CN1148457C - 纳米微粒标记基因探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因检测技术，具体地说，涉及纳米微粒标记基因探针及其制备方法和应用。本发明提供纳米微粒标记基因探针代替传统的标记探针以克服它们分别存在的问题和不足，使其从实验室走向实际应用。纳米微粒标记基因探针的制备方法是：胶体金或纳米微粒的制备，DNA探针分子设计及合成与修饰，金标探针的自组装合成与封闭。该探针适用于各类用途的基因杂交检测，进行纳米放大和目视显色；特别适用于低集成度诊断型基因芯片应用领域。

Description

纳米微粒标记基因探针及其制备方法和应用

一、技术领域

本发明涉及一种基因检测技术，更具体地说，涉及纳米微粒标记基因探针及其制备方法和在基因杂交中的应用。

二、背景技术

基因研究带动了20世纪整个生命科学的迅速发展；在21世纪，基因研究仍将推动生命科学研究向纵深发展。基因检测不仅对生物学研究至关重要，而且对临床医学、药学、农业技术、环境监控、法学鉴定等领域也具有极其重要的意义。

基因检测一般采用直接测序或杂交检测。直接测序就是直接分离、扩增、纯化基因片段后，采用末端链终止反应原理测定核酸中的每个核苷酸组成及其排列顺序。测序方法有同位素、银染、四色荧光标记激光共聚焦测序等，这些方法都需要复杂的程序，昂贵的试剂和配套昂贵的设备。相比之下，杂交检测进行基因检测方法简单、方便，因此，基因传感器和基因芯片等是一种基于杂交检测的方法。

传统基因检测进行基因探针的标记方法有放射法、酶标法、化学发光标记法等；近年来，银染法也在DNA序列分析中得到广泛应用。放射法灵敏度高，但因其对环境有污染，正逐渐被非放射法所取代。酶标法由于反应过程复杂，酶催化底物反应过快，显色区域不集中，限制了它的使用，特别是不适合生物芯片领域的应用。化学发光标记法、普通银染法及一些其它的标记方法则由于灵敏度较低而使其应用受到很大限制。

基因芯片的出现使得大规模生物信息的同时存储与处理成为现实。迄今，比较成熟的基因芯片检测方法是激光扫描共聚焦显微法，但其程序复杂，检测设备昂贵，难于推广和应用。

三、发明内容

本发明的目的是克服现有基因检测技术存在的问题和不足，提供一种由纳米微粒表面共价结合寡核苷酸单链基因探针分子构成的纳米微粒标记基因探针；本发明的另一个目的是提供一种本发明的纳米微粒标记基因探针的制备方法；本发明还有一个目的是将本发明的基因探针作为基因杂交检测，特别适合于低集成度诊断型基因芯片的应用。

本发明的目的是这样实现的，即将表面合成化学、生物化学及物理化学技术有机结合起来，解决目视法基因检测技术设计与制造中的关键技术；提供双探针杂交银粒子着色进行微量DNA检测与信息放大的最新工艺，进而研究具有实用价值的能够用于多种目的基因检测的目视法基因芯片检测系统，如肝炎(七种肝炎病毒)等传染性疾病或遗传疾病临床用目视法基因芯片诊断系统，推动基因诊断技术的进步。本发明包括三方面的内容：纳米基因探针、该种探针的制备方法、该种探针的应用。其创新点在于探针制备，纳米放大，目视显色主要技术，适用于各类用途的基因检测，特别适合于低集成度基因芯片领域。

1、探针制备，即基因探针的制备。该探针是由纳米微粒表面共价结合100～1000个寡核苷酸单链基因探针分子构成，纳米微粒的化学组成包括金、银原子，硫化镉、氧化铁、氧化硅等分子，微粒与寡核苷酸通过二硫键、醚键、硫胺酯键结合，寡核苷酸与微粒的结合处有脂肪烃臂，寡核苷酸为单链DNA或RNA。

探针的制备方法和注意事项包括如下：

①胶体金或纳米微粒的制备，目前通过将氯金酸溶液煮沸还原法，通过添加还原剂和搅拌速度来控制粒径。也可采用反向胶束法等方法制备。粒径一般使用8～160纳米。

②DNA探针分子设计及委托合成与修饰，要根据不同用途设计不同的DNA碱基顺序并连接不同的基团，如用于交连到玻片上的探针，除了在5’端添加氨基等活性基团外，还应增加脂肪酸链或非特异性核苷酸以克服杂交时的空间位阻。用于纳米微粒标记的DNA探针除了考虑杂交时的空间位阻外，更重要的是应考虑使用易于与纳米微粒交连固定的活性基团，如巯基(-SH)。

③纳米标记探针的自组装合成与封闭，这是实现与否的关键，只有严格控制反应条件，才能使多达成百上千的基因探针牢牢地以共价键结合到纳米金上，使用牛血清白蛋白或聚乙二醇或鲑鱼精子DNA封闭多余的活性位点后，经过后续的杂交反应，才能使银粒子特异性富集。

2、纳米放大，主要通过“金标记寡核苷酸探针”或纳米微粒探针与固定到波片、尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片上的双探针与目的或待检DNA片段特异性地互补杂交，通过氢键形成一种多级三维聚集的立体结构，借重与基片上固定的探针形成化学键将杂交聚集体锚定在固体支持物上，实现杂交信号的分子聚集放大。

3、目视显色，是在上述特异性的杂交聚集体形成的基础上，将银盐(如硝酸银)和还原剂添加在杂交体系中，首先通过静电相互作用将带正电荷的银离子吸引到带负电荷的核酸片段周围和纳米金球表面，再被还原成银原子，在成核理论作用下沉积在杂交聚集体四周，显示出银灰色，从而将杂交信号放大100万倍以上。在光学效应上实现了目视显色，观察基因杂交结果。

本发明具有以下优点和积极效果：

①具有灵敏度高、特异性好、简便、快速、廉价的特点。

②既可用于单基因检测，也可应用于多基因集成检测，如多种传染性微生物病原的临床检测、癌症早期诊断、遗传病产前诊断与在体常规体检，基因表达调控研究，特征基因表达谱检测，基因文库筛选等，尤其适用于低集成度基因芯片检测，有很好的临床使用价值。

③本发明所述的纳米微粒也适用于采用免疫学原理的免疫组化检测，如蛋白质芯片检测等。

四、附图说明

图1为本发明实施步骤方框图；

图2为硅烷化处理反应分子机理示意图。

其中：1-基因探针合成与修饰，2-纳米粒子制备与表征，3-硅烷化处理 4-金标探针制备与表征，5-载体表面探针固定，6-杂交与纳米放大，7-模式识别体系配套，8-基因目视检测，9-结果分析。

由图1可知，本发明的实现和应用包括9大步骤：每个步骤的技术要求都比较高，必须由专业技术人员严格控制工艺过程，方能达到新方法所述基因检测的标准。

①基因探针合成与修饰1，主要是作好分子设计，一般借重分子生物学设计软件完成。如上所述，要根据不同用途设计不同的DNA碱基顺序并连接不同的基团。总的要求是便于探针与固相支持物交连固定和便于充分杂交。

②纳米粒子制备与表征2，我们使用加热还原法，也可使用反向胶束等其它方法。根据不同的基因检测需要制备不同粒径和外型的纳米微粒。纳米粒子的表征可以使用透射电子显微镜、瑞利(Rayleigh)散射光谱、X-射线衍射，现已有专门纳米测量仪器出售。

③硅烷化处理3，使用现有基因芯片技术中的玻片处理方法，略加改进。

④纳米标记探针制备与表征4，指金标基因探针的制备。要选用合适粒度的纳米金，一般选用8～160nm(分辩率要求越高粒径越小，浓度为10～20nM)与预先针对目的基因片段设计、合成并用烷基巯基修饰好的浓度为1-10μM的DNA寡核苷酸水溶液，在温度为15-40℃反应，控制反应的pH值为6-8之间，时间为10-20小时，继续在0.1M NaCl，10mM磷酸缓冲液中放置30-50小时后，12000-16000rpm离心去上清，加入0.1M NaCl，10mM磷酸缓冲液反复洗涤三次，最后加入0.3M NaCl，10mM磷酸缓冲液(pH7)，0.01％叠氮化钠，4℃保存。反应产物冷藏保存。表征方法目前采用紫外吸收法和瑞利散射法。

⑤载体表面探针固定5，采用直接点样法，探针浓度10^-5～10^-11摩尔。反应过程中要保持润湿和无菌状态。

⑥杂交与纳米放大6，如前所述。

⑦模式识别体系配套7，指事先设计规定好的结果判定方法、标准；与检测相对应的信号识别软件及必要的识别、扫描和分析设备配套。

⑧基因目视检测8，通过探针杂交后经过纳米放大银染看是否显色，显出灰褐色的即为有基因杂交信号，可以用肉眼观察直接判定检测结果。

⑨结果分析9，将上述显色结果，经过模式识别和分析处理后，将检测结果整理输出。

由图2可知，玻片表面在处理过程中经过了一系列化学变化，通过硅烷化偶联剂和/或手臂分子将寡核苷酸探针共价结合到玻片上，便于以后步骤的稳定实施。固相载体如果用硝酸纤维素膜、尼龙膜、纳米粒等可不用硅烷化处理，只需活化过程。

本发明流程如下：

1、基片表面处理

以玻片为基片的检测芯片为例：

用浓硝酸煮洗玻片10分钟，再用蒸馏水洗3次，放入烘箱40℃烘干。

取1.5毫升水，28毫升丙酮和600微升硅烷化偶联剂PDITC(苯2异硫氰酸酯)加入容器中，再将玻片浸入其中40分钟。

用丙酮(分析纯)洗涤玻片5次(5分钟/次)，再将玻片烘干。

把玻片放入0.2％PDITC溶液中，置于烘箱中2小时(维持温度37℃)。

从PDITC中取出玻片，先用甲醇洗涤5次(5分钟/次)，再用丙酮洗涤2次，最后用双蒸水洗涤一次，晾干。

将光密度值为1OD(吸光度值)的5’-氨基寡核苷酸溶解于100μl(微升，容积单位)TE(1×Tris-EDTA缓冲液，分子生物学常用试剂)中，然后将单链DNA点在玻片上，将玻片在4℃放置5小时，转入潮湿的环境下40℃放置2小时。

2、纳米金微粒(胶体金)的制备(100ml)

将0.01％的HAuClO₄(氯金酸)加热至沸。搅拌下加入2-4ml、1％的柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，继续加热煮沸15分钟。停止加热，搅拌下冷却至室温，用蒸馏水恢复至原体积，粒径8～140纳米。

3、纳米金微粒探针的制备

用0.1M Na₂CO₃(碳酸纳)或1M Tris碱调节胶体金溶液的pH至选定值，选择pH7±0.5为反应pH值。原则上可选择待标记核酸或蛋白质等电点，也可略微偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。

取制备好的纳米金球1ml(14nm)，离心(10000转左右)，去除沉淀物。再16000-25000转离心30-50分钟，去上清，再加入1ml(0.1M NaCl，10mM磷酸缓冲液，0.2％的PEG(聚乙二醇)或BSA(牛血清白蛋白))溶液，超声旋起，重复3次，以除去杂物。

将1OD DNA溶解在100μlTE(1TE)中，加入上述1ml纳米金球溶液中，室温放置1小时，然后在4℃放置过夜，离心洗涤去上清后加入终浓度为0.3M NaCl，10mM磷酸缓冲液，0.01％叠氮化钠的溶液体系中，4℃保存备用。

4、杂交

取PCR(聚合酶链式反应)扩增产物或直接提取的目标序列溶解在100μlTE(1×TE)中，取1-10μl溶解到1-50ml 8×PBS(磷酸缓冲液)中(浓度大于100nM)，将固定好DNA的玻片与之杂交(50℃1小时，4℃放置过夜)，然后，加入纳米金探针1-50μl(浓度大于5nM)，继续杂交2-4小时。

5、染色

(1)溶液配制：

A、银显影液：

*乳酸银显影液

a.10％阿拉伯胶水溶液或1％明胶      60ml

b.枸橼酸缓冲液(pH3.5)              10ml

c.对苯二酚0.85g，加水15ml溶解

d.乳酸银0.11g，加水15ml溶解

以上a～c用前混合过滤，最后加入d.注意避光。

*硝酸银显影液：

a.10％阿拉伯胶水溶液或1％明胶      60ml

b.枸橼酸缓冲液(pH3.5)              10ml

c.对苯二酚1.7g，加水30ml溶解

d.硝酸银50mg，加水2ml溶解

以上a～c用前混合过滤，最后加入d.注意避光。

以上两种显影液中，如以蒸馏水代替阿拉伯胶或明胶，则显色速度明显加快，要在镜下控制显色程度。

B、枸橼酸缓冲液

枸橼酸(C₆H₈O₇·H₂O)            2.55g

枸橼酸三钠(C₆H₅Na₃O₇·H₂O)    2.35g

加蒸馏水100ml溶解。

C、定影液

20％硫代硫酸钠

(2)显色步骤：

将杂交后的玻片取出，分别用8×PBN漂洗3次，每次2分钟。银染色反应：将基因芯片用去离子水洗涤3×6分钟，除去Cl^-(氯离子)，接着于0.2M pH3.5柠檬酸缓冲液中浸泡3分钟，然后将玻片放入装有显影液的平皿中作用10～15分钟，再将玻片放入定影液中3分钟，取出用大量去离子水洗涤后，自然干燥。

判定：凡是着色很深、呈均匀一致的灰黑色斑点，与背景反差强者判为强阳性(+++)；着色较深，与背景反差较强者判为阳性(++)；着色淡，与背景反差小者判为弱阳性(+)；不着色者判为阴性(-)。

五、具体实施方式

例1，纳米金银放大目视显色法检测人乙、丙肝病毒病原基因，其流程如下：

(1)配制0.2％的PDITC(1，4-苯二异硫氰酸酯)溶液

①混合溶剂

吡啶：DMF(N，N-二甲基甲酰胺)＝1∶9(注意都是无水溶剂)，例：0.19gPDC+10ml吡啶+90mlDMF即为100ml0.2％的PDITC溶液。

②玻片的处理

用浓硝酸煮洗玻片10分钟，再用蒸馏水洗，放入烘箱烘干。

③寡核苷酸溶液的配制

将光密度值为1.0(约33ug)的5’-氨基寡核苷酸溶解于100ulTE(1×TE)中，浓度约为3.35×10-5mol/L。5’-氨基寡核苷酸序列：5’-NH₂-GGA CTT CTC TCA ATT TTC TAG GG-3’

(2)玻片的硅烷化处理，捕获DNA与玻片的交联

①活化

取1.5毫升水，28毫升丙酮和600微升硅烷化偶联剂加入一培养皿中，再将玻片浸入其中40分钟。

用丙酮洗涤玻片5次(5分钟/次)，再将玻片烘干。

②PDC交联

把玻片放入0.2％PDITC溶液，置于烘箱中2小时(维持湿度37摄氏度)。

从PDITC中取出玻片，先用甲醇洗涤5次(5分钟/次)，再用丙酮洗涤2次，最后用双蒸水洗涤一次，晾干。

③DNA探针的固定

将单链乙丙型肝炎DNA探针点在玻片上不同的位点，然后将玻片在4℃放置5小时，潮湿的环境下40℃放置2～4小时。

(3)纳米微粒金银放大目视显色法检测基因

①胶体金的制备，同上。

②在纳米金球上修饰HS-DNA。技术同上，带巯基修饰的乙丙肝病毒特异性基因探针通过专门设计软件设计序列后委托专业公司合成HS-DNA。

(4)目的基因获取与制备。用常规分子生物学技术提取病毒核酸或者以此作为模版进行PCR扩增，使病原基因达到检测最低浓度。

(5)杂交。

取1OD目标序列溶解在100ulTE中，取1-10μl溶解到1-50ml8×PBS中(浓度大于100nM)，将固定好DNA的玻片与之杂交(50℃2小时，4℃放置过夜)，然后，加入纳米金探针1-50μl(浓度大于5nM)，继续杂交2小时。

(6)染色

①银显影液：硝酸银显影液、枸橼酸缓冲液同上配制。

②定影液：20％硫代硫酸钠

③显色

将杂交后的玻片取出，分别用8×PBN漂洗3次，每次2分钟。银染色反应：将基因芯片用去离子水洗涤3×6分钟，除去Cl^-，接着于0.2M pH3.5柠檬酸缓冲液中浸泡3分钟，然后将玻片放入装有显影液的平皿中作用10～15分钟，再将玻片放入定影液中3分钟，取出用大量去离子水洗涤后，自然干燥。

判定：准则同上。

(7)结果。

芯片上固定有乙肝病毒基因探针的点与对应的乙肝病毒检测金标探针与乙肝阳性血清PCR扩增产物杂交后着色很深、呈均匀一致的灰黑色斑点，与背景反差强.显色率100％，同琼脂糖凝胶检测符合率100％。而对照所用丁肝特异性cDNA作捕获DNA探针，检测乙肝阳性血清PCR扩增产物，呈空白斑点，不着色，判为阴性。

Claims (1)

1、一种制备纳米微粒标记基因探针的方法，包括：

①胶体金或纳米微粒的制备；

②DNA探针分子设计及合成与修饰；

③金纳米基因标记探针的自组装合成与封闭；

其特征在于：

金纳米基因标记探针的自组装合成选用粒度8-160nm的纳米金，与预先针对目的基因片段设计、合成并用烷基巯基修饰好的浓度为1-10μM的DNA寡核苷酸水溶液在温度为15-40℃反应，控制反应的pH值为6-8，时间为10-20小时，继续在0.1M NaCl，10mM磷酸缓冲液中放置30-50小时后，12000-16000rpm离心去上清，加入0.1M NaCl，10mM磷酸缓冲液反复洗涤三次，最后加入0.3M NaCl，10mM磷酸缓冲液，0.01％叠氮化钠，4℃保存。

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