CN114933643B - 苏氏圆腹鲶nkl抗菌肽及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽及其编码基因和应用。本发明所述苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌具有抗菌活性，可有效防治由上述细菌引发的细菌性疾病，用于制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌的制剂，或用于防治相关的细菌性疾病等。本发明不仅为哈维氏弧菌的防治提供了新的药物来源，同时丰富了嗜水气单胞菌和大肠杆菌的防治药物，且所述抗菌肽的合成成本小，有助于水产养殖行业的发展。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。具体地，涉及一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽及其编码基因和应用。
背景技术
由哈维氏弧菌(Vibrio harvey)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)等细菌引发的细菌性疾病严重危害了水产养殖行业的发展，给水产养殖行业带来了严重的经济损失。抗生素虽能对细菌性疾病起到防治效果，但抗生素的滥用也导致了抗生素耐药菌的出现、抗生素残留以及环境污染等问题，而开发抗生素替代产品，例如抗菌肽等，或许是解决该问题的根本途径。
抗菌肽(AMP)是一种免疫调节分子，其可作用于各种病原微生物，通过直接与细菌膜蛋白相互作用，改变细菌细胞膜通透性导致细菌死亡；或通过胞内蛋白质或核酸相互作用，诱导细胞凋亡，为宿主提供广泛的免疫保护。细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和自然杀伤(NK)细胞产生的颗粒溶素(NK-lysin，NKL)属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族(saposin-likeproteins，SAPLIP)，这类蛋白能与磷脂发生相互作用，进而扰乱生物膜结构，可用于开发抗菌肽。
现有技术中已有关于NKL抗菌肽的报道。例如，鱼类来源的牙鲆NKL抗菌肽对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌都有抗菌活性。但目前尚未有可抗哈维氏弧菌的NKL抗菌肽的报道，也未有体内也可以抑制嗜水气单胞菌的NKL抗菌肽的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽及其编码基因和应用。
本发明的第一个目的是提供一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述抗菌肽的基因。
本发明的第三个目的是提供所述抗菌肽或所述基因在制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌的制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述抗菌肽或所述基因在制备预防细菌性疾病的药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述抗菌肽或所述基因在制备治疗细菌性疾病的药物中的应用。
本发明的第六个目的提供一种抗大肠杆菌和/或哈维氏弧菌的制剂。
本发明的第七个目的是提供一种抗嗜水气单胞菌的制剂。
本发明的第八个目的是提供一种用于预防/治疗细菌性疾病的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明发现SEQ ID NO.1所示抗菌肽可以有效抑制大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌；其对大肠杆菌的最低抑菌浓度为31.25μmol/L，对哈维氏弧菌的最低抑菌浓度为15.625μmol/L，对大肠杆菌和哈维氏弧菌的最低杀菌浓度均为62.5μmol/L；对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为250μmol/L，对嗜水气单胞菌的最低杀菌浓度为500μmol/L；可有效防治由大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌引发的细菌性疾病，用于制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌的制剂，或用于防治相关的细菌性疾病等。
因此，本发明申请保护SEQ ID NO.1所示抗菌肽或SEQ ID NO.2所示基因在制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌的制剂中的应用。
本发明还申请保护SEQ ID NO.1所示抗菌肽或SEQ ID NO.2所示基因在制备预防细菌性疾病的药物中的应用。
本发明还申请保护SEQ ID NO.1所示抗菌肽或SEQ ID NO.2所示基因在制备治疗细菌性疾病的药物中的应用。
除可通过人工合成获得本发明所述抗菌肽外，还可通过本领域技术人员所熟知的基因重组表达等方式获得本发明所述抗菌肽，将其用于制备抗细菌的制剂或用于防治由病原细菌引发的疾病等。
具体地，所述细菌性疾病是由大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌引发的疾病。
更具体地，所述细菌性疾病是由嗜水气单胞菌所引发的鱼类细菌性败血症。
更具体地，所述鱼类为苏氏圆腹鲶。
更具体地，利用SEQ ID NO.1所示抗菌肽治疗鱼类细菌性败血症时，所述抗菌肽的用量为20μg/g～50μg/g。
本发明还提供了一种抗大肠杆菌和/或哈维氏弧菌的制剂，所述制剂中含有SEQID NO.1所示抗菌肽，所述抗菌肽的浓度为62.5μmol/L～125μmol/L。
本发明还提供了一种抗嗜水气单胞菌的制剂，所述制剂中含有SEQ ID NO.1所示抗菌肽，所述抗菌肽的浓度为250μmol/L～500μmol/L。
本发明还提供了一种用于预防/治疗细菌性疾病的药物，所述药物中含有SEQ IDNO.1所示抗菌肽。
具体地，所述细菌性疾病为鱼类细菌性败血症。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽，该抗菌肽不仅可以抑制大肠杆菌、嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌，还可有效防治由大肠杆菌、嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌的引发的细菌性疾病，可用于制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌的制剂，或用于防治相关的细菌性疾病等。本发明不仅为哈维氏弧菌的防治提供了新的药物来源，同时丰富了嗜水气单胞菌和大肠杆菌的防治药物，且所述抗菌肽的合成成本小，有助于水产养殖行业的发展。
附图说明
图1为人工合成的NKL抗菌肽的高效液相色谱检测结果。
图2为人工合成的NKL抗菌肽的质谱检测结果。
图3为注射人工合成的NKL抗菌肽后对苏氏圆腹鲶肝胰脏和体肾组织细菌载量的影响结果；其中，图a为对肝胰脏组织的影响结果；图b为对体肾组织的影响结果；**p＜0.05。
图4为注射人工合成的NKL抗菌肽后对感染嗜水气单胞菌的苏氏圆腹鲶存活率的影响结果；其中，图a为苏氏圆腹鲶的存活曲线，图b为苏氏圆腹鲶的累计存活率；图中，Mock：空白组，腹腔注射等量PBS；A.hydrophila：嗜水气单胞菌感染组；Penicillin andStreptomycin(10μg/g)+A.hydrophila：抗生素注射组，嗜水气单胞菌感染后，按10μg/g剂量注射青霉素-链霉素合剂；NKL(1μg/g)+A.hydrophila：NKL低剂量组，嗜水气单胞菌感染后，按1μg/g剂量注射人工合成的NKL抗菌肽；NKL(20μg/g)+A.hydrophila：NKL高剂量组，嗜水气单胞菌感染后，按20μg/g剂量注射人工合成的NKL抗菌肽；**p＜0.05。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽的合成
由于不同来源的同类抗菌肽所具有的抗菌效果有所区别，甚至同种来源的不同肽段的抗菌肽的抗菌效果也会有所区别，或不具有抗菌活性。在不明确具体哪个肽段具有抗菌功能的情况下，本发明通过一系列不同的分析和实验筛选，得到了一种具有抗菌活性的NKL抗菌肽。
本发明所述NKL抗菌肽来源于苏氏圆腹鲶的NKL蛋白，为该蛋白其中的一段肽段，该肽段内部包含两个半胱氨酸，预测可以形成一对二硫键C87-C97，其氨基酸序列如下(SEQID NO.1)所示：
IKAKLMKVCDSIGFLRSLCKKMITKYLGTLVEELSTTG
本发明还提供了编码该NKL抗菌肽的基因，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)所示：
ATTAAAGCAAAACTGATGAAAGTCTGTGATTCAATCGGATTCCTGCGAAGTCTCTGTAAGAAAATGATTACCAAGTACCTGGGTACCTTGGTGGAGGAACTTTCTACCACAGGT
本发明委托南京杰肽生物科技有限公司，按固相化学技术合成得到了SEQ IDNO.1(IKAKLMKVCDSIGFLRSLCKKMITKYLGTLVEELSTTG)所示的NKL抗菌肽；其中，半胱氨酸通过自然氧化法形成二硫键。
NKL抗菌肽人工合成后，通过高效液相色谱和质谱进行验证，结果分别如图1和2所示。由图1和2所示结果可知，人工合成的NKL抗菌肽的纯度可达95.73％，可进行后续实验。
实施例2NKL抗菌肽的最低抑菌浓度和杀菌浓度检测
本发明通过微量肉汤稀释法测定了实施例1所述人工合成的NKL抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。测试所用细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)和大肠杆菌(Escherichia coli)。
将上述细菌培养至对数中期，通过平板法准确测定菌液浓度，随后将菌液稀释至2.0×105CFU/mL，依次加入96孔板的第1～8孔中，每孔50μL；配制质量浓度分别为1000μmol/L、500μmol/L、250μmol/L、125μmol/L、62.5μmol/L和31.25μmol/L的NKL抗菌肽溶液，每种浓度各取50μL，依浓度从高到低，分别加入到96孔板的第1～6孔中，与菌液反应，各孔中NKL抗菌肽溶液的终浓度分别为500μmol/L、250μmol/L、125μmol/L、62.5μmol/L、31.25μmol/L和15.625μmol/L；另在第7孔添加等量的空白LB液体培养基，第8孔添加等量的浓度为200μmol/L的青链霉素溶液，分别作为阴性对照和阳性对照；28℃条件下孵育24h，试验设置3个重复；通过多功能酶标仪测量600nm波长下各个孔的吸光度值(OD值)，确认最低抑菌浓度。随后在无菌环境中，用接种环从各试验孔中沾取约10μL培养液，在LB培养板中均匀划线，28℃倒置培养过夜，若3个试验重复都没有发现菌落生长，则对应抗菌肽浓度为最低杀菌浓度。若最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的数值＞500，则视为没有抑菌或杀菌能力。
NKL抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的检测结果如表1所示。由表1可知，本发明所述苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和哈维氏弧菌具有抗菌活性，其对大肠杆菌的最低抑菌浓度为31.25μmol/L，对大肠杆菌的最低和哈维氏弧菌的最低杀菌浓度为62.5μmol/L；对嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为250μmol/L，对嗜水气单胞菌的最低杀菌浓度为500μmol/L；对哈维氏弧菌的最低抑菌浓度为15.625μmol/L，对哈维氏弧菌的最低杀菌浓度为62.5μmol/L。
表1苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽的抗菌谱
实施例3NKL抗菌肽对苏氏圆腹鲶内脏器官细菌载量的影响
体外试验表明，NKL抗菌肽对嗜水气单胞菌的生长具有抑制作用。在此基础上，本发明通过腹腔注射方式，进一步探索NLK抗菌肽在体内复杂环境中对嗜水气单胞菌的抗菌作用。
在预实验中，本发明将60尾苏氏圆腹鲶平均分为3组，每组分别按照50μg/g、20μg/g和0μg/g的剂量注射人工合成的NKL抗菌肽，注射后观察苏氏圆腹鲶的生长状态一周。结果发现，苏氏圆腹鲶采食正常并无死亡，随后开展正式试验。
将健康无病的苏氏圆腹鲶6尾随机分为对照组和试验组；对照组和试验组苏氏圆腹鲶均感染嗜水气单胞菌，感染后30min，试验组注射人工合成的NKL抗菌肽(注射剂量：20μg/g)，对照组注射等体积PBS；注射24h后，将鱼用MS222麻醉，以75％无水乙醇浸泡消毒，在超净台中无菌剖取试验组和对照组鱼的肝胰脏和体肾组织，用灭菌滤纸吸干水分，随后放入已知重量的离心管中，离心管再次称重，计算获得采集组织的重量；分别在离心管中加入1mL无菌PBS，用灭菌后的剪刀剪碎组织，充分震荡摇匀后，吸取上清100μL，加入装有900μLPBS的新离心管中，进行10倍梯度稀释，随后吸取各个梯度稀释液分别在LB培养平板中涂布均匀，28℃条件下倒置培养过夜，计算苏氏圆腹鲶肝胰脏和体肾组织的嗜水气单胞菌载量。
通过对培养板中单菌落进行计数，即可准确了解组织悬液中的细菌浓度，最后将细菌浓度换算成每0.1g组织所含细菌数目。本试验独立重复两次(n＝3)。
注射人工合成的NKL抗菌肽后对苏氏圆腹鲶肝胰脏和体肾组织细菌载量的影响结果如图3所示；其中，图a为对肝胰脏组织的影响结果；图b为对体肾组织的影响结果；**p＜0.05。由图3可知，注射20μg/g NKL抗菌肽的苏氏圆腹鲶肝胰脏中，平均每0.1g组织中含有细菌量为29748±12491CFU/0.1g；对照组注射等量PBS，苏氏圆腹鲶肝胰脏中平均细菌载量为595874±386860CFU/0.1g，注射NKL后苏氏圆腹鲶肝胰脏细菌载量显著低于对照组(p＜0.05)。在体肾组织中也存在相似的结果，注射20μg/g NKL抗菌肽的苏氏圆腹鲶体肾组织中，平均细菌载量为68434±29294CFU/0.1g，对照组中体肾组织的平均细菌载量为15238199±10640512CFU/0.1g。以上结果表明，NKL抗菌肽能显著降低感染嗜水气单胞菌的苏氏圆腹鲶中肝胰脏和体肾组织的细菌载量(p＜0.05)。
实施例4NKL抗菌肽对感染嗜水气单胞菌的苏氏圆腹鲶存活率的影响
本发明通过腹腔注射抗菌肽的方式对NKL抗菌肽对感染嗜水气单胞菌的苏氏圆腹鲶存活率的影响进行了试验。
本实施例的预实验结果表明，按照20μg/g的比例注射人工合成的NKL抗菌肽后，苏氏圆腹鲶的采食正常，并无死亡发生。故随机选取健康无病的苏氏圆腹鲶90尾(平均体重为11.3±1.4g)，平均分为5组，每组18尾，分别为空白组(Mock)、嗜水气单胞菌感染组(A.hydrophila)、抗生素组(Penicillin and Streptomycin(10μg/g+A.hydrophila))、NKL低剂量组(1μg/g+A.hydrophila)和NKL高剂量组(20μg/g+A.hydrophila)。空白组腹腔注射0.1mL PBS，其余4组分别注射等体积嗜水气单胞菌悬液(1×107CFU/mL)；感染30min后，通过电子秤分别称量5组苏氏圆腹鲶体重；根据体重不同，抗生素组苏氏圆腹鲶按照10μg/g剂量注射青链霉素；NKL低剂量组和NKL高剂量组分别按照1μg/g和20μg/g剂量腹腔注射人工合成的NKL抗菌肽；空白组和嗜水气单胞菌感染组再次注射等量PBS；随后每12h观察一次，持续一周，记录每日的苏氏圆腹鲶存活情况，及时清理死鱼；试验独立重复两次；最后通过GraphPad Prism 5软件绘制存活曲线和累计存活率差异分析图。
注射人工合成的NKL抗菌肽后对感染嗜水气单胞菌的苏氏圆腹鲶存活率的影响结果如图4所示；其中，图a为苏氏圆腹鲶的存活曲线，图b为苏氏圆腹鲶的累计存活率；图中，Mock：空白组，腹腔注射等量PBS；A.hydrophila：嗜水气单胞菌感染组；Penicillin andStreptomycin(10μg/g)+A.hydrophila：抗生素注射组，嗜水气单胞菌感染后，按10μg/g剂量注射青霉素-链霉素合剂；NKL(1μg/g)+A.hydrophila：NKL低剂量组，嗜水气单胞菌感染后，按1μg/g剂量注射人工合成的NKL抗菌肽；NKL(20μg/g)+A.hydrophila：NKL高剂量组，嗜水气单胞菌感染后，按20μg/g剂量注射人工合成的NKL抗菌肽；**p＜0.05。由图4a所示结果可知，在注射后的第1天，除空白组外，各组的苏氏圆腹鲶均出现了死亡情况，死亡苏氏圆腹鲶均出现腹鳍基部出血，肛门红肿出血以及腹水等嗜水气单胞菌感染症状，剖检发现死亡个体存在腹水以及肝脾肿胀等症状；另在试验期间，空白组的18尾苏氏圆腹鲶均存活，平均存活率为100％，而嗜水气单胞菌感染组仅存活5尾，平均存活率为27.7％，抗生素组、NKL低剂量组和NKL高剂量组的平均存活率分别为83.3％、38.9％和66.7％。通过计算组内重复的差异水平，进行组间差异分析，结果如图4b所示，抗生素组和NKL高剂量组的存活率显著高于嗜水气单胞菌感染组(p＜0.05)，NKL低剂量组和嗜水气单胞菌感染组存活率并无显著差异(p＞0.05)。以上结果表明，NKL人工合成肽段能显著增加嗜水气单胞菌感染后苏氏圆腹鲶存活率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽及其编码基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Lys Ala Lys Leu Met Lys Val Cys Asp Ser Ile Gly Phe Leu Arg
1 5 10 15
Ser Leu Cys Lys Lys Met Ile Thr Lys Tyr Leu Gly Thr Leu Val Glu
20 25 30
Glu Leu Ser Thr Thr Gly
35
<210> 2
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attaaagcaa aactgatgaa agtctgtgat tcaatcggat tcctgcgaag tctctgtaag 60
aaaatgatta ccaagtacct gggtaccttg gtggaggaac tttctaccac aggt 114
Claims (10)
1.一种苏氏圆腹鲶NKL抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述抗菌肽的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.权利要求1所述抗菌肽或权利要求2所述基因在制备抗大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌的制剂中的应用。
4.权利要求1所述抗菌肽或权利要求2所述基因在制备预防细菌性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述细菌性疾病是由大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌引发。
5.权利要求1所述抗菌肽或权利要求2所述基因在制备治疗细菌性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述细菌性疾病是由大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌引发。
6.一种抗大肠杆菌和/或哈维氏弧菌的制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述抗菌肽，所述抗菌肽的浓度为62.5μmol/L～125μmol/L。
7.一种抗嗜水气单胞菌的制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述抗菌肽，所述抗菌肽的浓度为250μmol/L～500μmol/L。
8.一种用于预防/治疗细菌性疾病的药物，其特征在于，所述药物中含有权利要求1所述抗菌肽，所述细菌性疾病是由大肠杆菌、嗜水气单胞菌和/或哈维氏弧菌引发。
9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述细菌性疾病为鱼类细菌性败血症。
10.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述抗菌肽的用量为20μg/g～50μg/g。
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