CN114853872A - 一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰rhG‑CSF的制备方法。具体包括如下内容：以复合层析介质为固相反应载体，将rhG‑CSF蛋白上样吸附于层析填料上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，在催化剂催化的条件下，完成修饰反应，反应完成后采用梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白mPEG‑rhG‑CSF。采用上述制备方法，可获得单修饰率与纯度较高的mPEG‑rhG‑CSF修饰蛋白，所得mPEG修饰蛋白单修饰率达91％以上，纯度达到99.3％以上；同时该制备方法简化了修饰、纯化反应操作，大大降低生产成本，为实现蛋白的mPEG修饰提供新工艺，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法。
背景技术
20世纪50年代末期，用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构和功能的关系成为生物化学和分子生物学领域的热点。蛋白质修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面，化学修饰可以降低免疫原性或免疫反应性、抑制免疫球蛋白E的产生等；在生物技术领域，酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。
蛋白质修饰剂与蛋白质发生反应的性质，主要可以分为四种类型：(1)酰化及其相关反应，这类修饰剂可以与蛋白质的侧链基团发生酰基化反应；(2)烷基化反应，这类修饰剂的特点是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团发生烷基化；(3)氧化和还原反应，这类修饰剂具有氧化性，能将侧链基团氧化；(4)芳香环取代反应，蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。代表性的修饰剂有N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇(PEG)等。
其中，聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。
目前，国内外已有很多款PEG修饰的药物应用于临床，取得了显著的社会效益和经济效益。Pfizer公司PEG修饰人生长激素受体拮抗剂用于治疗肢端肥大症和超常增生症；Hoffman-LaRoche公司PEG修饰α干扰素用于治疗丙型肝炎；PEG修饰的血管内皮(细胞)生长因子适配子，用于治疗老年黄斑变性病。
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)可以显著改善化疗所引起的中性粒细胞减少症的严重性和持续时间，自1991年起就广泛用于治疗癌症化疗导致的骨髓抑制，但其血浆半衰期仅为3-4小时，需要每天用药，连续7-14天，对于治疗的方便性和病人的依从性不利。对rhG-CSF进行PEG修饰改造能较好的实现延长其半衰期、增加稳定性、降低免疫原性。
rhG-CSF的PEG修饰可以分为N端、C端和链上修饰，但C端修饰的难度大；而成熟的rhG-CSF蛋白有四个Lys残基，还有一个18位游离的半胱氨酸的巯基，无法定点单一修饰；因而，更多研究集中在PEG蛋白N端进行特异性定点修饰。其主要策略是通过提高PEG活性基团对N端α氨基的选择性实现的。
最初的是通过控制修饰反应pH，实现定点修饰。然而，这种修饰方式对rhG-CSF来说并非最优，因为除了N端的α-氨基外，rhG-CSF结构中其余的四个Lys残基的氨基也可能与活化的PEG结合，还可能通过酯键连接于丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸残基的羟基。造成修饰的不均一和异构体等诸多不易解决的问题，不利于rhG-CSF的后续纯化及临床应用等。还可以通过某些酶实现特异性定点修饰，如枯草杆菌酶、谷氨酰胺酶等，但这无疑增加成本和下游处理的难度，更不利于放大生产。
CN200680021159公开了一种通过在特异位点取代或加成半胱氨酸，将氨基酸加成到人粒细胞集落刺激因子多肽链的两个末端并同时在加成位点进行聚乙二醇化，得到一种人粒细胞集落刺激因子的新型异构体。该方法工艺复杂，并且难免会带来非天然氨基酸的诸多相关问题。
CN201410272925公开了一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法，该方法也是目前国内外已上市PEG-rhG-CSF经典的修饰方法。齐鲁制药的新瑞白、石药集团的津优力以及鲁南制药的申利达，均采用类似的液相修饰方法。但此类方法，单修饰率偏低，有较多的未修饰和多修饰，给后序纯化工作带来难度，且所需修饰剂较多，增加了生产成本。
CN202011019986公开了一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法，通过离子交换层析将rhG-CSF分子上的赖氨酸-epsilon氨基“封闭”而实现PEG与N端α-氨基的特异性偶联，并同时实现了PEG-rhG-CSF的纯化，该方法在修饰时通过添加维生素B6和辅酶，从而实现较高的修饰率。但该方法一是增加修饰的成本，二会增加工艺相关杂质和后序纯化的压力，商业化放大生产后成本不具有优势，还存在18位半胱氨酸的巯基被修饰的可能。
因此，提供一种通用性好、工艺简便的修饰方法，用于rhG-CSF的PEG修饰，提高rhG-CSF的成分均一性，在医药技术领域具有重要意义。
发明内容
本发明旨在弥补rhG-CSF现有PEG修饰工艺的不足，提供一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法。
本发明的目的是具体通过如下技术方案实现：以复合层析介质为固相反应载体，将rhG-CSF蛋白上样吸附于层析填料上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，在催化剂催化的条件下，完成修饰反应，反应完成后采用梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白mPEG-rhG-CSF。
一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法，包括如下步骤：
a、上柱：将rhG-CSF蛋白溶解于缓冲液A中得rhG-CSF蛋白溶液，然后上样吸附于层析填料上；
b、修饰反应：将聚乙二醇修饰剂溶解于上述缓冲液A中，加入催化剂，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱；
c、洗脱：用缓冲液B与上述缓冲液A进行洗脱，获得单修饰的目的蛋白mPEG-rhG-CSF。
优选地，步骤a所述层析填料选自但不限于Capto MMC填料、HCX填料和BestaroseDiamond MMC填料，优选Capto MMC填料。
在一个优选实施方案中，步骤a所述rhG-CSF蛋白溶液其浓度为2～3mg/mL。
在一个优选实施方案中，步骤b所述聚乙二醇修饰剂选自mPEG-丁醛、mPEG-丙醛、mPEG-琥珀酸酯等，分子量在10～50kDa。
在一个优选实施方案中，步骤b所述修饰缓冲液中聚乙二醇修饰剂浓度为1～5mg/mL，优选2～3mg/mL。
优选地，所述rhG-CSF蛋白与聚乙二醇修饰剂质量比为1:2～10；进一步优选地，所述rhG-CSF蛋白与聚乙二醇修饰剂质量比为1:3～6。
在一个优选实施方案中，步骤a、b和c所述缓冲液A为含有氯化钠的醋酸钠缓冲液。
优选地，所述缓冲液A中氯化钠浓度为0.1～0.8M；进一步优选地，所述缓冲液A中氯化钠浓度为0.2～0.5M。
优选地，所述缓冲液A中醋酸钠浓度为10～50mM；进一步优选地，所述缓冲液A中醋酸钠浓度为20～30mM。
优选地，所述缓冲液A的pH值为4.0～5.0。
在一个优选实施方案中，步骤b所述催化剂为氰基硼氢化钠，终浓度为10～30mM。
在一个优选实施方案中，步骤b所述循环反应时间为4～8小时。
在一个优选实施方案中，步骤b所述修饰反应在室温下进行，层析柱做避光处理。
在一个优选实施方案中，步骤c所述缓冲液B为含有氯化钠的醋酸钠缓冲液。
优选地，所述缓冲液B中氯化钠浓度为10～50mM；进一步优选地，所述缓冲液B中氯化钠浓度为20～30mM。
优选地，所述缓冲液B中醋酸钠浓度为10～50mM；进一步优选地，所述缓冲液B中醋酸钠浓度为20～30mM。
优选地，所述缓冲液B的pH值为5.5-6.0。
在一个优选实施方案中，通过缓冲液B与缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，获得聚乙二醇修饰的rhG-CSF。
优选地，所述梯度洗脱方法为流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白mPEG-rhG-CSF。
在一个优选实施方案中，一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法，包括如下步骤：
a、上样：取适量层析填料(Capto MMC填料、HCX填料或Bestarose Diamond MMC填料中的一种)装载于层析柱中，用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠10～50mM，氯化钠0.1～0.8M，调pH4.0～5.0)对层析柱进行平衡；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2～3mg/mL溶液，上样吸附于层析柱上，再用缓冲液A冲洗，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：PEG修饰剂＝1:2～10的比例称取修饰剂，将其用上述缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠10～50mM，氯化钠0.1～0.8M，调pH4.0～5.0)配制成1～5mg/mL的溶液，并加入终浓度为10～30mM的氰基硼氢化钠，调pH至4.0～5.0，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间4～8h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠10～50mM，氯化钠10～50mM，调pH5.5～6.0)与上述缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠10～50mM，氯化钠0.1～0.8M，调pH4.0～5.0)不同配比进行梯度洗脱，方法为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白mPEG-rhG-CSF。
本发明pH调节所用溶液采用本领域常规的酸或碱的水溶液，为减少反应体系其它物质的引入，优选醋酸溶液、氢氧化钠溶液。
本发明与现有技术相比具有如下优点和显著的进步：
(1)以复合层析介质为固相反应载体，在低PH、高盐状态下获得单修饰率高的mPEG-rhG-CSF修饰蛋白，所得聚乙二醇修饰蛋白单修饰率达91％以上；
(2)本工艺以较高pH、低盐浓度进行梯度洗脱获得高纯度的mPEG-rhG-CSF修饰蛋白，纯度达到99.6％以上；
(3)本工艺简化了修饰、纯化反应操作，大大降低生产成本，为实现蛋白的PEG修饰提供新工艺。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时，本领域技术人员根据本发明所作的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围内。
实施例1
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，待上样完成后，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白mPEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例2
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠20mM，氯化钠400mM，调pH4)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为3mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:2的比例称取mPEG-丙醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为3mg/mL的溶液，并加入终浓度为10mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠30mM，氯化钠20mM，pH6，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例3
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠30mM，氯化钠400mM，调pH5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:10的比例称取mPEG-琥珀酸酯(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为1mg/mL的溶液，并加入终浓度为10mM的氰基硼氢化钠，并调pH至5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠20mM，氯化钠20mM，pH5.5，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例4
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠10mM，氯化钠100mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为3mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:3的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为5mg/mL的溶液，并加入终浓度为30mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为4h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠10mM，氯化钠50mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例5
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠50mM，氯化钠800mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:6的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为30mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为6h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠50mM，氯化钠10mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例6
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠500mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为8h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠30mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例7
a、上样：取适量层析填料
HCX，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为6h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例8
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠100mM，氯化钠400mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:20的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为10mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制时间为7h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠100mM，氯化钠20mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例9
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH3)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至3，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例10
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH6)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至6，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH6.3，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例11
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠1.2M，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠5mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
实施例12
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠50mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠100mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例1
a、上样：取适量层析填料Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为6h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例2
a、上样：取适量层析填料Generik MC60-SP，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5.8，)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例3
a、上样：取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH4.5)对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；用上述缓冲液A将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，上样于层析柱，载量20mg/mL，再用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积，至无蛋白穿出。
b、修饰反应：按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例称取mPEG-丁醛(20kDa)，将其用上述缓冲液A配制成浓度为2mg/mL的溶液，并加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，并调pH至4.5，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱，流速2～3mL/min，控制循环反应时间为5h，柱温维持在室温，同时层析柱避光处理；循环结束，再以上述缓冲液A继续冲洗层析柱，以10mL/min的流速冲洗5个柱体积。
c、洗脱：用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5.8)与上述缓冲液A进行洗脱，流速5mL/min，具体操作为：先30％缓冲液B、3CV，洗脱多修饰的rhG-CSF，再以50％缓冲液B、10CV，洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例4
用缓冲液A(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠400mM，调pH4.5)将rhG-CSF配制成浓度为2mg/mL溶液，按照摩尔比rhG-CSF：mPEG修饰剂＝1:4的比例加入mPEG-丁醛(20kDa)，搅拌溶解，加入终浓度为20mM的氰基硼氢化钠，反应混合物搅拌反应5h。取适量层析填料Capto MMC，装载于XK26层析柱中，柱高20cm，连接到蛋白纯化系统；用上述缓冲液A对层析柱进行平衡，3～5个柱体积，流速10mL/min；按照20g/L的载量循环上样修饰液；最后用上述缓冲液A冲洗3～5个柱体积；
用缓冲液B(含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠25mM，氯化钠20mM，pH5.8)与上述缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，具体操作为：流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白PEG-rhG-CSF，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例5
取重组人粒细胞刺激因子的母液1L(含有1g rhG-CSF、20mM NaAc和50Mm NaCl)，降温至4℃，加入0.5M/L NaOH溶液调节pH至6。加入11g甲氧基-聚乙二醇-丙醛(mPEG-PAL，分子量约20KD)，搅拌溶解，加入腈硼氢钠(NaBH3CN)，并使得腈硼氢钠的终浓度为15mM/L，反应混合物低速搅拌反应15小时；反应混合物中加入0.5M/L盐酸溶液调节反应液pH至3。反应液通过层析柱纯化，填料为SP Sepharose FF，先在平衡液(含20mM/L NaAc和150mM/LNaCl的水溶液)下平衡，然后通过洗脱液(含20mM/L NaAc和200mM/L NaCl的水溶液)洗脱PEG-rhG-CSF。取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例6
rhG-CSF反应溶液(40mL，浓度为3mg/mL)，内含100mM磷酸钠，pH5.0，还含有40mMNADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇丙醛(MPEG-PALD)(分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌反应10小时；将反应混合物用0.5mol/L盐酸调节pH至4.0，静置10分钟。使用孔径为0.22μm的滤芯进行过滤。以缓冲液(20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠，pH4.0)平衡Capto MMC层析柱，流速300cm/小时，直到pH稳定在4.0；将过滤后样品上样，流速300cm/小时；上样结束后，用缓冲液(20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠，pH4.0)再次平衡层析柱，流速300cm/小时；以10mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(pH7.5)洗脱杂质，流速180cm/小时；：以50mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(pH8.0)洗脱目的蛋白，流速300cm/小时，收集目标蛋白峰。取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
对比实施例7
将rhG-CSF(5mg/mL)溶于含有20mM氰基硼氢化钠的100mM醋酸钠溶液中，pH为5，在冰浴中搅拌，加入5倍摩尔过量的mPEG-乙醛(20KD)，在相同条件下继续搅拌反应混合物10h；将反应混合物稀释5倍并调节pH值至4。使用HiLoad 16/10SP Sepharose HP柱通过离子交换色谱法分离单mPEG-rhG-CSF偶联物，该柱用20mM醋酸钠缓冲液平衡，pH 4，并用线性0-1M NaCl梯度洗脱，取样检测纯度、计算收率，结果见表1。
验证实施例
1、纯度、收率测定
反相纯度依据《中国药典》2020年版四部通则0512测定，SEC纯度依据《中国药典》2020年版四部通则0514测定。实施例1-12、对比实施例1-7纯度、收率结果如表1所示。
表1.纯度、收率检测结果
由此可见，对比实施例1和对比实施例2更换柱子，样品纯度及收率较低；对比实施例3等度洗脱，洗脱效果不佳，纯度及收率均较低；对比实施例4先反应最后上柱子，使得收率较低；对比实施例5-7为现有技术报道的方法，纯度及收率均低于实施例1。
2、修饰率测定
分别参照实施例1-12，对比例1-3制备方法，重复步骤a和步骤b，然后用20mMTris，pH9.0以5mL/min的流速洗脱层析柱，收集全部洗脱峰，依据《中国药典》2020年版四部通则0514测定修饰率；对比实施例4-7取搅拌反应后的反应混合物，依据《中国药典》2020年版四部通则0514测定修饰率。结果见表2。
表2.修饰率检测结果
由此可见，对比实施例1和对比实施例2更换柱子，多修饰产物增多；对比实施例3等度洗脱，影响产物纯度与收率，对单修饰率无影响；对比实施例4先反应最后上柱子，使得多修饰产物增多；对比实施例5-7为现有技术报道的方法，单修饰率低。
Claims (10)
1.一种聚乙二醇修饰rhG-CSF的制备方法，其特征在于，包括如下内容：以复合层析介质为固相反应载体，将rhG-CSF蛋白上样吸附于层析填料上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，在催化剂催化的条件下，完成修饰反应，反应完成后采用梯度洗脱获得聚乙二醇修饰的蛋白mPEG-rhG-CSF。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、上样：将rhG-CSF蛋白溶解于缓冲液A中得rhG-CSF蛋白溶液，然后上样吸附于层析填料上；
b、修饰反应：将聚乙二醇修饰剂溶解于上述缓冲液A中，加入催化剂，得修饰缓冲液并作为流动相，循环流过层析柱；
c、洗脱：用缓冲液B与上述缓冲液A进行梯度洗脱，获得单修饰的目的蛋白mPEG-rhG-CSF。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述层析填料选自Capto MMC填料、HCX填料和Bestarose Diamond MMC填料，优选Capto MMC填料。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰剂选自mPEG-丁醛、mPEG-丙醛、mPEG-琥珀酸酯，分子量10～50kDa。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述rhG-CSF蛋白与聚乙二醇修饰剂质量比为1:2～10，优选1:3～6。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a所述rhG-CSF蛋白液其浓度为2-3mg/mL；步骤b所述修饰缓冲液中聚乙二醇修饰剂浓度为1～5mg/mL，优选2～3mg/mL。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a、b和c所述缓冲液A为含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中氯化钠浓度为0.1～0.8M，醋酸钠浓度为10～50mM；优选地，氯化钠浓度为0.2～0.5M，醋酸钠浓度为20～30mM；缓冲液A的pH值为4.0～5.0。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b所述催化剂为氰基硼氢化钠，终浓度为10～30mM；循环反应时间为4～8小时。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c所述缓冲液B为含有氯化钠的醋酸钠缓冲液，其中氯化钠浓度为10～50mM，醋酸钠浓度为10～50mM；优选地，氯化钠浓度为20～30mM，醋酸钠浓度为20～30mM；缓冲液B的pH值为5.5～6.0。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c所述梯度洗脱为缓冲液B与缓冲液A不同配比进行梯度洗脱，流速5mL/min，先10％～30％缓冲液B、3CV，梯度洗脱多修饰的rhG-CSF，再以30％～80％缓冲液B、10CV，梯度洗脱单修饰的rhG-CSF，获得单修饰的目的蛋白mPEG-rhG-CSF。
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| GR01 | Patent grant | ||
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