CN114891639B - 一种提高红景天苷含量的微生物菌株及其发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高红景天苷含量的微生物菌株及其发酵方法，利用微生物菌株对红景天药材原料进行固体发酵，该微生物菌株对红景天原料中的糖苷发酵分解，用于提高红景天苷元成分的含量；该微生物菌株为一种发酵红景天的菌株SWS‑008，其名称为Eurotiumcristatum，冠突散囊菌(金花菌)SWS‑008，保藏日期2020年3月27日，保藏号CGMCCNO：19605。该提高红景天苷含量的微生物菌株及其发酵方法，在冠状散囊菌的葡萄糖苷酶作用下，可以切断糖苷化学键，从而使红景天苷分子剥离开来，所以使红景天苷的含量有所提高，该方法的实施可以进一步提高红景天药材的药效成分，为相关企业节约成本，具有较好的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体公开一种提高红景天苷含量的微生物菌株及其发酵方法。
背景技术
红景天为景天科植物大花红景天Rhdiolacrenulata(Hook.f.etThoms.)H.Ohba的干燥根和根茎。红景天具有益气活血，通脉平喘的功能，用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘。目前健康领域确定的红景天的药理作用包括：增强免疫力，红景天苷通过改善T-细胞免疫，可提升机体对外毒的抵抗能力。消除忧郁感，红景天被用以提升人的精神状态，成为那些生活在因月份周期延长，而得不到足够阳光照射的国家和季节的人的宝贵医药。保护心血管，红景天可缓和压力所致心血管组织损伤和功能紊乱，防止继发的心脏收缩力下降，有助于心肌的稳定性收缩。
红景天苷是大花红景天的重要活性成分，其含量高低是评价其药用价值的重要指标之一。红景天苷(Salidroside)的分子式是C14H20O7，结构式如下：
红景天苷是一种由葡萄糖与酪醇苷键结合的糖苷，纯品为白色或者浅黄色粉末，易溶于水和醇类。作为红景天药材的主要药效成分，其含量即药材的质量标准。<<中华人民共和国药典>>2020版收载红景天，其红景天苷含量不得少于0.50％。由于红景天种植环境特殊，野生资源有限，其药材是根茎部分，不能续代采收，所以提高红景天苷含量的技术研究具有重要的商业价值。不同地域产的红景天药材原料中红景天苷的含量也有一定差距，中国药材公司的崔秀梅等测试发现，西藏错那地区的含量最高，可以达到2.10％左右，其它如产自云南和四川阿坝州的大概在0.80-1.29％之间，最低的是产自青海海北的只有0.58％。红景天产品厂家一般会采取更加精细的提取技术来达到制定的企业标准，该技术相对比较成熟，一般采取水提、醇提和超声微波技术。
综合后可以发现，红景天苷的含量是药材质量和价格的决定因素。本发明利用微生物发酵红景天药材原料，采用冠状散囊菌株SWS-008，制备菌丝体发酵种子液，接种到蒸汽处理的红景天药材原料中，搅拌均匀后，放置于无菌托盘中。将喷洒菌液后的红景天覆盖纱布，在无菌发酵室恒温发酵，温度28℃，保持无菌通风，通气量1L/m3/h，湿度80±5％。发酵3天，药材的表面有少量白色或者黄色的菌丝生长，用无菌不锈钢铲翻转红景天药材，使均匀，继续发酵培养。发酵至10天左右，药材的表面布满黄色菌丝和孢子，取出托盘烘干后即为发酵后的红景天。
冠状散囊菌俗称“金花”菌，来自中国传统发酵黑茶，如茯砖和普洱等，具有抗氧化、降血脂、促进肠道健康的作用，安全无毒副作用。由于冠状散囊菌可以分泌多种生物酶，尤其是葡萄糖苷酶等纤维素酶。红景天药材原料通过发酵过程后，采用相同的提取方式，其红景天苷的含量可以明显提高。红景天苷在红景天植物内的生物合成，但是有部分可能与其它化学基团键合，一般的水提和醇提不能将之分开，但是冠状散囊菌的葡萄糖苷酶作用下，可以分开这些化学键，从而使红景天苷分子剥离开来，所以使红景天苷的含量有所提高。该方法的实施可以进一步提高红景天药材的药效成分，为相关企业节约成本，具有较好的经济和社会效益，为此，提出一种提高红景天苷含量的微生物菌株及其发酵方法。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本申请旨在提供一种提高红景天苷含量的微生物菌株，利用微生物菌株对红景天药材原料进行固体发酵，该微生物菌株对红景天原料中的糖苷发酵分解，用于提高红景天苷元成分的含量；
该微生物菌株为一种发酵红景天的菌株SWS-008，其名称为Eurotiumcristatum，冠突散囊菌(金花菌)SWS-008，保藏日期2020年3月27日，保藏号CGMCCNO：19605；
优选的，该所述微生物菌株的主要生物学特征包括：菌丝有横隔，菌落上生长闭囊壳，子闭囊壳无子座，内有子囊，破碎后释放子囊孢子。
优选的，所述微生物菌株的PDA培养平板菌落为圆形黄色菌丝体，质地致密，黄色晕圈，边缘淡黄色，中央颜色较深至褐色，大于15天老化后，表面分泌黑色液体，整体菌丝体逐渐加深，至全部黑褐色。
提高红景天苷含量的微生物菌株的发酵方法，该发酵方法包括以下步骤：
S1:首先制备菌株SWS-008的种子液，于液体PDA培养基中装量100ml/300ml,pH7.0，灭菌121℃-20min，降温后备用，然后将试管中保存的SWS-008菌株的菌苔表面挑取少量，接入灭菌后的培养液中，摇床培养；
S2:红景天原料的处理与接种，红景天药材原料，切成约1cm长宽的小块，放入容器中，表面喷洒水，比例为药材：水＝4:1，使药材表面微湿，取出放入托盘，表面覆盖4层纱布，入高温蒸汽锅，105℃-5min处理，取出放入无菌室降温备用，然后将培养2天的SWS-008种子液，收集至灭菌罐中，用9倍无菌水稀释，用无菌压缩空气连接灭菌罐，使稀释菌液均匀喷洒于红景天药材表面；
S3:红景天的发酵过程，将喷洒菌液后的红景天覆盖纱布，在无菌发酵室恒温发酵，药材的表面有少量白色或者黄色的菌丝生长，用无菌不锈钢铲翻转红景天药材，使均匀，继续发酵培养，再发酵至10天左右，药材的表面布满黄色菌丝和孢子，取出托盘烘干后即为发酵后的红景天。
优选的，S1中摇床发酵温度28℃，转速140r/min，培养时间2天。
优选的，S2中药材：菌液＝20-25:1。
优选的，S3中发酵时发酵室的温度28℃，保持无菌通风，通气量1L/m3/h，湿度80±5％，发酵3天。
有益效果：该提高红景天苷含量的微生物菌株及其发酵方法，在冠状散囊菌的葡萄糖苷酶作用下，可以分开这些化学键，从而使红景天苷分子剥离开来，所以使红景天苷的含量有所提高，该方法的实施可以进一步提高红景天药材的药效成分，为相关企业节约成本，具有较好的经济和社会效益。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是实施例1步骤A中，菌株SWS-008的电镜图。
图2是实施例2步骤B中种子液的显微镜图。
图3是发酵后的红景天外表面图。
图4是实施例3步骤C中的红景天苷标品的液相图谱。
图5是实施例3步骤C中的红景天发酵后的测试液相色谱图。
保藏说明
保藏菌种归类于冠状散囊菌，拉丁名为，命名为Eurotiumcristatum，SWS-008，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏日期2020年3月27日，保藏号CGMCCNO：19605。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
本发明实施例中的附图：图中不同种类的剖面线不是按照国标进行标注的，也不对元件的材料进行要求，是对图中元件的剖视图进行区分。
请参阅图1-5，一种提高红景天苷含量的微生物菌株，利用微生物菌株对红景天药材原料进行固体发酵，该微生物菌株对红景天原料中的糖苷发酵分解，用于提高红景天苷元成分的含量；
该微生物菌株为一种发酵红景天的菌株SWS-008，其名称为Eurotiumcristatum，冠突散囊菌(金花菌)SWS-008，保藏日期2020年3月27日，保藏号CGMCCNO：19605；
其中，该所述微生物菌株的主要生物学特征包括：菌丝有横隔，菌落上生长闭囊壳，子闭囊壳无子座，内有子囊，破碎后释放子囊孢子。
其中，微生物菌株的PDA培养平板菌落为圆形黄色菌丝体，质地致密，黄色晕圈，边缘淡黄色，中央颜色较深至褐色，大于15天老化后，表面分泌黑色液体，整体菌丝体逐渐加深，至全部黑褐色。
提高红景天苷含量的微生物菌株的发酵方法，该发酵方法包括以下步骤：
S1:首先制备菌株SWS-008的种子液，于液体PDA培养基中装量100ml/300ml,pH7.0，灭菌121℃-20min，降温后备用，然后将试管中保存的SWS-008菌株的菌苔表面挑取少量，接入灭菌后的培养液中，摇床培养；
S2:红景天原料的处理与接种，红景天药材原料，切成约1cm长宽的小块，放入容器中，表面喷洒水，比例为药材：水＝4:1，使药材表面微湿，取出放入托盘，表面覆盖4层纱布，入高温蒸汽锅，105℃-5min处理，取出放入无菌室降温备用，然后将培养2天的SWS-008种子液，收集至灭菌罐中，用9倍无菌水稀释，用无菌压缩空气连接灭菌罐，使稀释菌液均匀喷洒于红景天药材表面；
S3:红景天的发酵过程，将喷洒菌液后的红景天覆盖纱布，在无菌发酵室恒温发酵，药材的表面有少量白色或者黄色的菌丝生长，用无菌不锈钢铲翻转红景天药材，使均匀，继续发酵培养，再发酵至10天左右，药材的表面布满黄色菌丝和孢子，取出托盘烘干后即为发酵后的红景天。
其中，S1中摇床发酵温度28℃，转速140r/min，培养时间2天。
其中，S2中药材：菌液＝20-25:1。
其中，S3中发酵时发酵室的温度28℃，保持无菌通风，通气量1L/m3/h，湿度80±5％，发酵3天。
实施例1、菌种的斜面培养
a、仪器设备和试剂
无菌室及超净工作台、灭菌锅、试管、茄子瓶、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨及琼脂等。
b、培养基制备
按如下配方制备培养基(金花菌培养基)：PDA培养基、琼脂2％；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.8，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
c、菌种活化与扩大培养
用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养72小时，存放备用。
实施例2、发酵菌种的液体培养
a、仪器设备和试剂
无菌室及超净工作台、灭菌锅、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸等。
b、种子液培养基的配制
按如下方法配制种子液，PDA培养基装量100ml/300ml,pH7.0，灭菌121℃-20min，降温后备用。
c、接种及培养
将试管中保存的SWS-008菌株的菌苔表面挑取少量，接入灭菌后的培养液中。摇床培养，发酵温度28℃，转速140r/min，培养时间2天，生成白色菌丝球，直径约2-3mm。种子液镜检合格后，4℃保存备用。
所有种子液合并，装入无菌不锈钢接种罐内，冰箱保存备用，同时用划线法作无菌检查，种子液保存不得多于三天。
实施例3、红景天的固体发酵
红景天药材原料，切成约1cm长宽的小块，放入容器中，表面喷洒水，比例为药材：水＝4:1，使药材表面微湿。取出放入托盘，表面覆盖4层纱布，入高温蒸汽锅，105℃-5min处理，取出放入无菌室降温备用。
将培养好的SWS-008种子液，收集至灭菌接种罐中，用9倍无菌水稀释，用无菌压缩空气连接灭菌罐，使稀释菌液均匀喷洒于红景天药材表面，比例为药材：菌液＝20-25:1。将喷洒菌液后的红景天覆盖纱布，在无菌发酵室恒温发酵，温度28℃，保持无菌通风，通气量1L/m3/h，湿度80±5％。发酵3天，药材的表面有少量白色或者黄色的菌丝生长，用无菌不锈钢铲翻转红景天药材，使均匀，继续发酵培养。发酵至10天左右，药材的表面布满黄色菌丝和孢子，取出托盘烘干后即为发酵后的红景天。
实施例4、发酵前后的红景天检测
取三次发酵前和发酵后的红景天，放到粉碎机中，打碎，加入蒸馏水，红景天：水＝3：1，温度50-55℃，超声，水提三次，合并后过0.45μm滤膜，备用，待测。
同时准确称量发酵前和发酵后的红景天各2-5g，放入70℃烘箱内，至三次称量不再减少为止，再分别准确称量其干燥后重量，每种样品三个平行。
采用C-18液相色谱法测定红景天苷含量，其红景天含水量和红景天苷含量(去除水分)如下表。
可见，经过3批次红景天发酵前后对比测试可知，菌株SWS-008的固体发酵红景天可以有效提高红景天苷的含量，工艺可行，设备常规化。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (5)
1.一种提高红景天苷含量的微生物菌株，其特征在于：
该微生物菌株为一种发酵红景天的菌株SWS-008，其名称为，冠突散囊菌(Eurotium cristatum)SWS-008，保藏日期2020年3月27日，保藏号CGMCC NO：19605。
2.根据权利要求1所述的一种提高红景天苷含量的微生物菌株的发酵方法，其特征在于，该发酵方法包括以下步骤：
S1:首先制备菌株SWS-008的种子液，于液体PDA培养基中装量100ml/300ml,pH7.0，灭菌121℃-20min，降温后备用，然后将试管中保存的SWS-008菌株的菌苔表面挑取少量，接入灭菌后的培养液中，摇床培养；
S2:红景天原料的处理与接种，红景天药材原料，切成约1cm长宽的小块，放入容器中，表面喷洒水，比例为药材：水＝4:1，使药材表面微湿，取出放入托盘，表面覆盖4层纱布，入高温蒸汽锅，105℃-5min处理，取出放入无菌室降温备用，然后将培养2天的SWS-008种子液，收集至灭菌罐中，用9倍无菌水稀释，用无菌压缩空气连接灭菌罐，使稀释菌液均匀喷洒于红景天药材表面；
S3:红景天的发酵过程，将喷洒菌液后的红景天覆盖纱布，在无菌发酵室恒温发酵，药材的表面有少量白色或者黄色的菌丝生长，用无菌不锈钢铲翻转红景天药材，使均匀，继续发酵培养，再发酵至10天左右，药材的表面布满黄色菌丝和孢子，取出托盘烘干后即为发酵后的红景天。
3.根据权利要求2所述的一种提高红景天苷含量的微生物菌株的发酵方法，其特征在于：S1中摇床发酵温度28℃，转速140r/min，培养时间2天。
4.根据权利要求3所述的一种提高红景天苷含量的微生物菌株的发酵方法，其特征在于：S2中药材：菌液＝20-25:1。
5.根据权利要求4所述的一种提高红景天苷含量的微生物菌株的发酵方法，其特征在于：S3中发酵时发酵室的温度28℃，保持无菌通风，通气量1L/m3/h，湿度80±5％，发酵3天。
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