CN114853847B - 辣椒籽分离的寡肽ftle及其在预防或治疗癌症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了辣椒籽分离的寡肽FTLE及其在预防或治疗癌症中的应用，该寡肽由辣椒籽中分离获取，具有抗肿瘤作用，尤其是可以有效地抑制HepG2细胞生长代谢，应用前景好。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及辣椒籽分离的寡肽FTLE及其在预防或治疗癌症中的应用。
背景技术
辣椒，茄科辣椒属草本植物，原产于墨西哥，后传入中国，现主要分布于四川、云南、贵州、湖南、河南等地种植。辣椒主要由辣椒果肉和辣椒籽组成，辣椒籽占辣椒干重的30%-60%，是辣椒加工过程中的主要副产物。辣椒籽含有丰富的膳食纤维、脂肪、蛋白质、矿物质和维生素E等，具有极佳的营养经济价值。
随着我国辣椒加工业的快速发展，辣椒在食品、医药、化工等领域均有应用，食品领域中干辣椒、辣椒酱、辣椒粉、火锅底料等辣椒产品越来越多，辣椒碱在医药中的应用也很广泛，辣椒加工过程中会产生大量的废弃辣椒籽。目前我国的辣椒籽少部分作为动物饲料，但大部分都未经有效利用被当作废弃物处理，造成环境污染和资源浪费。辣椒籽产量较多，价格低廉、容易获取，并且饼粕蛋白中氨基酸齐全，必需氨基酸含量适中，是一种优质的蛋白资源。因此从辣椒籽中提取生物活性肽既可“变废为宝”，提高资源利用率，又可减少污染，符合环境友好型社会的发展目标。
目前，抗肿瘤药物如氟尿嘧啶、顺铂、柔红霉素等在肿瘤治疗中发挥着重要作用，但是这些药物的安全性、有效性、及价格昂贵等使其临床应用性受到限制。越来越多的研究表明来自天然食物或动植物的生物活性肽对人体健康有着积极的作用。生物活性肽的生理活性功能主要体现在抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压、降胆固醇、免疫调节等方面，动物源活性肽存在着成本高、安全性等问题，而植物源活性肽因其纯天然、营养价值高得到广泛应用，如大豆活性肽、花生活性肽、菜籽活性肽等，但是辣椒籽中活性肽研究尚少。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述分离的寡肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能类似物，具体地，所述分离的寡肽的氨基酸序列为FTLE（Phe-Thr-Leu-Glu，SEQ ID NO：1）。发明人从辣椒籽中分离获得了上述寡肽，并对其功能进行研究，发现其具有抗肿瘤作用，尤其是可以有效地抑制HepG2细胞生长代谢，应用前景好。
根据本发明的实施例，所述分离的寡肽来源于辣椒籽。发明人提取辣椒籽中的蛋白，意外发现了上述具有抗肿瘤作用的寡肽。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述分离的寡肽。根据本发明实施例的核酸分子在导入受体细胞后，在适于蛋白表达的环境下，表达前面所述的分离的寡肽，该寡肽具有抗肿瘤作用。
需要说明的是，本发明对于核酸分子的序列不作严格限定，只要是能够编码前面所述分离的寡肽即可。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体含有前面所述核酸分子。根据本发明实施例的构建体导入细胞后，在适于蛋白表达的环境下，表达前面所述的分离的寡肽，有助于发挥该寡肽的抗肿瘤作用。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前面所述的核酸分子或前面所述的构建体。由此，在适于蛋白表达的环境下，表达前面所述的寡肽，有助于发挥该寡肽的抗肿瘤作用。本发明的重组细胞不包含生殖细胞、受精卵细胞或者胚胎细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包括：前面所述的分离的寡肽、核酸分子或重组细胞。由此，根据本发明实施例的药物具有预防或治疗癌症作用。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述寡肽、核酸分子或重组细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防或治疗癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症为乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、甲状腺癌、淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、子宫体癌、卵巢癌、胆囊癌、口腔癌、喉癌、骨癌、睾丸癌或脑癌。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种获得前面所述分离的寡肽的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对辣椒籽进行处理，得到所述分离的寡肽。
根据本发明的实施例，所述方法包括：（1）将辣椒籽进行粉碎，得到辣椒籽粕；（2）对所述辣椒籽粕进行脱脂处理，得到脱脂后的辣椒籽粕；（3）提取所述脱脂后的辣椒籽粕中的蛋白，得到粗蛋白提取物；（4）将所述粗蛋白提取物进行酶解处理，然后灭酶，得到酶解蛋白溶液；（5）对所述酶解蛋白溶液进行分离纯化，得到所述分离的寡肽。
步骤（1）中，通过将辣椒籽粉碎，以便更好地发生后续反应，反应更加充分，从而提高寡肽的得率和纯度。步骤（2）中，脱脂处理可以除去辣椒籽粕中的油脂，从而提高蛋白的提取率和纯度。步骤（4）中，通过酶解处理，可以有效地使蛋白酶解为小分子肽，有助于得到具有抗癌功能的寡肽。
根据本发明的实施例，步骤（1）中，将所述粉碎所得粉碎物通过60~100目筛，得到截留物和透过物，收集透过物，得到辣椒籽粕。由此，可以使得辣椒籽粉透过，截留杂质，提高蛋白提取率，避免杂质影响。
根据本发明的实施例，所述脱脂处理采用的脱脂溶剂为正己烷。由此，可以有效地除去脂肪，且使用安全。
根据本发明的实施例，步骤（3）包括：将所述脱脂后的辣椒籽粕与水混合，所得混合液用碱液调节pH值至9~10，反应3~5小时，再调节反应液的pH值至4~5，反应1~3小时，将反应液离心，收集沉淀，得到粗蛋白提取物。pH值先高是因为在碱性环境下可以使辣椒籽粕中的蛋白溶解出来，后降低pH是在蛋白的等电点下蛋白可以沉降下来，离心后即可得到分离蛋白。
根据本发明的实施例，步骤（4）中进行所述酶解处理之前，预先将所述粗蛋白提取物进行超高压处理。超高压处理可以改善蛋白理化性质，经超高压和酶解的产物活性比仅进行酶解的产物活性高。
根据本发明的实施例，所述超高压处理的压力为100~400MPa，时间为20~40分钟。由此，有助于改善蛋白理化性质，提高酶解所得产物的活性。
根据本发明的实施例，所述酶解处理的温度为30~50℃，时间为1~5小时，pH值为7~10，所述酶解处理采用的酶选自碱性蛋白酶，优选地衣芽孢杆菌，所述酶与所述粗蛋白提取物的质量比为1:20~1:50。由此，以便将蛋白酶解为小分子肽，从而可以获得抗癌寡肽。
根据本发明的实施例，所述灭酶是在90℃~100℃进行1~10min。由此，以便使酶失活，防止反应过度或防止酶干扰后续实验。
根据本发明的实施例，步骤（5）中，所述分离纯化是采用色谱柱进行的，所述色谱柱为阴离子色谱柱或者疏水型色谱柱；当所述色谱柱为阴离子色谱柱时，采用的流动相为水和NaCl；当所述色谱柱为疏水性色谱柱时，采用的流动相为水和40~60v/v%的甲醇溶液。
根据本发明的实施例，步骤（5）中，所述分离纯化包括：将所述酶解蛋白溶液注入阴离子色谱柱中，流动相洗脱，收集35~45min内的流出液；将所述流出液注入疏水性色谱柱中，流动相洗脱，收集75~90min内的流出液，以便得到含有所述寡肽的纯化产物。
发明人经过大量实验得到上述较优的分离纯化方式，由此，可以获得前述分离的寡肽。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的不同肽段对HepG2细胞增殖影响分析示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法提取辣椒籽中的寡肽FTLE：
1）脱籽：新鲜辣椒籽肉分离，得到辣椒籽；
2）粉碎：将辣椒籽研磨成辣椒籽粕，过80目的筛，得到辣椒籽粉；
3）脱脂：将辣椒籽粕和正己烷按照1:10（g/ml）比例混合，过夜搅拌脱脂，脱脂结束后采用抽滤的方式除去正己烷，得到辣椒籽粕；
4）提取蛋白：将脱脂后的辣椒籽粕以1:10（w/v，单位g/mL）溶于水中，用NaOH溶液调节溶液的pH值为9.5，溶解4 h，再用HCl调节溶液的pH值为4.5，沉淀2 h，将反应液于8000rpm离心20 min，收集沉淀即为粗蛋白提取物；
5）超高压辅助酶解：分离蛋白溶于水后，于300 MPa压力下超高压处理30min，然后将超高压处理所得产物进行酶解处理，酶为地衣芽孢杆菌，酶与底物质量比为1：20（w/w，单位g/g），温度为40℃，用1mol/L NaOH调pH值为8，时间为3 h；
6）灭酶：酶解结束后，90℃灭酶10分钟，得到辣椒籽酶解物溶液；
7）酶解物分离纯化：将辣椒籽酶解物溶液通过DEAE阴离子色谱柱，流动相为去离子水和NaCl，收集35~45min时间段的洗脱液，之后采用ODS-A反相C18柱（疏水柱）分离纯化，流动相为去离子水和50%甲醇，收集75~90min时间段的洗脱液。对获得的洗脱液中的肽段进行质谱鉴定分析，获得了多条肽序列信息。
实施例2
根据实施例1质谱鉴定分析获得的肽序列进行化学合成，得到合成肽。分别研究各肽对HepG2细胞增殖影响，具体步骤如下：
1）HepG2细胞培养：HepG2细胞来源于ATCC细胞库，HepG2细胞培养于含10%FBS 的DMEM培养基中，生长环境为37℃、5%二氧化碳细胞培养箱。在25cm2培养瓶中培养细胞，细胞生长到密度为70%-90%时传代，将细胞接种于96孔板中。
2）肽段处理：96孔板中细胞培养24小时后，吸出孔中原有DMEM培养基，向每孔中加入含有肽段的DMEM，肽段浓度为0.1、0.3、0.6mM，继续培养24小时。
3）MTT法测细胞增值率：96孔板中每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，培养4小时后，吸出每孔液体，向每孔中加入150μL DMSO，反应20min后测量吸光度。
结果如图1所示，可以看出，相比于其他寡肽，寡肽FTLE具有较好的HepG2细胞抑制率，有助于预防或治疗肝癌。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 辣椒籽分离的寡肽FTLE及其在预防或治疗癌症中的应用
<130> BI3220847
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
Phe Thr Leu Glu
1
Claims (11)
1.一种分离的寡肽，其特征在于，所述分离的寡肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的分离的寡肽，其特征在于，所述分离的寡肽来源于辣椒籽。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述分离的寡肽。
4.一种构建体，其特征在于，含有权利要求3所述核酸分子。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述核酸分子或权利要求4所述构建体。
6.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1或2所述分离的寡肽、权利要求3所述核酸分子或权利要求5所述重组细胞。
7.权利要求1或2所述分离的寡肽、权利要求3所述核酸分子或权利要求5所述重组细胞在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于预防或治疗肝癌。
8.一种获得权利要求1或2所述分离的寡肽的方法，其特征在于，包括：
对辣椒籽进行处理，得到所述分离的寡肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括：
（1）将辣椒籽进行粉碎，得到辣椒籽粉；
（2）对所述辣椒籽粉进行脱脂处理，得到脱脂后的辣椒籽粕；
（3）提取所述脱脂后的辣椒籽粕中的蛋白，得到粗蛋白提取物；
（4）将所述粗蛋白提取物进行酶解处理，然后灭酶，得到酶解蛋白溶液；
（5）对所述酶解蛋白溶液进行分离纯化，得到所述分离的寡肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将所述辣椒籽进行粉碎后通过60~100目筛，得到截留物和透过物，收集透过物，得到辣椒籽粉；
步骤（2）中，所述脱脂处理采用的脱脂溶剂为正己烷；
步骤（3）包括：将所述脱脂后的辣椒籽粕与水混合，所得混合液用碱液调节pH值至9~10，反应3~5小时，再调节反应液的pH值至4~5，反应1~3小时，将反应液离心，收集沉淀，得到粗蛋白提取物；
步骤（4）中进行所述酶解处理之前，预先将所述粗蛋白提取物进行超高压处理；
所述超高压处理的压力为100~400MPa，时间为20~40分钟；
所述酶解处理的温度为30~50℃，时间为1~5小时，pH值为7~10；
所述酶解处理采用的酶选自碱性蛋白酶，所述酶与所述粗蛋白提取物的质量比为1:20~1:50；
所述灭酶是在90℃~100℃进行1~10min；
步骤（5）中，所述分离纯化是采用色谱柱进行的，所述色谱柱为阴离子色谱柱和疏水型色谱柱；当采用阴离子色谱柱时，采用的流动相包括水和NaCl；当采用疏水性色谱柱时，采用的流动相包括水和40~60v/v%的甲醇溶液。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述酶解处理采用的酶选自地衣芽孢杆菌；
步骤（5）中，所述分离纯化包括：
将所述酶解蛋白溶液注入阴离子色谱柱中，流动相洗脱，收集35~45min内的流出液；
将所述流出液注入疏水性色谱柱中，流动相洗脱，收集75~90min内的流出液，以便得到含有所述寡肽的纯化产物。
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| GR01 | Patent grant | ||
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