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CN114917367A - Lhx2在促进中枢系统神经元的损伤修复再生中的应用 - Google Patents

Lhx2在促进中枢系统神经元的损伤修复再生中的应用 Download PDF

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CN114917367A
CN114917367A CN202110613980.2A CN202110613980A CN114917367A CN 114917367 A CN114917367 A CN 114917367A CN 202110613980 A CN202110613980 A CN 202110613980A CN 114917367 A CN114917367 A CN 114917367A
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CN
China
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protein
lhx2
nucleic acid
acid molecule
sequence
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Application number
CN202110613980.2A
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刘长梅
李长平
滕兆乾
刘佩佩
杜洪震
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Original Assignee
Institute of Zoology of CAS
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Abstract

本发明公开了LHX2在促进中枢系统神经元的损伤修复再生中的应用。本发明采用先在视网膜神经节细胞中稳定表达LHX2蛋白，然后利用视神经损伤模型对小鼠神经神经进行急性损伤，再通过神经元特性行示踪技术追踪神经元再生轴突，发现视网膜神经节细胞中表达LHX2蛋白可以显著促进细胞轴突损伤后再生；并且采用模拟临床的方法，在视神经损伤同时表达LHX2蛋白，发现LHX2蛋白也可以显著促进神经元轴突再生；将LHX2蛋白和CNTF共同作用，可以强有力促进神经元轴突损伤再生。因此LHX2以及LHX2蛋白和CNTF蛋白的组合可以用于促进中枢系统神经元的损伤修复再生，进一步可用于治疗视神经损伤，具有很好的应用前景。

Description

LHX2在促进中枢系统神经元的损伤修复再生中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，LHX2在促进中枢系统神经元的损伤修复再生中的应用。
背景技术
中枢神经系统(central nervous system，CNS)是哺乳动物神经系统的主体部分，其损伤后造成神经细胞受损、缺失或死亡，使得神经功能严重受损而导致瘫痪、失明、智力障碍或昏迷，甚至死亡。在再生医学研究领域，治疗神经系统的损伤,尤其是中枢神经系统的损伤仍旧是一个巨大的挑战。中枢神经系统的损伤，如脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风、视神经损伤和神经退行性疾病以及其它多种神经系统疾病，通常会导致神经元大量死亡，存活的神经元不能进行再生和突触连接的重建，从而导致神经系统功能无法回复。
视觉系统是中枢神经系统的重要组成部分，其中视神经是大脑通过眼睛接受外部光学信号的唯一途径。视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)是位于视网膜最内层的一群中枢神经系统的神经元，RGCs轴突向内汇聚成束形成视神经，向大脑传递视觉信号。但是，随着年龄的增长，工作的压力和生活环境的变化等多种因素造成诸多视觉系统疾病，如青光眼和视神经炎等，致使视神经发生不可逆性损伤。而且，视网膜神经节细胞在发育成熟过程中逐渐失去再生能力，导致视神经损伤后(外伤或退行性变性)无法再生及重建视觉传导环路，最终导致永久失明。
由于视觉系统和视神经结构和位置的特殊性，视神经损伤模型用于研究不同神经元提高内在再生能力具有诸多优势：一，根据文献报道小鼠视网膜中可能存在约46种具有不同形态和生理功能的神经节细胞，其中代表性标志物如spp1,Tbr1,Foxp1,Opn4等，并且许多细胞类型在损伤模型中表现不同的存活状态和轴突再生能力；二，所有的视网膜神经节细胞处于同样的微环境；三，视神经节细胞所有的轴突汇聚形成视神经通过视交叉连接大脑，可以对所有视神经节细胞轴突同时进行损伤。
LHX2(LIM homeobox protein 2)是LIM蛋白家族成员之一，LIM蛋白是一类富含半胱氨酸且分子结构中具有一个或多个锌指结构的蛋白家族。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗视神经损伤，尤其是如何促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了由LHX2蛋白质与CNTF蛋白质组成的蛋白质组合的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品；
所述LHX2蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述CNTF蛋白质为如下C1)、C2)或C3)：
C1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；
C2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)或C1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。上述C2)中的蛋白质，为与序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)与C2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的LHX2蛋白质。上述C2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3所示的DNA分子编码序列4所示的CNTF蛋白质。
本发明还提供了由所述LHX2蛋白质含量或活性的物质与调控所述CNTF蛋白质含量或活性的物质组成的物质组合或调控所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
上述应用中，所述调控所述LHX2蛋白质含量或活性的物质可为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述LHX2蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系、或含有B3)所述重组载体的细胞系。
所述调控所述CNTF蛋白质含量或活性的物质可为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码所述CNTF蛋白质的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的细胞系、或含有D2)所述表达盒的细胞系或含有D3)所述重组载体的细胞系。
所述调控所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质可为下述E1)至E4)中的任一种：
E1)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的表达盒；
E2)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的重组载体、或含有E1)所述表达盒的重组载体；
E3)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E1)所述表达盒的重组微生物、或含有E2)所述重组载体的重组微生物；
E4)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的细胞系、或含有E1)所述表达盒的细胞系、或含有E2)所述重组载体的细胞系。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列1所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述LHX2的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述LHX2的cDNA分子或DNA分子。
D1)所述核酸分子可为如下d11)或d12)或d13)或d14)：
d11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；
d12)序列表中序列3所示的DNA分子；
d13)与d11)或d12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CNTF的cDNA分子或DNA分子；
d14)在严格条件下与d11)或d12)或d13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述CNTF的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码LHX2或CNTF蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的LHX2或CNTF蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码LHX2或CNTF蛋白质且具有LHX2或CNTF蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码LHX2蛋白质的核酸分子的表达盒(LHX2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达LHX2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动LHX2基因转录的启动子，还可包括终止LHX2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
D2)所述的含有编码CNTF蛋白质的核酸分子的表达盒(CNTF基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达CNTF蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动CNTF基因转录的启动子，还可包括终止CNTF基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
E1)所述的含有编码LHX2蛋白质的核酸分子与CNTF蛋白质的核酸分子的表达盒(LHX2和CNTF基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达LHX2和CNTF蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动LHX2基因和CNTF基因转录的启动子，还可包括终止LHX2基因和CNTF基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述LHX2基因表达盒和/或CNTF基因表达盒的重组载体。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为质粒pAAV-CAG-GFP。所述病毒载体具体可为腺相关病毒载体。
B3)所述重组载体具体可为AAV2-LHX2载体，所述AAV2-LHX2载体为将质粒pAAV-CAG-GFP的BamHI和EcoRI识别序列间的EGFP基因替换为序列表中序列1所示的LHX2基因得到的重组载体。所述AAV2-LHX2载体能表达序列表中序列2所示的LHX2蛋白质。进一步，B3)所述重组载体具体可为利用所述AAV2-LHX2载体与pAAV2/2、pAdDeltaF6得到的腺相关病毒载体。
D3)所述重组载体具体可为AAV2-CNTF载体，所述AAV2-CNTF载体为将质粒pAAV-CAG-GFP的BamHI和EcoRI识别序列间的小DNA片段替换为序列表中序列3所示的CNTF基因得到的重组载体。所述AAV2-CNTF载体能表达序列表中序列4所示的CNTF蛋白质。进一步，B3)所述重组载体具体可为利用所述AAV2-CNTF载体与pAAV2/2、pAdDeltaF6得到的腺相关病毒载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述应用中，所述细胞系不包括繁殖材料。
本发明还提供了所述LHX2蛋白质的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
本发明还提供了所述调控所述LHX2蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
具有如下X1或X2功能的物质，所述物质的活性成分为所述蛋白质组合，或所述物质组合，或所述调控所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质，或所述LHX2蛋白质，或所述调控所述LHX2蛋白质含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
所述蛋白质组合，或所述物质组合，或所述调控所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质，或所述LHX2蛋白质，或所述调控所述LHX2蛋白质含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。
本发明采用腺相关病毒技术先在视网膜神经节细胞中稳定表达LHX2蛋白，然后利用视神经损伤模型对小鼠神经神经进行急性损伤，再通过神经元特性行示踪技术追踪神经元再生轴突，发现视网膜神经节细胞中表达LHX2蛋白可以显著促进细胞轴突损伤后再生；并且采用模拟临床的方法，在视神经损伤同时表达LHX2蛋白，发现LHX2蛋白也可以显著促进神经元轴突再生；将LHX2蛋白和CNTF(Ciliary Neurotrophic Factor，睫状神经营养因子)共同作用，可以强有力促进神经元轴突损伤再生。因此LHX2以及LHX2蛋白和CNTF蛋白的组合可以用于促进中枢系统神经元的损伤修复再生，进一步可用于治疗视神经损伤，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为AAV2-LHX2载体质粒图谱。
图2为视神经经过四氢呋喃和BABB透明处理效果。
图3为视网膜神经节细胞表达LHX2促进轴突损伤再生。
图4为模拟临床视神经损伤同时表达LHX2促进RGCs轴突再生。
图5为LHX2和CNTF联合促进RGCs轴突损伤再生。
其中，ns表示无显著差异，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、LHX2可以促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生
一.实验动物：
4-6周龄C57鼠，北京思贝福生物技术有限公司。
二.实验过程：
一)AAV2-LHX2载体质粒构建及腺相关病毒包装
(1)AAV2-LHX2载体构建：
以小鼠视网膜组织cDNA为模板，利用LHX2编码扩增引物进行扩增，得到PCR产物，将得到的PCR产物利用BamHI和EcoRI进行双酶切，将得到的酶切产物与质粒pAAV-CAG-GFP(Addgene，#37825)经BamHI和EcoRI进行双酶切得到的载体骨架连接，将得到的序列正确的重组载体记为AAV2-LHX2载体。AAV2-LHX2载体为将质粒pAAV-CAG-GFP(Addgene，#37825)的BamHI和EcoRI识别序列间的EGFP基因替换为序列表中序列1所示的LHX2基因得到的重组载体(图1)，AAV2-LHX2载体能表达序列表中序列2所示的LHX2蛋白质。LHX2编码扩增引物如下：
正向引物F：CGGGATCCATGCTGTTCCACAGTCTGTCGG；
反向引物R：CGGAATTCTTAGAAAAGGTTGGTAAGAGTCGTTTGTG。
下文将质粒pAAV-CAG-GFP作为对照质粒，记为AAV2-Control。
(2)病毒包装及纯化：
使用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)(1mg/mL)进行质粒转染AAV-293(Procell，#CL-0019)细胞，实现AAV病毒包装。质粒使用量按照每个15cm培养皿：AAV2-LHX2或AAV2-Control载体质粒6μg，pAAV2/2(Addgene，#104963)包装质粒10μg，pAdDeltaF6(Addgene，#112867)辅助质粒12μg的用量进行转染。转染72h后提取病毒，采用15％，25％，40％，60％的碘克沙醇密度梯度离心的方法对病毒纯化浓缩，最后进行病毒滴度测定。
将由AAV2-LHX2得到的病毒记为AAV2-LHX2病毒，将由AAV2-Control得到的对照病毒记为AAV2-Control病毒。
二)病毒注射后视神经损伤
1.小鼠玻璃体腔注射：
(1)4-6周龄C57鼠，随机分为实验组和对照组，每组6只，麻醉后俯卧位固定四肢；
(2)在各小鼠眼球角膜和巩膜连接处用打孔针扎孔，尽量避免流血，棉签挤压眼球从扎孔处挤出眼内液体；
(3)采用WPI公司微量注射泵连接注射针，在打孔处进针朝向眼后方向，注射病毒，将病毒注射当天记为第1天。实验组每只小鼠注射1μL AAV2-LHX2病毒(病毒滴度约1012VG/mL)，对照组每只小鼠注射1μL AAV2-Control病毒(病毒滴度约1012VG/mL)，注射完成停针60s，使病毒在眼内充分扩散，拔出注射针，眼睛涂抹凡士林保湿。
2.视神经损伤：
(1)将完成步骤1的C57鼠正常喂养，在第14天，麻醉后俯卧位固定四肢；
(2)剪开眼球后壁靠近视神经处巩膜上的结缔组织，向下轻轻拨开视神经周边组织，可见亮白色视神经，避免出血；
(3)离视盘1-2mm处眼科显微镊轻轻夹5s，进行视神经损伤，眼睛涂抹凡士林保湿。
3.再生轴突示踪：
(1)将完成步骤2的视神经损伤的眼睛无明显炎症和出血的C57鼠，正常喂养，在第26天，麻醉后俯卧位固定四肢；
(2)在小鼠眼球角膜和巩膜连接处用打孔针扎孔，尽量避免流血，棉签挤压眼球从扎孔处挤出眼内液体；
(3)采用WPI公司微量注射泵连接注射针，在打孔处进针朝向眼后方向，每只小鼠注射1μL Cholera toxin subunit B 555(CTB555，Thermo Fisher,C34776)(神经元特异性示踪剂)，注射完成停针60s，使药物液体在眼内充分扩散，拔出注射针，眼睛涂抹凡士林保湿。
4.小鼠灌流剥离视神经和眼球
(1)麻醉：第28天，将完成步骤3的小鼠按照小鼠体重10g/0.1mL 1％戊巴比妥钠在小鼠腹腔内注射麻醉剂，待2-3min后小鼠麻醉开始灌流；
(2)准备：将1×PBS和4％PFA置于冰盒中，准备15mL离心管，管中加入3-4mL4％PFA，置于冰盒上；
(3)调节灌流泵，使灌流泵管道充满PBS；
(4)手术位定位：小鼠麻醉后将其用针头固定在泡沫板上(用针头插住四肢)喷洒少许75％乙醇灭菌。一只手用尖镊夹住剑突上皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔一小口，纵剪，挑剪开胸，剪掉心脏上方肋骨，使心脏完全暴露；
(5)弯镊夹住固定心脏，将注射针头插入小鼠左心室，同时剪破右心房上心窦，使血液流出。打开灌流泵，灌注15-20mL PBS；
(6)待流出血液近无色，且肝脏变为白色，改用4％PFA灌流固定，当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象，灌注30-40mL PFA，至小鼠身体完全僵直；
(7)将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。
(8)视神经及眼球剥离：
A.用剪刀剪下头部，剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。
B.将头盖骨小心剥开，露出白色大脑。
C.将大脑轻轻抬起，可看待连接脑底部和眼睛的两根明亮的视神经，贴着大脑底部剪开，取下大脑充分暴露视神经。
D.轻轻拨开眼睛和视神经连接的组织，剥离出眼睛和视神经。将剥离的眼睛和视神经在体式镜下玻璃周边结缔组织，然后浸泡在4％PFA中，放入4℃冰箱，过夜固定。
5.小鼠视神经脱水透明：
(1)将步骤4中4％PFA中4℃过夜的视神经依次采用50％，70％，80％，100％和100％四氢呋喃水溶液梯度脱水，每个梯度20min，注意避光；
(2)将Benzyl alcohol(BA，Sigma-Aldrich，305197)和Benzyl benzoate(BB，Sigma-Aldrich，B6630)按照BA：BB＝1：2比例混合，得到BABB液，将(1)中视神经在BABB液中进行透明处理20min，然后将透明完视神经保存于-20℃冰箱，待激光共聚焦显微镜成像。
视神经脱水透明结果如图2所示，图2中，左图：在空气中透明前组织；中间图：在空气中透明前组织；右图：透明后储存于BABB液，黑色箭头表明几乎完全透明。
各组小鼠的结果如图3所示，LHX2表达可以促进RGCs轴突损伤再生。图3为距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.0mm RGCs再生轴突定量分析，实验组距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.0mm RGCs再生轴突数分别为161、109、66、43、40、28、12、8，对照组距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.0mmRGCs再生轴突数分别为105、2、0、0、0、0、0、0，实验组距离损伤点1.75mm以内的RGCs再生轴突量均显著高于对照组。
三)病毒注射时视神经损伤
1.小鼠玻璃体腔注射与视神经损伤：
(1)4-6周龄C57鼠，随机分为实验组和对照组，每组6只，麻醉后俯卧位固定四肢；
(2)剪开眼球后壁靠近视神经处巩膜上的结缔组织，向下轻轻拨开视神经周边组织，可见亮白色视神经，避免出血；
(3)离视盘1-2mm处眼科显微镊轻轻夹5s，进行视神经损伤；
(4)在各小鼠眼球角膜和巩膜连接处用打孔针扎孔，尽量避免流血，棉签挤压眼球从扎孔处挤出眼内液体；
(5)采用WPI公司微量注射泵连接注射针，在打孔处进针朝向眼后方向，注射病毒，将病毒注射当天记为第1天。实验组每只小鼠注射1μL AAV2-LHX2病毒(病毒滴度约1012VG/mL)，对照组每只小鼠注射1μL AAV2-Control病毒(病毒滴度约1012VG/mL)，注射完成停针60s，使病毒在眼内充分扩散，拔出注射针，眼睛涂抹凡士林保湿。
2.再生轴突示踪：
在第12天，进行再生轴突示踪，步骤同步骤(二)中3。
3.小鼠灌流剥离视神经和眼球
在第14天，进行小鼠灌流剥离视神经和眼球，步骤同步骤(二)中4。
4.小鼠视神经脱水透明
将步骤3中固定后视神经进行脱水透明，步骤同步骤(二)中5。
结果如图4所示，结果表明视神经损伤同时表达LHX2也可以促进RGCs轴突损伤再生。图4中，A.视神经损伤同时表达LHX2促进再生的时间流程图，实验组小鼠视神经损伤同时眼球玻璃体注射AAV2-LHX2病毒，对照组注射AAV2-Control病毒，损伤后14天灌流取视神经，灌流前2天玻璃体腔注射示踪剂CTB555；B.视神经损伤同时在实验组和对照组相较，LHX2的表达可以显著促进RGCs轴突再生；D.距离视神经损伤位点0.5和1.0mm处轴突再生放大效果；D.距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75mm RGCs再生轴突定量分析，实验组距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75mm RGCs再生轴突数分别为207、139、111、70、50、32、24，对照组距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75mm RGCs再生轴突数分别为76、10、0、0、0、0、0，实验组距离损伤点0.75mm以内的RGCs再生轴突量均显著高于对照组。
实施例2、LHX2和CNTF联合可以促进RGCs轴突损伤再生
一.实验动物：
4-6周龄C57鼠，北京思贝福生物技术有限公司。
二.实验过程：
一)AAV2-CNTF载体质粒构建及腺相关病毒包装
(1)AAV2-CNTF载体构建：
将质粒pAAV-CAG-GFP(Addgene，#37825)的BamHI和EcoRI识别序列间的小DNA片段替换为序列表中序列3所示的CNTF基因，得到重组载体，将得到的重组载体记为AAV2-CNTF载体，AAV2-CNTF载体能表达序列表中序列4所示的CNTF蛋白质。
(2)病毒包装及纯化：
使用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)(1mg/mL)进行质粒转染AAV-293(Procell，#CL-0019)细胞，实现AAV病毒包装。质粒使用量按照每个15cm培养皿：AAV2-CNTF载体质粒6μg，pAAV2/2(Addgene，#104963)包装质粒10μg，pAdDeltaF6(Addgene，#112867)辅助质粒12μg的用量进行转染。转染72h后提取病毒，采用15％，25％，40％，60％的碘克沙醇密度梯度离心的方法对病毒纯化浓缩，最后进行病毒滴度测定。
将由AAV2-CNTF得到的病毒记为AAV2-CNTF病毒。
二)病毒注射时视神经损伤
按照实施例1中步骤三)的方法，将AAV2-LHX2病毒替换为AAV2-LHX2/AAV2-CNTF病毒(即AAV2-LHX2病毒与AAV2-CNTF病毒等量混合得到的混合病毒)，将AAV2-Control病毒替换为AAV2-CNTF病毒，其他步骤均不变，检测LHX2与CNTF联合对RGCs轴突损伤再生的影响。
结果如图5所示，LHX2和CNTF组合可以促进RGCs轴突损伤再生。距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75mm RGCs再生轴突定量分析发现，实验组(注射AAV2-LHX2/AAV2-CNTF病毒)距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75mm RGCs再生轴突数分别为318、208、103、43、12、5、2，对照组(注射AAV2-CNTF病毒)距离损伤点0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75mm RGCs再生轴突数分别为162、70、32、15、10、8、9，实验组距离损伤点0.75mm以内的RGCs再生轴突量均显著高于对照组。
进一步比较实施例1步骤三)实验组与实施例2步骤二)实验组的结果发现，本实施例实验组(即注射AAV2-LHX2/AAV2-CNTF病毒)距离损伤点0.75mm以内的RGCs再生轴突量均显著高于实施例1中步骤三)实验组(即注射AAV2-LHX2病毒)，说明LHX2和CNTF组合后对RGCs轴突损伤再生的促进作用也高于单独的LHX2。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国科学院动物研究所
<120> LHX2在促进中枢系统神经元的损伤修复再生中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atgctgttcc acagtctgtc gggccccgag gtgcacgggg tcatcgacga gatggaccgc 60
agggccaaga gcgaggctcc ggccatcagc tccgccatcg accgcggcga cacggagacg 120
accatgccgt ccatcagcag tgaccgggca gcgttgtgtg ctggctgtgg gggcaagatc 180
tctgaccgct actacctgct ggcagtagac aagcaatggc acatgcgctg cctcaagtgc 240
tgtgaatgca agctcaacct ggagtcggaa ctcacctgct tcagcaagga tggcagcatc 300
tactgcaaag aagactacta caggcggttc tctgtgcagc gctgcgcccg ctgccacctg 360
ggcatctcgg cctcagagat ggtgatgcgc gctcgggact tggtttatca cctcaactgc 420
ttcacatgca caacgtgtaa caagatgctg acgaccggcg accatttcgg catgaaggac 480
agcctggtct attgccgctt gcacttcgag gctctgctgc agggcgaata cccagcacac 540
tttaaccatg ccgacgtggc agcggcggca gccgcagccg cagcagctaa gagtgcagga 600
ttgggctcag ccggggctaa tccgctgggt cttccctact acaacggcgt gggcactgtg 660
caaaagggga ggccgagaaa gcgcaagagt ccaggacccg gggcagatct ggcagcttac 720
aacgccgcgc ttagctgtaa cgagaacgat gctgaacacc tggatcgtga ccagccctac 780
cccagcagcc aaaagacaaa gcgcatgcgc acctccttca agcaccacca gcttcggaca 840
atgaagtctt actttgccat taaccacaat cccgatgcca aggacttgaa gcagcttgcg 900
caaaagaccg gcctcaccaa gagagtcctc caggtctggt ttcagaatgc ccgggccaag 960
ttcaggcgca accttttacg gcaggaaaac acgggcgtgg acaagacgtc agatgccacg 1020
ctgcagacag ggacgccgtc agggcccgcc tcggagctgt ccaacgcctc gctcagcccc 1080
tccagcacgc ctacaaccct cacagacttg actagcccca ccctgccgac tgtgacgtca 1140
gtcttaactt ctgtgcctgg caacctggag ggccacgagc cccacagccc ttcacaaacg 1200
actcttacca accttttcta a 1221
<210> 2
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Leu Phe His Ser Leu Ser Gly Pro Glu Val His Gly Val Ile Asp
1 5 10 15
Glu Met Asp Arg Arg Ala Lys Ser Glu Ala Pro Ala Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Ile Asp Arg Gly Asp Thr Glu Thr Thr Met Pro Ser Ile Ser Ser Asp
35 40 45
Arg Ala Ala Leu Cys Ala Gly Cys Gly Gly Lys Ile Ser Asp Arg Tyr
50 55 60
Tyr Leu Leu Ala Val Asp Lys Gln Trp His Met Arg Cys Leu Lys Cys
65 70 75 80
Cys Glu Cys Lys Leu Asn Leu Glu Ser Glu Leu Thr Cys Phe Ser Lys
85 90 95
Asp Gly Ser Ile Tyr Cys Lys Glu Asp Tyr Tyr Arg Arg Phe Ser Val
100 105 110
Gln Arg Cys Ala Arg Cys His Leu Gly Ile Ser Ala Ser Glu Met Val
115 120 125
Met Arg Ala Arg Asp Leu Val Tyr His Leu Asn Cys Phe Thr Cys Thr
130 135 140
Thr Cys Asn Lys Met Leu Thr Thr Gly Asp His Phe Gly Met Lys Asp
145 150 155 160
Ser Leu Val Tyr Cys Arg Leu His Phe Glu Ala Leu Leu Gln Gly Glu
165 170 175
Tyr Pro Ala His Phe Asn His Ala Asp Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Lys Ser Ala Gly Leu Gly Ser Ala Gly Ala Asn Pro
195 200 205
Leu Gly Leu Pro Tyr Tyr Asn Gly Val Gly Thr Val Gln Lys Gly Arg
210 215 220
Pro Arg Lys Arg Lys Ser Pro Gly Pro Gly Ala Asp Leu Ala Ala Tyr
225 230 235 240
Asn Ala Ala Leu Ser Cys Asn Glu Asn Asp Ala Glu His Leu Asp Arg
245 250 255
Asp Gln Pro Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Thr Lys Arg Met Arg Thr Ser
260 265 270
Phe Lys His His Gln Leu Arg Thr Met Lys Ser Tyr Phe Ala Ile Asn
275 280 285
His Asn Pro Asp Ala Lys Asp Leu Lys Gln Leu Ala Gln Lys Thr Gly
290 295 300
Leu Thr Lys Arg Val Leu Gln Val Trp Phe Gln Asn Ala Arg Ala Lys
305 310 315 320
Phe Arg Arg Asn Leu Leu Arg Gln Glu Asn Thr Gly Val Asp Lys Thr
325 330 335
Ser Asp Ala Thr Leu Gln Thr Gly Thr Pro Ser Gly Pro Ala Ser Glu
340 345 350
Leu Ser Asn Ala Ser Leu Ser Pro Ser Ser Thr Pro Thr Thr Leu Thr
355 360 365
Asp Leu Thr Ser Pro Thr Leu Pro Thr Val Thr Ser Val Leu Thr Ser
370 375 380
Val Pro Gly Asn Leu Glu Gly His Glu Pro His Ser Pro Ser Gln Thr
385 390 395 400
Thr Leu Thr Asn Leu Phe
405
<210> 3
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
atggctttcg cagagcaatc acctctgacc cttcaccgcc gggacctctg tagccgctct 60
atctggctag caaggaagat tcgttcagac ctgactgctc ttatggaatc ttatgtaaaa 120
catcaaggcc tgaataaaaa tatcagcctt gactcagtgg atggtgtacc agtggcaagc 180
actgatcgct ggagtgagat gactgaggca gagcgactcc aagagaacct ccaggcttac 240
cgtaccttcc aagggatgtt aaccaagctt ttagaagacc agagagtgca tttcaccccg 300
actgaaggtg acttccatca ggcaatacat actcttacgc tccaagtttc tgccttcgcc 360
taccagctag aggagttaat ggcgcttctg gaacagaagg tccctgaaaa agaggctgat 420
gggatgcctg tcacaattgg agatggtggc ctctttgaga agaagctgtg gggcttgaag 480
gtccttcaag agctttcaca gtggactgtg aggtctatcc atgacctccg tgtcatttct 540
tctcatcaca tgggaatctc agcacatgag agccattatg gggccaagca aatgtag 597
<210> 4
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Met Ala Phe Ala Glu Gln Ser Pro Leu Thr Leu His Arg Arg Asp Leu
1 5 10 15
Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Ala Leu Met Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Val Asp Gly Val Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
50 55 60
Ser Glu Met Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
65 70 75 80
Arg Thr Phe Gln Gly Met Leu Thr Lys Leu Leu Glu Asp Gln Arg Val
85 90 95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
100 105 110
Thr Leu Gln Val Ser Ala Phe Ala Tyr Gln Leu Glu Glu Leu Met Ala
115 120 125
Leu Leu Glu Gln Lys Val Pro Glu Lys Glu Ala Asp Gly Met Pro Val
130 135 140
Thr Ile Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145 150 155 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
165 170 175
Arg Val Ile Ser Ser His His Met Gly Ile Ser Ala His Glu Ser His
180 185 190
Tyr Gly Ala Lys Gln Met
195

Claims (10)

1.由LHX2蛋白质与CNTF蛋白质组成的蛋白质组合的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品；
所述LHX2蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述CNTF蛋白质为如下C1)、C2)或C3)：
C1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；
C2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
C3)在C1)或C2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.由调控权利要求1中所述LHX2蛋白质含量或活性的物质与调控权利要求1中所述CNTF蛋白质含量或活性的物质组成的物质组合或调控权利要求1中所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述调控权利要求1中所述LHX2蛋白质含量或活性的物质为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述LHX2蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系、或含有B3)所述重组载体的细胞系；
所述调控权利要求1中所述CNTF蛋白质含量或活性的物质为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码权利要求1中所述CNTF蛋白质的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的细胞系、或含有D2)所述表达盒的细胞系或含有D3)所述重组载体的细胞系；
所述调控权利要求1中所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质为下述E1)至E5)中的任一种：
E1)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的表达盒；
E2)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的重组载体、或含有E1)所述表达盒的重组载体；
E3)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E1)所述表达盒的重组微生物、或含有E2)所述重组载体的重组微生物；
E4)含有B1)所述核酸分子与D1)所述核酸分子的细胞系、或含有E1)所述表达盒的细胞系、或含有E2)所述重组载体的细胞系。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列1所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述LHX2的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述LHX2的cDNA分子或DNA分子；
D1)所述核酸分子为如下d11)或d12)或d13)或d14)：
d11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；
d12)序列表中序列3所示的DNA分子；
d13)与d11)或d12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述CNTF的cDNA分子或DNA分子；
d14)在严格条件下与d11)或d12)或d13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述CNTF的cDNA分子或DNA分子。
5.权利要求1中所述LHX2蛋白质的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
6.调控权利要求1中所述LHX2蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述调控权利要求1中所述LHX2蛋白质含量或活性的物质为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述LHX2蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列1所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述LHX2的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述LHX2的cDNA分子或DNA分子。
9.具有如下X1或X2功能的物质，其活性成分为权利要求1中所述蛋白质组合，或权利要求2-4中任一所述物质组合，或权利要求2-4中任一所述调控所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质，或权利要求1中所述LHX2蛋白质，或权利要求2-4中任一所述调控所述LHX2蛋白质含量或活性的物质：
X1、制备促进视网膜神经节细胞轴突损伤再生产品；
X2、制备治疗和/或预防视神经损伤产品。
10.权利要求1中所述蛋白质组合，或权利要求2-4中任一所述物质组合，或权利要求2-4中任一所述调控所述LHX2蛋白质与所述CNTF蛋白质含量或活性的物质，或权利要求1中所述LHX2蛋白质，或权利要求2-4中任一所述调控所述LHX2蛋白质含量或活性的物质。
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