CN114875124A - 一种改进核酸扩增反应的方法及其应用 - Google Patents
一种改进核酸扩增反应的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种改进核酸扩增反应的方法及其应用：通过反应扩增效率特异性等方面的提高，以便应用到更多的场景中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种改进核酸扩增反应的方法及其应用。
背景技术
伴随着生物相关产业的迅速发展和新技术的大规模应用，与人们生活健康息息相关的诊断行业受到越来越广泛的关注，在进一步推动诊断技术进步的同时，也提出了更高的要求。
PCR技术作为分子诊断技术的基础之一，能够在短时间内对目的片段进行指数级的扩增，在医学诊断等方面的诊断和研究中都有着广泛的应用，其相对其他诊断技术虽然有着较高的扩增效率和较强的特异性，但是随着技术的不断更新和迭代，这些优势也面临着越来越多的挑战，如何进一步改进核酸扩增反应，以将其应用到更多的场景中,也成为研发人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明目的是提供一种改进核酸扩增反应的方法及其应用。
在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：
1.一种改进核酸扩增反应的方法，其中，包括将模板加入到含有六偏磷酸钠的反应体系中的步骤。
2.根据项目1所述的方法，其中，六偏磷酸钠在所述反应体系中的终浓度为0.005-0.5(w/v)％；
可选的，六偏磷酸钠在所述反应体系中的终浓度为0.01-0.35(w/v)％。
3.根据项目1-2中任一项所述的方法，其中，所述反应体系进一步含有聚多卡醇、明胶、单链结合蛋白、DNA错配修复蛋白中至少任意一种。
4.根据项目3所述的方法，其中，
聚多卡醇在所述反应体系中的终浓度为0.005-0.25(w/v)％；
可选的，明胶在所述反应体系中的终浓度为0.005-0.5(w/v)％；
可选的，单链结合蛋白在所述反应体系中的终浓度为2-10ng/μL；
可选的，DNA错配修复蛋白在所述反应体系中的终浓度为0.05-5μg/μL。
5.根据项目1-4中任一项所述的方法，其中，所述反应体系还包含DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物、缓冲液中至少任意一种。
6.根据项目5所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。
7.根据项目1所述的方法，其中，所述核酸扩增反应可以是例如聚合酶链式反应。
8.一种改进核酸扩增反应的组合物，其中，所述组合物用于制备项目1-7中任一项所述的反应体系。
9.一种试剂盒，其中，包含项目1-7中任一项所述的反应体系、或项目8所述的组合物。
10.项目1-7中任一项所述的方法、项目8所述的组合物、项目9所述的试剂盒在核酸扩增反应中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为向单重PCR反应体系中添加单一添加剂的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，各组六泳道按照10pg/100pg/1ng模板量、每一模板梯度做一复孔进行；
图2为向多重PCR反应体系中添加两组合添加剂的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，各组三泳道按照有模板添加做一复孔和无模板添加的NTC(无模板对照，下同)进行；
图3为向多重PCR反应体系中添加三组合添加剂的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，各组三泳道按照有模板添加做一复孔和无模板添加的NTC进行。
具体实施方式
核酸扩增反应中可能伴随着非特异性反应的发生导致目的片段的合成量降低，特异性变差和/或扩增效率降低。在一些实施方案中，本发明提供了一种改进核酸扩增反应的方法，包括将模板加入到含有六偏磷酸钠的反应体系中的步骤。
在一些实施方案中，六偏磷酸钠在反应体系中的终浓度为0.005-0.5(w/v)％；在一些实施方案中，六偏磷酸钠在反应体系中的终浓度为0.01-0.35(w/v)％；在一些实施方案中，六偏磷酸钠在反应体系中的终浓度包括例如0.005(w/v)％、例如0.01(w/v)％、例如0.05(w/v)％、例如0.1(w/v)％、例如0.15(w/v)％、例如0.2(w/v)％、例如0.25(w/v)％、例如0.3(w/v)％、例如0.35(w/v)％、例如0.4(w/v)％、例如0.45(w/v)％、例如0.5(w/v)％，但不限于此。
在一些实施方案中，反应体系进一步含有聚多卡醇、明胶、单链结合蛋白、DNA错配修复蛋白中至少任意一种。
在一些实施方案中，明胶不作来源限定；在一些实施方案中，明胶选自牛明胶、鱼明胶和/或其组合。
在一些实施方案中，聚多卡醇在反应体系中的终浓度为0.005-0.25(w/v)％；在一些实施方案中，聚多卡醇在反应体系中的终浓度包括例如0.005(w/v)％、例如0.01(w/v)％、例如0.05(w/v)％、例如0.1(w/v)％、例如0.15(w/v)％、例如0.2(w/v)％、例如0.25(w/v)％，但不限于此；
在一些实施方案中，明胶在反应体系中的终浓度为0.005-0.5(w/v)％；在一些实施方案中，明胶在反应体系中的终浓度包括例如0.005(w/v)％、例如0.01(w/v)％、例如0.05(w/v)％、例如0.1(w/v)％、例如0.15(w/v)％、例如0.2(w/v)％、例如0.25(w/v)％、例如0.3(w/v)％、例如0.35(w/v)％、例如0.4(w/v)％、例如0.45(w/v)％、例如0.5(w/v)％，但不限于此；
在一些实施方案中，单链结合蛋白在反应体系中的终浓度为2-10ng/μL；在一些实施方案中，单链结合蛋白在反应体系中的终浓度包括例如2ng/μL、例如3ng/μL、例如4ng/μL、例如5ng/μL、例如6ng/μL、例如7ng/μL、例如8ng/μL、例如9ng/μL、例如10ng/μL，但不限于此；
在一些实施方案中，DNA错配修复蛋白在反应体系中的终浓度为0.05-5μg/μL；在一些实施方案中，DNA错配修复蛋白在反应体系中的终浓度包括例如0.05μg/μL、例如0.1μg/μL、例如0.125μg/μL、例如0.2μg/μL、例如0.5μg/μL、例如1μg/μL、例如1.5μg/μL、例如2μg/μL、例如2.5μg/μL、例如3μg/μL、例如4μg/μL、例如5μg/μL，但不限于此。
在一些实施方案中，本发明的反应体系还包含一种或多种聚合酶。这类聚合酶可以是能够复制DNA分子的任何酶。在一些实施方案中，所述反应体系可以包含DNA依赖性DNA聚合酶、用于逆转录的酶(RNA依赖性DNA聚合酶)和/或两种类型的酶的组合。在一些实施方案中，DNA依赖性DNA聚合酶的组合和/或RNA依赖性DNA聚合酶的组合可以存在于本文所公开的反应体系中。在一些实施方案中，如本文所使用的聚合酶是热稳定DNA聚合酶。在一些实施方案中，当如本文所使用的热稳定DNA聚合酶经受高温持续一段在核酸扩增或PCR扩增期间实现单链核酸不稳定或双链核酸变性所需的时间时，其并不会不可逆地失活。酶的不可逆性是指酶活性的显著丧失。热稳定DNA聚合酶优选在如PCR扩增通常需要的条件下不会不可逆地变性。
在一些实施方案中，本发明的反应体系还包含Mg2+、dNTP、引物、缓冲液中的至少任意一种。所属领域的普通技术人员能够基于模板序列设计与其互补的寡核苷酸链作为引物。在一些实施方案中，引物选自常规引物或简并引物中的一种。一般核酸扩增(例如PCR扩增)大都选用常规引物，特异性相对较高、结构简单，但在扩增一些未知序列时，只能通过保守序列设计简并引物。这给特异性扩增带来了困难。在一些实施方案中，本发明的反应体系可以包含常规引物。在一些实施方案中，本发明的反应体系可以包含较为复杂、解链温度较高的简并引物。
根据本发明的教导，一种或多种额外的组分和/或添加剂可以并入本发明的反应体系、方法、组合物和试剂盒中以优化核酸扩增。在一些实施方案中，所述反应体系可以包含能够促进或增强核酸扩增反应的额外的组分和/或添加剂(例如用于促进或增强PCR的试剂)。额外的组分和/或添加剂可以是其它有机化合物或无机化合物、其它多肽以及非多肽组分。这类组分和/或添加剂可以包括但不限于例如含硫化合物、含乙酸盐的化合物、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、外蛋白、多元醇、表面活性剂(例如吐温20、NP-40、Triton X-100和CHAPS)、拥挤剂(例如Ficoll 70、糖原和PEG)。所属领域的普通技术人员将能够识别根据本发明反应体系、方法、组合物和试剂盒使用的额外的组分和/或添加剂。
根据本发明的教导，内部参照物、质控品、防污染物质(例如尿嘧啶DNA糖基化酶、RNA酶)可以并入本发明反应体系、方法、组合物和试剂盒中。
在一些实施方案中，本发明核酸扩增包括但不限于引物延伸或聚合酶链式反应。在一些实施方案中，所述核酸扩增反应可以是聚合酶链式反应。在一些实施方案中，PCR是单重PCR。在一些实施方案中，PCR是多重PCR。如本文所使用的术语“单重”或“单重PCR”是指为在反应容器内扩增单一产物而提供的测定。使用不同的引物对来引发产物。单重反应可以进一步包括对扩增产物具有特异性的标记探针，其中探针可以用可检测部分如荧光染料来检测性地标记。如本文所使用的术语“多重”或“多重PCR”是指为在同一反应容器内同时扩增两种或更多种产物而提供的测定。使用不同的引物对来引发每种产物。多重反应可以进一步包括对每种产物具有特异性的标记探针，其中探针可以用不同的可检测部分来检测性地标记。在一些实施方案中，本文所公开的核酸扩增方法可用于广泛的包括检测、定量和/或表征靶核酸的测定，例如包括但不限于单核苷酸多态性(SNP)、微卫星分析和基因分型、拷贝数测定和变异分析、检测基因表达和检测小RNA表达的测定。
在一些实施方式中，改进核酸扩增反应的方法还包括提供允许发生核酸扩增反应条件的步骤。
在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠及聚多卡醇；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠及明胶；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠及单链结合蛋白；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠及DNA错配修复蛋白；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠、聚多卡醇及明胶；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠、聚多卡醇及单链结合蛋白；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠、聚多卡醇及DNA错配修复蛋白；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠、明胶及单链结合蛋白；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠、明胶及DNA错配修复蛋白；在一些实施方案中，本发明的组合物包括六偏磷酸钠、单链结合蛋白及DNA错配修复蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了包含任一实施方案的反应体系或组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含对核酸扩增(例如PCR扩增)产物和/或DNA靶标的检测具有特异性的标记探针。
在一些实施方案中，本发明还提供了包含任一实施方案的反应体系、方法、组合物和试剂盒在核酸扩增反应中的应用。
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。提供以下实施例以说明本发明的实施方案，并非意在限制本发明。本发明可以任选包括未通过实施例示出的实施方案。
一、单重PCR反应
1.模板制备
(1)细胞类型：293T细胞；
(2)菌体收集：将细胞培养液分装于1.5mL离心管中，每管约1×106个细胞，离心去细胞液；
(3)人基因组提取：用天根TIANamp Genomic DNA Kit(离心柱型)提取。
2.引物
提供针对β-珠蛋白基因(β-Globin gene)的一对引物进行扩增，如下所示；
F–5’-TGCTGTTATGGGCAACCCTAA-3’，序列如SEQ ID NO:1所示
R–5’-GAGCCAGGCCATCACTAAAGG-3’，序列如SEQ ID NO:2所示
3.目的基因扩增
PCR反应体系：0.5μL Pfu DNA聚合酶(5U/μL)、2mM MgCl2、0.5μL dNTP(10mM)、2.5μL 10倍上下游引物混合物、10pg/100pg/1ng人基因组DNA，单组分的添加剂，ddH2O补足至25μL。
PCR扩增程序：95℃，2min30s；(98℃，20s；56℃，20s；72℃，30s)×35cycles；72℃，3min；4℃，∞。
4.PCR扩增产物检测
实施例一：向单重PCR反应体系中添加0.25(w/v)％胆酸钠。
实施例二：向单重PCR反应体系中添加0.1％40nm纳米金颗粒。
实施例三：向单重PCR反应体系中添加0.5(w/v)％L-精氨酸。
实施例四：向单重PCR反应体系中添加0.5(w/v)％海藻糖。
实施例五：向单重PCR反应体系中添加0.01(w/v)％六偏磷酸钠。
实施例六：向单重PCR反应体系中添加0.35(w/v)％六偏磷酸钠。
实施例七：向单重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％鱼明胶。
实施例八：无添加剂，对照组。
向单重PCR反应体系中添加单一添加剂(胆酸钠、纳米金颗粒、L-精氨酸、海藻糖、鱼明胶均在最优用量下)的扩增效果如图1所示：某些添加剂会抑制扩增如胆酸钠、纳米金颗粒和海藻糖；某些添加剂则基本无影响如L-精氨酸；鱼明胶能够提高扩增效率但较对照组非特异性条带有增加；而六偏磷酸钠能对PCR扩增的扩增效率及特异性都起到一定的促进作用。
二、多重PCR反应体系
1.模板制备
(1)细胞类型：293T细胞；
(2)菌体收集：将细胞培养液分装于1.5mL离心管中，每管约1×106个细胞，离心去细胞液；
(3)人基因组提取：用天根TIANamp Genomic DNA Kit(离心柱型)提取。
2.引物：采用20对引物，序列如SEQ ID NO:3-42所示。
3.目的基因扩增
PCR反应体系：0.5μL Pfu DNA聚合酶(5U/μL)、2mM MgCl2、0.5μL dNTP(10mM)、2.5μL 10倍上下游引物混合物、100ng人基因组DNA，单组分/两组合/三组合的添加剂，ddH2O补足至20μL。
PCR扩增程序：98℃，20min；(98℃，15s；65℃，10min；68℃，1min；72℃，1min)×6cycles；(98℃，15s；68℃，1min；72℃，1min)×28cycles；72℃，10min；4℃，∞。
4.PCR扩增产物检测
实施例九：无添加剂，对照组。
实施例十：向多重PCR反应体系中添加0.25(w/v)％胆酸钠。
实施例十一：向多重PCR反应体系中添加0.5(w/v)％海藻糖。
实施例十二：向多重PCR反应体系中添加0.1％40nm纳米金颗粒。
实施例十三：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠。
实施例十四：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％鱼明胶。
向多重PCR反应体系中添加单一添加剂(胆酸钠、海藻糖、纳米金颗粒、鱼明胶均在最优用量下)的扩增效果如表一所示：向多重PCR反应体系中添加六偏磷酸钠时扩增效果最优。
表一、实施例十-十四扩增效果
实施例十-十四均与无添加剂的对照组对比，“/”表示基本无作用；“-”表示抑制作用；“+”表示促进作用；符号增多表示程度加深。
实施例十五：无添加剂，对照组。
实施例十六：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+0.1(w/v)％聚多卡醇(组合一)。
实施例十七：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+0.05(w/v)％鱼明胶(组合二)。
实施例十八：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+5ng/μL SSB(组合三)。
实施例十九：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+0.125μg/μLMutS(组合四)。
向多重PCR反应体系中添加两组分组合的扩增效果如图2所示，两组合添加剂较添加单一六偏磷酸钠对多重PCR扩增有进一步的促进作用。
实施例二十：无添加剂，对照组。
实施例二十一：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+0.1(w/v)％聚多卡醇+0.125μg/μL MutS(组合五)。
实施例二十二：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+0.05(w/v)％鱼明胶+0.125μg/μL MutS(组合六)。
实施例二十三：向多重PCR反应体系中添加0.05(w/v)％六偏磷酸钠+5ng/μL SSB+0.125μg/μL MutS(组合七)。
向多重PCR反应体系中添加三组合添加剂的扩增效果如图3所示，三组合添加剂对多重PCR扩增促进作用显著。
实施例二十四：将实施例二十二中的多重PCR反应体系中的Pfu DNA聚合酶换为0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)。
实施例二十五：将实施例十一中的六偏磷酸钠添加量换为0.005(w/v)％。
实施例二十六：将实施例十一中的六偏磷酸钠添加量换为0.5(w/v)％。
实施例二十七：将实施例十五中的聚多卡醇添加量换为0.005(w/v)％。
实施例二十八：将实施例十六中的鱼明胶添加量换为0.005(w/v)％。
实施例二十九：将实施例二十中的聚多卡醇添加量换为0.25(w/v)％、MutS添加量换为0.05μg/μL。
实施例三十：将实施例二十一中的鱼明胶添加量换为0.5(w/v)％、MutS添加量换为5μg/μL。
实施例三十一：将实施例二十二中的SSB添加量换为2ng/μL。
实施例三十二：将实施例二十四中的SSB添加量换为10ng/μL。
将PCR反应体系中的添加剂(浓度)和/或DNA聚合酶作替换，PCR扩增的促进作用基本相当。
表二、实施例二十四-三十二扩增效果
| 实施例 | 扩增效率 |
| 二十四 | ++++ |
| 二十五 | ++++ |
| 二十六 | ++++ |
| 二十七 | ++++ |
| 二十八 | ++++ |
| 二十九 | ++++ |
| 三十 | ++++ |
| 三十一 | ++++ |
| 三十二 | ++++ |
实施例二十四-三十二均与无添加剂的对照组对比，“+”表示促进作用；符号增多表示程度加深。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东菲鹏生物有限公司
菲鹏生物股份有限公司
<120> 一种改进核酸扩增反应的方法及其应用
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<211> 25
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 23
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<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 24
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<211> 25
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<400> 25
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<210> 26
<211> 21
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<400> 26
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<210> 27
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<400> 27
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<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物()
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<210> 29
<211> 25
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<400> 29
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<210> 30
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<400> 30
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<210> 31
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<211> 25
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<400> 32
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<211> 25
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 33
cccaatccaa tcatctttgc tcttt 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 34
aaactgacct tggatggaat ggaaa 25
<210> 35
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<210> 36
<211> 25
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<400> 36
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<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 37
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<211> 25
<212> DNA
<213> 引物()
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<212> DNA
<213> 引物()
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<212> DNA
<213> 引物()
<400> 42
gctaaggctg cagtaagatt agaaa 25
Claims (10)
1.一种改进核酸扩增反应的方法，其特征在于，包括将模板加入到含有六偏磷酸钠的反应体系中的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，六偏磷酸钠在所述反应体系中的终浓度为0.005-0.5(w/v)％；
可选的，六偏磷酸钠在所述反应体系中的终浓度为0.01-0.35(w/v)％。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系进一步含有聚多卡醇、明胶、单链结合蛋白、DNA错配修复蛋白中至少任意一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
聚多卡醇在所述反应体系中的终浓度为0.005-0.25(w/v)％；
可选的，明胶在所述反应体系中的终浓度为0.005-0.5(w/v)％；
可选的，单链结合蛋白在所述反应体系中的终浓度为2-10ng/μL；
可选的，DNA错配修复蛋白在所述反应体系中的终浓度为0.05-5μg/μL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包含DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物、缓冲液中至少任意一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应可以是聚合酶链式反应。
8.一种改进核酸扩增反应的组合物，其特征在于，所述组合物用于制备权利要求1-7中任一项所述的反应体系。
9.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的反应体系、或权利要求8所述的组合物。
10.权利要求1-7中任一项所述的方法、权利要求8所述的组合物、权利要求9所述的试剂盒在核酸扩增反应中的应用。
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2021
- 2021-02-05 CN CN202110160935.6A patent/CN114875124A/zh active Pending
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