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CN114867853A - 蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定 - Google Patents

蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定 Download PDF

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CN114867853A CN202080085264.5A CN202080085264A CN114867853A CN 114867853 A CN114867853 A CN 114867853A CN 202080085264 A CN202080085264 A CN 202080085264A CN 114867853 A CN114867853 A CN 114867853A
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G·特里吉安特
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Phoenix Eagle Co Pty Ltd
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Abstract

本发明涉及用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定的方法，用于产生包括已增强和稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，包括通过上述方法获得或可获得的已增强和稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物，这种组合物在制造药剂和化妆品中的用途，这种组合物在疾病和失调(包括伤口)的治疗中的用途，以及在化妆品上的应用，以及相关试剂盒。

Description

蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定
技术领域
本发明涉及用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定的方法，用于产生包括已增强和稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，包括通过上述方法获得或可获得的已增强和稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物，这种组合物在制造药剂和化妆品中的用途，这种组合物在疾病和失调(包括伤口)的治疗中的用途，以及在化妆品上的应用，以及相关试剂盒。
背景技术
木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶是用在用于清创(debridement)的药物产品和用于表皮脱落(exfoliation)和皮肤增亮(skin lightening)的化妆产品/药妆产品中的蛋白酶。正是木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的蛋白水解活性带来这种清创、表皮脱落和皮肤增亮的作用。然而，由于其蛋白水解活性的不稳定性，木瓜蛋白酶制剂和菠萝蛋白酶制剂都没有发挥其潜力。
先前已投入大量精力来开发稳定的组合物，该组合物通过去除死亡和受损组织来促进伤口愈合，例如在伤口(例如，烧伤和慢性溃疡)中发现的组织。有效的清创是至关重要的，因为死亡和临死的组织是机会性感染的极佳培养基。感染引起的败血症是严重烧伤患者死亡的主要原因。
一种先前的方法是使用蛋白水解酶，例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶。特别地，NexoBridTM(一种富含菠萝蛋白酶的蛋白水解酶浓缩物)于2012年在欧洲获得批准，用于患有深层部分和全层(deep partial-and full-thickness)热烧伤的成人的焦痂的去除(即清创)。然而，欧洲药品管理局在其2012年9月20日的“评估报告-Nexobrid-富含菠萝蛋白酶的蛋白水解酶浓缩物”第2.2.3节、第14页中证实，蛋白水解酶的组合物的一个普遍问题是蛋白水解活性的稳定性差，阐明：
“在25℃和37℃下的新相容性(使用中的稳定性)研究已被进行，证明NexoBrid在混合后数小时内降解。申请人关于该产品应当在混合后立即使用的结论，因此受到了支持。”
相应地，NexoBridTM典型地以冻干粉的形式供应，其在使用之前用凝胶载体加水复原(reconstituted)且必须在配制的15分钟内使用。因此，以备好待用的(ready-for-use)形式提供如NexoBridTM等组合物并无需加水复原，将是有利的。然而，这样做将需要清创活性的稳定性的显著增强，为的是实现可接受的保存期(shelf life)。
相似地，在营销为具有表皮脱落和/或皮肤增亮特性的含有木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶的化妆产品中，由于化妆产品中的木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶的活性丧失，表皮脱落活性通常在短时间内严重降低。
先前已经设想了一些方法来解决药品中蛋白酶的蛋白水解活性丧失问题，包括将酶于活性丧失低或不存在的pH下(木瓜蛋白酶的情况下，已使用酸性pH)储存或以固体形式储存。然而，这些处理需要专业的终端用户处理，以获得可行的产品。这限制了这种方法和组合物的有用性。
另一个先前尝试的途径是酶在聚合物基质上的固定，以防止流动性(mobility)和自身反应性。经固定的酶的例子是PEG-木瓜蛋白酶和壳聚糖-木瓜蛋白酶。尽管蛋白水解活性的稳定性可能通过这种方法被提高，但是该酶可能以不可逆的方式被化学地改变，并相应地在特定底物上可能不表现出足够的活性，特别是当应用至复杂底物时，例如皮肤和细胞蛋白。此外，这种酶的被改变的化学结构可以造成终端用户的有害反应，例如过敏和不耐受。
为了解决这些问题，支持本发明的研究，研究了提取自各种来源的蛋白酶的蛋白水解活性丧失，例如番木瓜(Carica papaya)(木瓜)植物(包括木瓜蛋白酶)和凤梨(Ananascomosus)(凤梨)植物(包括菠萝蛋白酶)。基于这些研究，开发了用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定的方法，特别是在含有源自木瓜和菠萝植物的蛋白酶的药物和化妆品/药妆品组合物中。
令人惊讶地和出乎意料地，发现一些增强了蛋白水解活性的稳定性的方法也显著增强了蛋白水解活性本身。
发明内容
本发明教导用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定的新方法。在具体的实施例中，所述蛋白酶获自或可获得自水果和/或蔬菜。相应地，在一些实施例中，所述蛋白酶获自水果和/或蔬菜，而在其他实施例中，所述蛋白酶获自重组表达系统。在具体的实施例中，所述蛋白酶为半胱氨酸蛋白酶。在具体的实施例中，所述半胱氨酸蛋白酶可能为木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2)、木瓜凝乳蛋白酶(EC 3.4.22.6)、菠萝蛋白酶(茎菠萝蛋白酶-EC3.4.22.32和果实菠萝蛋白酶-EC 3.4.22.33)、无花果蛋白酶(EC 3.4.22.3)或猕猴桃蛋白酶(EC 3.4.22.14)。在具体的实施例中，所述蛋白酶获自或可获得自番木瓜(Caricapapaya)(木瓜)植物或凤梨(Ananas comosus)(凤梨)植物。在具体的实施例中，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。
在第一方面，本发明提供一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气。在一个实施例中，所述氧气通过对所述制剂脱气而去除。在一个实施例中，所述蛋白酶被包装在实质上无氧的气氛中。
在一个相关方面，本发明提供一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括(i)提供包括所述蛋白酶的溶液或凝胶；(ii)将所述溶液或凝胶中的所述蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(iii)去除所述溶液或凝胶的实质上全部的氧气。
在第二方面，本发明提供一种用于产生包括已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气。在一个实施例中，所述氧气通过对所述组合物脱气而去除。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在一个相关方面，本发明提供一种用于产生包括已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括(i)提供包括所述蛋白酶的溶液或凝胶；(ii)将所述溶液或凝胶中的所述蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(iii)去除所述溶液或凝胶的实质上全部的氧气。
在第三方面，本发明提供一种组合物，其包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶，其中所述组合物通过第一方面的方法获得或可获得，例如一种方法，其包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气。在一个实施例中，所述氧气通过对所述组合物脱气而去除。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在第四方面，本发明提供一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶和还原剂，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，并且其中所述组合物为实质上无氧。在一个实施例中，氧气通过对所述组合物脱气而去除。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
根据本发明，蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定也可能通过将蛋白酶固定在阴离子聚合物基质上来实现。阴离子聚合物的使用使蛋白酶与所述基质非共价结合成为可能。这与本领域先前的通过与基质材料形成共价连接来固定蛋白酶的方法形成对比，例如通过将所述蛋白酶的部分伯胺与卡波姆的羧基反应，其中使用胺类活性交联试剂，所述蛋白酶的部分剩余伯胺被交联。
相应地，在第五方面，本发明提供一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括将蛋白酶和阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在第六方面，本发明提供一种用于产生包括已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括将蛋白酶和阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在第七方面，本发明提供一种组合物，其包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶，其中所述组合物通过一种方法获得或可获得，所述方法包括将蛋白酶和阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在第八方面，本发明提供一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶和阴离子聚合物基质，其中所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
本发明中所教导的方法也可以进行结合。例如，第一方面的方法可以与第五方面的方法结合，或者第二方面的方法可以与第六方面的方法结合。
相应地，在第九方面，本发明提供一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述氧气通过对所述制剂脱气而去除。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述蛋白酶被包装在实质上无氧的气氛中。
在一个实施例中，步骤(iii)在步骤(i)和(ii)之前进行。在另一个实施例中，步骤(i)至(iii)按该顺序进行。
在一个相关方面，本发明提供一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括(i)提供包括所述蛋白酶的溶液；(ii)将所述溶液中的所述蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态；(iii)去除所述溶液的实质上全部的氧气；以及(iv)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
在一个实施例中，步骤(iv)在步骤(i)至(iii)之前进行。在另一个实施例中，步骤(i)至(iv)按该顺序进行。
在第十方面，本发明提供一种用于产生包括已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述氧气通过对所述制剂脱气而去除。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在一个相关方面，本发明提供一种产生包括已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括(i)提供包括所述蛋白酶的溶液或凝胶；(ii)将所述溶液或凝胶中的所述蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态；(iii)去除所述溶液或凝胶的实质上全部的氧气；以及(iv)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
在第十一方面，本发明提供一种组合物，其包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶，其中所述组合物通过第九方面的方法获得或可获得，例如一种方法，其包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶和阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，所述氧气通过对所述制剂脱气而去除。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在第十二方面，本发明提供一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶、还原剂和阴离子聚合物基质，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，所述组合物为实质上无氧，以及所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。在一个实施例中，氧气通过对所述组合物脱气而去除。在一个实施例中，所述聚合物为卡波姆。在一个实施例中，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
在一个实施例中，所述组合物为凝胶的形式。
在第十三方面，本发明提供第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物在制造药剂中的用途。在一些实施例中，所述药剂用于疾病和失调的治疗，所述疾病和失调包括伤口。在一些实施例中，所述药剂为用于清创。在一些实施例中，所述药剂为用于治疗烧伤。在一些实施例中，所述药物为用于治疗溃疡。在一些实施例中，所述药物为用于治疗坏疽。
在第十四方面，本发明提供第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物在制造化妆品中的用途。在一些实施例中，所述化妆品为用于表皮脱落、皮肤增亮，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损皮肤。
在第十五方面，本发明提供一种药物组合物，其包括第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂。
在第十六方面，本发明提供一种化妆品组合物，其包括第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物，以及化妆品上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂。
在第十七方面，本发明提供第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物，或第十五方面的药物组合物，其用于疾病和失调的治疗，所述疾病和失调包括伤口。在一些实施例中，所述治疗为清创。在一些实施例中，所述治疗为用于烧伤。在一些实施例中，所述治疗为用于溃疡。在一些实施例中，所述治疗为用于坏疽。在一些实施例中，所述组合物为局部应用。
在第十八方面，本发明提供一种用于疾病和失调的治疗的方法，所述疾病和失调包括伤口，其中所述方法包括向受试者施用第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物，或第十五方面的药物组合物。在一些实施例中，所述治疗为清创。在一些实施例中，所述治疗为用于烧伤。在一些实施例中，所述治疗为用于溃疡。在一些实施例中，所述治疗为用于坏疽。在一些实施例中，所述组合物为局部应用。
在第十九方面，本发明提供第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物，或第十六方面的化妆品组合物，其用于皮肤增亮、表皮脱落，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损的皮肤。
在第二十方面，本发明提供试剂盒，其包括第三、第四、第七、第八、第十一和/或第十二方面的组合物、第十五方面的药物组合物或第十六方面的化妆品组合物。在一个实施例中，所述试剂盒用于进行第十八方面的方法或用于第十七和第十九方面的用途。
与先前可获得的组合物相比，本发明的组合物不需要为了对于药物和/或化妆用途是充分稳定的而被冻干。因此，这种组合物可以配制为，例如，胶囊、片剂、乳膏、软膏、溶液、糊剂、滴剂、喷雾剂、气溶胶、蒸汽、湿巾、贴片、纱布、凝胶或液体。相应地，在一个实施例中，本发明的组合物被提供或包装为胶囊、片剂、乳膏、软膏、乳剂、溶液、糊剂、滴剂、喷雾剂、气溶胶、蒸汽、湿巾、贴片、纱布、凝胶或液体，并且使用之前不需要被加水复原。在一个优选的实施例中，本发明的组合物以凝胶或液体的形式被提供或包装，并且使用之前不需要被加水复原。
附图说明
图1.X+Y、Z和X+Y+Z处理的Opal的稳定性。显示在X+Y、Z和X+Y+Z处理后，按照BApNA测定法测量的总蛋白水解活性。与初始Opal活性的比率(2E3 USP units/mL)。在t＝0时的活性反映了通过X+Y、Z和X+Y+Z处理的蛋白水解活性的立即增强。所有处理均在相同批次的Opal上进行。
图2.X+Y、Z和X+Y+Z处理的木瓜蛋白酶的稳定性。显示在X+Y、Z和X+Y+Z处理后，按照BApNA测定法测量的总蛋白水解活性。与初始P活性的比率(1E4 USP units/mL)。在t＝0时的活性反映了通过X+Y、Z和X+Y+Z处理的蛋白水解活性的立即增强。所有处理均在相同批次的木瓜蛋白酶上进行。
图3.X+Y、Z和X+Y+Z处理的菠萝蛋白酶的稳定性。显示在X+Y、Z和X+Y+Z处理后，按照BApNA测定法测量的总蛋白水解活性。与初始B活性的比率(1.5E4 USP units/mL)。在t＝0时的活性反映了通过X+Y、Z和X+Y+Z处理的蛋白水解活性的立即增强。所有处理均在相同批次的菠萝蛋白酶上进行。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本文所使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解具有相同含义。虽然在本发明的实践或测试中可能使用任何与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中使用，指的是该冠词的语法对象的一个或超过一个(即，至少一个)。例如，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素。
“大约(about)”是指相对于参考数量(quantity)、水平(level)、值(value)、数目(number)、频率(frequency)、百分比(percent)、尺寸(dimension)、大小(size)、数(amount)、重量(weight)或长度(length)，变化多达20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数、重量或长度。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为是指包含所述步骤或元素或步骤组或元素组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤组或元素组。因此，术语“包括(comprising)”及其相似的词的使用表示所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是可选的，以及可能存在或可能不存在。“由……组成(consisting of)”是指包括并限于短语“由……组成”之间的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，并且其他要素可能不存在。“基本上由……组成(consisting essentially of)”是指包括在该短语之间列出的任何元素，并且限于不妨碍或有助于在所列元素的公开内容中特定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是可选的，以及存在与否取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。
术语“清创(debridement)”指的是伤口中死亡和受损组织的去除。
当用于关于本发明的组合物时，术语“可获得的(obtainable)”不仅包括通过具体的特定方法产生的组合物，而且包括用任何方法产生的相同组合物，例如通过从水果或蔬菜获得的蛋白酶，或通过重组DNA技术或其他基因工程方法(例如，通过使用重组表达系统)。
“分离的(isolated)”是指实质上或基本上不受通常在其天然状态伴随其的组分的限制的材料。例如，如本文所使用，“分离的蛋白酶”指的是肽或多肽蛋白酶分子从其天然细胞环境和从与细胞的其他组分的联系中的体外分离和/或纯化，即其与体内物质没有关联。
术语“Opal”指的是获自木瓜果实(不包括果皮的乳液)的含有木瓜蛋白酶的组合物。例如，Opal可能通过国际专利申请号PCT/AU2003/000931(公开号为WO2004/008887)所公开的方法制备，其全部内容以引用的方式全文并入。
术语“患者(patient)”、“受试者(subject)”和“个体(individual)”可互换地使用，指的是人类或其他哺乳动物的患者、受试者和个体，且包括渴望使用本发明来治疗、预防、改善或降低疾病、失调或病症的严重性的任何人。然而，将理解的是，“患者”不暗示着症状存在。落入本发明范围的适合哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人类、黑猩猩)、家畜(例如，羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验用动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如，猫、狗)和圈养的野生动物(例如，狐狸、鹿、澳洲野狗)。
在整个说明书中，短语“实质上无氧(substantially oxygen-free)”包括小于1ppm的浓度。
如本文所使用，短语“蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定(enhancementand/or stabilisation of the proteolytic activity of a protease)”和“已增强和/或稳定的蛋白水解活性(proteolytic activity that has been enhanced and/orstabilised)”及等同短语，指的是用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强的方法和用于蛋白酶的蛋白水解活性的稳定的方法，例如通过增加、保持、延长或减缓蛋白酶以相对于给定的时间单位(unit of time)或相对于参考活性水平进行其通常的酶促功能的能力的下降。这种方法可能因此造成一种蛋白酶组合物，其进行其酶促功能的时间比不存在该方法的情况下进行其酶促功能所花费的时间更短。可替换地，该方法可能造成该蛋白酶进行其酶促功能的活性水平比不存在该方法的情况下更高，例如，当在进行该方法后的具体时间点或多个时间点测量时。所花费更少的时间或活性的更高水平还可能相对于一系列其他因素被测量，包括但不限于暴露于热和灭菌辐射，以及该蛋白酶组合物的储存时间和储存条件，和此外，任何运输条件(包括温度、湿度和大气压力)。
蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定可能被测量或证实，例如，通过比较受本发明的方法影响的蛋白酶(例如，“样品A”)的酶促活性与没有受本发明的方法影响的蛋白酶(例如，“对照样品”，其可能例如是野生型或天然存在的蛋白酶)的稳定性。这种样品之间的比较可以被进行，例如，在本发明的方法已被进行后的特定时间，为的是确定“样品A”蛋白酶相对于对照样品的稳定性和/或活性的增加。
术语“野生型(wild-type)”和“天然存在的(naturally occurring)”可互换地使用，指的是在种群(population)中最常观察到的基因产物(例如，多肽(如蛋白酶))，并因此被任意地指定为该基因的“正常”或者“野生型”形式。
术语“伤口(wound)”是指活体组织的伤害，其中皮肤被切割(cut)或破裂(broken)，并包括皮肤溃疡和烧伤。皮肤溃疡可能包括糖尿病性溃疡、压力性溃疡、静脉性(或静脉曲张性)溃疡和动脉性溃疡。
本说明书对任何现有技术的引用，不是且不应被视为承认或以任何形式的暗示现有技术形成本领域技术人员的公知常识的一部分。
本说明书所列举的所有出版物、专利、专利申请和其他材料的全部内容以引用的方式并入本文。
发明详细说明
半胱氨酸蛋白酶，也称为硫醇蛋白酶和半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)，是降解蛋白质的酶。它们共有共同的催化机制，即需要催化三联体或二联体中的亲核的半胱氨酸硫醇。它们出现在各种生物体中。特别地，它们通常在水果中被发现，包括木瓜(Carica papaya和Vasconcellea cundianmarcensus)、凤梨(Ananas comosus)、无花果(Ficus carica)和猕猴桃(Actinidia chinensis)，但也可能在各种其他水果和蔬菜中被发现。半胱氨酸蛋白酶可能通过各种方法获得，包括从生物材料(例如，果实提取物)中提取(例如从木瓜果肉)，或通过在适合的宿主细胞中重组表达。在一个实施例中，存在于本发明的组合物或基于本发明方法的蛋白酶是从木瓜的成熟果肉中制得的蛋白酶，例如通过WO2004/008887所描述的方法。在另一个实施例中，所述蛋白酶是菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.33)。
稳定性程序
在本发明的一个方面，包括半胱氨酸蛋白酶的组合物受用还原剂处理的影响，这使所述蛋白酶的活性部位(active site)半胱氨酸氨基酸残基保持在还原态。当被氧化时，半胱氨酸残基可以形成破坏酶促活性的二硫键(disulphide bridges)。还原剂可以帮助所述活性部位残基保持在还原形式，也可以将已被氧化的半胱氨酸残基转换为还原形式。适合的还原剂是本领域已知的并包括半胱氨酸。添加的还原剂的量一般应当足以使溶解状态的蛋白酶的全部或大部分活性部位半胱氨酸残基再生并将其保持在还原形式。这将典型地需要过量添加还原剂。在一个实施例中，所述还原剂(例如半胱氨酸)的浓度，典型地为10至200mM，例如50至150mM。在具体的实施例中，所述还原剂(例如半胱氨酸)的浓度为60至140mM、70至130mM、80至120mM、90至100mM、92至108mM、94至106mM、96至104mM或98至102mM。在一个具体的实施例中，所述还原剂(例如半胱氨酸)的浓度为大约100mM或100mM。
所述组合物可能例如为以包括所述蛋白酶的液体或凝胶的形式。在一个实施例中，在用还原剂进行上述处理步骤之前，所述蛋白酶先前已与阴离子聚合物结合，如下文所述。
所述组合物还可能基于去除存在于所述蛋白酶周围的区域中的实质上全部的氧气的步骤，例如，存在于含有所述蛋白酶的液体或凝胶(例如溶液)的实质上全部的氧气。这可以例如通过对所述组合物脱气(degassing)来实现，例如用惰性气体(例如氮气或氩气)冲洗(flushing)所述组合物。例如，以25mL/s的流速，氮气或氩气清除(purging)20-40min，可以实现大约0.2-0.4ppm的剩余溶解氧。去除存在于所述组合物的实质上全部的氧气的其他方法也可能被利用且将是本领域技术人员已知的，例如但不限于，在大气压或减压(reduced pressure)下加热，或在大气压或减压下超声处理。氧气去除的步骤可以在还原剂的添加之前、同时或紧随其后进行。
所得组合物包括半胱氨酸蛋白酶和还原所述半胱氨酸蛋白酶的一个或多个活性部位半胱氨酸残基的还原剂，其中所述组合物是实质上无氧的。作为与所述组合物中所述半胱氨酸蛋白酶和/或的其他组分反应的结果，所述还原剂的至少一部分可能处于氧化态。
为了降低储存期间与氧气的接触，所述组合物可以被包装，以降低或防止氧气的吸收。例如，所述组合物可能被包装在实质上无氧的气氛(atmosphere)中，例如在有惰性气体(例如氮气或氩气)的容器中。可替换地，所述组合物可能为真空包装。
在另一方面(其也可以与本发明的上述方面结合)，阴离子聚合物基质可以与半胱氨酸蛋白酶结合，以便所述半胱氨酸蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。这旨在以非共价方式分离酶分子，并因此限制自溶和酶失活。阴离子聚合物的选择一般基于木瓜蛋白酶和相关蛋白酶的高等电点(pI)，这意味着它们在中性pH值下带正电荷。
所述阴离子聚合物还可能被选择，使得其形成凝胶，例如在6.5和8之间的pH或在碱性pH下。
在一个实施例中，所述阴离子聚合物基质为聚丙烯酸，例如丙烯酸的均聚物、共聚物或互聚物。所述阴离子聚合物典型地具有高分子量。均聚物的例子是丙烯酸的聚合物，其与几种多元醇的烯丙基醚(例如，季戊四醇烯丙基醚、蔗糖的烯丙基醚、或丙烯的烯丙基醚)中的任意一种交联。共聚物的例子是与例如烯丙基季戊四醇醚交联的丙烯酸和C10-C30丙烯酸烷基酯的聚合物。适合的阴离子聚合物的特定例子是卡波普(Carbopol)、CarbopolUltrez、卡波姆(Carbomer)910、卡波姆934、卡波姆934p、卡波姆940和卡波姆941(可获自路博润(Lubrizol))。
所述阴离子聚合物可以与所述蛋白酶结合，以产生液体悬浮液。阴离子聚合物的浓度可能为0.01至3％w/w或更多，例如0.1至2％w/w。如果与本发明的其他方面结合，另外如果尚未进行，所述还原剂可以在此阶段被添加且氧气被去除，例如通过氮气冲洗。然后，碱可以被添加以引起所述液体悬浮液的凝胶化，以产生黏稠的(viscous)凝胶，例如通过将pH调整到7.5至8。
这三个不同的处理步骤可以按不同的顺序进行。例如，可能首先进行与所述阴离子聚合物结合，然后按任一顺序进行所述还原剂的添加/氧气的去除。可替换地，可以按任一顺序进行所述还原剂的添加/氧气的去除，接着是与所述阴离子聚合物结合。在所述还原剂和氧气的去除步骤之间，进行与所述阴离子聚合物的结合也会是可能的。各个步骤可能被依次或同时(或有一定程度的重叠)进行。
本发明的组合物典型地表现出比相应的未经处理的蛋白酶对照样品(即不与阴离子聚合物非共价结合且在正常的氧化条件下储存，例如在大气氧气水平下且不添加还原剂)，更大的蛋白水解活性的稳定性。例如，本发明的一些蛋白酶组合物，特别是木瓜蛋白酶(P)和木瓜提取物(例如Opal)，在室温和压力下储存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60天或更长时间后，可能表现出至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％的蛋白水解活性；而其他，特别是菠萝蛋白酶(B)，在室温和压力下储存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天或更长时间后，可能表现出至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％的蛋白水解活性。测量的活性可能与紧接着根据本发明的程序处理的活性比较。
在一些实施例中，本发明的蛋白酶组合物的初始蛋白水解活性大于未经处理的蛋白酶组合物，例如与未经处理的蛋白酶相比，具有至少1.5倍的活性，例如至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍活性。出于比较的目的，所述初始活性可以在已进行的处理步骤后被立即测量。
活性可以使用BApNA分光光度法来测量：BApNA溶液(10mM，DMSO中)可以与反应缓冲液(磷酸二氢钾100mM、氯化钾116mM和EDTA 3mM，pH 6)同时制备。预混合液可以用2份水、2份反应缓冲液和1份v/v BApNA制得。分光光度计(例如Jasco V-630 UV-Vis分光光度计)可以在410nm，用预混合溶液作为空白(blanked)。然后，将1/5v/v的水添加至对照样品和阳性样品中，并之后立即开始读数。相对酶活性可以用所得线的斜率来测量。
组合物
与先前可获得的组合物相比，本发明的组合物不需要为了对于药物和/或化妆用途是充分稳定的而被冻干。因此，这种组合物可以配制为，例如，胶囊、片剂、乳膏、软膏、溶液、糊剂、滴剂、喷雾剂、气溶胶、蒸汽、湿巾、贴片、纱布、凝胶或液体。相应地，在一个实施例中，本发明的组合物被提供或包装为胶囊、片剂、乳膏、软膏、乳剂、溶液、糊剂、滴剂、喷雾剂、气溶胶、蒸汽、湿巾、贴片、纱布、凝胶或液体，并且使用之前不需要被加水复原。在一个优选的实施例中，本发明的组合物以凝胶或液体的形式被提供或包装，并且使用之前不需要被加水复原。
在本发明的具体方面，所述组合物可能为凝胶或液体的形式。所述组合物的蛋白水解活性的提高的稳定性，使其能够以液体或凝胶形式被提供，这意味着它是即用的，并且使用之前不需要被立即加水复原。这对所述组合物的施用高度有利，并可能在难以加水复原冻干组合物的情况下是有用的，例如在伤口(例如烧伤)需要立即治疗的临床环境外。
所述组合物也可能被吸收到固体材料内/吸收到固体材料上，例如伤口敷料。所述组合物也可能与载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂药学上和/或化妆品上结合，以获得本发明的药物或化妆品组合物。因此，本发明的组合物可能被配制为包括一种或多种额外的成分。
例如，表面活性剂可能作为所述蛋白酶组合物的一部分被使用，为的是提高所述组合物的物理特性。表面活性剂的存在并不影响所述组合物的功效。因此，所述组合物也可能并入任何适合的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，例如山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。适合的表面活性剂还可能包括十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂醇硫酸铵、月桂醇硫酸钠和肉豆蔻醇聚醚硫酸钠。表面活性剂通常用于减少非特异性吸附，并需要谨慎的选择和优化。悬浮剂(例如天然胶、纤维素衍生物或无机材料(例如含硅的二氧化硅(silicaceous silicas)以及其他成分(例如羊毛脂))也可能被包括。
组合物可能根据本领域普通技术人员已知的方法被制备，并还可能包括额外的载体、赋形剂或稀释剂。就与所述组合物的其他成分相容而言，载体、赋形剂和稀释剂必须是“可接受的”，并对组合物的形成是非有害的，如果需要的话将能够储存更长时间。这种载体、赋形剂和稀释剂可能被用于进一步增强本发明的组合物的完整性和半衰期。
可接受的载体或稀释剂的进一步例子是脱盐或蒸馏(demineralised ordistilled)水；盐溶液；基于植物的油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲基苯基聚硅氧烷(methylphenyl polysolpoxane)；挥发性硅酮；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇(alkanols)，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇(aralkanols)；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油(glycerin)；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄蓍胶或阿拉伯树胶，以及石油凝胶。载体(例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素、聚乙烯醇和聚氧化乙烯)也可能被使用。
可能被包含在本发明的组合物中的额外的载体包括非还原性糖(例如蔗糖)和还原性糖(例如乳果糖)。这种载体以及糖醇(例如甘露醇、木糖醇、甘油(glycerol)和山梨醇)对于包括在本发明的组合物中也是有用的，因为它们可以作为抗氧化剂和潜在的稳定剂。
用于制备可施用的组合物的方法对于本领域技术人员是显而易见的，并在例如Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.中详细描述，通过引用的方式并入本文。
用途
本发明的组合物可以用在与疾病(diseases)、失调(disorders)和病症(conditions)的治疗相关的各种药物上的应用，包括皮肤病和伤口。本发明的组合物还可以用在各种化妆品上的应用。
相应地，本发明进一步提供伤口的清创的方法，其包括本发明的组合物的局部施用，用于治疗伤口的方法的本发明的组合物，治疗患有烧伤的个体的方法，其中所述方法包括向所述个体的患处(affected area)局部或通过其他施用途径施用本发明的制剂，用于或当用于治疗伤口的方法的本发明的组合物，增强伤口愈合的方法，其包括向伤口局部或通过其他施用途径施用本发明的组合物，表皮脱落或皮肤增亮的方法，其包括向皮肤应用本发明的化妆品组合物，本发明的化妆品组合物来表皮脱落或皮肤增亮的用途，治疗干燥、老化或受损皮肤的方法，其包括向皮肤应用本发明的化妆品组合物，以及本发明的化妆品组合物来治疗干燥、老化或受损皮肤的用途。
本发明的蛋白酶组合物可能特别地被用于预防、治疗、降低或改善各种皮肤病，包括伤口(包括慢性伤口，例如血管性/压力性皮肤溃疡、烧伤)和其他皮肤病(包括但不限于湿疹、银屑病、痤疮、红斑痤疮、鱼鳞癣、白癜风、荨麻疹、脂溢性皮炎)。
本发明的组合物可能在治疗上或化妆品上被施用。在这种应用中，组合物可能被施用到已患某种病症的受试者，以足以治愈或至少部分阻止该病症和任何并发症的量。所述组合物的数量应当足以有效地治疗该患者。
所述组合物还可能以脂质体的形式被施用。脂质体可能源自磷脂或其他脂质物质，并可能是由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成的。能够形成脂质体的任何无毒、生理上可接受的且可代谢的脂质可能被使用。以脂质体形式的组合物可能含有稳定剂、防腐剂和赋形剂。优选的脂质包括天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。产生脂质体的方法是本领域已知的，并且就此，具体参考：Prescott,Ed.,Methods in CellBiology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.Y.(1976),p.33et seq.，其内容以引用的方式并入本文。
剂量
对于任何具体患者的“治疗上有效的”剂量水平将取决于各种因素，其包括所治疗的病症及该病症的严重性，所利用的组合物的活性，患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食，施用时间，施用途径，治疗的持续时间，与治疗组合或碰巧使用的药物，以及本领域中公知的其他相关因素。因此，本领域技术人员将能够通过常规的实验，来确定治疗适用病症所需的组合物的有效、无毒量。
进一步地，对本领域普通技术人员将是显而易见的是，组合物的单个剂量的最佳数量和时间间隔将由所治疗的病症的性质和程度，施用形式、途径和部位，和所治疗的具体个体的性质确定。而且，这种最佳条件可以通过常规技术确定。
对于本领域普通技术人员还显而易见的是，本领域技术人员可以使用常规的治疗疗程确定试验(course of treatment determination tests)来确定最佳的治疗疗程，例如在限定的天数内每天给予的组合物的剂量数目。
施用途径
本发明的组合物可以通过标准途径来施用。一般来说，所述组合物可能通过局部途径被施用。典型地，本发明的组合物被局部施用至个体的患处。
在其他实施例中，所述组合物可能通过其他肠内/肠溶(enteral/enteric)途径(例如直肠、舌下或唇下)或经由中枢神经系统(例如穿过硬膜外、脑内或脑室内)途径被施用。其他用于施用的位置可能包括经由表皮(epicutaneous)、经皮、皮内、鼻、动脉内、心内、骨内、鞘内、腹膜内、膀胱内、玻璃体内、海绵窦内(intracavernous)、阴道内或子宫内途径。
疗法的时间
典型地，在治疗上的应用中，治疗将在疾病状态的持续时间内进行。
本领域技术人员将明白的是，在诊断时或其后，本文所公开的组合物可能作为单一药剂或作为本文所公开的方法的组合治疗方法的一部分被施用，例如，作为后续治疗或巩固疗法，作为目前可获得的这种治疗的疗法的补充。本文公开的组合物也可能作为预防疗法，用于遗传上或环境上易患这种疾病的受试者。
只要需要，所述组合物可能被有规律地施用，例如直到看到病症的改善。因此，其可能被每小时、每天多次、每天、每周多次、每周、每月或以任何被视为适当的频率施用。
试剂盒
本发明的试剂盒促进本发明的方法和用途的利用。典型地，用于实施本发明的方法或用途的试剂盒包含实施该方法的全部的必要试剂和手段。例如，在一个实施例中，所述试剂盒可能包括本发明的组合物以及，可选地，施用所述组合物的手段，例如用于定点照护(point of care)方法的装置。
典型地，本文所描述的试剂盒还将包括一个或多个容器。在本发明的上下文中，分隔化的试剂盒包括任何采用独立容器乘放组合物的试剂盒，并可能包括小玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸条。这种容器可能允许组合物从一个隔间向另一隔间的有效转移，同时避免组合物的交叉污染，并允许每个容器的试剂或溶液以定量的方式从一个隔间添加到另一个。
典型地，本发明的试剂盒还将包括使用该试剂盒来进行适当方法和用途的说明。
本发明的方法、用途、组合物和试剂盒同等地适用于任何动物(包括人类)，例如包括非人灵长类动物、马、牛、绵羊、山羊、野兔、鸟类、猫科动物和犬科动物物种。相应地，为了应用于不同物种，本发明的单一试剂盒可能是适用的，或者可替换地不同的试剂盒可能是所需要的，例如含有用于每个单独物种的特定成分。
本领域的技术人员将理解和明白的是，本文所公开的不同特征可能被组合以形成本发明范围内的特征组合。
列举的实施例
1.一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
2.实施例1所述的方法，其中所述蛋白酶被包装在实质上无氧的气氛中。
3.一种产生包含已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
4.实施例3所述的方法，其中所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
5.实施例1至4中任一项所述的方法，其中氧气通过对所述制剂脱气而去除。
6.实施例1至5中任一项所述的方法，其中所述聚合物为卡波姆。
7.一种包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物，其中所述组合物通过一种方法获得或可获得，所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
8.一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶、还原剂和阴离子聚合物基质，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，所述组合物为实质上无氧，以及所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
9.实施例7或8中任一项所述的组合物，其中氧气通过对所述组合物脱气而去除。
10.实施例7至9中任一项所述的组合物，其中所述聚合物为卡波姆。
11.实施例7至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
12.一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气。
13.实施例12所述的方法，其中所述蛋白酶被包装在实质上无氧的气氛中。
14.一种用于产生含有已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(ii)去除所述组合物周围的区域的实质上全部的氧气。
15.实施例12至14中任一项所述的方法，其中所述氧气通过对所述组合物脱气而去除。
16.实施例14或15中任一项所述的方法，其中所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
17.一种包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物，其中所述组合物通过一种方法获得或可获得，所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及(ii)去除所述组合物周围的区域的实质上全部的氧气。
18.一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶和还原剂，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，以及其中所述组合物为实质上无氧。
19.实施例17或18中任一项所述的组合物，其中氧气通过对所述组合物脱气而去除。
20.实施例17至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
21.一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其中所述方法包括将蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
22.一种用于产生已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其中所述方法包括将蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
23.实施例21或22中任一项所述的方法，其中所述聚合物为卡波姆。
24.实施例21至23中任一项所述的方法，其中所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
25.一种组合物，其包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶，其中所述组合物通过一种方法获得或可获得，其中所述方法包括将蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
26.一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶和阴离子聚合物基质，其中所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
27.实施例25或26中任一项所述的组合物，其中所述聚合物为卡波姆。
28.实施例25至27中任一项所述的组合物，其中所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
29.实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物在制造用于疾病和失调的治疗，用于清创，或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽的药剂中的用途，所述疾病和失调包括伤口。
30.实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物在制造用于皮肤增亮、表皮脱落，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损皮肤的化妆品中的用途。
31.一种药物组合物，其包括实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂。
32.一种化妆品组合物，其包括实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物，以及化妆品上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂。
33.实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物或实施例31所述的药物组合物，其用于疾病和失调的治疗，用于清创，或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽，所述疾病和失调包括伤口。
34.实施例33所述的组合物，其中所述组合物为局部应用。
35.一种用于疾病和失调的治疗、用于清创或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽的方法，其中所述方法包括向受试者施用实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物或实施例31所述的药物组合物，所述疾病和失调包括伤口。
36.实施例35所述的方法，其中所述组合物为局部应用。
37.实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物或实施例32所述的化妆品组合物，其用于皮肤增亮、表皮脱落，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损皮肤。
38.一种试剂盒，其包括实施例7至11、17至20或25至28中任一项所述的组合物、实施例31所述的药物组合物或实施例32所述的化妆品组合物。
39.实施例38所述的试剂盒，其用于或当用于疾病和失调的治疗，用于清创，或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽，或用于皮肤增亮、表皮脱落，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损皮肤，所述疾病和失调包括伤口。
参照以下实例，本发明现在将被进一步描述，这些实例仅为说明性的且非限制性的。
实例
半胱氨酸蛋白酶是特征为活性部位中存在氨基酸半胱氨酸的蛋白酶家族。这种含硫氨基酸对蛋白水解活性起作用的原因，是与辅助的(accessory)组氨酸残基一起，通过攻击肽键的酰胺羰基来形成硫酯，硫酯随后被水攻击以再生半胱氨酸并释放羧酸。
半胱氨酸蛋白酶被发现在大量植物物种的乳液(latex)中大量存在，例如番木瓜(Carica papaya)(木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、番木瓜蛋白酶、氨基乙酰基肽链内切酶)、无花果属(无花果蛋白酶)和凤梨科的几个成员，例如凤梨(Ananas comosus)(菠萝蛋白酶)。
然而，半胱氨酸蛋白酶承受限制其有用性的主要弱点：半胱氨酸对氧化特别敏感，因为硫醇基团的相对强的还原电位(E0＝-0.34V)。因此，在氧气或氧化剂的存在下，硫醇将经历一系列氧化步骤，最终产生磺酸基团(-SO3-)。由于这些氧化的物种(oxidisedspecies)都没有保留对肽键的催化活性，氧化可以使半胱氨酸蛋白酶失活。
蛋白酶的蛋白水解稳定性差的另一个原因是自溶。因为蛋白酶本身是蛋白质，它们可以被活性蛋白酶降解，从而导致蛋白水解活性的丧失。这适用于全部蛋白酶(包括半胱氨酸蛋白酶)，并无需外部试剂，例如氧气。尽管不希望受理论束缚，但本发明因此可能防止或抑制自溶。
目前的研究已经发现并测试了显示出增强和稳定蛋白酶的蛋白水解活性的方法的组合。因此，这些方法为氧化损伤和自溶引起的蛋白酶失活问题提供解决方案。
一个方面，本发明的方法涉及作为还原剂的半胱氨酸的添加，以将蛋白酶的活性部位半胱氨酸残基保持在还原态，和该蛋白酶周围的区域的氧气的实质上的去除，例如，用稳定的气体(例如氮气或氩气)冲洗溶液。
在一个额外或可替换方面，还测试了阴离子聚合物(例如交联聚丙烯酸酯)的添加，其作为以非共价方式分离蛋白酶的手段并因此限制自溶。基于木瓜蛋白酶和相关蛋白酶的高pI的阴离子聚合物的选择，意味着其在中性pH下带正电荷。相应地，本发明可能导致蛋白酶通过可逆的静电相互作用，与聚合物结合。
材料和方法
来自植物乳液的木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶(工业级)获自Sigma Aldrich。含有木瓜蛋白酶的组合物获自木瓜果实(不包括果皮的乳液)。这种含木瓜蛋白酶的组合物(例如Opal)，可能例如通过国际专利申请PCT/AU2003/000931(公开号为WO2004/008887)所公开的方法制备，其全部内容以引用的方式并入本文。
氮气获得自BOC Gases(UK)和Carbopol Ultrez获得自Lubrizol Inc(OH,USA)。全部其他化学品均购自Sigma Aldrich。分光光度计读数在Jasco V-630UV-Vis分光光度计上获取。
半胱氨酸的添加：半胱氨酸被添加到每个样品中，至最终浓度为100mM。
氮气冲洗：将样品置于塑料小瓶中，且氮气在室温下被通入溶液5分钟。每个小瓶立即被关闭，以防止氧气进入。
Carbopol的添加：Carbopol Ultrez被添加到每个溶液中，至最终浓度为0.25％，产生液体悬浮液。对于无氧样品，氮气冲洗在此阶段进行。NaOH 10M的随后添加(1:1000，最终为10mM)引起溶液的立即凝胶化，产生黏稠的凝胶。
BApNA分光光度法：BApNA 溶液(在DMSO中10mM)与反应缓冲液(磷酸钾100mM、氯化钾116mM和EDTA 3mM，pH 6)同时制备。
用2份水、2份反应缓冲液和1份v/v BApNA制备预混液。分光光度计在410nm处用该溶液作为空白。然后向对照样品和阳性样品中添加1/5v/v水，并然后立即开始读数。相对酶活性作为所得线的斜率被测量。
关键
Opal(或O)–木瓜提取物；P–木瓜蛋白酶；B–菠萝蛋白酶，每个用以下测定：
·没有处理(O、P或B)，
·Z处理–Carbopol(0.25％)，
·XY处理–半胱氨酸(X)的添加和氮气脱气(Y)，或
·XYZ处理–半胱氨酸(X)的添加和氮气脱气(Y)和Carbopol(0.25％)。
Opal的稳定：新鲜制得的Opal(16mL)被分成2x8mL的等分试样。然后每个等分试样被进一步分成两份，形成4x4mL的样品(Opal，Opal+XY，Opal+Z，Opal+XY+Z)。对于X样品，半胱氨酸被添加(12mg/mL，100mM)。对于Z样品，Carbopol被添加(0.25％)。XY样品在氮气下被脱气5分钟。然后，在N2冲洗下，10M NaOH以1:1000被添加到Opal+XY+Z样品，至最终pH为7.5。然后，10M NaOH以1:1000被添加到Opal+Z样品，至最终pH为7.5。
木瓜蛋白酶的稳定：木瓜蛋白酶1mg/mL(16mL)被分成2x8mL的等分试样。然后每个等分试样被进一步分成两份，形成4x4mL的样品(P，P+XY，P+Z，P+XY+Z)。对于X样品，半胱氨酸被添加(12mg/mL，100mM)。对于Z样品，Carbopol被添加(0.25％)。XY样品在氮气下被脱气5分钟。然后，在N2冲洗下，10M NaOH以1:1000被添加到P+XY+Z样品，至最终pH为7.5。然后，10M NaOH以1:1000被添加到P+Z样品，至最终pH为7.5。
菠萝蛋白酶的稳定：菠萝蛋白酶1mg/mL(16mL)被分成2x8mL的等分试样。然后每个等分试样被进一步分成两份，形成4x4mL的样品(B、B+XY、B+Z、B+XY+Z)。
对于X样品，半胱氨酸被添加(12mg/mL，100mM)。对于Z样品，Carbopol被添加(0.25％)。XY样品在氮气下被脱气5分钟。然后，在N2冲洗下，10M NaOH以1:1000被添加到B+XY+Z样品，至最终pH为7.5。然后，10M NaOH以1:1000被添加到B+Z样品，至最终pH为7.5。
结果和讨论
1.蛋白酶的蛋白水解活性的稳定
总之，发现相对于未经处理的Opal和木瓜蛋白酶样品，用XY和XYZ处理，造成Opal和木瓜蛋白酶样品的蛋白酶的蛋白水解活性的稳定。用Z处理也造成木瓜蛋白酶样品的蛋白酶的蛋白水解活性的稳定。这可以从图1和图2中看出。相对于未经处理的菠萝蛋白酶样品，用XY和XYZ处理显示出菠萝蛋白酶样品的蛋白酶的蛋白水解活性的较低的稳定。这可以从图3中看出。这些结果被进一步详细讨论如下。
木瓜提取物(Opal)
经由BApNA测定法，木瓜提取物稳定化溶液的稳定性被每周测定，持续2个月的时期。然后，测得的活性被归一化至实验开始时的Opal(未经处理)样品的活性，并设定为1。结果于图1呈现。
半胱氨酸/氮气冲洗组合的稳定作用造成了在所考虑时期内(一直到至少第58天)检测不到的活性损失。这可以解释为氧气的缺乏使还原剂半胱氨酸处于其还原态，从而允许其继续相应地使半胱氨酸蛋白酶活性部位的活性半胱氨酸处于其还原态，并防止氧化。相似地，Carbopol的稳定作用虽然比用半胱氨酸/氮气冲洗组合的处理持续更少的时间，但仍然是显著的(一直到至少第12天)。
额外的考虑是XY+Z样品的酶活性随着时间而增强(在下面结果的第2部分讨论)。
1.1木瓜蛋白酶(P)
商业乳液木瓜蛋白酶溶液的结果于图2中显示。所观察到的结果与Opal样品相似，XY组合和Z(Carbopol)处理都造成了酶溶液在64天的稳定。木瓜蛋白酶的XYZ处理也显示了酶溶液在64天的稳定。
1.2菠萝蛋白酶(B)
对菠萝蛋白酶所观察到的结果也跟随Opal和木瓜蛋白酶关于在XY和XYZ处理后立即活性增加的结果。半胱氨酸/氮气加上Carbopol的即时作用(immediate effect)是极度明显的，与未经处理的菠萝蛋白酶相比，达到超过10倍的扩大(图3)。进一步地，用Z处理的稳定在14天时实现。
虽然在测试的时间段内，菠萝蛋白酶的蛋白水解活性的稳定性下降，然而与未经处理的样品相比，在第7天和第14天时，用Carbopol(0.25％)单独(Z)、用半胱氨酸和氮气脱气二者(XY)和用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)全部(XYZ)处理时，菠萝蛋白酶的蛋白水解活性都保持净稳定性(net stabilisation)。
2.蛋白酶的蛋白水解活性的增强
令人惊讶地和出乎意料地，还发现增强蛋白水解活性的稳定性的方法也显著增强了蛋白水解活性本身。总之，发现相对于未经处理的样品，用Z、XY和XYZ处理都造成了每个Opal、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶样品的蛋白酶的水解活性的增强。这可以从下面的表1、表2和表3中看出，其中“平均值”指的是相对酶活性，“SD”指的是标准偏差，“Z”指的是用Carbopol(0.25％)处理，“XY”指的是用半胱氨酸(X)和用氮气脱气(Y)处理，以及“XYZ”指的是用半胱氨酸(X)、用氮气脱气(Y)和Carbopol(0.25％)(Z)处理。每个表格中显示的样品处理都使用了相同批次的相同蛋白酶。
这些结果表明酶原的立即活化(即，酶原向酶的转化)。半胱氨酸的作用可能是由于半胱氨酸对推定的酶原和可逆地氧化的物种的还原/活化作用。出乎意料的Carbopol作用可以解释为酶聚集体的聚合物对自溶的破坏。
2.1木瓜提取物(Opal)
表1显示，相对于未经处理的样品，用Carbopol(0.25％)单独处理(Z)造成了蛋白水解活性的立即(第0天)3倍的增加。活性的增加在第12天到达峰值，随后在试验期的剩余时间，活性下降到基本水平。
相对于未经处理的样品，用半胱氨酸和氮气脱气(XY)处理造成了蛋白水解活性的立即(第0天)3.3倍的增加。在整个试验期，活性的增加在这个水平保持持续，一直到第58天。活性的最大增加在第12天被观察到(3.59倍的增加)，活性的最小增加在第30天被观察到(3倍的增加)。
相对于未经处理的样品，用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)(XYZ)全部处理造成了蛋白水解活性的立即(第0天)12倍的增加。值得注意的是，这种蛋白水解活性的增加进一步随时间(in time)增加，以在第5天观察到的13.8倍的增加，在第12天观察到的14.3倍的增加，在第30天观察到的16.6倍的增加，在第45天观察到的15.3倍的增加，在第58天观察到17.9倍的增加。与酶原和/或其他非活性形式的酶相关的活性酶(即蛋白酶)因此表现出随时间增加。
表1-Opal(O)的蛋白水解活性的增强
第0天 第5天 第12天 第30天 第45天 第58天
未经处理的(平均值) 1.000 0.718 0.103 0.000 0.000 0.000
未经处理的(SD) 0.050 0.035 0.005 0.001 0.001 0.001
Z(平均值) 3.077 2.821 3.333 0.000 0.000 0.000
Z(SD) 0.153 0.060 0.060 0.001 0.001 0.001
XY(平均值) 3.333 3.333 3.590 3.077 3.333 3.333
XY(SD) 0.166 0.166 0.179 0.153 0.166 0.166
XYZ(平均值) 12.051 13.846 14.359 16.667 15.385 17.949
XYZ(SD) 0.602 0.692 0.717 0.833 0.769 0.040
用各种处理观察到的Opal的增强的蛋白水解活性表现出持续相当长的一段时间。Carbopol(0.25％)单独处理(Z)显示出持续至少12天的增强的蛋白水解活性，同时用半胱氨酸和氮气脱气二者处理(XY)，以及用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)全部处理(XYZ)，显示出持续至少58天(整个试验期)的增强的蛋白水解活性。
2.2木瓜蛋白酶(P)
表2显示，相对于未经处理的样品，用Carbopol(0.25％)单独处理(Z)造成了蛋白水解活性的立即(第0天)4.6倍的增加。该增长接近于维持到至少第26天(4.1倍的增加)，随后在试验期的剩余时间，活性下降到大约2.6-2.7倍的增加，一直到至少第64天。
相对于未经处理的样品，用半胱氨酸和氮气脱气(XY)处理造成了蛋白水解活性的立即(第0天)2.1倍的增加。在整个试验期，这种活性的增加逐渐下降，以在第26天的活性增加被观察到为1.905倍的增加，在第51和64天的活性增加被观察到为1.667倍的增加。
相对于未经处理的样品，用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)(XYZ)全部处理造成了蛋白水解活性的立即(第0天)5.2倍的增加。值得注意的是，这种蛋白水解活性的增强显示出进一步的随时间净增加，以在第26天观察到的8.0倍的增加，在第51天观察到的5.7倍的增加，在第64天观察到的6.1倍的增加。
表2-木瓜蛋白酶(P)的蛋白水解活性的增强
第0天 第26天 第51天 第64天
未经处理的(平均值) 1.000 0.129 0.048 0.000
未经处理的(SD) 0.048 0.014 0.014 0.002
Z(平均值) 4.667 4.143 2.619 2.762
Z(SD) 0.048 0.048 0.238 0.048
XY(平均值) 2.190 1.905 1.667 1.667
XY(SD) 0.190 0.048 0.048 0.048
XYZ(平均值) 5.238 8.095 5.714 6.190
XYZ(SD) 0.143 0.048 0.095 0.143
用各种处理观察到的木瓜蛋白酶的增强的蛋白水解活性，再次表现出持续相当长的一段时间。Carbopol(0.25％)单独处理(Z)、用半胱氨酸和氮气脱气二者处理(XY)，以及用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)全部处理(XYZ)，每个都显示出持续至少64天(整个试验期)的增强的蛋白水解活性。
2.3菠萝蛋白酶(B)
表3显示，相对于未经处理的样品，用Carbopol(0.25％)单独处理(Z)造成了蛋白水解活性的立即(第0天)1.6倍的增加。该增长接近于维持到至少第14天(1.5倍的增加)，以活性的增加在第7天至3.0倍。
相对于未经处理的样品，用半胱氨酸和氮气脱气(XY)处理造成了蛋白水解活性的立即(第0天)6.3倍的增加。然后，在整个试验期，这种活性的增加下降，以在第14天的活性增加被观察到为0.6倍的增加，以及在第14天的活性增加被观察到为0.65倍的增加。
相对于未经处理的样品，用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)(XYZ)全部处理造成了蛋白水解活性的立即(第0天)11倍的增加。然后，这种蛋白水解活性的增强随时间下降，以在第7天观察到的4.6倍的增加，以及在第14天观察到的1.3倍的增加。
表3–菠萝蛋白酶(B)的蛋白水解活性的增强
第0天 第7天 第14天
未经处理的(平均值) 1.000 0.110 0.000
未经处理的(SD) 0.040 0.409 0.001
Z(平均值) 1.600 3.000 1.500
Z(SD) 0.025 0.033 0.067
XY(平均值) 6.300 0.600 0.650
XY(SD) 0.022 0.067 0.108
XYZ(平均值) 11.000 4.600 1.300
XYZ(SD) 0.036 0.109 0.077
用各种处理观察到的菠萝蛋白酶的蛋白水解活性的立即增强，与在Opal和木瓜蛋白酶二者上观察到的相同趋势是一致的。虽然菠萝蛋白酶的活性增加比Opal和木瓜蛋白酶下降得更快，然而在整个试验期中，与未经处理的样品相比，当用Carbopol(0.25％)单独处理(Z)、用半胱氨酸和氮气脱气二者处理(XY)，以及用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)全部处理(XYZ)，菠萝蛋白酶的蛋白水解活性都保持净增加。
结论
本文呈现的数据教导，使用本文公开的每种方法，可以实现蛋白酶的蛋白水解活性的增强和稳定，即用Carbopol(0.25％)单独处理蛋白酶(Z)、用半胱氨酸和氮气脱气二者处理蛋白酶(XY)，以及用半胱氨酸、氮气脱气和Carbopol(0.25％)全部处理蛋白酶(XYZ)。
令人惊讶地和出乎意料地，还发现增强蛋白水解活性的稳定的方法也显著增强了蛋白水解活性本身。总之，发现用Z、XY和XYZ处理全部造成蛋白酶的蛋白水解活性的增强。特别地，XYZ处理对蛋白水解活性的稳定的增强是高度明显的。
因此，本文呈现的数据教导，使用本文公开的方法，可以实现蛋白酶的蛋白水解活性的稳定和蛋白水解活性本身的增强二者。
本文公开的处理涉及试剂，其安全记录是极佳的且不涉及酶的化学共价修饰，从而防止与消费者安全有关的问题，例如过敏和监管挑战。
虽然已经参照具体方面公开了本发明，但显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域其他技术人员可能设想出本发明的其他方面和变型。在不同部分中的特征和实施例可以进行必要的组合。

Claims (20)

1.一种用于蛋白酶的蛋白水解活性的增强和/或稳定的方法，其特征在于，所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶被包装在实质上无氧的气氛中。
3.一种用于产生包括已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，氧气通过对所述制剂脱气而去除。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合物为卡波姆。
7.一种组合物，其包括一种或多种已增强和/或稳定的蛋白水解活性的蛋白酶，其中所述组合物通过一种方法获得或可获得，所述方法包括(i)将蛋白酶与还原剂接触，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，(ii)去除所述蛋白酶周围的区域的实质上全部的氧气，以及(iii)将所述蛋白酶与阴离子聚合物基质结合，以致所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
8.一种组合物，其包括一种或多种蛋白酶、还原剂和阴离子聚合物基质，其中所述蛋白酶的半胱氨酸残基被保持在还原态，所述组合物为实质上无氧，以及所述蛋白酶与所述阴离子聚合物基质非共价结合。
9.如权利要求7或8中任一项所述的组合物，其特征在于，氧气通过对所述组合物脱气而去除。
10.如权利要求7至9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述聚合物为卡波姆。
11.如权利要求7至10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物被包装在实质上无氧的气氛中。
12.如权利要求7至11中任一项所述的组合物在制造用于疾病和失调的治疗，用于清创，或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽的药剂中的用途，所述疾病和失调包括伤口。
13.如权利要求7至11中任一项所述的组合物在制造用于皮肤增亮、表皮脱落，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损皮肤的化妆品中的用途。
14.一种药物组合物，其包括如权利要求7至11中任一项所述的组合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂。
15.一种化妆品组合物，其包括如权利要求7至11中任一项所述的组合物，以及化妆品上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、表面活性剂和/或佐剂。
16.如权利要求7至11中任一项所述的组合物或如权利要求14所述的药物组合物，其用于疾病和失调的治疗，用于清创，或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽，所述疾病和失调包括伤口。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述组合物为局部应用。
18.一种用于疾病和失调的治疗、用于清创或用于治疗烧伤、溃疡或坏疽的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用如权利要求7至11中任一项所述的组合物或权利要求14所述的药物组合物，所述疾病和失调包括伤口。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述组合物为局部应用。
20.如权利要求7至11中任一项所述的组合物或如权利要求15所述的化妆品组合物，其用于皮肤增亮、表皮脱落，或用于应用至皱纹、皮肤瑕疵、雀斑、丘疹、痤疮、红斑痤疮、晒斑、疤痕或静脉曲张，或用于应用至干燥、老化或受损皮肤。
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