CN114887034B

CN114887034B - LLP2A-Ale在制备用于治疗和/或预防外周血淋巴细胞减少症的药物中的用途

Info

Publication number: CN114887034B
Application number: CN202210823845.5A
Authority: CN
Inventors: 陈继伟; 陈猛猛; 向雪香
Original assignee: Zhongshan Laibo Ruichen Biomedical Co ltd
Current assignee: Zhongshan Laibo Ruichen Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2042-07-14
Also published as: CN114887034A

Abstract

本发明涉及LLP2A‑Ale在制备用于治疗和/或预防外周血淋巴细胞减少症的药物中的用途。所述外周血淋巴细胞减少可以是由任何原因导致的。

Description

LLP2A-Ale在制备用于治疗和/或预防外周血淋巴细胞减少症的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域。具体地，本发明涉及LLP2A-Ale在制备用于治疗和/或预防外周血淋巴细胞减少症的药物中的用途。

背景技术

LLP2A-Alendronate (缩写为LLP2A-Ale)，一种多肽化合物，结构如下所示：

。

LLP2A-Ale 是针对骨病 (骨坏死，骨质疏松病和骨折) 开发的一个临床候选药，目前处于一期临床试验阶段。它是一种单一的有机分子，有两个配体通过化学链共价连接，一个配体即LLP2A，是一个高度衍生合成三肽，具有与 α4β1 整联蛋白高度亲和力和特异性。另一个配体是一种骨靶向双磷酸盐 (Alendronate /Ale)，由于α4β1 整联蛋白在间充质干细胞高表达，因此，LLP2A-Ale与间充质干细胞特异性结合后，能将间充质干细胞牵引至骨表面，增加体内血管内皮生长因子 (VEGF-A)水平和改善局部骨组织微循环，促进间充质干细胞向骨生细胞而不是脂肪细胞的转化，从而产生更多的成骨细胞和刺激新的骨形成。

目前，外周血淋巴细胞减少症的常见原因分为以下几种：

1、急性暴露于骨髓抑制剂量辐射的患者（急性辐射综合征的造血综合征）出现外周血严重的全血白细胞减少症 (包括中性粒细胞和淋巴细胞减少症)，是因意外急性暴露于骨髓抑制剂量辐射导致外周血出现严重的全血白细胞减少症 (包括淋巴细胞减少症)，针对这个适应症，美国FDA于2015年批准了美国安进公司研发的Neupogen / Filgrastim /G-CSF (全人源化蛋白大分子, 175 amino acid)，它能促进骨髓中性粒细胞的增殖和成熟，增加中性粒细胞进入到血循环的数目，从而达到减少严重感染的风险。然而, Neupogen/ Filgrastim / G-CSF对外周血淋巴细胞没有影响，不能治疗急性暴露于骨髓抑制剂量辐射导致外周血严重的全血白细胞减少症中的淋巴细胞减少症部分。因此，它对这个适应症的疗效是有限的，目前针对这个外周血严重的淋巴细胞减少症，没有有效的治疗药物，这个未满足的医疗需求需要有新的药物来填补。

2、肿瘤放射治疗或放化疗引起的与放疗相关的外周血严重淋巴细胞减少症，局部放射治疗或放化疗是肿瘤疾病治疗的主要手段之一，大约70%的癌症患者在治疗癌症的过程中需要用放射治疗。然而, 放疗常常引起许多不良事件，外周血严重淋巴细胞减少症和免疫功能下降是其一个严重的副作用，根据文献报道多个不同的肿瘤 (肝癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌和头和颈癌) 在放疗后或同时放疗+化疗后均出现了与放疗相关的高比例 (46%-71.7%) 外周血循环急性严重淋巴细胞减少 (Acute Severe Lymphopenia, 开始放疗后三个月内的淋巴细胞计数<500/uL, 3/4级毒性)，这个放疗相关的严重不良事件，一方面可能导致肿瘤放疗被迫暂时中止，不能完成放疗的疗程和影响肿瘤疾病的治疗。另一方面，严重的外周血循环淋巴细胞的减少和免疫功能下降，不仅会增加因感染需要入院治疗的风险，也导致肿瘤病人较差的预后和较短的生存期。目前针对局部放疗引起的外周血严重淋巴细胞减少症，没有有效的治疗药物，这个巨大的未满足的医疗需求需要有新的有效的药物来填补。

3、艾滋病(AIDS)免疫重建不良或免疫无应答引起的外周血淋巴细胞减少症：艾滋病发病机制主要是HIV病毒侵犯人体的免疫系统，包括 CD4+ T淋巴细胞、单核巨噬细胞和DC等，主要表现为 CD4+ T淋巴细胞数量不断减少，最终导致人体细胞免疫功能缺陷，引起各种机会性感染和肿瘤的发生。目前艾滋病的标准治疗(2021诊疗指南)是使用抗反转录病毒药物（anti-retroviral therapy, ART）抑制病毒复制、重建免疫、预防和减少艾滋相关性疾病（机会性感染、肿瘤等）及非艾滋相关性疾病的发病率和病死率。但约有10%～40%的HIV感染者，即便在病毒被完全抑制后，仍不能完全实现免疫重建。这一现象被称为免疫重建不良，这些患者被称为免疫重建不良者或免疫无应答者（immunological non-responders, INRs)。与免疫应答者（IRs）相比, INRs艾滋相关性疾病（感染、肿瘤等）及非艾滋相关性疾病（心血管疾病、肿瘤、神经认知障碍、骨质疏松症等）的发病率和病死率显著增加，使家庭和社会的医疗负担、经济负担加重。目前对于艾滋病(AIDS)免疫重建不良或免疫无应答，没有有效的治疗药物。

4、糖皮质激素使用引起的外周血淋巴细胞减少症:其引起免疫抑制作用的原因是通过抑制巨噬细胞对抗原的吞噬和处理，促进淋巴细胞的破坏和解体，促其移出血管而减少循环中淋巴细胞数量；小剂量时主要抑制细胞免疫；大剂量时抑制浆细胞和抗体生成而抑制体液免疫功能。这个糖皮质激素使用引起的副作用目前无有效的治疗药物。

5、自身免疫性疾病 (如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎) 引起的外周血淋巴细胞减少症，LLP2A-Ale也许可以成为这个未满足临床需求的有效治疗药物。

6、感染性疾病 (如结核、乙型肝炎、AIDS、新冠) 引起的外周血淋巴细胞减少症,如新冠肺炎，华中科技大学同济医学院、武汉市金银潭医院、武汉大学人民医院等机构在《柳叶刀呼吸医学》发表了一项针对金银潭医院52名危重症患者的回顾性研究。研究显示，80%的危重症患者出现淋巴细胞减少。因为新冠 (SARS-CoV) 病毒颗粒的靶向侵袭会破坏淋巴细胞的细胞质成分并导致其破坏。作者称，血液淋巴细胞与疾病进展高度相关提示淋巴细胞缺乏或丧失能力是新冠肺炎的关键细胞病理学。淋巴细胞水平的保护、维持或促进可能对新冠肺炎的防治有良好作用。目前无有效的增加外周血淋巴细胞计数的治疗药物。

7、血液病 (如Hodgkin's disease) 引起的外周血淋巴细胞减少症，目前无有效的增加外周血淋巴细胞计数的治疗药物。

8、遗传疾病(ataxia-telangiectasia, DiGeorge anomaly, severe combinedimmunodeficiency syndrome, Wiskott-Aldrich syndrome) 引起的外周血淋巴细胞减少症,其原因是由于干细胞质量与数量的异常导致淋巴系无效造血。其他病因如Wiskott-Aldrich综合征，可由于T细胞加速破坏而引起。有效的治疗方式为干细胞移植，如骨髓移植或脐带血移植。

9、蛋白质损失肠病 (包括Amyloidosis, celiac disease, Crohn’s disease,ulcerative colitis, regional enteritis, Zinc deficiency) 引起的外周血淋巴细胞减少症，目前无有效的增加外周血淋巴细胞计数的治疗药物。

10、某些情况下如剧烈的体育锻炼 (运动员训练)、严重的压力、营养不良 (如癌症或末期癌症患者)、饮食失调 (神经性厌食) 等引起的外周血淋巴细胞减少症, 目前无有效的增加外周血淋巴细胞计数的治疗药物。

发明内容

因为 α4β1 整联蛋白在淋巴细胞也有表达，LLP2A-Ale 也会与淋巴细胞特异性结合，本发明研究发现，实验动物在接受LLP2A-Ale 治疗后，外周血淋巴细胞数目明显增加，提示LLP2A-Ale在与淋巴细胞特异性结合后，它可能通过干扰淋巴细胞与血管内皮细胞的结合，减少淋巴细胞依附在血管壁上，从而引起外周血循环的淋巴细胞数目增加。

本发明的研究人员还通过大鼠实验发现，使用KLH (钥孔血蓝蛋白，keyholeLimpet Hemocyanin) 诱导抗体IgM和IgG后，阳性对照药cyclophosphamide（环磷酰胺）如预期明显减少了体内血清IgM 和IgG抗体水平，而LLP2A-Ale 静脉给药治疗，与阴性对照组(Vehicle组) 相比，既没有增加也没有减少抗体IgM和IgG 的水平，证明LLP2A-Ale在与大鼠淋巴细胞特异结合后，不会影响它的免疫功能。

利用这个药物的作用机理，本发明对LLP2A-Ale的用途进行了进一步研究，发现LLP2A-Ale 可以用于治疗因任何原因导致的外周血淋巴细胞减少症。

本发明提供了化合物LLP2A-Ale在制备用于治疗和/或预防外周血淋巴细胞减少症的药物中的用途。

所述外周血淋巴细胞减少症包括因任何原因导致的外周血淋巴细胞减少症，具体包括但不限于：急性辐射综合征的造血综合征出现外周血严重的全血白细胞减少症；肿瘤局部放射治疗或放化疗引起的外周血严重淋巴细胞减少症和全血白细胞减少症；艾滋病(AIDS)免疫重建不良或免疫无应答引起的外周血淋巴细胞减少症；糖皮质激素使用引起的外周血淋巴细胞减少症；自身免疫性疾病引起的外周血淋巴细胞减少症；感染性疾病引起的外周血淋巴细胞减少症；血液病引起的外周血淋巴细胞减少症；遗传疾病引起的外周血淋巴细胞减少症；蛋白质损失肠病引起的外周血淋巴细胞减少症；生理原因导致的外周血淋巴细胞减少症。

具体地，所述急性辐射综合征的造血综合征是指急性暴露于骨髓抑制剂量辐射的患者（急性辐射综合征的造血综合征）出现外周血严重的全血白细胞减少症，可以用LLP2A-Ale单药使用治疗或联合其他药物（比如Neupogen / Filgrastim / G-CSF等）使用治疗。

所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎等。

所述感染性疾病包括结核、乙型肝炎、AIDS、新冠等。

所述血液病，如霍奇金病（Hodgkin's disease）等。

所述遗传疾病包括共济失调毛细血管扩张症（ataxia-telangiectasia）、DiGeorge异常（DiGeorge anomaly）、严重联合免疫缺陷综合征（anomaly,severe combinedimmunodeficiency syndrome）、Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome）等。

所述蛋白质损失肠病包括淀粉样变（Amyloidosis）、腹腔疾病（celiac disease）、克罗恩病（Crohn’s disease）、溃疡性结肠炎（ulcerative colitis）、局部肠炎（regionalenteritis）、缺锌（Zinc deficiency）等。

所述生理原因包括如下某些情况，如剧烈的体育锻炼 (运动员训练)、严重的压力、营养不良 (如癌症或末期癌症患者)、饮食失调 (神经性厌食) 等。

附图说明

图1为实施例1中瓦里安射线对小鼠体重影响曲线图；

图2为实施例1中瓦里安射线对小鼠淋巴细胞的影响（单位：10⁹/L）曲线图；

图 3为瓦里安射线对小鼠骨髓细胞的影响的柱形图；

图4为实施例2-1中治疗实验方案中Rab001-US (0.4mg/kg) 与 Rab001-CN（0.1mg/kg，0.4mg/kg，1.6mg/kg）对小鼠循环淋巴细胞数量的影响曲线图；

图5为实施例2-1中治疗实验方案中Rab001-US (0.4mg/kg) 与 Rab001-CN（0.1mg/kg，0.4mg/kg，1.6mg/kg）对小鼠白细胞数量的影响曲线图；注：通过Tukey（单因素方差分析），*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001 VS. 6D或13D ；a:P<0.05；b:P<0.01；c:P<0.001 VS. 基线；

图6为实施例2-1中治疗实验方案中Rab001-US (0.4mg/kg) 与 Rab001-CN（0.1mg/kg，0.4mg/kg，1.6mg/kg ）对小鼠骨髓细胞数量的影响柱形图；注：通过Tukey（单因素方差分析），*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001 溶媒组VS非照射组；

图7为实施例2-2中预防实验方案中Rab001-US (0.4mg/kg) 与Rab001-CN（0.1mg/kg，0.4mg/kg，1.6mg/kg ）对小鼠循环淋巴细胞数量的影响曲线图；

图8为实施例2-2中预防实验方案中Rab001-US (0.4mg/kg) 与 Rab001-CN（0.1mg/kg，0.4mg/kg，1.6mg/kg ）对小鼠循环淋巴细胞数量的影响曲线图；注：通过Tukey（单因素方差分析），*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001 VS. 6D或13D ；a:P<0.05；b:P<0.01；c:P<0.001 VS . 基线；

图9为实施例2-2中预防实验方案中Rab001-US (0.4mg/kg) 与 Rab001-CN（0.1mg/kg，0.4mg/kg，1.6mg/kg ）对小鼠骨髓细胞数量的影响柱形图；注：通过Tukey（单因素方差分析），*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001 溶媒组VS非照射组。

具体实施方式

以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1 小鼠全身接受辐射诱导淋巴细胞减少的模型建立

瓦里安UNIQUE-6MV射线对C57小鼠血细胞计数和骨髓细胞计数的影响。

1、主要实验材料与仪器

材料：C57BL/6小鼠12只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。试剂：2.5ul、10ul、200ul、1000ul移液器（德国 eppendorf）；台盼蓝。仪器：超净工作台（中国苏州净化 SW-CJ-1FD）；生物倒置显微镜（日本OLYMPUS IX51）；酶标仪（美国 BioTek ELx800）；振荡器（中国上海沪西分析仪器厂 WH-2）。

2、实验方法：

雄性C57BL/6小鼠12只，适应性喂养1周，随机分组，每组3只，共4组。4组分别给与不同剂量的瓦里安UNIQUE-6MV射线照射一次（0Gy、3Gy、6Gy、12Gy），分别在0h、1h、6h、24h、3d、7d、10d，分别取100μL全血做血常规检测，造模10天后处死动物，收集骨髓进行骨髓细胞计数。

使用台盼蓝法进行细胞计数：(1)细胞收集：取小鼠骨髓细胞，1000转离心5分钟，弃上清，用1mL PBS重悬细胞；(2)盼蓝染色：吸取10ul细胞悬液置于塑料离心管内，加入10ul台盼蓝染液，轻轻混匀，染色1min；(3)细胞计数：吸取适量经过染色的细胞悬液，涂于细胞计数板中，置于倒置光学显微镜下观察，蓝色染色的细胞为死亡细胞，未染色的细胞为活性细胞。

3、结果：

(1) 瓦里安射线对小鼠体重的影响

结果见表1-1和图1：一次照射在剂量水平3-12Gy范围内，小鼠体重增加减少，并且与照射剂量相关。

结果显示单次3-12 瓦里安射线的辐射使体重在辐射后第 10 天减少约5%。

表1-1 瓦里安射线对小鼠体重的影响(g)

(2) 瓦里安射线对小鼠淋巴细胞的影响

结果见表1-2和图2。

① 在3-12Gy剂量照射范围内，1次照射明显诱导淋巴细胞减少(P＜0.05，甚至P＜0.001)，照射引起的淋巴细胞减少是与照射剂量相关，淋巴细胞减少在照射1h后出现。

② 在 3Gy和6Gy剂量组中，在单次照射10天，淋巴细胞计数倾向恢复到基线值(3Gy=32.18%，6Gy=45.29%)，12Gy剂量照射10天后，未观察到淋巴细胞计数恢复至基线值的倾向。

③ 在6Gy照射组中，第1只小鼠基线值明显低于其他小组淋巴细胞值(1.84Vs4.16~10.09)，此小鼠基线值明显异常，可判定为离散值；第2只小鼠在24h时间点上淋巴细胞计数恢复到基线值，而其他时间点淋巴细胞计数明显低于基线值，此数值明显异常，也可判定为离散值。

结果显示，单次3-12 瓦里安射线的辐射抑制淋巴细胞活力长达10天。

表1-2 瓦里安射线对小鼠淋巴细胞数量的影响（单位：10⁹/L）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

(3) 瓦里安射线对小鼠骨髓细胞的影响

结果见表1-3和图3，结果显示：在3-12Gy照射剂量范围内，1次照射10天后，骨髓总细胞数和活细胞数明显少于未照射组，显现出明显的骨髓抑制，照射诱导的骨髓抑制是与照射剂量相关(P＜0.05或P＜0.01）。

结果显示，单次3-12瓦里安射线的辐射抑制骨髓活细胞数量长达 10 天。

表1-3 瓦里安射线照射10天后对小鼠骨髓细胞数量的影响（单位：10⁶个）

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

实施例2

评估LLP2A-Ale与对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的治疗/预防效果。

1、主要实验材料与仪器

材料：C57BL/6小鼠72只(购自上海斯莱克实验动物有限公司)。试剂：0.9%生理盐水，Rab001-CN(即化合物LLP2A-Ale，由本公司委托成都圣诺生物科技股份有限公司生产)，Rab001-US（即化合物LLP2A-Ale，由本公司授权美国Bachem公司合成）。

2、实验方法

组-1基线对照：不进行辐射，不注射药物。

组-2年龄相仿的非照射组：不进行辐射，注射0.9%生理盐水。

组-3溶媒组：进行辐射，注射0.9%生理盐水。

组-6，组-5，组-4：进行辐射，称取Rab001-CN药物1.6mg，加入10ml生理盐水溶解，得到浓度为0.16mg/ml的工作液，分装每只动物100μL/10g体重注射；0.4mg/kg给药剂量，从高浓度工作液取1ml加3ml生理盐水，稀释4倍，即可；0.1mg/kg给药剂量通过上述工作液生理盐水稀释即可。

组-7：进行辐射，称取Rab001-US药物0.4mg，加入10ml生理盐水溶解，得到浓度为0.04mg/ml的工作液，分装每只动物100μL /10g体重注射。

3、实验方案：

实施例2-1 LLP2A-Ale 对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的治疗效果。

研究目的：评估LLP2A-Ale对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的治疗效果。

实验编号：Rab001_小鼠_3Gy-剂量_202112。

研究设计：C57BL/6雄性小鼠（n=42， 6/组），年龄6-8周。

试验步骤：在照射 (3Gy, 第一天开始试验时辐射1次) 诱导外周血严重的全血白细胞减少和淋巴细胞减少，在第7天、14天和21天后，分别静脉治疗给药Rab001-CN(4个不同剂量，0、0.1、0.4、1.6mg/kg或给药Rab001-US0.4mg/kg），一周一次，总共给药3次；在实验的第21天给药后0.5h，所有给药组 (n=3) 采集0.2 ml 的血样用于分析药物在血浆中的浓度。在实验的第28天，所有小鼠接受安乐死，并且采集两个股骨和测量骨髓中总细胞数和活细胞数。在小鼠全身接受辐射后引起外周血严重的全血细胞减少症模型中检测LLP2A-Ale治疗时间静脉给药后的疗效 (增加外周血淋巴细胞的数目)。

实验方案如下表所示：

实施例2-2 LLP2A-Ale 对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的预防效果。

研究目的：评估LLP2A-Ale对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的预防效果。

实验编号：Rab001_小鼠_3Gy-剂量_202110。

研究设计：C57BL/6雄性小鼠（n=42），年龄6-8周。

实验步骤：在第一天3Gy剂量照射后，分别于当日（辐射后）、7天、14天后静脉预防给药Rab001-CN (4个不同剂量: 0、0.1、0.4、1.6mg/kg或给药Rab001-US 0.4mg/kg），一周一次，总共给药3次。在实验的第14天给药后0.25h，所有给药组 (n=3) 采集0.2 ml 的血样用于分析药物在血浆中的浓度。在实验的第28天，所有小鼠接受安乐死，并且采集两个股骨和测量骨髓中总细胞数和活细胞数。在小鼠全身接受辐射后引起外周血严重的全血细胞减少症模型中检测LLP2A-Ale预防时间静脉给药后的疗效(增加外周血淋巴细胞的数目)。

实验方案如下表所示：

4、实验结果：

4.1 实施例1小鼠全身接受辐射诱导淋巴细胞减少模型建立结果（见图1）。

一次照射在剂量水平3-12Gy范围内，小鼠在辐射后第 10 天体重增加减少约5%；同时，淋巴细胞减少在照射1h后出现，单次3-12 Gy安射线的辐射抑制淋巴细胞活力长达10天，其辐射抑制骨髓活细胞数量也长达10天。

4.2 实施例2-1 LLP2A-Ale 对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的治疗效果。

1. 淋巴细胞和全血白细胞计数（见图4、图5）。

(1) 非照射组：全组小鼠的白细胞和淋巴细胞计数维持在基线（正常）水平。

(2) 照射+溶媒组：在接受3Gy一次性照射后6h，小鼠全血中白细胞、淋巴细胞与基线相比，小鼠白细胞、淋巴细胞计数分别明显减少超过80% (p<0.001, p<0.001)，白细胞计数和淋巴细胞计数的低水平状态维持时间为2周；其余实验期间这些细胞计数恢复和维持在正常水平，直到实验结束。

(3) 照射+Rab001-US组：与给药前相比, 在7d和14d给药后1h，观察到Rab001-US在0.4mg/kg剂量水平导致了全血白细胞和淋巴细胞有明显增加(14d: p<0.001)，但给药后6h (在7d和14d) 白细胞和淋巴细胞计数回落到给药前水平。在第21d给药后6h同样未观察到全血白细胞、淋巴细胞计数与给药前有明显差异。

(4) 照射+Rab001-CN 组：相比给药前，在14d给药后1h，观察到白细胞和淋巴细胞计数明显增高 (1.6mg/kg组: p<0.001)，且增加量与给药计量具有相关性。给药后6h (在7d和14d) 白细胞和淋巴细胞回落到给药前水平。由于第21d在给药后1h需采血评估血药浓度，因此21d后给药1h无法评估疗效。在第21d给药后6h同样未观察到全血白细胞、淋巴细胞计数与给药前有明显差异。

2. 骨髓活细胞和总细胞计数（见图6）。

(1) 非照射组与基线对照组相比，总细胞和活细胞数没有明显差异，照射+溶媒组相比于非照射组，总细胞数改变不大，但活细胞数明显减少了29.43% (P<0.001)。

(2) 照射+Rab001-US组：相比照射+溶媒组，总细胞数没有明显改变，但活细胞数增加了11%。

(3) 照射+Rab001-CN组: 相比照射+溶媒组, 总细胞数目无影响，但活细胞数分别增加了13.37%、10.20%、22.82%，此增加与给药剂量具有相关性。但增加仍低于非照射组水平，显示测试药没有刺激骨髓产生新的细胞, 而是部分预防和减轻照射对骨髓细胞的损伤。

1.淋巴细胞和全血白细胞计数（见图7、图8）。

(2) 照射+溶媒组：与基线相比，在接受3Gy一次性照射后1h, 小鼠白细胞、淋巴细胞计数分别明显减少超过80% (p<0.001， p<0.001)，白细胞计数和淋巴细胞计数的低水平状态维持时间为14d；其余实验期间这些细胞计数恢复和维持在正常水平，直到实验结束。

(3) 照射+Rab001-US组：LLP2A-Ale药物在0.4mg/kg剂量下，小鼠在接受辐射照射后立即给药，1h后测定的淋巴细胞数和全血白细胞数，结果相较于0h给药前有所增加或维持在基线水平。而在第7d和14d给药后，与给药前相比，阳性药导致了全血白细胞和淋巴细胞明显增加(p<0.001，p<0.001)，但给药后24h白细胞和淋巴细胞计数回落到给药前水平。

(4) 照射+Rab001-CN组：照射后立刻给药，0.1mg/kg剂量测试药组在给药后1h与基线相比, 预防了淋巴细胞数量减少和增加白细胞数量，其余两测试药组 (0.4、1.6mg/kg剂量) 在这个时间点没有观察到药效。在给药第7d和14d时间点，测试药组在给药后1h相比给药前 (4d、11d), 明显增加淋巴细胞数和全血白细胞数 (p<0.05，p<0.05), 并观察到药效与给药剂量具有相关性。但给药后24h白细胞和淋巴细胞计数回落到给药前水平。

2. 骨髓活细胞和总细胞计数（见图9）。

(1) 非照射组与基线组相比，骨髓总细胞和活细胞数目改变小。

(2) 照射+溶媒组与非照射组相比，照射对骨髓总细胞数目影响不大, 但明显减少了22.8% 骨髓活细胞数目 (p<0.001)。

(3) 无论Rab001-US还是Rab001-CN，与照射+溶媒组相比，骨髓总细胞和活细胞计数都无显著差异。

结论：

实施例1 小鼠全身接受辐射诱导淋巴细胞减少模型建立。

小鼠全身接受辐射诱导淋巴细胞减少模型建立的数据表明，对小鼠进行全身辐射1次可导致外周循环血总白细胞减少和淋巴细胞减少以及减少骨髓活细胞计数，这与急性暴露于亚致死剂量全身辐射（最严重形式的淋巴细胞减少）的临床情况相似。

实施例2-1 LLP2A-Ale对全身辐射诱导淋巴细胞减少小鼠模型的治疗效果。

治疗实验数据表明，3Gy剂量辐射照射一次可引起明显的小鼠全血中白细胞、淋巴细胞及骨髓活细胞计数的减少；LLP2A-Ale（无论是Rab001-US还是Rab001-CN），实验药静脉注射可引起短暂的白细胞、淋巴细胞计数明显增加以及部分预防照射诱导的骨髓抑制，这些药效均与给药剂量具有相关性，这些结果显示实验药对骨髓细胞的增殖没有影响，与之前观察到的LLP2A-Ale药物作用机制一致，即增加外周血淋巴细胞数目不是通过刺激骨髓细胞的增殖导致更多的淋巴细胞进入外周血循环，而是通过影响淋巴细胞的迁移和其在体内的分布。

预防实验数据表明，3Gy剂量辐射照射一次可引起明显的小鼠全血中白细胞、淋巴细胞及骨髓活细胞计数的减少；LLP2A-Ale（无论是Rab001-US还是Rab001-CN），实验药静脉注射可引起短暂的白细胞、淋巴细胞计数明显增加，这些药效均与给药剂量具有相关性。但无论是Rab001-US还是Rab001-CN，对照射诱导的骨髓抑制均未观察到明显的疗效。与之前观察到的LLP2A-Ale药物作用机制一致，即增加外周血淋巴细胞数目不是通过刺激骨髓细胞的增殖导致更多的淋巴细胞进入外周血循环，而是通过影响淋巴细胞的迁移和其在体内的分布。

以上结果表明LLP2A-Ale可用于预防和治疗全身辐射引起的淋巴细胞减少症。

Claims

1.化合物LLP2A-Ale在制备用于治疗接受辐射诱导的外周血淋巴细胞减少症的药物中的用途；其中，化合物LLPA-Ale的结构为：

。