CN114940979B

CN114940979B - 一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法及应用

Info

Publication number: CN114940979B
Application number: CN202210140263.7A
Authority: CN
Inventors: 林世贤; 赵红霞; 刘超; 方誉
Original assignee: Hangzhou Chihua Hesheng Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Chihua Hesheng Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114940979A

Abstract

阳离子‑π相互作用是一种分子间重要的非共价相互作用，在生物领域和化学领域扮演着重要角色，尽管在理解阳离子‑π的起源和生物功能方面取得巨大成功，但设计和合成更强的阳离子‑π相互作用的研究稀缺。本发明提供一种利用遗传密码扩展提高阳离子‑π相互作用的方法及应用，以组蛋白甲基化修饰的解码蛋白为例，利用遗传密码扩展技术在解码蛋白的芳香笼的色氨酸位点引入强给电子侧链基团取代的色氨酸类似物，提高解码蛋白与组蛋白甲基化修饰的亲和力，建立识别组蛋白甲基化修饰的超亲体分子识别系统。

Description

一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种提高阳离子-π相互作用的方法，特别涉及一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

非共价相互作用调节生物分子的结构和功能，在分子折叠和分子识别过程中扮演着关键作用。非共价相互作用包括阳离子-π相互作用、氢键相互作用、离子相互作用和疏水相互作用，其中阳离子-π是发生在阳离子与π电子云之间的一种强非共价相互作用，在生物分子自组装、分子识别、分子黏连和分子折叠中扮演重要作用，近些年关于阳离子-π相互作用的起源和基本原理的一系列工作表明，底物-受体的结合和组蛋白翻译后修饰的识别过程中阳离子-π相互作用起到关键性作用。有报道表明，当氟取代的色氨酸类似物取代芳香笼中的芳香族氨基酸会削弱阳离子-π相互作用，这是由于氟具有吸电子能力。另外突变解码蛋白的芳香笼中芳香族氨基酸会显著降低或破坏相互作用。尽管在理解阳离子-π相互作用的起源和生物功能方面取得了巨大的成功，但是设计和合成更强的阳离子-π相互作用作用的研究基本空白。

以组蛋白甲基化解码蛋白为例，组蛋白甲基化是指在甲基转移酶介导的发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化修饰，组蛋白甲基化修饰通过被“解码蛋白”识别参与调控基因表达、DNA复制、DNA损伤修复和调控细胞周期等重要生命过程，研究组蛋白甲基化的分布及丰度是理解“组蛋白密码”和染色质调控分子机制的基础，目前基于组蛋白甲基化的抗体是主要检测组蛋白甲基化基因组分布和位点特异性的技术方法。遗憾的是，抗体具有序列依赖型亲和力、底物分辨率低、非特异性识别和仅适用于体外实验等缺点，限制了其应用和组蛋白甲基化功能的精准解析。因此亟待发展高亲和力检测组蛋白甲基化修饰的新方法。

研究表明，组蛋白甲基化修饰的解码蛋白由2-4个芳香族氨基酸形成疏水口袋通过阳离子-π相互作用特异性识别组蛋白甲基化修饰，鉴于解码蛋白能够特异性识别组蛋白甲基化修饰的特性，基于解码蛋白结构域的检测组蛋白甲基化修饰的方法成为特异性抗体的替代物被广泛关注，ATRX蛋白的ADD结构域和DNMT3A蛋白的PWWP结构域分别用于捕获H3K9me3和H3K36me3；L3MBTL1的MBT2结构域广谱识别甲基化赖氨酸或双甲基化赖氨酸修饰，因此发展成为捕获甲基化赖氨酸蛋白质组的方法。基于解码蛋白结构域的检测方法具有易改造、经济和捕获多种PTMs的优势，但解码蛋白结构域与组蛋白甲基化修饰的亲和力在微摩尔级别，限制该技术的广泛应用。因此，亟待设计高亲和力的组蛋白甲基化解码蛋白促进解码蛋白结构域应用于组蛋白甲基化修饰的富集、成像和测序等方面。

遗传密码扩展技术(genetic code expansion，简称GCE)在蛋白质上特异性引入具备新颖结构和独特性质的非天然氨基酸，拓展了合成蛋白质的砖瓦，从而为精准的蛋白质操控、蛋白质功能的鉴定和优化提供了强有力的工具。发明名称为“一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系”的第ZL 2019 1 0440254.8号发明专利阐明利用蛋白质嵌合设计将吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶 (PylRS)/tRNACUA正交对普适正交的特性移植到了人源线粒体苯丙氨酰tRNA合成酶(PheRS)/tRNA对上构建具有普适正交性的嵌合苯丙氨酰tRNA合成酶 (chPheRS)/tRNA系统，以此来拓宽识别非天然氨基酸的类型，为遗传密码扩展技术提供新的工具，该系统的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶能够特异性识别色氨酸类似物，比如：6-甲基-色氨酸、7-甲基-色氨酸、6-氯-色氨酸、7-氯-色氨酸、6-氰基 -色氨酸和7-氰基-色氨酸。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法，该方法利用遗传密码扩展技术将生物分子中形成阳离子-π相互作用的色氨酸替换成色氨酸类似物，从而提高阳离子-π相互作用的结合能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法，该方法利用遗传密码扩展技术将生物分子中形成阳离子-π相互作用的芳香族笼的色氨酸替换成色氨酸类似物，以提高阳离子-π相互作用的结合能。

非共价相互作用调节生物分子的结构和功能，在分子折叠和分子识别过程中扮演着关键作用，其中阳离子-π是发生在阳离子与π电子云之间的一种强非共价相互作用，在生物分子自组装、分子识别、分子黏连和分子折叠中扮演重要作用，但对于如何提高阳离子-π相互作用的发明处于空白状态。本发明提供一种带有给电子基团色氨酸类化合物的合成方法，并发展一种利用遗传密码扩展技术替换芳香族笼的色氨酸，经验证合成的化合物A1-A6显著提高阳离子-π相互作用结合能的方法。组蛋白甲基化修饰在调控基因表达、DNA复制、DNA损伤修复和调控细胞周期等重要生命过程发挥重要作用，目前检测组蛋白甲基化修饰的方法主要依赖于特异性抗体，但抗体存在序列依赖型亲和力、底物分辨率低、非特异性识别和仅适用于体外实验等缺点，本发明以组蛋白甲基化修饰的解码蛋白为例，利用遗传密码扩展技术在解码蛋白的芳香笼的色氨酸位点引入强给电子侧链基团取代的色氨酸类似物，提高解码蛋白与组蛋白甲基化修饰的亲和力达到4-8倍，且没有影响蛋白本身的功能，显示了其潜在价值。利用该方法建立识别组蛋白甲基化修饰的超亲体分子识别系统，并将该系统应用于组蛋白甲基化修饰的检测、成像及测序等方面。

在本发明中，一系列的色氨酸类似物位点特异性地引入到解码蛋白的芳香笼调控解码蛋白与组蛋白甲基化修饰的结合亲和力，利用这样的策略，提高组蛋白甲基化和其解码蛋白的亲和力达到4-8倍，通过串联重复设计使得H3K4me3与PHD解码蛋白结构域的亲和力达到纳摩尔级别，并利用该策略发展检测组蛋白甲基化修饰的超亲分子识别系统。

本发明所述方法可应用于研究任何形成阳离子-π相互作用的生物大分子。

作为优选，该方法包括如下步骤：

S1、设计合成强供电子侧链取代的色氨酸类似物，所述的色氨酸类似物为非天然氨基酸，选自6-甲基-色氨酸(A1)、6-甲氧基-色氨酸(A2)、7-甲基-色氨酸(A3)、 7-甲氧基-色氨酸(A4)、6,7-甲氧基-色氨酸(A5)、6,7-甲基-色氨酸(A6)、7,8-二氢呋喃-色氨酸(A7)、6,7-二氢呋喃-色氨酸(A8)、7,8-呋喃-色氨酸(A9)、6,7-呋喃-色氨酸(A10)、6,7-间二氧杂环戊烯-色氨酸(A11)或6,7-环戊烷-色氨酸(A12) 中的一种，以上色氨酸类似物A1至A12的结构式为：

S2、筛选特异性识别色氨酸类似物A1至A12的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体；

S3、以形成阳离子-π相互作用的生物分子为研究对象，利用遗传密码扩展技术通过所述的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体在生物分子中特异性地引入色氨酸类似物，获得带有色氨酸类似物的蛋白。

作为优选，以不同位置取代的吲哚B为反应物，反应得到目标产物，所述不同位置取代的吲哚化学结构式为：所述的目标产物结构通式为：其中X选自：氧原子或碳原子中的一种。

作为优选，所述色氨酸类似物A1至A12的合成方法，包括如下步骤：

步骤一：起始原料化合物B的合成：

起始原料B选自6-甲基-吲哚(B1)、6-甲氧基-吲哚(B2)、7-甲基-吲哚(B3)、 7-甲氧基-吲哚(B4)、6,7-甲氧基-吲哚(B5)、6,7-甲基-吲哚(B6)、7,8-二氢呋喃- 吲哚(B7)、6,7-二氢呋喃-吲哚(B8)、7,8-呋喃-吲哚(B9)、6,7-呋喃-吲哚(B10)、 6,7-间二氧杂环戊烯-吲哚(B11)或6,7-环戊烷-吲哚(B12)中的一种，以上吲哚类似物B1至B12的结构式为：

(1)化合物B6，B7，B8，B9，B10的合成：以苯胺(G6，G7，G8，G9或 G10)和三乙醇胺作为反应物，以RuCl₃·nH₂O，SnCl₂·2H₂O和PPh₃为催化剂，在无水二氧六环中反应得到起始原料化合物B；(2)化合物B11，B12的合成：以苯胺(G11或G12)与水合氯醛、盐酸羟胺为反应物，硫酸作为催化剂，水作溶剂得到粗产物后，再和甲磺酸反应得到靛红产物，最后经过氢化铝锂还原得到起始原料化合物B；

步骤二：化合物C的合成：起始原料化合物B与碘为反应物，氢氧化钾作碱，无水N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，反应得到中间体化合物C；

步骤三：化合物D的合成：化合物C与二碳酸二叔丁酯为反应物，以三乙胺为碱，DMAP为催化剂，在无水二氯甲烷中，反应得到中间体化合物D；

步骤四：化合物E的合成：化合物D与Boc-3-碘-L-丙氨酸甲酯为反应物，以醋酸钯为催化剂，S-Phos为配体，在无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，在氮气保护下反应得到中间体化合物E；

步骤五：化合物F的合成：化合物E在甲醇和水为溶剂的条件下，以氢氧化钾为碱，反应得到中间体化合物F；

步骤六：化合物A的合成：化合物F在无水二氯甲烷为溶剂的条件下，以三氟乙酸为催化剂，反应得到目标产物(色氨酸类似物A1至A12)。

作为优选，步骤四中，所述催化剂醋酸钯的用量以摩尔量计为底物(化合物D) 的2％；

步骤一所述反应时间为1-2h，步骤二反应时间为2h，步骤三所述反应时间为 8h，步骤四所述反应时间为5h，步骤五所述反应时间为2-3h，步骤六所述反应时间为2h；

步骤一所述反应温度为90℃，步骤二反应温度为0℃，步骤三所述反应温度为 0℃，步骤四所述反应温度为40℃，步骤五所述反应温度为25℃，步骤六所述反应温度为0℃。

作为优选，S2中，(1)通过对嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶氨基酸结合口袋的氨基酸构建饱和诱变基因文库，筛选特异性识别色氨酸类似物的嵌合体苯丙氨酰 -tRNA合成酶突变体；(2)GFP荧光和LC-MS质谱鉴定苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体识别的效率及特异性；(3)筛选所得的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA突变体，应用于细菌、细胞或病毒等宿主进行表达应用。

在筛选特异性识别6-甲氧基-色氨酸(A2)、7-甲氧基-色氨酸(A4)、6,7-甲氧基-色氨酸(A5)、6,7-甲基-色氨酸(A6)、7,8-二氢呋喃-色氨酸(A7)、6,7-二氢呋喃-色氨酸(A8)、7,8-呋喃-色氨酸(A9)、6,7-呋喃-色氨酸(A10)、6,7-间二氧杂环戊烯-色氨酸(A11)、6,7-环戊烷-色氨酸(A12)的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体中，通过对嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶氨基酸结合口袋的氨基酸(E391, V393,F464，M490,T467和A507)构建饱和诱变基因文库(E391NNK、V393NNK、F464NNK、M490NNK、T467G和A507G)，通过正负筛选策略筛选特异性识别6- 甲氧基-色氨酸(A2)、7-甲氧基-色氨酸(A4)、6,7-甲氧基-色氨酸(A5)、6,7-甲基 -色氨酸(A6)、7,8-二氢呋喃-色氨酸(A7)、6,7-二氢呋喃-色氨酸(A8)、7,8-呋喃- 色氨酸(A9)、6,7-呋喃-色氨酸(A10)、6,7-间二氧杂环戊烯-色氨酸(A11)、6,7- 环戊烷-色氨酸(A12)的嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体，最终获得包含E391D, V393G,M490V,F464V,T467G和A507G六个突变的苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体，其中该苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ： ID 1～2所示。

作为优选，S3中，(1)解码蛋白形成芳香笼的色氨酸对应位点突变成终止密码子(TAG)，(2)将解码蛋白突变体与嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体共转表达，在表达过程中添加相应的色氨酸类似物(一般为1mM)，(3)按照GST-tag蛋白纯化方法纯化解码蛋白变体，并通过LC-MS鉴定解码蛋白变体的保真度。

作为优选，识别色氨酸类似物A1-A6的嵌合体苯丙氨酸-tRNA合成酶突变体的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示。

作为优选，所述方法以组蛋白甲基化解码蛋白结构域为研究对象，所述的解码蛋白结构域为Chromo、PHD、PWWP、Tudor、MBT、CW、SPIN和BAH结构域中的任意一个。

一种所述的方法得到的带有色氨酸类似物的蛋白在建立特异性识别组蛋白甲基化修饰的解码蛋白超亲体识别系统方面的应用。以H3K4me3为例，建立识别H3K4me3的解码蛋白KDM5A-PHD3超亲体，命名为PHD超亲体；以H3K9me3 为例，建立识别H3K9me3的解码蛋白CDY1-Chromo超亲体，命名为Chromo超亲体；以H3K27me3为例，建立识别H3K27me3的解码蛋白BAHD1-BAH超亲体，命名为BAH超亲体；以H3K36me3为例，建立识别H3K36me3的解码蛋白DNMT3B-PWWP超亲体，命名为PWWP超亲体。

建立特异性识别组蛋白甲基化修饰的解码蛋白超亲体，其亲和力达到纳摩尔级别，效价优于组蛋白甲基化修饰特异性抗体，用于检测生物样品中的组蛋白甲基化修饰。所述的特异性识别组蛋白甲基化修饰的解码蛋白超亲体被荧光基团标记，可应用于成像技术检测生物样品中组蛋白甲基化修饰。所述的特异性识别组蛋白甲基化修饰的解码蛋白超亲体识别系统可应用于活体成像，动态检测组蛋白甲基化修饰的变化。所述的组蛋白甲基化修饰的解码蛋白超亲体识别系统，可用于富集样品的组蛋白甲基化修饰，应用于单细胞测序技术。强供电子侧链取代的色氨酸类似物能够提高解码蛋白与组蛋白甲基化修饰的亲和力达到4-8倍，串联重复的解码蛋白提高解码蛋白与组蛋白甲基化修饰的亲和力。

以KDM5A PHD3为例，

(1)通过晶体结构(PDB：2KGI)判断W18和W28构成芳香笼特异性识别H3K4me3，故将KDM5A PHD3的W18位点和W28位点突变为终止密码子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3～4所示。

(2)利用嵌合体苯丙氨酸翻译系统分别在PHD3解码蛋白结构域的W18和W28 位点特异性地引入色氨酸类似物，色氨酸类似物为6-氰基-色氨酸、7-氰基-色氨酸、 6-氯-色氨酸、7-氯-色氨酸、6-甲基-色氨酸(A1)、6-甲氧基-色氨酸(A2)、7-甲基- 色氨酸(A3)、7-甲氧基-色氨酸(A4)、6,7-甲氧基-色氨酸(A5)、6,7-甲基-色氨酸 (A6)、7,8-二氢呋喃-色氨酸(A7)、6,7-二氢呋喃-色氨酸(A8)、7,8-呋喃-色氨酸 (A9)、6,7-呋喃-色氨酸(A10)、6,7-间二氧杂环戊烯-色氨酸(A11)、6,7-环戊烷- 色氨酸(A12)中的任意一个，获得PHD3解码蛋白结构域变体蛋白。

(3)微量热泳动仪测定PHD3解码蛋白结构域变体与H3K4me3的亲和力，当非天然氨基酸A2插入到PHD3解码蛋白结构域的W28位点能够提高PHD3与H3K4me3 的亲和力达到8倍，该解码蛋白变体为PHD3-W28-A2，命名为PHD。具体的 H3K4me3多肽氨基酸序列详见表2。

(4)在一些具体的实施方案中，6-甲氧基-色氨酸(A2)位点特异性引入到不同的组蛋白甲基化修饰的解码蛋白结构域均能提高该解码蛋白结构域与组蛋白甲基化修饰的亲和力。

以H3K9me3为例，选择CDY1的Chromo结构域为研究对象，当6-甲氧基- 色氨酸插入到CDY1的Chromo结构域的W28位点后，H3K9me3和CDY1 Chromo 结构域的亲和力被提高2倍；以H3K27me3为例，选择BAHD1的BAH结构域为研究对象，当6-甲氧基-色氨酸插入到BAHD1的BAH结构域的W667位点后， H3K27me3与BAH结构域的亲和力被提高5倍；以H3K36me3为例，选择DNMT3B的PWWP结构域为研究对象，当6-甲氧基-色氨酸插入到DNMT3B的PWWP结构域的W263位点，H3K36me3和DNMT3B的PWWP结构域的亲和力被提高了7倍。其中CDY1的Chromo结构域的核苷酸序列和蛋白质序列如SEQ ID NO：5-6；其中 BAHD1的BAH结构域的核苷酸序列和蛋白质序列如SEQ ID NO：7-8；其中 DNMT3B的PWWP结构域的核苷酸序列和蛋白质序列如SEQ ID NO：9-10。

以下阐述本发明几个方面的应用。

一、本发明提供了一种建立串联重复的组蛋白甲基化解码蛋白以提高组蛋白甲基化修饰与解码蛋白亲和力的方法。

以PHD3为例，

(1)构建多联重复的解码蛋白变体，将SEQ ID NO：4为模板，构建双联和三联的解码蛋白突变体，双联和三联的解码蛋白分别携带2个和3个琥珀终止子(TAG), 具体的双联和三联突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：11～12所示。

(2)通过遗传密码扩展技术位点特异性地在双联或三联PHD蛋白的琥珀终止子位点引入2个或3个6-甲氧基-色氨酸(A2)，获得双联和三联PHD蛋白变体，分别命名为2x PHD和3x PHD。

采用微量热泳动仪测定双联或三联PHD蛋白变体与H3K4me3的亲和力。获得双联和三联PHD变体与H3K4me3亲和力提高达到14.7倍和62.9倍。

在一些具体的实施方案中，以上策略同样适用与其他组蛋白甲基化修饰的解码蛋白结构域。

二、本发明提供了一种组蛋白甲基化修饰超亲分子识别系统检测组蛋白甲基化修饰的方法。

(1)表达纯化6-甲氧基-色氨酸(A2)取代的PHD蛋白变体，获得PHD蛋白、2xPHD 蛋白和3xPHD蛋白。

(2)以HeLa细胞裂解液为例，将Hela细胞裂解后，梯度稀释到不同浓度，将该蛋白样品通过SDS-PAGE跑胶分离并转移到PVDF膜。

(3)PVDF膜牛奶封闭后，分别过夜孵育H3K4me3特异性抗体、PHD蛋白、2x PHD 蛋白和3x PHD蛋白。

(4)孵育H3K4me3特异性抗体的PVDF膜孵育相应的二抗。孵育PHD蛋白的PVDF 膜进一步孵育GST特异性抗体，最后孵育相应的二抗。

(5)化学发光成像。相较于H3K4me3特异性抗体，2x PHD蛋白和3x PHD蛋白表现出更高的检测能力。

三、本发明提供了一种组蛋白甲基化修饰超亲分子识别系统通过成像技术检测组蛋白甲基化修饰的方法。该方法可应用于活细胞成像，也可应用于体外的免疫荧光成像技术。该方法可应用于不同细胞，比如：HEK 293T细胞系、HeLa细胞系、NCI-60 细胞系、CHOs细胞系等。

应用于活细胞成像包括以下几个步骤：

(1)构建细胞表达的质粒，以SEQ ID NO：4为模板克隆PHD-W28TAG片段，以 pEGFP-EGFP为模板克隆载体片段，通过Gibson组装构建 pEGFP-PHD-W28TAG-EGFP的质粒；以SEQID NO：1为模板克隆苯丙氨酸氨酰 -tRNA合成酶(chPheRS)片段，以pCDNA3.1为模板克隆载片段，以Gibson组装构建pCDNA3.1-chPheR9质粒质粒。质粒图谱如图1所示。

(2)将以上两个质粒按照1：1的摩尔比转染HEK 293T细胞。6-8小时后换液，添加2mM 6-甲氧基-色氨酸(A2)。

(3)活细胞成像显微镜检测EGFP荧光信号变化。

应用于体外的免疫荧光成像技术包括以下几个步骤：

(1)表达纯化6-甲氧基-色氨酸取代的PHD蛋白变体，获得PHD蛋白、2xPHD蛋白和3xPHD蛋白。

(2)标记蛋白，PHD蛋白、2x PHD蛋白和3xPHD蛋白分别被NHS-Cy5活化脂标记。

(3)以HeLa细胞系为例，甲醛固定的细胞分别用Cy5标记的PHD蛋白或组蛋白甲基化修饰的特异性抗体分别孵育，孵育后通过共聚焦显微镜成像，检测相应组蛋白甲基化修饰的定位。相较于H3K4me3特异性抗体，2xPHD蛋白变体和3xPHD蛋白变体具有更高的信噪比。

四、本发明提供了一套组蛋白甲基化修饰超亲分子识别系统通过邻近标记技术检测组蛋白甲基化修饰相互作用关系组的方法。

临近标记技术的发展为传统的在活细胞中研究分子间相互作用的方法提供了补充，该技术一般利用CRISPR基因编辑技术或基于质粒的表达将临近生物素化酶与诱饵蛋白在细胞内融合表达。在添加外源生物素后，诱饵蛋白临近的蛋白质会被生物素化，这些生物素化的蛋白质可以被链霉亲和素偶联的磁珠富集，之后可以通过质谱进行分析鉴定。本发明提供的H3K4me3超亲分子识别系统对H3K4me3的亲和力达到7nM，可将PHD-W28TAG与坏血酸过氧化物酶APEX/APEX2融合表达，当PHD变体特异性结合H3K4me3时，APEX2可在双氧水刺激下将H3K4me3邻近的蛋白质组标记Biotin，后通过Streptavidin富集该蛋白质组，最后通过LC-MS分析该蛋白质组。该方法不限于基于APEX2的临近标记技术，也适用于基于其他临近生物素酶的技术。比如：辣根过氧化物酶HRP和生物素连接酶BioID、BASU、TurboID、miniTurbo等。

与现有技术相比，本发明的主要优点包括：

1、本发明提供了一种提高阳离子-π相互作用的方法，该方法可应用于任何发生阳离子-π相互作用的生物大分子。本发明提供了6-甲基-色氨酸(A1)、6-甲氧基 -色氨酸(A2)、7-甲基-色氨酸(A3)、7-甲氧基-色氨酸(A4)、6,7-甲氧基-色氨酸 (A5)、6,7-甲基-色氨酸(A6)、7,8-二氢呋喃-色氨酸(A7)、6,7-二氢呋喃-色氨酸 (A8)、7,8-呋喃-色氨酸(A9)、6,7-呋喃-色氨酸(A10)、6,7-间二氧杂环戊烯-色氨酸(A11)、6,7-环戊烷-色氨酸(A12)的合成路径，以上非天然氨基酸均可应用于遗产密码扩展技术，能够提高阳离子-π相互作用。

2、本发明具有广泛的应用，其中包括(但并不限于)：与活细胞成像技术结合应用于检测组蛋白甲基化修饰的动态变化；与免疫荧光技术结合检测生物样本中组蛋白甲基化修饰；与基因组测序技术等结合可分析组蛋白甲基化修饰相关基因组等；与临近标记技术等结合可鉴定组蛋白甲基化修饰相互作用蛋白质组。具体而言：(1) 利用遗传密码扩展技术在形成阳离子-π相互作用的色氨酸位点引入6-甲氧基-色氨酸(A2)能够提高生物分子之间的亲和力达到4-8倍。(2)H3K4me3的解码蛋白PHD位点特异性引入6-甲氧基-色氨酸(A2)提高H3K4me3与PHD的亲和力达到 8倍，三联设计后该PHD变体与H3K4me3的亲和力达到7nM。(3)本发明的组蛋白甲基化超亲分子识别系统识别组蛋白甲基化修饰有很高灵敏度，与组蛋白甲基化修饰特异性抗体相比，表现出更高的特异性和灵敏性。(4)本发明的组蛋白甲基化修饰超亲分子识别系统具有易改造、经济和捕获多种PTMs的优势，可发展多种针对特定甲基化修饰的超亲分子识别系统。

附图说明

图1是质粒图谱；

图2是化学合成路径，A为6-甲氧基-色氨酸(A2)和7-甲氧基-色氨酸(A4)合成路径，B为6,7-环戊烷-色氨酸A12的化学合成路径；

图3是应用遗传密码扩展技术调节组蛋白甲基化和其解码蛋白之间的阳离子-π相互作用的发明策略。(A)不同组蛋白甲基化修饰解码蛋白的芳香笼组分中色氨酸所占数量。(B)应用遗传密码扩展技术发展组蛋白甲基化超亲分子识别系统的流程示意图。以H3K4me3为例，利用遗传密码扩展技术用色氨酸类似物替换解码蛋白芳香笼中的色氨酸，从而调控芳香笼中阳离子-π相互作用，获得显著性提高解码蛋白与组蛋白甲基化亲和力的非天然氨基酸类似物。(C)本发明中使用的非天然氨基酸的结构式；

图4是鉴定嵌合体丙氨酸氨酰-tRNA合成酶A2和A4的效率和特异性，其中： GFP荧光报告实验鉴定嵌合体苯丙氨酸氨酰tRNA合成酶A2RS(A)和A4RS(B) 分别识别A2和A4的效率，质谱鉴定嵌合体苯丙氨酸氨酰tRNA合成酶A2RS(C) 和A4RS(D)分别识别A2和A4的保真度；

图5是设计提高与H3K4me3亲和力的PHD结构域变体蛋白。(A)KDM5A PHD3 蛋白与H3K4me3多肽的复合物结构(PDB：2KGI)其中PHD3和多肽以卡通模式展示，芳香族氨基酸和H3K4me3修饰以棍状结构展示。(B)考马斯亮蓝展示 PHD-W18-UAA和PHD-W28-UAA变体。(C)微量热泳动仪测定PHD-W18-UAA 变体与H3K4me3的亲和力，其中H3K4me3被FITC荧光基团标记。(D)微量热泳动仪测定PHD-W28-UAA变体与H3K4me3的亲和力，其中H3K4me3被FITC荧光基团标记；

图6是设计识别H3K4me3的多价串联重复PHD结构域。(A)多价串联重复 PHD结构域设计卡通图。(B)考马斯亮蓝染色鉴定多联PHD蛋白变体的纯度。(C) 微量热泳动仪测定多联PHD蛋白变体与H3K4me3的亲和力，其中H3K4me3被FITC 荧光基团标记；

图7是应用组蛋白甲基化超亲分子识别系统检测和成像H3K4me3。(A)组蛋白甲基化超亲分子识别系统应用于检测和成像的策略示意图。(B)应用组蛋白甲基化超亲分子检测HeLa细胞的H3K4me3水平。H3特异性抗体和H3K4me3特异性抗体为对照组，PHD-WT、2xPHD和3xPHD分别用于检测H3K4me3。(C)组蛋白甲基化超亲体分子识别系统应用于荧光成像检测细胞H3K4me3定位，其中PHD蛋白被Cy5标记；

图8是该系统应用于哺乳动物细胞流式细胞术检测筛选所得的嵌合体苯丙氨酰 -tRNA合成酶在哺乳动物细胞识别6-甲氧基-色氨酸、6,7-甲氧基-色氨酸和6，7-甲基-色氨酸的效率；

图9是利用遗传密码扩展技术建立的组蛋白甲基化超亲分子识别系统应用于临近标记检测蛋白质互作组，(A)实验流程图，(B)GO分析数据。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明在具体实施例中构建载体过程中使用的引物序列如表1所示：

表1：构建载体的引物序列

本发明应用遗传密码扩展技术调节组蛋白甲基化和其解码蛋白之间的阳离子-π相互作用的发明策略如图3所示，以下举例进行具体方法的阐述。

实施例1：化合物A2和A4的化学合成

向50mL无水N,N-二甲基甲酰胺的B(2.0g,13.6mmol)溶液中加入氢氧化钾(1.68g,29.9mmol)，在室温下搅拌20min。向反应瓶中滴加30mL无水N,N-二甲基甲酰胺的碘溶液(4.14g,16.3mmol)，在室温下继续搅拌2h。将反应混合物倒入含 0.1％硫代硫酸钠的冰水溶液。将混合物放入冰箱，确保完全沉淀。沉淀物经过过滤，用冷水洗涤，然后在真空中干燥。3-碘-1H-吲哚B(B2收率为90％，B4收率为93％) 以淡黄色固体形式得到，无需进一步纯化即可用于下一步。

将第一步得到的固体B(2.73g,10.0mmol)溶于30mL无水N,N-二甲基甲酰胺中。将60％NaH(391.2mg,16.3mmol)用己烷洗涤后，在氮气保护下悬浮于10mL 无水N,N-二甲基甲酰胺中。在冰浴条件下，将原料B缓慢加入到该悬浮液中，搅拌 10min后，加入对甲苯磺酰氯(2.1g,11.0mmol)，在25℃下搅拌5h。将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次后，再用饱和盐水洗涤乙酸乙酯有机层，无水硫酸钠干燥。然后在减压下将有机相浓缩。用石油醚和乙酸乙酯进行柱层析，得到白色固体化合物C(C2收率为85％,C4收率为81％)。

在氮气保护下，将干燥脱气的N,N-二甲基甲酰胺加入到装有锌粉(3.9g,50.0mmol)的容器中。加入TMSCl(108.6mg,1.0mmol)，室温下剧烈搅拌30min，停止搅拌后使锌沉淀。上清液在氮气的流动下用注射器抽出，然后将新的N,N-二甲基甲酰胺加入到锌中。继续搅拌2min后停止搅拌使锌粉沉淀，并像之前一样除去上清液，此步骤重复两次以上。然后向容器内加入1,2-二溴乙烷(751.4mg,4.0mmol)，在80℃下搅拌30min。待混合物冷却至25℃后，加入TMSCl(325.8mg,3.0mmol)，并将得到的混合物再搅拌30min。将Boc-3-碘-L-丙氨酸甲酯(3.95g,12mmol)溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺后再加入到活性锌粉中，并大力搅拌混合物。放热消退后(用冰浴控制)，再继续搅拌30min，此时停止搅拌，让锌沉淀下来。用注射器轻轻地抽取上清液，在氮气的流动下倒入干净的反应烧瓶中。将上清液通过注射器转移到化合物D(2.13g,5.0mmol)、Pd(OAc)₂(112.2mg,0.5mmol)和S-Phos(410.5mg, 1.0mmol)中。在氮气保护下，反应4h。反应完全后将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，上层的有机层用盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩完成后经石油醚和乙酸乙酯柱层析纯化得到化合物E(E2收率为57％,E4收率为45％)，淡黄色油状物。

对产物E进行分析，结果如下：E2)¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.70(d,J＝8.5 Hz,2H),7.48(d,J＝2.3Hz,1H),7.30(d,J＝8.7Hz,1H),7.22(d,J＝8.1Hz,3H),6.84 (dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),5.05(d,J＝8.0Hz,1H),4.60(d,J＝7.1Hz,1H),3.86(s,3H), 3.62(s,3H),3.14(qd,J＝14.7,5.6Hz,2H),2.34(s,3H),1.49–1.26(m,9H).¹³C NMR (125MHz,CDCl₃)δ172.15,158.25,155.13,145.01,136.29,135.28,129.98,126.82, 123.22,120.13,117.44,112.55,98.09,80.26,55.91,53.69,52.47,28.46,21.70.HRMS(ESI)m/zcalcd.For C₂₀H₂₃N₂O₅S⁺(M-Boc)⁺403.1322,found 403.1331.E4)¹H NMR (500MHz,CDCl₃)δ7.69(d,J＝8.1Hz,2H),7.62(s,1H),7.24(d,J＝8.1Hz,2H),7.16 –7.06(m,2H),6.67(dd,J＝7.3,1.5Hz,1H),5.15(d,J＝8.0Hz,1H),4.65(dt,J＝8.0,5.5Hz,1H),3.71(s,3H),3.67(s,3H),3.32–3.11(m,2H),2.37(s,3H),1.44(s,9H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ172.28,155.16,147.49,144.21,137.36,133.77,129.43, 127.30,126.91,124.79,124.04,114.95,112.05,107.16,80.12,55.54,53.85,52.49,28.41,28.01,26.99,21.67.HRMS(ESI)m/z calcd.For C₂₀H₂₃N₂O₅S⁺(M-Boc)⁺403.1322, found 403.1334.

将化合物E(973.2mg,2.0mmol)溶于50mL甲醇中，加入NaOH(1.2g,30.0 mmol)溶解于20mL H₂O中。混合物在回流下加热8h，然后在减压下蒸发掉甲醇，使体积为反应体积的一半左右。用冰冷的2M稀盐酸酸化，调PH至3。用冷乙酸乙酯萃取水溶液，上层的有机层用饱和盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，然后在真空中蒸发，得到无色的油，无需进一步纯化即可得到氨基甲酸酯F。然后将F溶解在二氯甲烷中加入三氟乙酸(112.2mg,0.5mmol)去保护，得到目标化合物A(A2收率为74％,A4收率为68％),淡黄色固体，完整的合成路径如图2所示。

对产物A进行分析，结果如下：A2)¹H NMR(500MHz,D₂O)δ7.49(d,J＝8.7Hz, 1H),7.01(s,1H),6.95(d,J＝2.4Hz,1H),6.72(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),3.75(s,3H), 3.45(dd,J＝7.3,5.2Hz,1H),3.03(dd,J＝14.4,5.2Hz,1H),2.86(dd,J＝14.4,7.3Hz, 1H).¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ182.83,155.19,136.74,123.18,122.03,119.51, 110.63,108.80,95.26,56.42,55.78,30.43.HRMS(ESI)m/z calcd.For C₁₂H₁₅N₂O₃S⁺(M+H)⁺235.1077,found235.1081.A4)¹H NMR(500MHz,D₂O)δ7.27–7.22(m,2H), 7.08(td,J＝7.9,0.9Hz,1H),6.78(d,J＝7.7Hz,1H),4.31(ddd,J＝6.3,5.4,0.9Hz, 1H),3.94(s,3H),3.44(ddt,J＝15.4,5.3,0.9Hz,1H),3.36(dd,J＝15.4,7.3Hz,1H)).¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ171.83,146.06,128.04,126.58,124.97,120.10,117.44, 115.12,106.92,55.63,53.27,25.83.HRMS(ESI)m/z calcd.For C₁₂H₁₃N₂O₃S^-(M-H)^-233.0932,found 233.0939.

实施例2：嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的文库构建与正负筛选

本实施例中嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶chPheRS的基因序列如SEQ ID NO： 1所示。

(1)以人源线粒体苯丙氨酰-tRNA合成酶的结构为参考，选中嵌合体苯丙氨酰 -tRNA合成酶的氨基酸结合位点：F464、T467和A507，以及结合口袋周围的氨基酸：E391、V393、M490。

(2)以嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶(T467G和A507G)为模板，以引物 chPheRS-E391NNK-V393NNK-R/F，chPheRS-M490NNK-R/F和 chPheRS-F464NNK-R/F扩增基因片段，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19-24 所示，通过Gibson组装将突变文库克隆到pBK载体，生成chPheRS突变基因文库 (E391NNK、V393NNK、M490NNK、F464NNK、T467G和A507G)。

(3)将pNEG-chPheT-Barnase-2*TAG转化到大肠杆菌DH10B，制备负筛选感受态细胞，其质粒图谱如图1所示；将pNEG-3C11-CAT-112TAG-GFP190TAG转化到大肠杆菌DH10B，制备正筛选感受态细胞，其质粒图谱如图1所示。

(4)将(2)中的筛选文库转化到负筛选感受态细胞中，将菌液涂布在LB平板(卡那霉素，50μg/mL；氨苄青霉素，100μg/mL；0.2％L-阿拉伯糖)上，放置在37℃ 培养。

(5)将(4)中的克隆收集抽提质粒，并将质粒转化到正筛选感受态细胞，将全部菌液涂布在添加非天然氨基酸的LB琼脂平板(卡那霉素，50μg/mL；氨苄青霉素， 100μg/mL；氯霉素，10μg/mL；0.2％L-阿拉伯糖；2mM非天然氨基酸)上，37℃ 培养12h，再于30℃培养48h。

实施例3：通过GFP荧光报告实验筛选特异性识别非天然氨基酸的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体

(1)经过两轮正向筛选后，挑取实施例2中具有荧光信号的单克隆过夜培养。

(2)按照1：100的比例接种(1)中的菌液，37℃培养至OD600＝0.6-0.8时，添加0.2％的L-阿拉伯糖诱导表达，同时取1mL菌液添加1mM对应的非天然氨基酸，在30℃表达20h。

(3)取750μL(2)中的菌液离心后，加入150μL的1×Bugbuster(Millipore,Lot：3492682)放置在25℃裂菌30min，随后离心，取100μL上清至96孔板中，同时取100μL(2)中的菌液，通过酶标仪Bio Tek Synergy NEO2测量对应克隆的GFP荧光信号强度和OD₆₀₀，计算突变体识别非天然氨基酸的效率。

(4)对高效率识别相应非天然氨基酸的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体进行测序，获得具体突变体序列，对应克隆的质粒放置于-20℃备用。

(6)最终鉴定得到识别6-甲氧基-色氨酸、7-甲氧基-色氨酸、6,7-甲基-色氨酸、6,7- 甲氧基-色氨酸的嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体，包含E391D,V393G,M490V,F464V,T467G和A507G六个突变的苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体，命名为 chPheRS9，该苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的核苷酸序列和氨基酸序列详见 SEQ ID NO：1-2所示。

(7)利用GFP荧光报告实验测定上述嵌合体苯丙氨酸翻译系统在不同非天然氨基酸浓度条件下识别非天然氨基酸的效率。嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶识别6-甲氧基-色氨酸和7-甲氧基-色氨酸的效率和保真度如图4所示。

实施例4：KDM5A PHD3(PHD)结构域的系列质粒构建

除特殊说明外，所有的质粒均由Gibson组装系统构建的。以KDM5A PHD3(PHD) 结构域的一系列质粒构建为例。

1、PHD野生型质粒：以pGEX-6p载体为模板，使用引物pNEG-GST-F/R扩增 GST标签，核苷酸序列如SEQ ID NO：25-26所示；以cDNA为模板，使用引物 pNEG-PHD-F/R扩增PHD结构域(Uniport ID：P29375，核苷酸1598–1663，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：27-28所示；以pNEG-2*chPheT载体为模板，采用引物pNEG-PHD-V-F/R扩增载体，该引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：29-30所示，通过Gibson组装构建质粒pNEG-2*chPheT-PHD-GST。质粒图谱如如1所示。

2、PHD突变体质粒：以pNEG-2*chPheT-PHD-GST为模板，使用引物 pNEG-PHD-W28TAG-F/R在PHD结构域W28引入琥珀密码子的定点突变，通过 Gibson组装构建质粒pNEG-2*chPheT-PHD-W28TAG-GST；使用引物 pNEG-PHD-W18TAG-F/R在PHD结构域W18引入琥珀密码子的定点突变，通过 Gibson组装构建质粒pNEG-2*chPheT-PHD-W18TAG-GST，引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO：31-34所示。

3、多价串联重复PHD结构域质粒：以pNEG-2*chPheT-PHD-W28TAG-GST 为模板，采用引物pNEG-2*PHD-F/R扩增含有6x-Linker(GGSGGS)的 PHD-W28TAG片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：35-36所示；采用引物 pNEG-2*PHD-V-R，pNEG-PHD-V-F扩增载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：37和 SEQ ID NO：29所示，通过Gibson组装构建双联或三联PHD质粒： pNEG-2*chPheT-2xPHD-W28TAG-GST和pNEG-2*chPheT-3xPHD-W28TAG-GST。

4、多组分串联重复PHD-Chromo结构域质粒：以pNEG-2* chPheT-PHD-W28-GST为模板，采用引物pNGE-PHD-V-F和pNEG-2*PHD-V-R扩增载体；以pNEG-2*chPheT-CDY1-W28TAG-GST为模板，采用引物 pNEG-PHD-CDY1-F/R扩增CDY1-W2TAG片段，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：38-39所示。通过Gibson组装构建多组分串联质粒：pNEG-2*chPheT-PHD-W28TAG-CDY1-W28TAG-GST。质粒图谱如图1所示。

5、真核细胞表达质粒：pEGFP-PHD3-W28TAG-EGFP的质粒构建：以 pEGFP-EGFP为模板，以引物pEGFP-PHD-V-F/R扩增载体，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：40-41所示；以pNEG-2*chPheT-PHD-W28TAG-GST为模板，以引物pEGFP-PHD-F/R扩增PHD结构域，其核苷酸的序列如SEQ ID NO：42-43所示，通过Gibson组装构建该质粒，该质粒图谱如图1所示。pCDNA3.1-chPheRS9的质粒构建：设计引物将扩增嵌合苯丙氨酰-tRNA合成酶(chPheRS9)，克隆到pcDNA3.1 载体上，分别在CMV和U6启动子控制下，其克隆基因和载体的引物分别如SEQ ID NO：44-47所示，该质粒图谱如图1所示。

质粒的测序均有北京擎科生物公司完成。其余质粒的构建同以上步骤。

实施例5：KDM5A PHD3(PHD)野生型及突变体蛋白的表达纯化

一、KDM5A PHD3(PHD)野生型蛋白的表达

1、质粒转化：将DH10B化学感受态菌株从-80℃冰箱拿出，立即放入冰盒，待其融化后，加入质粒pNEG-2*chPheT-PHD-GST，指腹轻弹使之混匀。冰浴中静置30 min，42℃热激90s，再于冰浴中静置2min，随即加入无抗LB液体培养基，37℃ 复苏40min，取200μL菌液涂布在LB琼脂平板(氨苄青霉素，100μg/mL)上， 37℃培养过夜。

2、诱导表达：从上述抗性平板中挑取单克隆到3mL LB液体培养基(氨苄青霉素，100μg/mL)，振荡过夜培养(37℃，220rpm)；按照1：100的比例接种上述菌液， 37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入L-阿拉伯糖(终浓度：0.2％)及ZnCl₂(终浓度：0.1mM)，22℃诱导表达24h。

二、KDM5A PHD3突变体蛋白的表达

以PHD3-W28-6MeOW突变体为例。

1、共转化质粒pNEG-2*chPheT-PHD-W28TAG-GST和pBK-chPheRS9到大肠杆菌DH10B中，具体操作步骤同上。

2、诱导表达：从上述抗性平板中挑取单克隆到3mL LB液体培养基(氨苄青霉素，100μg/mL；卡那霉素，50μg/mL)，振荡过夜培养(37℃，220rpm)；按照1：100 的比例接种到100mL LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入L- 阿拉伯糖(终浓度：0.2％)、ZnCl₂(终浓度：0.1mM)及终浓度为0.5mM的非天然氨基酸，22℃诱导表达24h。

三、KDM5A PHD3(PHD)的纯化

1收集菌液。离心(4℃，4000rpm，20min)，收集沉菌。

2重悬菌体。使用裂解缓冲溶液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,0.1mMZnCl₂,2mMβ-Me,蛋白酶抑制剂PMSF、Aprotinin)重悬。

3超声破碎。设置超声仪程序：工作2s，间歇5s，功率60％，4℃超声。

4离心(4℃，12000rpm，20min)，收集上清液。

5取0.5mL的GST beads加到重力柱中，用ddH₂O冲洗beads，以10倍柱体积的裂解缓冲液平衡柱子。

6将4中的上清液加到已平衡的GST柱子中。

7用20倍柱体积的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5 150mM NaCl,0.1mMZnCl₂, 2mMβ-Me,蛋白酶抑制剂PMSF、Aprotinin)洗脱非特异性吸附的杂蛋白。

8用10倍柱体积的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，20mM还原型谷胱甘肽)，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

9洗脱后的蛋白质通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白表达纯度，使用Nanodrop(微量分光光度计和荧光分光光度计，赛默飞)测定蛋白表达量。该蛋白用于后续的SDS蛋白质凝胶电泳分析、质谱鉴定以及MST实验。

图5是设计提高与H3K4me3亲和力的PHD结构域变体蛋白。其中，(A)KDM5A PHD3蛋白与H3K4me3多肽的复合物结构(PDB：2KGI)其中PHD3和多肽以卡通模式展示，芳香族氨基酸和H3K4me3修饰以棍状结构展示。(B)考马斯亮蓝展示PHD-W18-UAA和PHD-W28-UAA变体。(C)微量热泳动仪测定PHD-W18-UAA 变体与H3K4me3的亲和力，其中H3K4me3被FITC荧光基团标记。(D)微量热泳动仪测定PHD-W28-UAA变体与H3K4me3的亲和力，其中H3K4me3被FITC荧光基团标记；

SDS蛋白质凝胶电泳的结果如图5B所示，蛋白的纯度达到90％以上。

四、LC-MS鉴定蛋白质

通过SCIEX Triple TOF 6600MS质谱仪，采用电喷雾电离方式以及SCIEX AnalystTF软件分析已纯化的蛋白质。采用PHENOMENEX AERIS宽孔C4色谱柱 (2.1x50mm,3.6μm)进行分离脱盐。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相 B为0.1％甲酸乙腈。设置恒定流速为0.2mL/min。采用SCIEX OS-Q软件(version2.0, SCIEX Corporation)进行质谱反卷积，分析质谱数据。使用ExPASy Compute pI/Mw工具预测蛋白质的分子量。

LC-MS鉴定结果如图4C和4D所示，目标蛋白的理论分子量为33378Da，实际分子量分别为33377Da和33378Da，证明嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体特异性识别6-甲氧基-色氨酸和7-甲氧基-色氨酸。

实施例6：微量热泳动仪(MST)测定解码蛋白结构域变体与组蛋白甲基化修饰多肽的亲和力。实验所用多肽均有北京景泰中科生物科技有限公司合成，并使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记肽段C端，具体序列如表2。

表2.MST实验中使用的多肽序列信息

以解码蛋白PHD与H3K4me3为例具体说明MST测定方法。

(1)蛋白质样品的脱盐。使用2L MST缓冲溶液(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,1 mMDTT,0.05％Tween-20,pH 7.5)透析蛋白质样品，重复3次。

(2)浓缩蛋白。采用10Kd的蛋白质浓缩管(Millipore)将蛋白样品浓缩至适当浓度。

(3)准备16个PCR管，取10μL MST buffer加入2-16号PCR管，取20μL蛋白样品至1号管，从1号管移液10μL至2号管，迭代稀释蛋白样品；

(4)每管加入10μL终浓度为100nM的多肽分子，充分混匀，共20μL；

(5)毛细管上样。

(6)Kd值测量。使用NT.115Monolith仪器(Nano Temper Technologies,Munich,Germany)进行，在恒温25℃的条件下，使用蓝色LED激发光源。仪器设置为：20％的蓝色LED激发功率，40％的红外激光功率。若无特殊说明，所有测量均使用标准玻璃毛细管(NanoTemper Technologies，#catMO-K022)，每组实验重复3次。

(7)数据处理。通过NT分析软件，按照目的蛋白与荧光肽段以1：1比例结合的模型拟合数据，得到目的蛋白的解离常数Kd。所有数据均由Origin软件处理分析。

(8)其他组蛋白甲基化修饰的解码蛋白与组蛋白甲基化修饰的亲和力测定步骤同理。

实验结果：实验数据如图5C和5D表明：PHD野生型结构域和H3K4me3的亲和力为440nM,W28位点特异性引入6-甲氧基-色氨酸的PHD变体与H3K4me3亲和力为52nM，相较于PHD3的PHD野生型结构域，W28位点特异性引入6-甲氧基-色氨酸的PHD变体与H3K4me3亲和力提升高达8倍，其他给电子色氨酸类似物提高PHD蛋白与H3K4me3的亲和力达到2-6倍。同理将6-甲氧基-色氨酸位点特异性引入到其他解码蛋白结构域同样提高该解码蛋白与其对应的组蛋白甲基化修饰的亲和力提高2-4倍。

实施例7：构建多价串联重复PHD结构域以提高其对H3K4me3的亲和力

1、按照实施例4所述，构建双联和三联重复PHD结构域质粒： pNEG-2*chPheT-2xPHD-W28TAG-GST(2x PHD)和 pNEG-2*chPheT-3xPHD-W28TAG-GST(3x PHD)。

2、按照实施例5所述，表达纯化W28位点特异性引入6-甲氧基-色氨酸的双联和三联PHD变体(2x PHD、3x PHD)，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 鉴定蛋白表达纯度，通过LC-MS鉴定蛋白质分子量。

3、按照实施例6所述，测定多价串联重复PHD结构域2x PHD、3x PHD与H3K4me3 的亲和力。

4、将该策略不限于PHD结构域与H3K4me3的相互作用，可拓展到其他解码蛋白与其他组蛋白甲基化修饰间，实验证明该策略能够提高不同解码蛋白结构域与其对应组蛋白甲基化修饰间的亲和力。

图6是设计识别H3K4me3的多价串联重复PHD结构域。(A)多价串联重复 PHD结构域设计卡通图。(B)考马斯亮蓝染色鉴定多联PHD蛋白变体的纯度。(C) 微量热泳动仪测定多联PHD蛋白变体与H3K4me3的亲和力，其中H3K4me3被FITC 荧光基团标记。

实验结果：实验数据如图6C所示：PHD野生型结构域和H3K4me3的亲和力为440nM，W28位点特异性引入6-甲氧基-色氨酸的双联和三联PHD变体与 H3K4me3亲和力分别为30nM和7nM，相较于PHD3的PHD野生型结构域，W28 位点特异性引入6-甲氧基-色氨酸的双联和三联PHD变体与H3K4me3亲和力提升高达14.7倍和62.9倍。将该策略拓展到其他解码蛋白与其对应的组蛋白甲基化修饰的亲和力测定结果表明：多价串联重复组蛋白甲基化修饰解码蛋白结构域均能提高其对相应组蛋白甲基化修饰的亲和力。

实施例8：Far-Western Blot评估PHD超亲体分子对H3K4me3的识别效率

1、蛋白质表达。按照实施例4、实施例5所述，表达纯化6-甲氧基-色氨酸取代的PHD蛋白变体，获得PHD蛋白、2x PHD蛋白和3x PHD蛋白。

2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。以HeLa细胞裂解液为例，将Hela细胞裂解后，梯度稀释到不同浓度，将该蛋白样品通过SDS-PAGE跑胶分离

3、转膜。将蛋白质转移到PVDF膜。恒流300mA，转膜2.5h。

4、封闭：将膜放到含有5％脱脂牛奶/TBST的塑料盒中，放在摇床上，封闭1h，倒掉封闭液。用TBST洗3次，一次10min。

5、诱饵蛋白孵育。分别过夜孵育H3K4me3特异性抗体、PHD蛋白、2x PHD蛋白和3xPHD蛋白。TBST洗3次，一次10min。

6、抗体孵育。孵育H3K4me3特异性抗体的PVDF膜在室温条件下孵育相应的二抗。孵育PHD蛋白的PVDF膜进一步孵育GST特异性抗体(Sigma-Aldrich，cat#G7781)，最后孵育相应的二抗(Proteintech,cat#SA00001-2)。TBST洗3次，一次10min。

7、化学发光成像。将PVDF膜覆盖在显影液上，注意覆盖均匀，室温放置3分钟，然后在多功能成像仪上成像显影。

图7是应用组蛋白甲基化超亲分子识别系统检测和成像H3K4me3。(A)组蛋白甲基化超亲分子识别系统应用于检测和成像的策略示意图。(B)应用组蛋白甲基化超亲分子检测HeLa细胞的H3K4me3水平。H3特异性抗体和H3K4me3特异性抗体为对照组，PHD-WT、2xPHD和3xPHD分别用于检测H3K4me3。(C)组蛋白甲基化超亲体分子识别系统应用于荧光成像检测细胞H3K4me3定位，其中PHD蛋白被Cy5标记。

实验结果：实验数据如图7B，相较于H3K4me3特异性抗体，2x PHD蛋白和 3x PHD蛋白表现具有更高的信噪比。该实验不限于PHD与H3K4me3的互作，同样适用于不同解码蛋白检测其对应的组蛋白甲基化修饰。

实施例9：组蛋白甲基化超亲分子识别系统结合免疫荧光技术检测组蛋白甲基化修饰。

以组蛋白甲基化H3K4me3和PHD解码蛋白为例。

1、标记PHD变体。利用Cy5染料标记PHD解码蛋白结构域。将NHS-Cy5溶解于 DMSO，PHD解码蛋白在PBS溶液中。NHS-Cy5和PHD蛋白以1：2摩尔比混合，于37℃避光孵育1h，50mMTris-HCl,pH 8.0溶液终止反应。

2、使用PD MiniTrapTM G-25脱盐柱(Cytiva,cat#28918007)纯化PHD蛋白。

3、细胞片的制备。将HeLa细胞接种到预先放置处理过的盖玻片的培养皿中，37℃培养。

4、细胞固定。待细胞完全贴壁后，去除培养基，PBS漂洗1次，使用4％多聚甲醛(4％PFA/PBS)室温固定10min，PBS漂洗3次。

5、细胞透化。使用含0.5％Triton X-100的PBS中渗透细胞10min，PBS漂洗3次。

6、封闭。在室温下，使用含3％BSA的PBS封闭30min。

7、一抗孵育。在室温条件，分别使用(2)中Cy5标记的PHD蛋白(野生型与突变体)及H3K4me3抗体(Abcam,cat#ab8580)孵育2h。

8、二抗孵育。使用PBS漂洗经过H3K4me3抗体孵育的细胞，每次漂洗10min，重复3次。再于室温下与Dylight 488，山羊属兔抗体IgG(Abbkine，cat#A23220)孵育1h。PBS漂洗3次，每次10min。以Cy5标记的PHD蛋白孵育的细胞直接使用 PBS漂洗3次，每次10min。

9、封片。将盖玻片细胞面朝下盖在滴有DAPI封固剂(Abcam,cat#ab104139)的载玻片上，避光静置过夜。安装在玻璃载玻片上进行成像。

10、成像。于室温下，采用LSM710共聚焦显微镜(Zessi)，以63x油镜成像。所有图像均用Zeiss的ZEN 2.3lite软件进行分析和处理。

实验结果：实验数据如图7C免疫荧光结果表明Cy5标记的PHD超亲体分子能够在有丝分裂过程中检测到H3K4me3与M期凝缩染色体的共定位。相较于市售商业化的H3K4me3抗体(Abcam,cat#ab8580)，PHD超亲体分子具有更高的信噪比。

实施例10：流式细胞术分析嵌合体苯丙氨酸翻译系统在哺乳动物细胞中的效率

1、转染细胞。按照标准的质粒瞬时转染流程转染293T细胞，实验组为共转表达嵌合体苯丙氨酸翻译系统的质粒pCDNA3.1-chPheRS9和荧光报告质粒 pEGFP-mCherry-T2A-EGFP-190TAG的细胞，对照组为单独传染pEGFP-mCherry和 pEGFP-EGFP的细胞。

2、细胞转染48h后吸掉培养基，加入1x PBS洗去残留的培养基。

3、吸掉PBS溶液，加入胰酶消化细胞，加入1mL DMEM培养基重悬细胞，将细胞转移到1.5mL离心管中。

4、用293T细胞设置流式细胞仪的前向散射和侧向散射门，用表达mCherry的细胞设置PE通道的参数和门，用表达EGFP的细胞设置FITC通道的参数和门。

5、测定实验组细胞，设置每个样品收集50000个细胞。使用软件FlowJo分析数据。

实验结果：实验数据如图8，流式细胞术实验结果显示嵌合体苯丙氨酸氨酰 -tRNA合成酶(chPheRS9)在哺乳动物细胞能高效率地识别6-甲氧基-色氨酸 (6MeOW)、7-甲氧基-色氨酸(7MeOW)、6,7-甲基-色氨酸(67MW)、6,7-甲氧基- 色氨酸(67MeOW)中的任意一个非天然氨基酸。该实验操作适用于293T细胞系，但不限于293T细胞系，适用于各种细胞系。

实施例11：利用邻近标记技术捕获与组蛋白甲基化修饰相互作用的蛋白质组

1、以pT3载体为模板，使用引物pT3-PHD-APEX-V-F/R扩增载体，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：52-53所示；以pNEG-2*chPheT-PHD-W28TAG-GST为模板，使用引物pT3-PHD-F/R扩增PHD基因片段，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO： 56-57所示；使用引物pT3-APEX2-F/R扩增APEX2基因片段，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：54-55所示，APEX2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO： 13-14所示，通过Gibson组装构建质粒pT3-PHD-APEX2。其质粒图谱如图1所示。

2、构建稳定表达PHD与APEX2融合蛋白的稳转细胞系。将含有Sleeping Beauty 转座子系统的质粒pCMV-SB100(具体质粒图谱见图1)与质粒pT3-APEX2-PHD 共转HeLa细胞，37℃培养24h后，用含有2μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养细胞，定期换液。待空白对照组的细胞全部死亡后，用含有1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养实验组细胞，获得混合克隆稳定细胞系。

3、转染细胞，在克隆稳定细胞系中过表达pCDNA3.1-chPheRS9，同时添加2mM的 6-甲氧基-色氨酸，培养36h。

4、APEX2催化的邻近标记。将步骤(3)中的稳定细胞系与含500μM生物素苯酚的DMEM于37℃孵育30min。换液为1mM H₂O₂/PBS溶液，室温静置5min。依次使用预冷的20mM抗坏血酸/PBS漂洗细胞4次，PBS漂洗1次。使用胰酶消化， DMEM中和，离心(1000g，1min)，弃上清。最后加入PBS重悬细胞，离心(1000 g，1min)，弃上清，重复上述操作步骤1次。

5、细胞核的分离。向步骤(4)中获得的细胞中加入1.5mL的低渗缓冲液(10mMHEPES,10mM KCl,0.05％NP40)，重悬，冰上静置10min，离心(4℃，12000rpm， 20min)，弃上清。重复上述操作步骤5-8次。

6、细胞核的裂解。向步骤(5)中的沉淀加入400μL裂解缓冲液(25mM TEOA pH7.5,150mM NaCl,0.1％SDS,1％Triton X-100,0.5％脱氧胆酸钠，1mM PMSF,1×PIC) 和20μLDNA酶，重悬，室温放置20min，离心(4℃，18000rpm，15min)，收集上清液。

7、生物素标记的蛋白质的富集。向步骤(6)收集所得的上清液加入链霉亲和素偶联的磁珠(Streptavidin Beads)，4℃过夜孵育。用0.01％NP40/PBS缓冲液洗涤1遍，再依次用含500mM NaCl的0.01％NP40/PBS缓冲液、含0.2％SDS的0.01％ NP40/PBS缓冲液、含2M尿素的0.01％NP40/PBS缓冲液分别洗涤3次，再用0.01％ NP40/PBS缓冲液洗涤1次，最后加入100μL1×SDS loading buffer重悬，100℃煮样10min。

8、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离步骤(7)中的蛋白质样品，使用考马斯亮蓝G250进行染色，再脱色。

9、LC-MS/MS检测与组蛋白甲基化修饰相互作用的蛋白质组。用干净刀片切胶分离步骤(8)中的蛋白胶的蛋白条带，分别进行脱色脱水、干燥、还原、烷基化、酶解、萃取肽段、脱盐、同位素标记、脱盐处理。经过上述处理的样品通过Q Exactive Orbitrap质谱仪分析，采用Proxeon nanospray电离方式，高效液相色谱仪器是Proxeon Easy-nLC II HPLC。样品装载到100-micron x 20mm Magic C185U反向柱中经过脱盐后通过75-micronx100mm Magic C183U反相柱分离蛋白样品。设置洗脱流速为300nL/min，洗脱时间为60min，获得MS/MS结果。数据处理：实验软件MaxQuant和pLabel software分析处理实验结果。

该实施例的操作流程如图9所示，结合临近标记技术和组蛋白甲基化超亲体识别系统能够捕获与组蛋白甲基化修饰(H3K4me3)相互作用的蛋白质组，有利于分析 H3K4me3在生命过程中扮演的生物学功能。

综上所述，本发明提供了一类吡啶生物碱化合物的合成方法，并应用该类化合物显著性提高阳离子-π相互作用，从而为研究阳离子-π相互作用的生物大分子提供研究方法，为开发基于解码蛋白的组蛋白甲基化修饰的超亲体的生物技术提供理论基础，为进一步应用提供可能，具有巨大的临床价值和开发应用价值。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本邻域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或者等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法及应用

<130> ZJDX-002

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 1

atggataaga agccgctgga tgttctgatc tctgcgaccg gtctgtggat gtcccgtacc 60

ggcacgctgc acaagatcaa gcactatgag atttctcgtt ctaaaatcta catcgaaatg 120

gcgtgtggtg accatctggt tgtgaacaac tctcgttctt gtcgtcccgc acgtgcattc 180

cgttatcata aataccgtaa aacctgcaaa cgttgtcgtg tttctgacga agatatcaac 240

aacttcctga cccgttctac cgaaggcaaa acctctgtta aagttaaagt tgtttctgag 300

ccgaaagtga aaaaagcgat gccgaaatct gtttctcgtg cgccgaaacc gctggaaaat 360

ccggtttctg cgaaagcgtc taccgacacc tctcgttctg ttccgtctcc ggcgaaatct 420

accccgaact ctccggttcc gacctctgca agcgccccag ctctgactaa atcccagacg 480

gaccgtctgg aggtgctgct gaacccaaag gatgaaatct ctctgaacag cggcaagcct 540

ttccgtgagc tggaaagcga gctgctgtct cgtcgtaaaa aggatctgca acagatctac 600

gctgaggaac gcgagggtgg cggaagcggc ggcggtggcg gaagcggcgg cggtggcgga 660

agcggcggcg gtggaagcca ggcctgggga tcgaggcctc ctgcagcaga gtgtgccacc 720

caaagagctc caggcagtgt ggtggagctg ctgggcaaat cctaccctca ggacgaccac 780

agcaacctca cccggaaggt cctcaccaga gttggcagga acctgcacaa ccagcagcat 840

caccctctgt ggctgatcaa ggagagggtg ttggagcact tcaacaagca gtatgtgggc 900

agctctggga ccccgttgtt ctcggtctat gacaaccttt cgccagtggt cacgacctgg 960

cagaactttg acagcctgct catcccagct gatcacccct gcaggaagaa gggggacaac 1020

tattacctga atcggactca catgctgaga gcgcacacgt ccgcacacca gtgggacttg 1080

ctgcacgcgg gactggatgc cttcctggtg gtgggtgatg tctacaggcg tgaccagatc 1140

gactcccagc actaccctat tttccaccag ctggacgccg gtcggctctt ctctaagcat 1200

gagttatttg ctggtataaa ggatggggaa agcctgcagc tctttgaaca aagttctcgc 1260

tctgcgcata aacaagagac acacaccatg gaggccgtga agcttgttga gtttgatctt 1320

aagcaaacgc ttaccaggct catggcacat ctttttggag atgagccgga gataaggtgg 1380

gtagactgct acgttccttt tggacatcct tcctttgaga tggagatcaa ctttcatgga 1440

gaatggctgg aagttcttgg ctgcggggtg gttgaacaac aactggtcaa ttcagctggt 1500

gctcaagacc gaatcggctg gggatttggc ctagggttag aaaggctagc catgatcctc 1560

tacgacatcc ctgatatccg tctcttctgg tgtgaggacg agcgcttcct gaagcagttc 1620

tgtgtatcca acattaatca gaaggtgaag tttcagcctc ttagcaaa 1668

<210> 2

<211> 556

<212> PRT

<213> 人工合成(synthetic sequence)

<400> 2

Met Asp Lys Lys Pro Leu Asp Val Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp

1 5 10 15

Met Ser Arg Thr Gly Thr Leu His Lys Ile Lys His Tyr Glu Ile Ser

20 25 30

Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val

35 40 45

Asn Asn Ser Arg Ser Cys Arg Pro Ala Arg Ala Phe Arg Tyr His Lys

50 55 60

Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys Arg Val Ser Asp Glu Asp Ile Asn

65 70 75 80

Asn Phe Leu Thr Arg Ser Thr Glu Gly Lys Thr Ser Val Lys Val Lys

85 90 95

Val Val Ser Glu Pro Lys Val Lys Lys Ala Met Pro Lys Ser Val Ser

100 105 110

Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu Asn Pro Val Ser Ala Lys Ala Ser Thr

115 120 125

Asp Thr Ser Arg Ser Val Pro Ser Pro Ala Lys Ser Thr Pro Asn Ser

130 135 140

Pro Val Pro Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys Ser Gln Thr

145 150 155 160

Asp Arg Leu Glu Val Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile Ser Leu Asn

165 170 175

Ser Gly Lys Pro Phe Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu Ser Arg Arg

180 185 190

Lys Lys Asp Leu Gln Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu Gly Gly Gly

195 200 205

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gln Ala Trp Gly Ser Arg Pro Pro Ala Ala Glu Cys Ala Thr

225 230 235 240

Gln Arg Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Leu Leu Gly Lys Ser Tyr Pro

245 250 255

Gln Asp Asp His Ser Asn Leu Thr Arg Lys Val Leu Thr Arg Val Gly

260 265 270

Arg Asn Leu His Asn Gln Gln His His Pro Leu Trp Leu Ile Lys Glu

275 280 285

Arg Val Leu Glu His Phe Asn Lys Gln Tyr Val Gly Ser Ser Gly Thr

290 295 300

Pro Leu Phe Ser Val Tyr Asp Asn Leu Ser Pro Val Val Thr Thr Trp

305 310 315 320

Gln Asn Phe Asp Ser Leu Leu Ile Pro Ala Asp His Pro Cys Arg Lys

325 330 335

Lys Gly Asp Asn Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr His Met Leu Arg Ala His

340 345 350

Thr Ser Ala His Gln Trp Asp Leu Leu His Ala Gly Leu Asp Ala Phe

355 360 365

Leu Val Val Gly Asp Val Tyr Arg Arg Asp Gln Ile Asp Ser Gln His

370 375 380

Tyr Pro Ile Phe His Gln Leu Asp Ala Gly Arg Leu Phe Ser Lys His

385 390 395 400

Glu Leu Phe Ala Gly Ile Lys Asp Gly Glu Ser Leu Gln Leu Phe Glu

405 410 415

Gln Ser Ser Arg Ser Ala His Lys Gln Glu Thr His Thr Met Glu Ala

420 425 430

Val Lys Leu Val Glu Phe Asp Leu Lys Gln Thr Leu Thr Arg Leu Met

435 440 445

Ala His Leu Phe Gly Asp Glu Pro Glu Ile Arg Trp Val Asp Cys Tyr

450 455 460

Val Pro Phe Gly His Pro Ser Phe Glu Met Glu Ile Asn Phe His Gly

465 470 475 480

Glu Trp Leu Glu Val Leu Gly Cys Gly Val Val Glu Gln Gln Leu Val

485 490 495

Asn Ser Ala Gly Ala Gln Asp Arg Ile Gly Trp Gly Phe Gly Leu Gly

500 505 510

Leu Glu Arg Leu Ala Met Ile Leu Tyr Asp Ile Pro Asp Ile Arg Leu

515 520 525

Phe Trp Cys Glu Asp Glu Arg Phe Leu Lys Gln Phe Cys Val Ser Asn

530 535 540

Ile Asn Gln Lys Val Lys Phe Gln Pro Leu Ser Lys

545 550 555

<210> 3

<211> 201

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 3

atgagcggtg cagaagaatc agatgatgaa aatgcagttt gtgcagcaca gaattgtcag 60

cgcccgtgta aagataaagt tgattaggtt cagtgtgatg gtggttgtga tgaatggttt 120

catcaggttt gtgttggtgt tagcccggaa atggcagaaa atgaagatta tatttgcatc 180

aactgcgcaa aaaaacaggg t 201

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 4

atgagcggtg cagaagaatc agatgatgaa aatgcagttt gtgcagcaca gaattgtcag 60

cgcccgtgta aagataaagt tgattgggtt cagtgtgatg gtggttgtga tgaatagttt 120

catcaggttt gtgttggtgt tagcccggaa atggcagaaa atgaagatta tatttgcatc 180

aactgcgcaa aaaaacaggg t 201

<210> 5

<211> 198

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 5

atggcaagtc aggaatttga agtagaagca attgttgata aacgtcaaga taaaaacggt 60

aatacccaat atctggttcg ttggaaaggt tatgataaac aggatgatac atgggaaccg 120

gaacagcatc tgatgaattg tgaaaaatgt gtgcatgatt tcaaccgtcg ccaaaccgaa 180

aaacagaaag gtggaagc 198

<210> 6

<211> 66

<212> PRT

<213> 人(H .sapiens)

<400> 6

Met Ala Ser Gln Glu Phe Glu Val Glu Ala Ile Val Asp Lys Arg Gln

1 5 10 15

Asp Lys Asn Gly Asn Thr Gln Tyr Leu Val Arg Trp Lys Gly Tyr Asp

20 25 30

Lys Gln Asp Asp Thr Trp Glu Pro Glu Gln His Leu Met Asn Cys Glu

35 40 45

Lys Cys Val His Asp Phe Asn Arg Arg Gln Thr Glu Lys Gln Lys Gly

50 55 60

Gly Ser

65

<210> 7

<211> 579

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 7

atgaatggct gggtacctgt tggggctgcg tgtgagaagg ctgtgtatgt cttggatgag 60

ccggagccag ccatccgaaa gagctaccag gcggtagagc ggcatgggga gacaatccga 120

gtccgggaca ccgtccttct caaatcaggc ccacgaaaga cctccacacc ttatgtggcc 180

aagatctctg ccctctggga gaaccccgag tcaggagagc tgatgatgag cctcctgtgg 240

tattacagac ctgagcactt acagggaggc cgcagtccca gcatgcacga gcccttgcag 300

aatgaagtgt ttgcatcgcg acatcaggac cagaacagtg tggcctgcat tgaggagaag 360

tgctatgtgc tgacttttgc cgagtactgc aggttctgtg ccatggccaa gcgccgaggt 420

gaaggcctcc ccagccgaaa gacagcactg gttcccccct ctgcagacta ttccacccca 480

ccccaccgca cagtgccaga ggacacggac cctgagctgg tgttcctttg ccgccatgtc 540

tatgacttcc gccacgggcg catccttaag aacccccag 579

<210> 8

<211> 193

<212> PRT

<213> 人(H .sapiens)

<400> 8

Met Asn Gly Trp Val Pro Val Gly Ala Ala Cys Glu Lys Ala Val Tyr

1 5 10 15

Val Leu Asp Glu Pro Glu Pro Ala Ile Arg Lys Ser Tyr Gln Ala Val

20 25 30

Glu Arg His Gly Glu Thr Ile Arg Val Arg Asp Thr Val Leu Leu Lys

35 40 45

Ser Gly Pro Arg Lys Thr Ser Thr Pro Tyr Val Ala Lys Ile Ser Ala

50 55 60

Leu Trp Glu Asn Pro Glu Ser Gly Glu Leu Met Met Ser Leu Leu Trp

65 70 75 80

Tyr Tyr Arg Pro Glu His Leu Gln Gly Gly Arg Ser Pro Ser Met His

85 90 95

Glu Pro Leu Gln Asn Glu Val Phe Ala Ser Arg His Gln Asp Gln Asn

100 105 110

Ser Val Ala Cys Ile Glu Glu Lys Cys Tyr Val Leu Thr Phe Ala Glu

115 120 125

Tyr Cys Arg Phe Cys Ala Met Ala Lys Arg Arg Gly Glu Gly Leu Pro

130 135 140

Ser Arg Lys Thr Ala Leu Val Pro Pro Ser Ala Asp Tyr Ser Thr Pro

145 150 155 160

Pro His Arg Thr Val Pro Glu Asp Thr Asp Pro Glu Leu Val Phe Leu

165 170 175

Cys Arg His Val Tyr Asp Phe Arg His Gly Arg Ile Leu Lys Asn Pro

180 185 190

Gln

<210> 9

<211> 207

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 9

atggagtatc aggatgggaa ggagtttgga ataggggacc tcgtgtgggg aaagatcaag 60

ggcttctcct ggtggcccgc catggtggtg tcttggaagg ccacctccaa gcgacaggct 120

atgtctggca tgcggtgggt ccagtggttt ggcgatggca agttctccga ggtctctgca 180

gacaaactgg tggcactggg gctgttc 207

<210> 10

<211> 69

<212> PRT

<213> 人(H .sapiens)

<400> 10

Met Glu Tyr Gln Asp Gly Lys Glu Phe Gly Ile Gly Asp Leu Val Trp

1 5 10 15

Gly Lys Ile Lys Gly Phe Ser Trp Trp Pro Ala Met Val Val Ser Trp

20 25 30

Lys Ala Thr Ser Lys Arg Gln Ala Met Ser Gly Met Arg Trp Val Gln

35 40 45

Trp Phe Gly Asp Gly Lys Phe Ser Glu Val Ser Ala Asp Lys Leu Val

50 55 60

Ala Leu Gly Leu Phe

65

<210> 11

<211> 417

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 11

atgagcggtg cagaagaatc agatgatgaa aatgcagttt gtgcagcaca gaattgtcag 60

cgcccgtgta aagataaagt tgattgggtt cagtgtgatg gtggttgtga tgaatagttt 120

catcaggttt gtgttggtgt tagcccggaa atggcagaaa atgaagatta tatttgcatc 180

aactgcgcaa aaaaacaggg tggcagcagc ggcagcagca gcggtgcaga agaatcagat 240

gatgaaaatg cagtttgtgc agcacagaat tgtcagcgcc cgtgtaaaga taaagttgat 300

tgggttcagt gtgatggtgg ttgtgatgaa tagtttcatc aggtttgtgt tggtgttagc 360

ccggaaatgg cagaaaatga agattatatt tgcatcaact gcgcaaaaaa acagggt 417

<210> 12

<211> 636

<212> DNA

<213> 人(H .sapiens)

<400> 12

atgagcggtg cagaagaatc agatgatgaa aatgcagttt gtgcagcaca gaattgtcag 60

cgcccgtgta aagataaagt tgattgggtt cagtgtgatg gtggttgtga tgaatggttt 120

catcaggttt gtgttggtgt tagcccggaa atggcagaaa atgaagatta tatttgcatc 180

aactgcgcaa aaaaacaggg tggcagcagc ggcagcagca gcggtgcaga agaatcagat 240

gatgaaaatg cagtttgtgc agcacagaat tgtcagcgcc cgtgtaaaga taaagttgat 300

tgggttcagt gtgatggtgg ttgtgatgaa tggtttcatc aggtttgtgt tggtgttagc 360

ccggaaatgg cagaaaatga agattatatt tgcatcaact gcgcaaaaaa acagggtctg 420

gtgccgcgcg gcagcagcag cggtgcagaa gaatcagatg atgaaaatgc agtttgtgca 480

gcacagaatt gtcagcgccc gtgtaaagat aaagttgatt gggttcagtg tgatggtggt 540

tgtgatgaat ggtttcatca ggtttgtgtt ggtgttagcc cggaaatggc agaaaatgaa 600

gattatattt gcatcaactg cgcaaaaaaa cagggt 636

<210> 13

<211> 747

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 13

ggaaagtctt acccaactgt gagtgctgat taccaggacg ccgttgagaa ggcgaagaag 60

aagctcagag gcttcatcgc tgagaagaga tgcgctcctc taatgctccg tttggcattc 120

cactctgctg gaacctttga caagggcacg aagaccggtg gacccttcgg aaccatcaag 180

caccctgccg aactggctca cagcgctaac aacggtcttg acatcgctgt taggcttttg 240

gagccactca aggcggagtt ccctattttg agctacgccg atttctacca gttggctggc 300

gttgttgccg ttgaggtcac gggtggacct aaggttccat tccaccctgg aagagaggac 360

aagcctgagc caccaccaga gggtcgcttg cccgatccca ctaagggttc tgaccatttg 420

agagatgtgt ttggcaaagc tatggggctt actgaccaag atatcgttgc tctatctggg 480

ggtcacacta ttggagctgc acacaaggag cgttctggat ttgagggtcc ctggacctct 540

aatcctctta ttttcgacaa ctcatacttc acggagttgt tgagtggtga gaaggaaggt 600

ctccttcagc taccttctga caaggctctt ttgtctgacc ctgtattccg ccctctcgtt 660

gacaaatatg cagcggacga agatgccttc tttgctgatt acgctgaggc tcaccaaaag 720

ctttccgagc ttgggtttgc tgatgcc 747

<210> 14

<211> 249

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 14

Gly Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Ala Asp Tyr Gln Asp Ala Val Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Gly Phe Ile Ala Glu Lys Arg Cys Ala

20 25 30

Pro Leu Met Leu Arg Leu Ala Phe His Ser Ala Gly Thr Phe Asp Lys

35 40 45

Gly Thr Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Ile Lys His Pro Ala Glu

50 55 60

Leu Ala His Ser Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg Leu Leu

65 70 75 80

Glu Pro Leu Lys Ala Glu Phe Pro Ile Leu Ser Tyr Ala Asp Phe Tyr

85 90 95

Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Lys Val

100 105 110

Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Pro Glu Gly

115 120 125

Arg Leu Pro Asp Pro Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Asp Val Phe

130 135 140

Gly Lys Ala Met Gly Leu Thr Asp Gln Asp Ile Val Ala Leu Ser Gly

145 150 155 160

Gly His Thr Ile Gly Ala Ala His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu Gly

165 170 175

Pro Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Thr Glu

180 185 190

Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp Lys

195 200 205

Ala Leu Leu Ser Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Asp Lys Tyr Ala

210 215 220

Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His Gln Lys

225 230 235 240

Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala

245

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

taagatgggt agactgctac nnkccttttg gtcatccttc ttttgag 47

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 16

gtagcagtct acccatctta tctcc 25

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 17

aagttcttgg ctgcggggtg nnkgaacaac aactggtcaa ttcagc 46

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 18

caccccgcag ccaagaactt 20

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(28)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 19

accctatttt ccaccagctg nnkgccnnkc ggctcttctc caagcatgag 50

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 20

cagctggtgg aaaatagggt agtg 24

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 21

ctggtgccgc gcggcagcat gtcccctata ctaggttatt ggaaaa 46

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 22

gtggcgacca tcctccaaaa tgaagcatgc accattcctt 40

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 23

taagaaggag atatacatat gagcggtgca gaagaatcag atgat 45

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 24

catgctgccg cgcggcacca gaccctgttt ttttgcgcag ttga 44

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 25

tgaagcatgc accattcctt gc 22

<210> 26

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 26

catatgtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctagcccaaa aaaacggg 58

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 27

cgtgtaaaga taaagttgat taggttcagt gtgatggtgg ttgtga 46

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 28

atcaacttta tctttacacg ggcgc 25

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 29

tttcatcagg tttgtgttgg tgttagc 27

<210> 30

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 30

ccaacacaaa cctgatgaaa ctattcatca caaccaccat cacactg 47

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 31

actgcgcaaa aaaacagggt ggcagcagcg gcagcagcag cggtgcagaa gaatcagat 59

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 32

atgctgccgc gcggcaccag accctgtttt tttgcgcagt tg 42

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 33

accctgtttt tttgcgcagt tgatgcaaat ataatcttc 39

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 34

atgctgccgc gcggcaccag gcttccacct ttctgttttt cg 42

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 35

actgcgcaaa aaaacagggt ggcagcagcg gcagcagcgc aagtcaggaa tttgaagta 59

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 36

ggcagcagcg gcagcagcgt gagcaagggc gaggagctgt 40

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 37

catggtggcg accggtagcg ct 22

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 38

cgctaccggt cgccaccatg agcggtgcag aagaatcaga tg 42

<210> 39

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 39

cgctgctgcc gctgctgcca ccctgttttt ttgcgcagtt gat 43

<210> 40

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 40

ctgcacggaa gcttgccacc atggataaga agccgctgga tgt 43

<210> 41

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 41

tagtgatggt gatggtggtg tttgctaaga ggctgaaact tcacct 46

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 42

caccaccatc accatcacta aaccc 25

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 43

ggtggcaagc ttccgtgcag tt 22

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 44

taactagtcc actgagatcg acg 23

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 45

cttatcgtcg tcatccttgt agtcca 26

<210> 46

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 46

tctggcagcg gttctgctag cggaaagtct tacccaactg tgagtg 46

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 47

cgatctcagt ggactagtta ggcatcagca aacccaagct 40

<210> 48

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 48

acaaggatga cgacgataag agcggtgcag aagaatcaga t 41

<210> 49

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(synthetic sequence)

<400> 49

gctagcagaa ccgctgccag aaccgctgcc accctgtttt tttgcgcagt t 51

Claims

1.一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法，其特征在于，该方法利用遗传密码扩展技术将生物分子中形成阳离子-π相互作用的芳香族笼的色氨酸替换成色氨酸类似物，以提高阳离子-π相互作用的结合能，具体步骤为：

S1、设计合成强供电子侧链取代的色氨酸类似物，所述的色氨酸类似物为非天然氨基酸，选自6-甲氧基-色氨酸(A2)、7-甲基-色氨酸(A3)、7-甲氧基-色氨酸(A4)中的一种，以上色氨酸类似物A2至A4的结构式为：

S2、提供特异性识别色氨酸类似物A2至A4的嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体，所述嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1-2所示；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于色氨酸类似物的合成方法是：以不同位置取代的吲哚B为反应物，反应得到目标产物，

所述不同位置取代的吲哚化学结构式为：所得到的目标产物的结构通式为：其中X选自：氧原子或碳原子中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S3中，

(1)解码蛋白形成芳香笼的色氨酸对应位点突变成终止密码子，

(2)将解码蛋白突变体与嵌合体苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体共转表达，在表达过程中添加相应的色氨酸类似物，

(3)按照GST-tag蛋白纯化方法纯化解码蛋白变体，并通过LC-MS鉴定解码蛋白变体的保真度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法以组蛋白甲基化解码蛋白结构域为研究对象，所述的解码蛋白结构域为Chromo、PHD、PWWP、Tudor、MBT、CW、SPIN和BAH结构域中的任意一个。

5.一种权利要求1所述的方法得到的带有色氨酸类似物的蛋白在建立特异性识别组蛋白甲基化修饰的解码蛋白超亲体识别系统方面的应用。