤维接触。而现有技术中，可溶性微针在使用过程中存在药物利用度低、背衬层吸附药物、给药剂量不明确等。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种可载药寡肽的制备方法，本发明采用一步法固相合成寡肽，通过一步法将小分子键合到生物相容性很好的寡肽，改进了以往分布键合的技术路线，不需要在寡肽和小分子间添加连接体，减少化学试剂污染同时也减少原料的损失。
本发明合成的可载药寡肽的所有缩合反应在同一个反应器内依次连续完成，无需在活化器中低温活化保护氨基酸再转移至缩合反应器中，在进行任一保护氨基酸的缩合反应时，保护氨基酸、缩合剂先溶解在有机溶剂中，然后与树脂混合并利用氮气流和树脂充分均匀接触，缩合反应温度控制在室温。
本发明还提供一种可载药寡肽的可溶性分层微针的制备方法及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种可载药寡肽的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)连接保护氨基：在树脂上通过缩合反应依次连接第一至第n个保护氨基，n是大于等于2、小于等于10的自然数；
(2)连接小分子：对第n个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入有机分子进行缩合反应；
(3)携载药物：步骤(2)缩合反应后，对整个寡肽侧链上的第一至第n个任一一个或者多个氨基酸残基进行脱保护基反应，加入药物和缩合剂，得到含有保护基团的携载药物的寡肽树脂；
(4)切肽反应和纯化：步骤(3)的产物中加入切肽试剂进行切肽反应，震荡抽滤后，旋蒸浓缩切肽液，沉析后收集固体，洗涤，真空干燥过夜获得携载卡托普利的寡肽粗品；将粗品洗脱，收集，经减压旋蒸，最后经冷冻干燥得纯的携载卡托普利的寡肽。
其中，步骤(1)所述树脂为经二氯甲烷溶胀处理的Wang树脂，保护氨基酸是Fmoc-Met-OH、Fomc-Lys(Boc)-OH、Fomc-Phe-OH、Fomc-Tyr(tBu)-OH、Fomc-Trp(Boc)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Ser(tBu)-OH、Fomc-His(Thr)-OH、Fomc-Cys(Thr)-OH、Fomc-Asp(OtBu)-OH、Fomc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Glu(OtBu)-OH、Fomc-Asn(Thr)-OH、Fomc-Asn-OH、Fomc-Ala-OH、Fomc-val-OH中的任一一种，整个氨基酸序列里要包含至少一种Fomc-Tyr(tBu)-OH或Fomc-Ser(tBu)-OH，这两个氨基酸连接在第几个保护氨基酸，连接药物时就对第几个氨基酸进行脱保护和药物进行进行反应。
寡肽序列可以包含x(1≤x≤n)个Fomc-Tyr(tBu)-OH或Fomc-Ser(tBu)-OH，就可以连接x个带羧基的药物，该药物可以是同一种带羧基的药物，也可以是不同带羧基的药物。优势在于，如果连接x个带羧基的同一种药物就可以实现保护药物的同时增大药量，进一步延长药效；如果连接x个带羧基的不同种药物不仅可以实现保护药物，还可以实现不同药物的联合治疗；药物可以选择任何种类带羧基的药物实现不同疾病模型的治疗。
其中，步骤(2)所述有机分子为萘乙酸。
其中，步骤(3)所述药物为带羧基的药物，其加入种类为大于等于1，小于等于n的自然数。
其中，步骤(1)-(3)中缩合反应的缩合剂为HOBt和液体缩合剂DIC，有机溶剂为DMF，助缩合剂是DMAP，缩合反应的温度为室温，时间为4-6h。
其中，步骤(3)中所述药物为携带羧基的药物。
其中，步骤(4)中切肽试剂为三氟乙酸、茴香硫醚、β-巯基乙醇、苯酚和水，其体积比为80～90：1～6：1～3：1～3：1～3。
其中，纯化的色谱条件为0.1％TFA/水(V/V)：0.1％TFA/ACN(V/V)为1～3:1～3。
本发明所述基于可载药寡肽的可溶性分层微针的制备方法，将制备的携载卡托普利寡肽溶解于PVP溶液中形成针尖浇筑液涂在PDMS模具上，再涂抹基底溶液填充模具，抽真空后室温下干燥过夜。
其中，所述基底溶液聚苯乙烯的二恶唑溶液。
本发明所述的可载药寡肽的制备方法制备的可载药寡肽在制备降压药物中的应用，可载药寡肽携载药物为卡托普利。
本发明所述的可载药寡肽的可溶性分层微针的制备方法制备的可载药寡肽的可溶性分层微针在制备降压药物中的应用，可载药寡肽的可溶性分层微针携载药物为卡托普利。
本发明采用一步法固相合成携载卡托普利的寡肽；将掺有携载卡托普利的寡肽针尖浇筑液涂在PDMS上填充模具；抽真空去气泡后将PDMS模具在室温下干燥过夜，干燥完成后，将形成的针状阵列从PDMS中分离出来，形成携载卡托普利寡肽的分层微针。
作为优选，一步法固相合成可载药寡肽均在一个反应容器内反应，具体方法包括如下步骤：
(1)在树脂上连接第一个保护氨基酸：将Wang树脂装入多肽固相合成管中，再加入DCM溶液使树脂充分溶胀，抽干，然后加入有机溶剂混合均匀的保护氨基酸和缩合剂，加入助缩合剂启动保护氨基酸和树脂进行的缩合反应，利用氮气使溶液和树脂充分接触，再加入液体缩合剂在室温下混合反应，反应完全后抽干，洗涤沉淀，再真空抽干；
(2)连接第n个保护氨基酸：在步骤(1)所得沉淀中加入乙酸酐/DCM溶液先进行封端，在室温下氮气鼓吹，真空抽干；再加入有机溶剂和DCM洗涤，真空抽干，再加入有机溶剂和哌啶，对第一个氨基酸末端进行脱保护基反应，在室温下氮气鼓吹，真空抽干，洗涤沉淀，真空抽干；加入第n个用有机溶剂混合均匀的保护氨基酸和缩合剂，同时向反应体系中通入氮气，再加入液体缩合剂混合反应，反应温度控制在室温，反应完全后真空抽干，洗涤沉淀后再真空抽干，所述n大于等于2、小于等于10的自然数；
采用步骤(2)的方法依次连接至所需保护氨基酸数目；
(3)连接小分子：在步骤(2)所得沉淀中加入有机溶剂和哌啶，对第n个氨基酸末端进行脱保护基反应，室温下氮气鼓吹，反应完全后抽干，将沉淀洗涤后真空抽干，加入有机溶剂混合均匀的萘乙酸和缩合剂，同时向反应体系中通入氮气，加入液体缩合剂，反应温度控制在室温；反应完全后抽干，洗涤沉淀后真空抽干；
(4)携载药物：在步骤(3)所得沉淀中加入三氯乙酸和二氯甲烷，对寡肽侧链进行脱保护基反应，室温下氮气鼓吹，反应完全后抽干，洗涤沉淀后真空抽干，加入有机溶剂混合均匀的药物，同时向反应体系中通入氮气，加入液体缩合剂启动保护药物和树脂进行的缩合反应，反应温度控制在室温，反应完全后抽干，洗涤沉淀后再真空抽干，得到含有保护基团的携载药物的寡肽树脂；
(5)切肽反应：在步骤(4)所得沉淀中加入切肽试剂三氟乙酸、茴香硫醚、β-巯基乙醇、苯酚和水进行切肽反应，震荡抽滤后，旋蒸浓缩切肽液，沉析后收集固体，洗涤，真空干燥过夜获得载药的寡肽粗品；
(6)将粗品溶解于ACN/水溶液，利用制备高效液在色谱条件下相等度洗脱，收集需要的组分，经减压旋蒸浓缩并除去ACN，最后经冷冻干燥得纯的白色固体。
更为优选地：
(1)连接保护氨基：在树脂上通过缩合反应连接第一个保护氨基酸，对第一个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入第二个保护氨基酸进行缩合反应连接，对第二个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入第三个保护氨基酸进行缩合反应连接；
(2)连接小分子：对第三个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入有机分子进行缩合反应；
(3)携载药物：对寡肽侧链进行脱保护基反应，加入药物和缩合剂，启动保护卡托普利和树脂进行的缩合反应，得到含有保护基团的携载卡托普利的寡肽树脂；
(4)切肽反应和纯化：步骤(3)的产物中加入切肽试剂进行切肽反应，震荡抽滤后，旋蒸浓缩切肽液，沉析后收集固体，洗涤，真空干燥过夜获得携载卡托普利的寡肽粗品；将粗品洗脱，收集，经减压旋蒸，最后经冷冻干燥得纯的携载卡托普利的寡肽。
设计原理：本发明的设计原理是基于寡肽的固相合成，以树脂为开端通过酰胺反应将氨基酸键合到树脂上，在所有氨基酸序列键合到树脂上后，对第三个氨基酸的侧链进行脱保护，再通过酯化反应将药物键合到树脂上，最后对整体序列进行切割得到目标产物。
本发明的核心发明点是一步法的固相合成可载药的寡肽，所有缩合反应在同一个反应器内依次连续完成，无需在活化器中低温活化保护氨基酸再转移至缩合反应器中，且药物的键合也在同一反应器内，通过化学合成技术将药物键合到生物相容性良好的寡肽载体上，并掺杂到聚合物基质中制备成微针针尖，最后合成携载药物的前药，再将合成的前药掺杂到可溶性的分层微针中，从而实现药物的缓释效果，延长药效，实现长效降压，并且避免口服药物的“首过效应”，实现对患者快速、高依从性的给药，使用方便、安全有效。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明针对连接小分子药物而言，实现了一步法合成寡肽载药策略，缩短了分步合成的流程，减少了中间产物的生成以及物料的使用，对抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋提供了一种通行的解决方案。
(2)本发明中配料以及保护氨基酸的活化和缩合反应都在同一个反应器内连续进行，无需将保护氨基酸在活化器中低温活化再转移至缩合反应器中进行缩合反应。在进行缩合反应时，不需预活化氨基酸，却能够抑制缩合反应中保护氨基酸的消旋。
(3)本发明制备的寡肽载药是以寡肽作为一种生物相容性良好的载体通过化学键将药物变成其前药，由于体内源性酶的存在会对载体和药物之间的键进行水解从而释放药物，起到保护药物被水解的功能。
(4)本发明是通过化学键形成卡托普利的前药，同时将携载卡托普利的前药装载到微针中，再经皮递送到体内，并通过内源性酶水解前药释放卡托普利，避免了口服药物的“首过效应”，实现方便、安全、高效给药，同时缓释的体系也延长了药效，实现了长效降压。
(5)在相同酶浓度下，酯肪酶对携载卡托普利的寡肽(MMTN-Cap)的亲和力比对Cap(卡托普利)的亲和力大，同时酯肪酶对MMTN-Cap的催化速率比对Cap的催化速率又快又高，说明脂肪酶是先水解MMTN-Cap释放Cap发挥药效的，因此证明了前药有保护Cap的效果。因为如果是单纯的Cap在脂肪酶的存在下会被水解失效，但如果设计成前药就会先水解前药释放出Cap，尽管脂肪酶最后依旧会水解Cap使其失活，但这样的前后顺序已经有效证明延长了Cap的降压时间。
(6)本发明制备的分层微针利用可分离双层微针递送药物，可将药物快速递送进体内的同时，利用快速可溶解针尖溶解后与不溶解基底层的分离，快递拔出非载药基底层(PS层)，该设计不仅避免了药物扩散进背衬层的药物浪费，还能克服在微针插入皮肤后随着针尖溶解造成的背衬层吸附针尖药物的现象；同时也避免了其他经皮制剂如敷料长期停留在皮肤表面给人带来的不适感，又实现了含药针尖在体内的隐形给药目的。
附图说明
图1为寡肽的质谱图。
图2为寡肽的核磁共振氢谱图。
图3为寡肽的傅里叶红外光谱图。
图4为寡肽的体外释放曲线。
图5为不同酶浓度下寡肽的体外释放曲线。
图6为寡肽和卡托普利在相同酶浓度、不同底物浓度下的米氏常数曲线。
图7为分层微针的扫描电镜图。
图8为分层微针的荧光双层表征。
图9为分层微针的机械力测试结果。
图10为分层微针的皮肤插入图。
图11为微针针尖和背衬层溶解情况。
图12为掺杂纯Cap微针和掺杂寡肽微针的透皮扩散曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明中技术术语的缩写如下：DCM：二氯甲烷、DMF：N,N-二甲基甲酰胺、HOBt：1-羟基苯并三唑、DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺、DMAP：4-二甲氨基吡啶、TFA：三氟乙酸、Pip：哌啶、NAA：萘乙酸、Cap：卡托普利、ACN：乙腈、PBS：磷酸缓冲盐溶液。
其中聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具购买于台州微芯医药科技有限公司，二恶唑溶液(1,4二氧六环，含量≥99.5％)购买于国药集团化学试剂有限公司，聚乙烯吡咯烷酮PVP分子量为90k，聚苯乙烯PS分子量为260k。
Wang树脂：阿拉丁，取代度：1.36mmol/g，Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH：南京肽业生物科技有限公司；脂肪酶为羧基酯水解酶类，具体采用CAS：9001-62-1。
实施例1
携载卡托普利的寡肽(MMTN-Cap)的制备
(1)在树脂上连接第一个保护氨基酸：称量0.91g的Wang树脂(1.36mmol/g)，装入多肽固相合成管，用20ml DCM溶液使树脂充分溶胀，抽干。称量保护氨基酸Fomc-Met-OH(MW:371.45,Wang树脂摩尔数的3倍)1.38g，缩合剂HOBt(MW:135.13，Wang树脂摩尔数的3倍)0.50g，助缩合剂DMAP(MW:122.17，Wang树脂摩尔数的3.6倍)0.55g，用25ml的有机溶剂DMF充分溶解并加入合成管中，利用氮气使溶液和树脂充分接触，缓慢加入缩合剂DIC(MW:126.2，Wang树脂摩尔数的3倍)0.61ml，将混合物在室温下反应4小时。真空抽干，依次用DCM、DMF(规格：AR 99％)洗涤两次，每次洗涤加入的量只需要淹没过沉淀即可，真空抽干，所得沉淀用溴酚蓝检测呈阴性。
(2)连接第二个保护氨基酸：在步骤(1)所得沉淀中加入20ml 20％乙酸酐/DCM溶液，在室温下氮气鼓吹50分钟，真空抽干，用DCM、DMF洗涤两次，真空抽干。加入20ml 20％Pip/DMF溶液，在室温下氮气鼓吹50分钟，真空抽干，用DCM、DMF洗涤两次，真空抽干，所得沉淀用溴酚蓝检测成阳性。然后称量保护氨基酸Fomc-Met-OH(MW:371.45,Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.69g，缩合剂HOBt(MW:135.13，Wang树脂摩尔数的1.8倍)0.30g，用25ml的有机溶剂DMF充分溶解并加入合成管中，利用氮气使溶液和树脂充分接触，缓慢加入缩合剂DIC(MW:126.2，Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.30ml，将混合物在室温下反应4小时。真空抽干，依次用DCM、DMF(规格：AR 99％)洗涤两次，每次洗涤加入的量只需要淹没过沉淀即可，真空抽干后所得沉淀用溴酚蓝检测呈阴性。
(3)连接第三个保护氨基酸：在步骤(2)所得沉淀中加入20ml 20％Pip/DMF溶液，在室温下氮气鼓吹50分钟，真空抽干，用DCM、DMF洗涤两次，真空抽干，所得沉淀用溴酚蓝检测成阳性。称量保护氨基酸Fomc-Tyr(tBu)-OH(MW:459.53,Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.85g，缩合剂HOBt(MW:135.13，Wang树脂摩尔数的1.8倍)0.30g，用25ml的有机溶剂DMF充分溶解并加入合成管中，利用氮气使溶液和树脂充分接触，缓慢加入缩合剂DIC(MW:126.2，Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.30ml，将混合物在室温下反应4小时。真空抽干，依次用DCM、DMF(规格：AR 99％)洗涤两次，每次洗涤加入的量只需要摸过沉淀即可，真空抽干后所得沉淀用溴酚蓝检测呈阴性。
(4)连接第四个小分子：在步骤(3)所得沉淀中加入20ml 20％Pip/DMF溶液，在室温下氮气鼓吹50分钟，真空抽干，用DCM、DMF洗涤两次，真空抽干，所得沉淀用溴酚蓝检测成阳性。称量NAA(MW:186.21,Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.35g，缩合剂HOBt(MW:135.13，Wang树脂摩尔数的1.8倍)0.30g，用25ml的有机溶剂DMF充分溶解并加入合成管中，利用氮气使溶液和树脂充分接触，缓慢加入缩合剂DIC(MW:126.2，Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.30ml，将混合物在室温下反应4小时。真空抽干，依次用DCM、DMF(规格：AR 99％)洗涤两次，每次洗涤加入的量只需要淹没过沉淀即可，真空抽干后所得沉淀用溴酚蓝检测呈阴性。
(5)携载卡托普利：在步骤(4)所得沉淀中加入15ml 30％TFA/DCM溶液，在室温下氮气鼓吹40分钟，真空抽干，用DCM、DMF(规格：AR 99％)洗涤两次，每次洗涤加入的量只需要淹没过沉淀即可，真空抽干。然后称量Cap(MW:217.29,Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.41g，缩合剂HOBt(MW:135.13，Wang树脂摩尔数的1.8倍)0.30g，用25ml的有机溶剂DMF充分溶解并加入合成管中，利用氮气使溶液和树脂充分接触，缓慢加入缩合剂DIC(MW:126.2，Wang树脂摩尔数的1.5倍)0.30ml，将混合物在室温下反应4小时，真空抽干。
(6)切肽反应：按三氟乙酸：茴香硫醚：β-巯基乙醇：苯酚：水＝87.5：5：2.5：2.5：2.5(体积比)配置切肽溶液10ml，将步骤(5)所制备的产物与切肽液充分接触并在摇床下充分震荡3小时、转速180rpm，抽滤得到滤液，在40℃下旋蒸浓缩切肽液，用冰无水乙醚(AR,≥99.7％)沉析收集固体，再用冰无水乙醚洗涤三次，真空干燥过夜获得粗品。
(7)将步骤(6)所制备的粗品溶解于50％的ACN/水溶液，利用制备型高效液相在0.1％TFA/水(V/V)：0.1％TFA/ACN(V/V)＝1:1色谱条件下等度洗脱，收集需要的组分，经减压旋蒸浓缩并除去ACN，最后经冷冻干燥得纯的白色固体(MMTN-Cap)。经质谱、红外、核磁检验结构正确。如图1所示，MMTN-Cap分子量为810，该质谱所表示的为带一个电荷的分子量即811，因此质谱图上所显示的分子量与目标产物的分子量一致，说明质谱表征正确。如图2所示，该图谱为MMTN-Cap的核磁共振氢谱，将目标产物溶解在氘代二甲亚砜溶液中，用核磁共振扫描仪进行扫描，得到的图谱进行峰积分，最后积分出氢的个数与原始分子式相符，且各个峰的化学位移与标准图谱一致，说明核磁共振氢谱表征正确。
取MMTN-Cap10mg，用傅立叶变换红外吸收光谱仪在500nm～4000nm的波数范围内扫描红外图谱。如图3所示，卡托普利标准品在2565nm处有吸收峰且为巯基吸收峰，MMTN-Cap组在2565nm处也有相同的吸收峰，说明卡托普利成功键合到寡肽上；MMTN-Cap在1651nm处有吸收峰，该峰为酰胺键的羰基峰，说明寡肽序列成功合成。
实施例2
MMTN-Cap的体外释放实验
取实施例1制备得到的MMTN-Cap 48mg溶于3mlPBS(pH＝7.4)中并移至分子量为500Da的透析袋中，同时往透析袋中加入2mg脂肪酶，夹住透析袋，并将其放入装有9毫升的PBS(pH＝7.4)溶液的离心管中作为释放介质。将装有透析袋的离心管放在37℃的摇床水浴中，以200转/分钟的速度摇动。在预定的时间间隔(2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h)分别取1ml的释放介质作为待测样品溶液，并及时补充1ml的PBS(pH＝7.4)溶液。
为检测所提取Cap的含量，采用HPLC-UV对提取产物进行定量分析。HPLC-UV实验条件为：反相C18柱，流动相为：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液—水—甲醇(70：25：5，v/v)，注射量为20μL，流动温度为40℃，流速为1mL/min。
实施例1制备得到的MMTN-Cap的体外Cap累计释放曲线如图4所示，在酯酶的作用下，MMTN-Cap上的Cap不断的被释放出来，整体呈现缓释的趋势。该寡肽在24小时累计释放17.33％的Cap，由于体系渗透压的存在，使得透析袋外Cap的累计释放量在312小时达到56.92％。表明酯酶确实能够加速Cap的释放，且释放速率和释放量能够达到良好的预期。进一步证明了MMTN-Cap作为前药能够在脂肪酶的存在下被水解释放出Cap发挥降压效果。
实施例3
不同酶浓度(0U/ml、20U/ml、40U/ml)对MMTN-Cap释药影响实验
取三组实施例1制备得到的MMTN-Cap24mg溶于3mlPBS(pH＝7.4)中并移至分子量为500Da的透析袋中，同时往透析袋中分别加入0mg、1mg、2mg脂肪酶夹住透析袋，并将其放入装有9毫升的PBS(pH＝7.4)溶液的离心管中作为释放介质。将装有透析袋的离心管放在37℃的摇床水浴中，以200转/分钟的速度摇动。在预定的时间间隔(4h、8h、12h、24h、48h)取9ml的释放介质作为待测样品溶液，并及时补充9ml的PBS(pH＝7.4)溶液，每组做三个平行组。
为检测所提取Cap的含量，采用HPLC-UV对提取产物进行定量分析。HPLC-UV实验条件为：反相C18柱，流动相为：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液—水—甲醇(70：25：5，v/v)，注射量为20μL，流动温度为40℃，流速为1mL/min。
不同酶浓度对MMTN-Cap释药影响如图5所示，该载药寡肽有着良好的缓释效果，且酶的浓度显著影响了Cap的释放量。酶浓度为0U/ml组在48h内体外释放累计释放率为2.22％(±0.14％)；酶浓度为20U/ml组在48h内体外释放累计释放率为8.82％(±0.23％)；酶浓度为40U/ml组在48h内体外释放累计释放率为12.21％(±3.19％)。表明Cap的释放率与酶浓度呈正比的关系，同时也表明在体外通过酯酶的作用Cap可以缓慢被水解释放。
实施例4
相同酶浓度、不同MMTN-Cap浓度对Cap释药影响实验
取16.2mg、24.3mg、28.4mg、32.4mg、40.5mg实施例1制备得到的MMTN-Cap分别溶于3mlPBS(pH＝7.4)中并移至分子量为500Da的透析袋中，同时往透析袋中加入2mg脂肪酶夹住透析袋，并将其放入装有9毫升的PBS(pH＝7.4)溶液的离心管中作为释放介质。将装有透析袋的离心管放在37℃的摇床水浴中，以200转/分钟的速度摇动。在预定的时间间隔(4h、8h、12h、24h)取9ml的释放介质作为待测样品溶液，并及时补充9ml的PBS(pH＝7.4)溶液。
为检测所提取Cap的含量，采用HPLC-UV对提取产物进行定量分析。HPLC-UV实验条件为：反相C18柱，流动相为：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液—水—甲醇(70：25：5，v/v)，注射量为20μL，流动温度为40℃，流速为1mL/min。
将不同底物浓度下所计算得出的Cap释放量带入米氏方程中计算米氏常数，所展示的曲线如图6(B)所示，以不同MMTN-Cap浓度为横坐标，单位时间内Cap的生成量为纵坐标作图，然后分别对横纵坐标取倒，代入米氏方程：v＝Vmax{S}/(KM+{S})，分别计算KM、kcat、kcat/KM如表1所示。
实施例5
相同酶浓度、不同Cap浓度对Cap降解影响实验
取2.2mg、3.3mg、4.3mg、5.4mg、6.5mg、8.7mg Cap分别溶于10mlPBS(pH＝7.4)中并分别加入8mg脂肪酶移至离心管，将离心管放在37℃的摇床水浴中，以200转/分钟的速度摇动。在预定的时间间隔(4h、8h、12h、24h、36h、48h)取500μl作为待测样品溶液。
为检测所提取Cap的含量，采用HPLC-UV对提取产物进行定量分析。HPLC-UV实验条件为：反相C18柱，流动相为：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液—水—甲醇(70：25：5，v/v)，注射量为20μL，流动温度为40℃，流速为1mL/min。
将不同底物浓度下所计算得出的Cap的含量转换为Cap降解后生成物的含量并带入方程中计算米氏常数，所展示的曲线如图6(A)所示，以不同Cap浓度为横坐标，单位时间内Cap降解后生成物的含量为纵坐标作图，然后分别对横纵坐标取倒，代入米氏方程：v＝Vmax{S}/(KM+{S})，分别计算KM、kcat、kcat/KM如表1所示。
表1MMTN-Cap和Cap的米氏常数和其他参数值
对实施例4、5各自所计算出的参数进行对比，所示结果如表1，KM值越小，说明酶对底物的亲和力越大，因此脂肪酶对MMTN-Cap的亲和力比对Cap的亲和力大；kcat值越大，说明酶催化生成底物的速率越快，因此脂肪酶对MMTN-Cap的催化速率比对Cap的催化速率快；kcat/Km值越大说明酶对底物的催化效率越高，因此脂肪酶对MMTN-Cap的催化效率比对Cap的催化效率高。
由于脂肪酶能够对MMTN-Cap水解释放出Cap，同时也能够水解Cap使其失活，因此通过比较两者的米氏常数的大小来判定脂肪酶水解的顺序，最终证明了脂肪酶先水解MMTN-Cap释放出Cap。在相同酶浓度下，脂肪酶对携载卡托普利的寡肽(MMTN-Cap)的亲和力比对Cap的亲和力大，同时脂肪酶对MMTN-Cap的催化速率比对Cap的催化速率又快又高。综上，说明本发明设计合成的MMTN-Cap在体内源性脂肪酶的存在下能够保护Cap被水解，使得Cap的作用时间延长即达到延长降压时间的效果。
实施例6
分层微针的制备
(1)利用带有圆锥形孔阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具(台州微芯医药科技有限公司)制备分层微针贴片。模具上所有的阵列包含20×20个针头，阵列面积8mm×8mm，圆锥形孔阵列包含10×10个针头，每个针尖中心到中心的间距为650微米，每个针头间距为800微米。
(2)配置浓度为100mg/ml的PVP水溶液，形成针尖浇筑液。
(3)用吸管吸取600μL制备好的针尖浇筑液涂在PDMS模具上，在4000rpm下离心20分钟，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液。
(4)制备浓度为100mg/ml的PS二恶唑溶液(二恶唑即1,4二氧六环为溶解PS的溶剂)作为基底浇筑液，用吸管吸取1mL制备好的基底溶液涂在PDMS模具上填充模具，抽真空去气泡后将模具在室温下干燥过夜。
(5)干燥完成后，将针状阵列从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。
如图7所示，分层微针的扫描电镜结果，该分层微针贴片是排列整齐的圆锥形针尖贴片。
实施例7
荧光分层微针的制备
称取1μg罗丹明B(R-B)粉末溶解于2ml浓度为100mg/mlPVP的水溶液中，形成针尖浇筑液，称取1μg香豆素6(C-6)粉末溶解于2ml浓度为100mg/mlPS的二恶唑溶液中作为基底浇筑液，其他制备步骤与实施例6相同。
如图8中(A)所示R-B为针尖的荧光照片，图8中(B)所示C-6为基底的荧光照片，图8中(C)所示Merge为R-B针尖和C-6基底的合并结果，从这三张荧光照片结果可知该双层微针成功制备。
实施例8
针尖掺杂纯Cap分层微针的制备
(1)称取100mg Cap粉末溶解于2ml浓度为100mg/ml的PVP水溶液中，形成针尖浇筑液。
(2)用吸管吸取600μL制备好的针尖浇筑液涂在PDMS模具上，在2000rpm下离心20分钟，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液。
(3)制备浓度为100mg/ml的PS二恶唑溶液(二恶唑为溶解PS的溶剂)作为基底浇筑液，用吸管吸取1mL制备好的基底溶液涂在PDMS模具上填充模具，抽真空去气泡后将模具在室温下干燥过夜。
(4)干燥完成后，将针状阵列从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。
实施例9
针尖掺杂MMTN-Cap的分层微针制备
(1)称取100mg实施例1制备的MMTN-Cap粉末溶解于2ml浓度为100mg/ml的PVP水/乙醇(2:1v/v)溶液中，形成针尖浇筑液。由于MMTN-Cap微溶于水，溶于乙醇，为了使MMTN-Cap很好的溶于溶剂添加乙醇作为助溶剂。
(2)用吸管吸取600μL制备好的针尖浇筑液涂在PDMS模具上，在2000rpm下离心20分钟，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液。
(3)制备浓度为100mg/ml的PS二恶唑溶液(二恶唑为溶解PS的溶剂)作为基底浇筑液，用吸管吸取1mL制备好的基底溶液涂在PDMS模具上填充模具，抽真空去气泡后将模具在室温下干燥过夜。
(4)干燥完成后，将针状阵列从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。
实施例10
纯游离Cap PVP微针的制备
(1)称取100mg Cap粉末溶解于2ml浓度为100mg/ml的PVP水溶液中，形成针尖浇筑液。
(2)用吸管吸取600μL制备好的针尖浇筑液涂在PDMS模具上，在2000rpm下离心20分钟，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液。
(3)制备浓度为100mg/ml的PVP水溶液作为基底浇筑液，用吸管吸取1mL制备好的基底溶液涂在PDMS模具上填充模具，抽真空去气泡后将模具在室温下干燥过夜。
(4)干燥完成后，将针状阵列从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。
实施例11
混合微针的机械强度和皮肤刺入观察实验
(1)将实施例8制备的掺杂纯Cap分层微针，和实施例9制备的掺杂MMTN-Cap的分层微针两个微针贴片的针尖朝上放置在拉力试验机(TH-82033，苏州拓博)的刚性不锈钢中心上。测试探头的传感器探头以0.1毫米/秒的速度向微针针尖移动。力和位移的测量从传感器第一次接触到微针尖端时开始，一直持续到从微针尖端施加到传感器的力达到70N并停止，结果如图9所示。有研究证明(Design and evaluation of dissolving microneedlesfor enhanced dermal delivery of propranolol hydrochloride.Pharmaceutics.2021,13,579.)每个针尖能承受的压力大于0.2N就能成功刺入人体皮肤，而实施例8(图9，CapMN)和实施例9(图9，MMTN-Cap MN)两个微针贴片的针尖在受到0.7N的压力下也没有出现断裂点，证明所制备的所有微针都有良好的机械强度。
(2)为了验证本发明微针的真实皮肤插入能力，实验中使用了猪皮肤模拟人体皮肤，用手将待测的分层微针贴片压在猪皮肤上并保持2分钟。取出微针贴片，将模拟皮肤放在显微镜下观察针孔。如图10所示，皮肤上留有完整的微针针孔阵列，证明了所制的微针贴片具有良好的皮肤穿刺效果。同时，将取下的实例7制备的荧光分层微针贴片和实施例10制备的纯游离Cap PVP微针贴片基底放在显微镜下观察背衬层的溶解情况。如图11所示，以PVP为材料制备的可溶性贴片背衬层几乎随着针尖完全溶解(实施例10)，而以PS为材料所制备的不可溶性背衬层完全与针尖分离(实施例8)。背衬层和针尖一起溶解后背衬层会吸附一部分载药针尖，将背衬层与皮肤分离时吸附的载药针尖也会跟随一起与皮肤分离，造成药物利用率的降低。而此发明所制备的分层微针因为PS的疏水性，待可溶解针尖进入皮肤溶解后会自动与背衬层分离，阻止药物的浪费。
实施例12
两组载药分层微针的体外透皮扩散实验
采用Franz扩散池(TK-24，上海楷凯)进行三两组载药分层微针(实施例8掺杂纯Cap微针组、实施例9掺杂MMTN-Cap微针组的体外透皮渗透试验。将整片微针的针尖对着家兔的皮肤角质层，用手指按压2分钟。将贴好的兔皮转移到带有搅拌器的接收池中，角质层面向供应池并固定。其中，接收池含有3毫升含25％乙醇的PBS(pH＝7.4)溶液。随后，将接收池放在透皮扩散器上，温度设定为37.0℃，速度设定为200r/min，在预定的时间间隔(2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h)取出1mL接收液作为待测样品液，并立即补充1mL的含25％乙醇的PBS(pH＝7.4)溶液。每组三个平行。用HPLC-UV检测Cap含量。HPLC-UV实验条件：反相C18柱，流动相为：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液—水—甲醇(70：25：5，v/v)，注射量为20μL，流动温度为40℃，流速为1mL/min。用HPLC-UV检测寡肽含量。HPLC-UV实验条件：反相C18柱，流动相为：0.1％TFA/水：0.1％TFA/ACN＝5:5，注射量为20μL，流动温度为30℃，流速为1mL/min。
实施例8和实施例9制备的两组微针的体外透皮扩散结果如图12所示，两组微针显示出相同的药物透皮扩散效果。在48h内的扩散率均高达85％且平行三组均无显著性差异，表明这两组微针贴片都能够在48h内将装载的药物通过皮肤递送进人体内发挥药效。进一步证明了分层微针能够刺破皮肤进入血液循环且证实了微针的缓释效果。

Claims (4)

1.一种可载药寡肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）连接保护氨基酸：在树脂上通过缩合反应连接第一个保护氨基酸Fmoc-Met-OH，对第一个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入第二个保护氨基酸Fmoc-Met-OH进行缩合反应连接，对第二个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入第三个保护氨基酸Fomc-Tyr(tBu)-OH进行缩合反应连接；
（2）连接小分子：对第三个氨基酸末端进行脱保护基反应，加入有机分子进行缩合反应；
（3）携载药物：对寡肽侧链进行脱保护基反应，加入卡托普利和缩合剂，启动保护卡托普利和树脂进行的缩合反应，得到含有保护基团的携载卡托普利的寡肽树脂；
（4）切肽反应和纯化：步骤（3）的产物中加入切肽试剂进行切肽反应，震荡抽滤后，旋蒸浓缩切肽液，沉析后收集固体，洗涤，真空干燥过夜获得携载卡托普利的寡肽粗品；将粗品洗脱，收集，经减压旋蒸，最后经冷冻干燥得纯的携载卡托普利的寡肽；
所述步骤（1）树脂为经二氯甲烷溶胀处理的Wang树脂；
所述步骤（2）有机分子为萘乙酸；
所述步骤（1）-（3）中缩合反应的缩合剂为HOBt和DIC，有机溶剂为DMF，助缩合剂是DMAP，缩合反应的温度为室温，时间为4-6h；
步骤（4）中切肽试剂为三氟乙酸、茴香硫醚、β-巯基乙醇、苯酚和水，其体积比为80~90：1~6：1~3：1~3：1~3。
2.一种基于可载药寡肽的可溶性分层微针的制备方法，其特征在于，将权利要求1制备的可载药寡肽溶解于PVP溶液中形成针尖浇筑液涂在PDMS模具上，再涂抹基底溶液填充模具，抽真空后室温下干燥过夜。
3.一种权利要求1所述的可载药寡肽的制备方法制备的可载药寡肽在制备降压药物中的应用。
4.一种权利要求2所述的可载药寡肽的可溶性分层微针的制备方法制备的可载药寡肽的可溶性分层微针在制备降压药物中的应用。
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