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CN114839288A - 一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法 - Google Patents

一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法 Download PDF

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CN114839288A CN202210453076.4A CN202210453076A CN114839288A CN 114839288 A CN114839288 A CN 114839288A CN 202210453076 A CN202210453076 A CN 202210453076A CN 114839288 A CN114839288 A CN 114839288A
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Abstract

本发明公开了一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法，包括以下步骤：S1、称取盐酸雷尼替丁样品，所述盐酸雷尼替丁样品中含有杂质N‑亚硝基二甲胺；S2、配制盐酸雷尼替丁供试品溶液，使所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中N‑亚硝基二甲胺的浓度达到高效液相色谱法的检出限；S3、在盐酸雷尼替丁供试品溶液中加入碱性溶液，碱性溶液与盐酸雷尼替丁中的盐酸完全发生反应，得到雷尼替丁中和溶液；S4、在雷尼替丁中和溶液中加入银离子溶液，银离子与雷尼替丁中的仲氨基完全发生络合反应，生成沉淀。本发明将高浓度雷尼替丁供试品中的雷尼替丁沉淀除去，不产生副产物NDMA，同时保留样品中的NDMA，大幅提高NDMA检测灵敏度，满足各类型号质谱检测要求。

Description

一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法
技术领域
本发明涉及盐酸雷尼替丁样品的处理，特别是一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法。
背景技术
N-亚硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)具有强基因毒性、强致畸性和强致癌性，属于2A类致癌物。FDA根据The Carcinogenic Potency Database(CPDB数据库)中的毒理学数据，将NDMA每日摄入限值设为约0.096μg。2019年9月13日，FDA 发布安全警告，一些雷尼替丁药物，其中也包括品牌药Zantac(善卫得)，含有N-二甲基亚硝胺(NDMA)杂质。随后，我国针对该品种展开了NDMA的专项检验检测。
依据《中国药典》2020年版四部9306遗传毒性杂质控制指导原则，盐酸雷尼替丁胶囊中NDMA含量可根据化合物特异性风险评估方法来推导可接受摄入量，即根据导致 50％肿瘤发生率的给药剂量(Median Toxic Dose,半数中毒剂量，TD50)线性外推法来计算化合物特异性的可接受摄入量，TD50线性外推法即通过啮齿类动物致癌性数据来计算杂质的可接受摄入量，NDMA杂质的限值为0.0959μg/(kg·d)÷300mg≈320ng/g。
国内现有检验技术为《关于开展雷尼替丁中N亚硝基二甲胺检验工作的通知》(中检化药函〔2019〕710号)“附件2：HPLC-MS/MS法测定盐酸雷尼替丁原料胶囊和片剂中N-亚硝基二甲胺”。该法采用液质联用法测定，供试品制备法为：取本品内容物适量，约相当于雷尼替丁300mg，至适宜容器中，精密加入甲醇10ml，涡旋混匀1分钟，再振摇40分钟，离心，取上清液滤过，取续滤液即得。经按现有技术测定，雷尼替丁中NDMA 的定量限约为33ppb。
欧盟与FDA现有的检验技术均为液质联用、气质联用。法国国家药品和保健品安全管理局使用HPLC法，但其检测限为8.5ng/ml，无法满足NDMA可接受限度的检验，仅用于初筛。
经仪器对比试验，现有方法对液质联用仪的要求较高，部分型号老旧的仪器仅能达到2ng/mlNDMA浓度的定量限，只有少量较新型号并维护良好的仪器能满足1ng/ml浓度定量限的要求。因此有必要研发一种方法提高耐用性，使大多数仪器均能满足测定需求。
按现有HPLC-MS/MS法测定盐酸雷尼替丁原料胶囊和片剂中N-亚硝基二甲胺的HPLC 部分测定，色谱柱严重过载(供试品溶液浓度为30mg/ml)，同时无法达到NDMA检测限度要求。若需要达到NDMA检测限度要求，供试品溶液浓度还需提高约8倍(供试品溶液浓度约250mg/ml)，在此供试品溶液浓度下，溶液为淡黄色粘稠液体。为保护色谱系统，未直接测定该浓度的溶液。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种雷尼替丁样品前处理方法，利用高效液相色谱法可准确检测出N-亚硝基二甲胺的含量。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法，包括以下步骤：
S1、称取盐酸雷尼替丁样品，所述盐酸雷尼替丁样品中含有杂质N-亚硝基二甲胺；
S2、配制盐酸雷尼替丁供试品溶液，使所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中N-亚硝基二甲胺的浓度高于高效液相色谱法的检测限；
S3、在所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中加入碱性溶液，所述碱性溶液与盐酸雷尼替丁中的盐酸根完全发生反应，得到雷尼替丁中和溶液；
S4、在所述雷尼替丁中和溶液中加入银离子溶液，得反应溶液；反应溶液中所述银离子与雷尼替丁中的仲氨基完全发生络合反应，生成沉淀；
S5、将S4生成的反应溶液过滤后得滤液，滤液即为处理后的供试品溶液。
当盐酸雷尼替丁供试品溶液中，N-亚硝基二甲胺的浓度高于高效液相色谱法的检测限时，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中盐酸雷尼替丁的浓度超出液相色谱的载样量，本发明加入碱性溶液中和盐酸雷尼替丁中的盐酸根、加入银离子与雷尼替丁中的仲氨基完全发生络合反应，两个手段相互结合，使大部分雷尼替丁变成沉淀，降低供试品溶液中雷尼替丁的浓度，使供试品溶液中雷尼替丁的浓度不超出液相色谱的载样量。
进一步地，S3中，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液与所述碱性溶液的摩尔比为 1:[1-1.05]。
碱性溶液可刚好中和盐酸雷尼替丁中的盐酸根，也可以稍过量。进一步优选地，碱性溶液稍过量，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液与所述碱性溶液的摩尔比为1:(1-1.05] 使溶液呈碱性，NDMA水溶性好，在碱溶液中更稳定，不与硝酸银等其他所加入的试剂发生反应，通过沉淀法可与雷尼替丁较好地分离。
进一步地，S4中，所述雷尼替丁中和溶液与所述银离子溶液的摩尔比为1:[2-2.1]。
银离子溶液可刚好与雷尼替丁中的仲氨基团发生反应，也可以稍过量。
进一步地，S5中的所述滤液显浑浊，可置于-25～-15℃冷冻5～20min后再离心、过滤得处理后的供试品溶液。低温冷冻可使沉淀更完全，使过滤更充分。
进一步地，S4中，若加入的银离子溶液过量，在S4生成沉淀后的反应溶液中加入氯离子溶液，与多余的银离子反应生成沉淀。
进一步地，所述氯离子溶液与所述银离子溶液的摩尔比为(0.5-0.6)∶(2-2.1)。
由氯化钠引入的氯离子可进一步与稍过量的银离子反应，保护色谱柱与质谱检测器。
进一步地，所述碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或氨水。进一步优选地，弱碱溶液中和能力有限，对沉淀影响不大，而强碱中氢氧化钠经济易得，所述碱性溶液为氢氧化钠水溶液。
进一步地，所述银离子溶液为硝酸银溶液。
进一步地，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液为盐酸雷尼替丁供试品的水溶液。
所述盐酸雷尼替丁供试品溶液采用水作为溶剂，避免采用二氯甲烷作为溶剂还需额外对盐酸雷尼替丁样品进行干燥，可以避免干燥过程中盐酸雷尼替丁样品生成副产物NDMA，影响检测的准确性。
进一步地，当高效液相色谱法的进样量是20uL时，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中N-亚硝基二甲胺的定量限可达32ppb。使得采用高效液相色谱法时，N-亚硝基二甲胺的浓度达到检测限。
按国内现有检验技术《关于开展雷尼替丁中N亚硝基二甲胺检验工作的通知》(中检化药函〔2019〕710号)“附件2：HPLC-MS/MS法测定盐酸雷尼替丁原料胶囊和片剂中N-亚硝基二甲胺”试验，该方法供试品溶液浓度为30mg/ml，色谱峰已出现平头峰的过载趋势，表明盐酸雷尼替丁供试品溶液浓度上限约为30mg/ml。
公开号为CN112526005A的专利公开了一种雷尼替丁类药物中亚硝胺类物质的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：(1)样品处理；(2)样品溶液配制；(3)对照溶液配制；(4)色谱分析。该发明通过对雷尼替丁类药物进行干燥、研磨处理及密封条件下低温配置、测试前过滤等工艺条件的设置，采用HPLC法测定NDMA。
公开号为CN112526005A的专利存在一定缺陷，无法满足测定需求，具体如下：
①对比试验表明NDMA转移不充分。取同批次样品按公开号为CN112526005A的专利与本发明所采用方法对比测试，公开号为CN112526005A的专利NDMA检出量仅约为本发明的50％(样品为水分含量低于0.1％的原料药，未干燥处理)。推测其原因可能是公开号为CN112526005A的专利供试品处理后雷尼替丁在二氯甲烷中几乎不溶解，包藏在晶格中的NDMA无法溶出，导致检出量下降。在进行回收率试验中，加入的NDMA均为非包藏态，故该专利报道的回收率较高。
②干燥过程可导致雷尼替丁降解产生NDMA。本发明的前期试验表明，盐酸雷尼替丁胶囊在80℃的高温影响因素试验中，24小时后NDMA含量可由0.2ppm升至约300ppm，每小时NDMA生成量约12.5ppm，每小时生成的NDMA已超出0.3ppm的限度，干燥处理将严重干扰测定结果。
③水分含量对测定结果影响较大。雷尼替丁与NDMA均易溶于水，在二氯甲烷中几乎不溶。若使用二氯甲烷作为溶剂从雷尼替丁中萃取NDMA，则需要保持供试品干燥，否则NDMA无法从水中分配至二氯甲烷，这也是该专利强调干燥处理的原因。由于盐酸雷尼替丁吸湿性较强，试验表明常温减压干燥或硅胶干燥无法在24小时内将水分控制到较低水平，而高温条件虽能较快降低水分，但干燥过程将导致雷尼替丁降解生成NDMA。
④重复性较差。由于二氯甲烷的萃取因素、干燥因素与水分含量等因素对测定结果均有较大影响，按公开号为CN112526005A的专利处理同一批样品后测定结果高低不定，重复性较差。
⑤二氯甲烷作为溶剂造成色谱峰延展较大。公开号为CN112526005A的专利色谱条件中0～15min流动相梯度由100％水相A递减至0％，NDMA在约4min出峰，此时水相与有机相的比例在90∶10以内，不足以洗脱二氯甲烷。二氯甲烷中的NDMA需要经过两相分配才能逐渐释放近入流动相出峰，导致色谱峰延展较大，灵敏度降低。
本发明为一种测定雷尼替丁及其固体制剂中N-亚硝基二甲胺(NDMA)的样品前处理方法。
NDMA是雷尼替丁及其制剂中含有的一种强致癌毒性杂质，其可接受限度极低，每g雷尼替丁中仅允许含NDMA在300ng以下。由于NDMA限量较低，按现有技术一般采用灵敏度较高的质谱法检测，定量限约为33ppb。质谱法虽灵敏度高，但仪器价格昂贵，依赖进口，且检验成本高，对检测人员专业能力要求高，导致大多数雷尼替丁及其制剂的制药企业无检验能力，为企业对药品质量的自控设置了壁垒，也为药品质量的监管造成了阻碍。
高效液相色谱法(HPLC法)可检验NDMA，但因灵敏度较质谱法低1个数量级，导致按现有方法供试品处理方式制备样品无法达到定量要求。若增加供试品溶液浓度或增大进样量，雷尼替丁将严重超出色谱柱载样量，且其他杂质干扰NDMA的检测。
本发明着重对样品处理方法进行研究，采用适宜的方式将高浓度雷尼替丁供试品中的雷尼替丁沉淀除去，同时保留NDMA，达到HPLC法测定的灵敏度要求。
本发明的技术关键点在于：
1、用氢氧化钠碱化溶液，去除盐酸雷尼替丁的酸根，使雷尼替丁更容易沉淀，避免雷尼替丁在供试品处理过程中降解生成NDMA，盐酸雷尼替丁去除酸根后在色谱柱中保留更稳定。经测试，未中和酸根的供试品将超出流动相缓冲能力，导致离子态与分子态的雷尼替丁彼此分离，雷尼替丁主峰分叉且出现较大的延展。
2、雷尼替丁仲氨基团与银络合生成沉淀，通过离心与过滤从溶液中去除雷尼替丁，使取样量大幅增加，NDMA浓度达到定量要求。
3、NDMA在设计的样品前处理方法中不与其他试剂发生反应，稳定性较好。
本发明还包括以下内容：利用色谱柱对处理后的供试品溶液和对照溶液分别进行色谱分析，高效液相色谱的条件为：
波长为235nm，流速为1ml/min，柱温为30℃，进样20μl；
高效液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为碱性水性流动相，所述碱性水相流动相满足7＜pH≤10.5，所述流动相B为有机相。
本发明采用碱性流动相A，满足7＜pH≤10.5，雷尼替丁为碱性化合物，在偏碱性的流动相中其以分子态与固定相进行分配，保留时间大幅延长，峰型更好。当pH低于 7则出双峰；当pH高于10.5，NDMA保留时间缩短，与相邻色谱峰分离度降低，且对色谱柱不友好，因此流动相pH以7＜pH≤10.5为宜。
进一步地，所述碱性水性流动相满足9.5≤pH≤10.5。当pH低于pH9.5可见峰分叉，因此流动相pH以9.5≤pH≤10.5较优。
进一步地，所述碱性水性流动相为碱性碳酸氢铵溶液。能够获得理想的pH值以及较好的缓冲能力，基线噪音较低，满足痕量物质的检测；碳酸氢铵为挥发性物质，能做到兼容质谱，能够方便的进行质谱验证或进行质谱的方法转移。
进一步地，所述碱性碳酸氢铵溶液的制备方法为在碳酸氢铵溶液加入氨水。氨水为挥发性物质，能做到兼容质谱，能够方便的进行质谱验证或进行质谱的方法转移。
进一步地，色谱分析过程中，采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括以下阶段：
第一阶段为亚硝胺类杂质检测区间，流动相A的体积比为90％～99％，流动相B 的体积比为1％～10％；
第二阶段为有机相梯度爬升阶段，流动相A的体积比为90％～99％，流动相B的体积比为1％～10％；
第三阶段为全洗脱阶段，流动相A的体积比为10％～30％，流动相的体积比为B70％～90％。
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：
(1)材料简单经济，操作简单。本发明通过相对专属的沉淀反应去除雷尼替丁，使用的试剂均为常用试剂；供试品溶液制备过程较为简单快捷，平均每批供试品处理时间在半小时以内，不涉及萃取、回流、富集等复杂操作。
(2)提供了一种可行的样品前处理方法大幅提升取样量，使HPLC法代替液质联用法测定NDMA成为可能，大幅降低了检验成本，降低了技术门槛。
(3)对于必须使用液质联用进行验证的样品，提供了一种提高目标化合物浓度的方法，使各种品牌和型号的质谱仪均能满足测定需求。
(4)处理过程没有高温环节，且处理时间短，避免了雷尼替丁降解为NDMA的可能。
附图说明
图1为现有HPLC方法测定样品图(供试品溶液浓度为30mg/ml)；
图2为用碱沉淀雷尼替丁样品图(供试品溶液浓度为30mg/ml)；
图3为用硝酸银沉淀雷尼替丁后供试品溶液图(供试品溶液浓度为250mg/ml)；
图4为用氢氧化钠中和酸根供试品溶液图(供试品溶液浓度为250mg/ml)；
图5为图4局部放大图；
图6为限度浓度的对照品(73ng/ml)；
图7为新批号的盐酸雷尼替丁原料药；
图8为新批号盐酸雷尼替丁胶囊；
图9为新批号盐酸雷尼替丁胶囊80℃高温放置；
图10为按本发明前处理方法制备的样品质谱图(云鹏医药集团，约含有限度量的NDMA)；
图11为按现行方法制备的样品质谱图(云鹏医药集团，约含有限度量的NDMA)；
图12为按现行方法液相部分测定样品(云鹏医药集团，约含有限度量的NDMA)；
图13为供试品取样(盐酸雷尼替丁原料药，1.5g)；
图14为精密加水2.5ml溶解；
图15为各试剂加入完毕，摇匀；
图16为离心后供试品溶液。
具体实施方式
1、所需材料盐酸雷尼替丁胶囊样品(来源：上海惠仁(夏邑)制药有限公司、佛山手心制药有限公司、苏州弘森药业股份有限公司、蚌埠丰原涂山制药有限公司、上海衡山药业有限公司、云鹏医药集团有限公司；规格均为150mg；辅料为淀粉、硬脂酸镁等)、硝酸银试剂(分析纯)、氢氧化钠试剂(分析纯)、氯化钠试剂(分析纯)、纯化水、离心机、离心管、微孔滤膜。
2、基本原理
2.1根据供试品溶液浓度越高，待测物浓度越高的原理，将供试品溶液浓度由现有方法的30mg/ml提升至250mg/ml(盐酸雷尼替丁的浓度)，供试品溶液浓度提升8倍，使 NDMA浓度基本达到定量要求。
2.2根据NDMA在碱溶液中稳定，雷尼替丁在酸中易降解生成NDMA的原理，在供试品溶液中加入0.35g/ml氢氧化钠溶液适量，中和盐酸雷尼替丁中的盐酸根，使其溶解度降低更易沉淀，同时避免雷尼替丁降解生成NDMA。
一分子盐酸雷尼替丁中含一份子盐酸，中和盐酸根需要相同摩尔量的氢氧化钠。当盐酸雷尼替丁的取样量为1.5g时，相同摩尔数的氢氧化钠为0.17g，可加入0.34g/ml 的氢氧化钠溶液0.5ml。为确保盐酸雷尼替丁中的盐酸根完全中和，将氢氧化钠溶液浓度提升至0.35g/ml，使氢氧化钠略过量。
经研究，氢氧化钠加入量以略超过中和量为宜。一方面，盐酸雷尼替丁中的盐酸根为强酸，若不中和或中和不完全将导致超出流动相的缓冲能力，离子态与分子态的雷尼替丁共存，离子态雷尼替丁保留时间提前，对NDMA会造成干扰，同时主峰分叉；另一方面，氢氧化钠加入量不可过大，若加入量超出中和量太多，将使溶液碱度超过雷尼替丁的稳定性限度，造成雷尼替丁分解成非NDMA的杂质。
2.3根据银离子络合原理，盐酸雷尼替丁结构中有2个仲氨基，可与银离子络合生成沉淀。在供试品溶液中按盐酸雷尼替丁∶硝酸银摩尔比为1∶2加入略过量的硝酸银使其沉淀。
按盐酸雷尼替丁∶硝酸银摩尔比为1∶2计算，当盐酸雷尼替丁取样量为1.5g时，硝酸银加入量应为1.45g，向上修约为1.5g，使硝酸银约有0.05g略过量的取样。
根据盐酸雷尼替丁物理化学特性，探索了碱溶液沉淀、水溶醇沉、异丙醇与丙酮溶解、不同沉淀剂沉淀等方法，结果表明：①盐酸雷尼替丁水溶液在加入氢氧化钠饱和溶液后出现大量沉淀，但雷尼替丁部分分解，且过滤后的溶液仍含有大量雷尼替丁，导致色谱柱过载；②在雷尼替丁水溶液中加入甲醇、乙醇、异丙醇等溶剂，雷尼替丁出现大量沉淀，但同样滤液中雷尼替丁的量仍超出色谱柱承载力；③异丙醇、丙酮等溶剂对雷尼替丁的溶解度相对水大幅降低，导致溶液浓度达不到限度要求；④从分子结构分析，探索了以钡盐为沉淀试剂的沉淀法，均不能使雷尼替丁有效沉淀；⑤由于雷尼替丁受热后极易分解生成NDMA，因此所有含加热步骤的供试品处理方法均不可采用；⑥盐酸雷尼替丁与NDMA性质相近，均易溶于水，且含有的氨基均显碱性，因此固液萃取、液液萃取、SPF小柱吸附等方法均不能有效分离两者；⑦NDMA在盐酸雷尼替丁中为痕量物质，只有专属性较高的分离方式才能获得满意的分离效果。综上，当前仅有采用氢氧化钠中和、硝酸银可选择性的与雷尼替丁络合，两个手段相互结合，缺一不可，沉淀效率高，不与NDMA反应，才能得到沉淀盐酸雷尼替丁的最佳供试品前处理方法。
经分析雷尼替丁结构，除银离子络合仲胺基团外尚未发现其他活性基团可被沉淀试剂利用。除使用沉淀试剂外，通过碱化溶液的方式可使雷尼替丁脱去盐酸根，使雷尼替丁溶解度下降，高浓度雷尼替丁在水溶液或甲醇溶液中析出。但经反复试验，该方法沉淀率不高，剩余溶液仍严重超出色谱柱载样量。
另有采用气相色谱法，顶空进样方式可使用高浓度供试品溶液，NDMA浓度可达到检验需求。但经研究，顶空进样方式需要加热振摇，且平衡时间长，导致雷尼替丁在顶空进样器中分解，导致检验结果偏高或出现假阳性。
2.4根据银与氯离子生成沉淀的原理，在含有过量硝酸银的供试品溶液中加入氯化钠适量，使过量的硝酸银沉淀，以保护后续测定过程中的仪器与色谱柱。
2.5根据NDMA的理化性质，NDMA水溶性好，在碱溶液中更稳定，不与硝酸银等其他所加入的试剂发生反应，通过沉淀法可与雷尼替丁较好地分离。
实施例1
取雷尼替丁或其固体制剂适量(约含雷尼替丁1.5g)，精密加水2.5ml，超声2分钟溶解，精密加入0.35g/ml氢氧化钠溶液0.5ml，摇匀，精密加入1g/ml硝酸银溶液2ml，充分振摇，精密加入0.2g/ml的氯化钠溶液1ml，充分振摇，放置10分钟，离心，滤过即得。滤液应澄清无色，若显浑浊，可置-20℃冷冻10min后再离心，过滤。
经反复验证，在上述拟定的操作下盐酸雷尼替丁几乎沉淀完全，供试品溶液可从沉淀前的淡黄色粘稠液体变为澄清非粘稠状态。各试验批次滤液滴加氯化钠溶液后未显浑浊，表明银离子去除完全。进样50余次后色谱柱性能未见明显下降，表明处理后的供试品溶液对色谱系统无明显损耗。
采用现有方法液相部分按本发明前处理方法测定，可检出NDMA。但受限于普通液相色谱无法通过质谱检测器筛选目标分子量化合物，分离度不理想，仅可用于初筛。
为达到液相色谱的良好分离，将液相色谱条件进行优化：采用HPLC法测定；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以10mM碳酸氢铵为流动相A(用氨水调pH至10.0)，乙腈为流动相B，照下表进行梯度洗脱。UV检测器检测，波长为235nm，流速为1ml/min，柱温为30℃，进样20μl。在该色谱条件下，NDMA保留时间进一步延长；通过梯度洗脱，使雷尼替丁主峰在第二梯度(15～25min)末尾出峰，相邻杂质峰与NDMA分离度达到1.5以上。
时间(分钟) A％ B％
0 95 5
15 95 5
25 20 80
40 20 80
40.1 95 5
55 95 5
按该技术测定，NDMA保留时间约为6分钟，雷尼替丁保留时间约25分钟，雷尼替丁中NDMA的定量限约为32ppb，达到了液质联用相同水平的检验灵敏度。
对比例1
现行方法：取雷尼替丁或其固体制剂适量，精密加水，超声2分钟溶解得供试品溶液，供试品溶液浓度为30mg/ml(含20倍限度量的NDMA)，按现有HPLC方法《关于开展雷尼替丁中N亚硝基二甲胺检验工作的通知》(中检化药函〔2019〕710号)“附件2： HPLC-MS/MS法测定盐酸雷尼替丁原料胶囊和片剂中N-亚硝基二甲胺”液相部分测定供试品溶液，如图1所示，色谱柱严重超载，色谱峰分叉。NDMA于4min出峰，雷尼替丁主峰前沿约8min，其杂质可能干扰NDMA的检测。
对比例2
现行方法加氢氧化钠：取雷尼替丁或其固体制剂适量，精密加水，超声2分钟溶解得供试品溶液，供试品溶液浓度为30mg/ml，在供试品溶液中精密加入0.35g/ml氢氧化钠溶液0.5ml，摇匀，雷尼替丁出现沉淀。取滤液测定，如图2所示，色谱柱仍严重超载，色谱峰分叉。
对比例3
本发明主要方法：取雷尼替丁或其固体制剂适量，精密加水，超声2分钟溶解得供试品溶液，供试品溶液浓度为250mg/ml，在供试品溶液中精密加入1g/ml硝酸银溶液 2ml，充分振摇，如图3所示，色谱柱超载情况大幅改善，但酸性供试品超出了流动相的缓冲能力，导致雷尼替丁与盐酸雷尼替丁同时存在，色谱图出现双峰。
对比例4
本发明方法优化：用氢氧化钠中和盐酸雷尼替丁的盐酸根后，沉淀更完全，如图4所示，色谱柱超载情况进一步改善，雷尼替丁未出现双峰。通过调节梯度洗脱程序，可使雷尼替丁在10分钟以后任意时间出峰。如图5所示，NDMA与相邻色谱峰分离良好。采用UV检测器检测，检测波长235nm，进样量为20μl时，雷尼替丁中NDMA的定量限约为32ppb。
对比例5
取限度浓度的对照品NDMA(73ng/ml),如图6所示，限度浓度的对照品(73ng/ml)具有良好的响应，检测限可达32ppb，其灵敏度略高于质谱法。
对比例6
如图7所示，收集新出厂的盐酸雷尼替丁原料药，按本发明实施例1处理，未检出NDMA。表明NDMA峰位无其他杂质干扰。
实施例2
如图8所示，收集新出厂的盐酸雷尼替丁胶囊，按本发明实施例1处理，检出低于限度的NDMA，其含量测定结果与现行质谱方法检测结果一致，再次表明本发明方法对 NDMA的检出能力达到质谱水平。
实施例3
取同一批新出厂的盐酸雷尼替丁胶囊置80℃放置6小时，如图9所示，按本发明处理，检出限度量约1000倍的NDMA。表明该方法专属性较好，灵敏度较高，同时也说明雷尼替丁在高温环境中降解产生NDMA的趋势及其明显。
实施例4
如图10所示，按本发明前处理方法制备样品质谱图(云鹏医药集团，约含有限度量的NDMA)。采用质谱检测器(三重四级杆，APCI源，正离子扫描模式，多反应监测，碰撞电压12V)检测，进样量为2μl，雷尼替丁中NDMA响应大幅提高。
如图11所示，按现行方法制备样品质谱图(云鹏医药集团，约含有限度量的NDMA)。采用质谱检测器(三重四级杆，APCI源，正离子扫描模式，多反应监测，碰撞电压12V) 检测，进样量为2μl，雷尼替丁中NDMA灵敏度约为本发明方法的15％。
如图12所示，按现行方法测定液相色谱图(云鹏医药集团，约含有限度量的NDMA)。采用紫外检测器检测，进样量为20μl，因灵敏度过低未检出NDMA。

Claims (10)

1.一种盐酸雷尼替丁样品的前处理方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、称取盐酸雷尼替丁样品，所述盐酸雷尼替丁样品中含有杂质N-亚硝基二甲胺；
S2、配制盐酸雷尼替丁供试品溶液，使所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中N-亚硝基二甲胺的浓度高于高效液相色谱法的检测限；
S3、在所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中加入碱性溶液，所述碱性溶液与盐酸雷尼替丁中的盐酸根完全发生反应，得到雷尼替丁中和溶液；
S4、在所述雷尼替丁中和溶液中加入银离子溶液，得反应溶液；反应溶液中所述银离子与雷尼替丁中的仲氨基完全发生络合反应，生成沉淀；
S5、将S4生成的反应溶液过滤后得滤液，滤液即为处理后的供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，S3中，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液与所述碱性溶液的摩尔比为1:[1-1.05]。
3.根据权利要求1所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，S4中，所述雷尼替丁中和溶液与所述银离子溶液的摩尔比为1:[2-2.1]。
4.根据权利要求1所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，S5中的所述滤液显浑浊，可置于-25～-15℃冷冻5～20min后再离心、过滤得处理后的供试品溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，S4中，若加入的银离子溶液过量，在S4生成沉淀后的反应溶液中加入氯离子溶液，与多余的银离子反应生成沉淀。
6.根据权利要求5所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，所述氯离子溶液与所述银离子溶液的摩尔比为(0.5-0.6)∶(2-2.1)。
7.根据权利要求1-4任一项所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，所述碱性溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或氨水。
8.根据权利要求1-4任一项所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，所述银离子溶液为硝酸银溶液。
9.根据权利要求1-4任一项所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液为盐酸雷尼替丁供试品的水溶液。
10.根据权利要求1-4任一项所述的雷尼替丁样品前处理方法，其特征在于，当高效液相色谱法的进样量是20uL时，所述盐酸雷尼替丁供试品溶液中N-亚硝基二甲胺的定量限可达32ppb。
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