CN114902960B - 一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法和培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法和培养基，所述方法包括：将成熟烟草种子的浸泡和消毒处理后，接种至愈伤诱导培养基进行光温诱导培养，获得出愈率高的愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基以MS作为基础培养基且添加了2,4‑D和6‑BA：所述2,4‑D浓度为1.0mg/L时，6‑BA的浓度为0.1～2.0mg/L；或者所述6‑BA浓度为1.0mg/L时，2,4‑D的浓度为0.1～2.0mg/L。本发明打破传统的以离体叶片作为主要材料进行展开的烟草植物组织培养再生体系，能够快速便捷地从烟草种子中获得愈伤组织，并可用于遗传转化和丛生芽的培养等后续实验。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法和培养基。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L.)，茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)一年生草本植物，不仅是一种重要的经济作物，而且常常作为模式植物并在植物生命科学领域中发挥着重要的作用，具有很高的科学研究价值。
目前，通过组培的手段获得烟草愈伤组织的方法有很多，其中较为成熟也是较为常用的方法是离体叶片诱导法，即以烟草的离体叶片组织作为主要材料，在添加合适的激素配比后，诱导其脱分化从而得到愈伤组织。
但是，这种离体叶片诱导法存在着操作繁琐、污染率高、出现机械伤口易导致褐化等一系列不足之处。此外，离体叶片组织一般来自于对种子的无菌培养，前期花费的时间也较长。
因此，如何制备一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，成为亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明目的是提供一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，打破传统的以离体叶片作为主要材料进行展开的烟草植物组织培养再生体系，提供一种全新、便捷、稳定的获得烟草愈伤组织的方法，为组培相关研究工作奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，所述方法包括：
将成熟烟草种子的浸泡和消毒处理后，接种至愈伤诱导培养基进行光温诱导培养，获得出愈率高的愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基以MS作为基础培养基且添加了2,4-D和6-BA：
所述2,4-D浓度为1.0mg/L时，6-BA的浓度为0.1～2.0mg/L；
或者所述6-BA浓度为1.0mg/L时，2,4-D的浓度为0.1～2.0mg/L。
进一步地，所述2,4-D浓度为1.0mg/L时，6-BA的浓度为0.5～1.0mg/L。
进一步地，所述6-BA浓度为1.0mg/L时，2,4-D的浓度为0.5～1.5mg/L。
进一步地，所述光温诱导培养的条件为：光照周期14～16h/天，光照强度100μmolm-2s-2，培养温度为：25±1℃，培养时间为18～24天。
进一步地，所述成熟烟草种子的浸泡和消毒处理，包括：
将新鲜烟草成熟种子加水浸泡，后用无菌水漂洗、用84消毒液浸泡消毒，再用无菌水漂洗。
在本发明的第二方面，提供了一种高效诱导烟草种子愈伤组织的培养基，所述培养基为愈伤诱导培养基，所述愈伤诱导培养基以MS作为基础培养基且添加了2,4-D和6-BA：
所述2,4-D浓度为1.0mg/L时，6-BA的浓度为0.1～2.0mg/L；
或者所述6-BA浓度为1.0mg/L时，2,4-D的浓度为0.1～2.0mg/L。
进一步地，所述2,4-D浓度为1.0mg/L时，6-BA的浓度为0.5～1.0mg/L。
进一步地，所述6-BA浓度为1.0mg/L时，2,4-D的浓度为0.5～1.5mg/L。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，区别于传统的以离体成熟组织如叶片作为主要材料进行的组培再生体系，本发明是以烟草成熟种子作为主要材料进行展开，具有整体周期短、操作简单、消毒方式简便、污染率低、不产生机械性伤口等诸多优势，另外，在合适配比的激素作用下，其出愈率一般为100％，且最终获得的愈伤组织通常呈淡绿色半透明堆块状，在质量和体积上均达到了一定的理想值。
本发明提供的一种高效诱导烟草种子愈伤组织的培养基，所用愈伤诱导培养基以MS作为基础培养基，当2,4-D浓度为1.0mg/L时，0.1～2.0mg/L 6-BA均能较好地诱导烟草种子形成愈伤组织；其中，又以0.5～1.0mg/L 6-BA表现最佳；当6-BA浓度为1.0mg/L时，0.1～2.0mg/L 2,4-D均能较好地诱导烟草种子形成愈伤组织；其中，又以0.5～1.5mg/L 2,4-D表现最佳。能够快速便捷地从烟草种子中获得愈伤组织，并可用于遗传转化和丛生芽的培养等后续实验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为1mg/L 2,4-D与不同6-BA浓度配比下的愈伤生长情况(21天)；其中，图1a:为MS+1.0mg/L 2,4-D；图1b为MS+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA；图1c为MS+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA；图1d为MS+1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA；图1e为MS+1.0mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA；图1f为MS+1.0mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA；
图2为1mg/L 6-BA与不同2,4-D浓度配比下的愈伤生长情况(21天)；其中图2a为MS+1.0mg/L 6-BA；图2b为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D；图2c为MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L 2,4-D；图2d为MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L 2,4-D；图2e为MS+1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L 2,4-D。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法和培养基进行详细说明。
实施例1
本发明实施例提供一种直接诱导烟草成熟种子愈伤组织的方法，包括如下步骤：
1、烟草种子的浸泡和消毒处理：具体地：
将适量的新鲜烟草成熟种子加水浸泡，并放置于4℃冰箱低温处理过夜，低温处理最长时间不超过7天为宜；将浸泡好的烟草种子转移至超净工作台，先用无菌水漂洗2次；用84消毒液浸泡消毒8min，在第4min换一次新鲜84消毒液，消毒期间上下颠倒EP管或用移液枪吸打混匀；之后，用无菌水漂洗6次，即可完成对烟草种子的消毒。
2、接种至愈伤诱导培养基：具体地：
首先制备1L不含琼脂的MS培养基溶液，其中蔗糖占3％，pH 5.8～6.0；使用50mL量筒将该1L MS培养基溶液分装至果酱瓶中，每瓶分装50mL，接着为每瓶果酱瓶添加0.4g琼脂(琼脂占0.8％)；使用微量移液枪向每个培养瓶中添加适量的2,4-D激素母液至终浓度为1.0mg/L和6-BA激素母液至终浓度为1.0mg/L，以配制成不同激素配比的愈伤诱导培养基；最后对培养基进行121℃高温高压蒸汽灭菌20min，灭菌完毕后取出并轻摇果酱瓶使得瓶中各组分得到充分混匀，室温冷却备用。
3、光温诱导培养愈伤组织：具体培养条件为：
光照周期16h/天，光照强度100μmol m-2s-2，培养温度调节至25±1℃，培养时间为三周左右。
4、观察记录愈伤组织的生长情况。
对比例1
该对比例中，愈伤诱导培养基中激素仅添加1.0mg/L 2,4-D，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
该对比例中，愈伤诱导培养基中激素仅添加1.0mg/L 6-BA，其他步骤与实施例1相同。
实施例2
该对比例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA，其他步骤与实施例1相同。
实施例3
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA，其他步骤与实施例1相同。
实施例4
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA，其他步骤与实施例1相同。
实施例5
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 2,4-D+2.0mg/L 6-BA，其他步骤与实施例1相同。
实施例6
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D，其他步骤与实施例1相同。
实施例7
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D，其他步骤与实施例1相同。
实施例8
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L 2,4-D，其他步骤与实施例1相同。
实施例9
该实施例中，其愈伤诱导培养基的激素配比为1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L 2,4-D，其他步骤与实施例1相同。
实验例1
测定并统计各实施例和各对比例中激素配比以及种子萌发率和出愈率如表1所示，生长情况如表2所示。
表1不同处理组中的激素配比以及种子萌发率和出愈率
注：种子萌发率＝萌发的种子数/所接种的种子数×100％，种子出愈率＝长出愈伤组织的种子数/所接种的种子数×100％，“-”表示没有数据可记录。
表2不同处理组中愈伤组织的生长情况(21天)
由表1和表2可知，本发明实施例中，在不同激素配比的愈伤诱导培养基中，新鲜的烟草成熟种子都能正常萌发，且萌发率一般为100％，而萌发的种子在合适配比的激素作用下，又能进一步被诱导出愈伤组织。
结合表2和图1可以看出，仅在1.0mg/L 2,4-D的作用下，幼苗整体出现了较为严重的玻璃化现象，并最终无法诱导出愈伤组织；在1.0mg/L 2,4-D的基础上配合使用较低浓度的6-BA(0.1mg/L 6-BA)，其玻璃化现象虽明显得到改善，但所诱导出的部分愈伤组织仍残留有根状体，且愈伤组织整体呈流沙状，可见其质量欠佳；在1.0mg/L 2,4-D的基础上适当提高6-BA的浓度(0.5～1.0mg/L 6-BA)可明显改善愈伤组织的质量，所诱导出的愈伤组织呈淡绿色半透明堆块状，其层次轮廓较为清晰，无论是在质量上还是在体积上都明显较好；在1.0mg/L 2,4-D的基础上配合使用较高浓度的6-BA(1.5～2.0mg/L 6-BA)，其愈伤组织的诱导受到了一定的抑制作用。综上可以得出最佳的6-BA浓度为1mg/L。
结合表2和图2可以看出，仅在1.0mg/L 6-BA的作用下，幼苗整体保持着相对正常的形态，但其根部短而粗壮且只带有少量的愈伤组织，诱导效果并不明显；在1.0mg/L 6-BA的基础上配合使用一定浓度的2,4-D(0.1～2.0mg/L 2,4-D)似乎都能较好地诱导愈伤组织的产生，其中以0.5～1.5mg/L的2,4-D表现最佳，愈伤组织整体较为松散，且三者之间并无明显差异；在1.0mg/L 6-BA的基础上配合使用较低浓度的2,4-D(0.1mg/L 2,4-D)，其膨胀组织整体呈淡绿色半透明球状，虽有愈伤组织的产生但带有部分的白色组织，且整体较为致密并在形态上区别于其它浓度；在1.0mg/L 6-BA的基础上配合使用较高浓度的2,4-D(2.0mg/L 2,4-D)，其愈伤组织出现了轻微的玻璃化现象。
综上可知，当2,4-D浓度为1.0mg/L时，0.1～2.0mg/L 6-BA均能较好地诱导烟草种子形成愈伤组织；其中，又以0.5～1.0mg/L 6-BA表现最佳；当6-BA浓度为1.0mg/L时，0.1～2.0mg/L 2,4-D均能较好地诱导烟草种子形成愈伤组织；其中，又以0.5～1.5mg/L 2,4-D表现最佳。综合考虑，愈伤诱导的最佳激素配比为1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA。本发明的主要优势和利用价值是能够快速便捷地从烟草种子中获得愈伤组织，并可用于遗传转化和丛生芽的培养等后续实验。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (3)
1.一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述方法包括：
将成熟烟草种子的浸泡和消毒处理后，接种至愈伤诱导培养基进行光温诱导培养，获得出愈率高的愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基以MS作为基础培养基且添加了2, 4-D和6-BA：
所述2, 4-D浓度为1.0 mg/L时，6-BA的浓度为0.1～0.5 mg/L或1.5～2.0 mg/L；
或者所述6-BA浓度为1.0 mg/L时，2, 4-D的浓度为0.1～0.5 mg/L或1.5～2.0 mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述光温诱导培养的条件为：光照周期14～16 h/天，光照强度100 μmol m-2 s-2，培养温度为25±1℃，培养时间为18～24 天。
3.根据权利要求1所述的一种高效诱导烟草种子愈伤组织的方法，其特征在于，所述成熟烟草种子的浸泡和消毒处理，包括：
将新鲜烟草成熟种子加水浸泡，后用无菌水漂洗、用84消毒液浸泡消毒，再用无菌水漂洗。
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2022
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