CN114836461B - 表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基和发酵培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基、发酵培养方法和用途，该重组质粒是在表达质粒中插入表达盒不同模块，包括信号肽αfactor、ColG或ColH前导肽和功能区；然后将重组质粒转化出发酵母菌株后得到分泌胶原蛋白酶的酿酒酵母。本发明构建了分泌生产胶原蛋白酶的酿酒酵母工程菌，通过优化酵母培养基的成分，优化胶原蛋白酶序列中的信号肽元件，提高了酿酒酵母分泌胶原蛋白酶的能力。所得重组胶原蛋白酶能够有效降解明胶和胶原蛋白，对胶原蛋白酶的应用及胶原蛋白资源的有效利用具有重要的实践意义。

Description

表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基和发 酵培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基、发酵培养方法和用途。

背景技术

在畜禽及水产品的加工生产中，副产物产量巨大，这些动物性的角、蹄、皮、骨和鳞片中含有丰富的胶原蛋白资源。

酶法提取是提高这些副产物加工利用率的重要手段，相比于其他酸碱处理等非生物过程，可以更好地获取高质量的生物活性提取物，且更加环保。鉴于胶原蛋白的特殊三螺旋结构具有较高强度，普通蛋白酶难以将其直接水解，通常需化学法或高温辅助水解。

目前工业生产中常用于制备胶原蛋白寡肽的酶主要包括木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶等，但是对胶原蛋白的特异性较差。

胶原蛋白酶是一种针对胶原蛋白的特异性金属蛋白水解酶，能在生理条件下水解胶原蛋白，从而更易获取具有生物活性的胶原蛋白肽，可有效提高温和处理条件下的胶原蛋白水解程度及质量。

来源于溶组织梭状芽孢杆菌的胶原蛋白酶研究最为广泛，是目前公认的用于鉴定分析新型胶原蛋白酶的标准酶，也是可商品化获取的微生物源胶原蛋白酶。但溶组织梭状芽孢杆菌源胶原蛋白酶主要是从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵上清液中纯化所得，其发酵上清液中成分复杂，蛋白纯化步骤繁琐，批次间胶原蛋白酶制剂的活性差异较大。此外，溶组织梭状芽孢杆菌是致病菌，其分泌的胶原蛋白酶在食品等对安全性要求较高领域的应用受到一定限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基、发酵培养方法和用途，来解决现有胶原蛋白酶来源待拓展的不足。通过将胶原蛋白酶基因导入酿酒酵母细胞体内，优化酵母发酵培养基组成成分，实现胶原蛋白酶在食品级安全宿主中的分泌表达。进而通过优化胶原蛋白酶序列中的信号肽元件，提高了胶原蛋白酶的分泌水平。本发明围绕培养基和信号肽元件的优化，得到了高效分泌表达胶原蛋白酶的酿酒酵母菌株，所得的重组胶原蛋白酶具有在生理条件下水解明胶和胶原蛋白的能力，含有重组胶原蛋白酶的发酵上清液可直接用于底物的加工处理。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表达胶原蛋白酶的重组质粒，是在表达质粒中插入αfactor的前导序列(leader)、溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶ColG的前导肽序列(pro peptide)和酶功能区序列(Chain)，或者是在表达质粒中插入αfactor的前导序列(leader)和间隔序列(spacer)、溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶ColH的前导肽序列(pro peptide)和酶功能区序列(Chain)；

所述αfactor的前导序列(leader)如SEQ ID No.1所示；

所述ColG的前导肽序列和酶功能区序列(pro peptide-Chain)如SEQ ID No.2所示；

所述αfactor的前导序列和间隔序列(leader-spacer)如SEQ ID No.3所示；

所述ColH的前导肽序列和酶功能区序列(pro peptide-Chain)如SEQ ID No.4所示；

本发明构建的胶原蛋白酶表达质粒，不限于仅使用胶原蛋白酶原生信号肽介导胶原蛋白酶分泌，而是通过比较表达盒不同模块(信号肽、前导肽、功能区)组合下的胶原蛋白酶分泌产量，得到优化后的模块组合，实现了在酿酒酵母细胞中的高效分泌。

所述的表达质粒，为CPOTud、p426GPD、p426TEF、p426ADH、p426CYC、p416GPD、p4216TEF、p4126ADH、p416CYC、p425GPD、p425TEF、p425ADH、p425CYC、p415GPD、p4215TEF、p4125ADH、p415CYC、p424GPD、p424TEF、p424ADH、p424CYC、p414GPD、p4214TEF、p4124ADH、p414CYC、p423GPD、p423TEF、p423ADH、p423CYC、p413GPD、p4213TEF、p4123ADH、p413CYC、pSP-GM1、pRS303、pRS304、pRS305、pRS306、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、pRS423、pRS424、pRS425或pRS426。

一种分泌胶原蛋白酶的酿酒酵母，是将上述的重组质粒转化出发酵母菌株后得到；

所述的出发酵母菌株为酿酒酵母B184M、CEN.PK 530.1C、CEN.PK 113.5D、BY4742、BY4741、CEN.PK2-1D、CEN.PK2-1C或IMX581。

一种适合于上述酿酒酵母的发酵培养基，是在YPD培养基中添加Ca²⁺和/或Zn²⁺；

所述Ca²⁺的浓度为10-25mM，在这个浓度下，胶原蛋白酶均有较高量的分泌；考虑较高金属离子浓度会有潜在导致发酵液沉淀的可能性，所以优选10mM；

所述Zn²⁺的浓度为0.4-1mM，优选0.6mM。

上述酿酒酵母的发酵培养方法，是将所述酿酒酵母接种至上述的发酵培养基中培养；

所述的培养，优选在30-37℃下培养至少96h，即可收集重组胶原蛋白酶。

本发明酿酒酵母的发酵产物重组胶原蛋白酶可有效降解明胶和胶原蛋白，因此上述的重组质粒和酿酒酵母可应用于生产胶原蛋白酶以及降解明胶和胶原蛋白。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明构建了分泌生产胶原蛋白酶的酿酒酵母工程菌，通过优化酵母培养基的成分，优化胶原蛋白酶序列中的信号肽元件，提高了酿酒酵母分泌胶原蛋白酶的能力。所得重组胶原蛋白酶能够有效降解明胶和胶原蛋白，对胶原蛋白酶的应用及胶原蛋白资源的有效利用具有重要的实践意义。

附图说明

图1是胶原蛋白酶表达质粒pCP_G01和pCP_H01的图谱。

图2是不同Ca²⁺离子浓度下的酶活和OD₆₀₀值。

图3是不同Zn²⁺离子浓度下的酶活和OD₆₀₀值。

图4是不同Zn²⁺离子浓度下的酶活和OD₆₀₀值。

图5是质粒构建框架图。

图6是不同菌株的酶活和OD₆₀₀值。

图7是不同菌株的平板水解实验结果。

图8是不同菌株的酶活和OD₆₀₀值。

图9是不同菌株的平板水解实验结果。

图10是胶原蛋白酶对明胶的降解效果。

图11是胶原蛋白酶对胶原蛋白的降解效果。

图12是胶原蛋白酶处理24h后胶原蛋白的形貌。

图13是菌株分泌表达胶原蛋白酶的产量。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。

为更好地理解本发明的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)B184M(PNAS,2015,112:E4689–E4696)为出发菌株，以质粒CPOTud(Biotechnology andBioengineering,2012,109(5):1259-1268)为表达质粒，为具体实施例作进一步说明。

下列实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl；

LB/Amp培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，灭菌后冷却至50℃左右，加入100μg/mL氨苄青霉素(过滤除菌)；

YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(单独灭菌后加入)；

改良YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(单独灭菌后加入)，10mM CaCl₂和0.6mM ZnCl₂；

YPE培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，0.5g/L葡萄糖(单独灭菌后加入)，10ml无水乙醇/L(过滤除菌)；

固体培养基则在相应的液体培养基的基础上添加20g/L琼脂粉。

下列实施例中，胶原蛋白酶的相关酶活检测按下述方法进行：

(1)含有胶原蛋白酶表达质粒的酵母菌株(BG01、BH01)在YPD平板上活化后，用1μL接种环挑取单菌落转接至2.5mL培养基30℃，200rpm培养96h。

(2)生物量的测定。将菌液稀释合适倍数，测定在600nm波长下的吸光值，即为OD₆₀₀值。

(3)采用茚三酮法测定胶原蛋白酶酶活(Anal Biochem,2013,437:46-48)。将培养后的菌液离心，得到发酵上清液。取20μL发酵上清，加入480μL用反应缓冲液(50mM Tris·Cl、5mM CaCl₂、1μM ZnCl₂，pH＝7.5)配制的2mg/mL明胶溶液，在37℃下反应30min，加入500μL终止液(12％(w/v)PEG6000、25mM EDTA)终止反应。取10μL反应液加90μL去离子水，加入500μL茚三酮显色液(含0.16％SnCl₂，pH＝5.0的200mM柠檬酸缓冲液与50g/L茚三酮-DMSO溶液等体积混合，现配现用)，80℃水浴中加热10min，冷却后加入600μL去离子水混合均匀，在570nm处测吸光度。在37℃，pH＝7.5的条件下，每100μL酶液每分钟水解胶原产生相当于1μg甘氨酸的量为1个酶活力单位U。

(4)平板透明圈法定性表征酶活高低。在固体培养基中额外添加1％的脱脂奶粉，菌株在平板上于30℃培养4天后，转移至37℃培养2-3天，查看菌落周围形成的水解圈大小，并进行拍照。

下列实施例中所涉及的引物序列如表1所示：

表1：引物序列

#下划线标记酶切位点

实施例1溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶编码基因的获取

根据UniProt数据库中公开的溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶ColG(Q9X721)和ColH(Q46085)的氨基酸序列，针对酿酒酵母进行密码子优化后由南京金斯瑞生物科技有限公司合成DNA编码序列，得到质粒pUC57-Mini_G(SEQ ID No.5)和pUC57-Mini_H(SEQ IDNo.6)(包含pre peptide-pro peptide-Chain)。

实施例2表达胶原蛋白酶ColG和ColH的酿酒酵母工程菌的构建

(1)CPOTud经Kpn I和Nhe I酶切后回收得到载体；

(2)使用引物对AF/ARproG、AF/ARproH，以pAlphaAmyCPOT(Biotechnology andBioengineering,2012,109:1259-1268)为模板扩增出带有G、H同源臂的信号肽(为αfactorleader+spacer)(SEQ ID No.3)；使用引物对proGF/GR、proHF/HR，以pUC57-Mini_G和pUC57-Mini_H为模板扩增出ColG和ColH片段(SEQ ID No.2和SEQ ID No.4)；相应片段(ColG或ColH与相应的信号肽)使用对应引物AF/GR、AF/HR经PCR扩增融合得到插入片段G01、H01。

(3)融合好的片段用Kpn I和Nhe I酶切回收后，使用T4 DNA Ligase与载体连接，得到质粒pCP_G01(SEQ ID No.7)和pCP_H01(SEQ ID No.8)。

(4)连接产物采用常规流程转化至大肠杆菌感受态细胞中。涂布的平板在37℃过夜培养后，挑取菌落至含有鉴定引物G1/G2或H1/H2的PCR体系中进行菌落PCR鉴定。

(5)鉴定正确的克隆接种至LB/Amp培养基中，37℃，250rpm培养12-16h，提质粒酶切鉴定并测序确认质粒pCP_G01(SEQ ID No.7)和pCP_H01(SEQ ID No.8)构建成功。质粒pCP_G01含有的胶原蛋白酶ColG表达框为：αfactor leader+spacer-colG pro peptide-colG chain；质粒pCP_H01含有的胶原蛋白酶ColH表达框为：αfactor leader+spacer-colHpro peptide-colH chain(图谱见图1)。

(6)得到的质粒pCP_G01、pCP_H01和对照空质粒CPOTud采用常规醋酸锂转化法转化至酿酒酵母B184M，得到菌株BG01、BH01和B0。

实施例3胶原蛋白酶生产菌的培养条件优化

由于ColG跟ColH是金属蛋白酶，其需要Ca²⁺跟Zn²⁺作为金属辅因子。

以菌株BG01为代表进行培养基优化。在常规的YPD培养基中分别补充浓度为2.5mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM的Ca²⁺(CaCl₂)和浓度为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM的Zn²⁺(ZnCl₂)后发酵96h，测定酶活。结果如图2、图3所示，单因素实验表明添加Ca²⁺或Zn²⁺使得胶原蛋白酶产量显著提升。其中，Ca²⁺在10mM～25mM之间，均能达到较高的酶活。为避免较高浓度的Ca²⁺造成的潜在沉淀影响，优选10mM Ca²⁺作为金属离子的添加浓度。对于Zn²⁺，则选用0.6mM Zn²⁺作为金属离子添加浓度。

基于ColG的优化结果，我们也在YPD培养基添加10mM Ca²⁺基础上，补充浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM的Zn²⁺(ZnCl₂)，并接种菌株BH01发酵96h，测定酶活。结果如图4所示，0.6mM Zn²⁺浓度下酶活最高。

综上，10mM Ca²⁺和0.6mM Zn²⁺为最佳金属离子添加浓度。

实施例4酿酒酵母表达盒的元件适配组装优化

元件适配组装优化系列质粒构建框架如图5所示，构建流程同实施例2，用相应引物对扩增融合得到不同片段。

使用引物对AF/ARWproG，以pAlphaAmyCPOT为模板扩增出带有G同源臂的信号肽(为αfactor leader)(SEQ ID No.1)；使用引物对WproGF/GR以pUC57-Mini_G为模板扩增出ColG片段；相应片段(ColG与相应的信号肽)使用对应引物AF/GR经PCR扩增融合得到插入片段G02。

使用引物对PproG/GR，以pUC57-Mini_G为模板扩增出带有αfactor pre同源臂的ColG，所得片段使用引物对AP/GR扩增得到插入片段G03。

使用引物对AF/ARG，以pAlphaAmyCPOT为模板扩增出带有G同源臂的信号肽(为αfactor leader+spacer)；使用引物对AGF/GR，以pUC57-Mini_G为模板扩增出ColG片段；相应片段(ColG与相应的信号肽)使用对应引物AF/GR经PCR扩增融合得到插入片段G04。

使用引物对AF/ARWG，以pAlphaAmyCPOT为模板扩增出带有G同源臂的信号肽(为αfactor leader+spacer)；使用引物对WGF/GR，以pUC57-Mini_G为模板扩增出ColG片段；相应片段(ColG与相应的信号肽)使用对应引物AF/GR经PCR扩增融合得到插入片段G05。

使用引物对PG/GR，以pUC57-Mini_G为模板扩增出带有αfactor pre同源臂的ColG，所得片段使用引物对AP/GR扩增得到插入片段G06。

使用引物对GF/GR，以pUC57-Mini_G为模板扩增得到插入片段G07。

使用引物对AF/ARWproH，以pAlphaAmyCPOT为模板扩增出带有H同源臂的信号肽(为αfactor leader)；使用引物对WproHF/HR，以pUC57-Mini_H为模板扩增出ColH片段；相应片段(ColH与相应的信号肽)使用对应引物AF/HR经PCR扩增融合得到插入片段H02。

使用引物对AF/ARH，以pAlphaAmyCPOT为模板扩增出带有H同源臂的信号肽(为αfactor leader+spacer)；使用引物对AHF/HR，以pUC57-Mini_H为模板扩增出ColH片段；相应片段(ColH与相应的信号肽)使用对应引物AF/HR经PCR扩增融合得到插入片段H03。

使用引物对AF/ARWH，以pAlphaAmyCPOT为模板扩增出带有H同源臂的信号肽(为αfactor leader+spacer)；使用引物对WHF/HR，以pUC57-Mini_H为模板扩增出ColH片段；相应片段(ColH与相应的信号肽)使用对应引物AF/HR经PCR扩增融合得到插入片段H04。

使用引物对HF/HR，以pUC57-Mini_H为模板扩增得到插入片段H05。

随后将以上G02、G03、G04、G05、G06、G07、H02、H03、H04、H05片段通过酶切连接插入到质粒CPOTud中，部分片段用Seamless Cloning master mix与质粒连接(具体参考世联博研试剂盒B632219说明书)；相应构建出表达质粒pCP_G02、pCP_G03、pCP_G04、pCP_G05、pCP_G06、pCP_G07、pCP_H02、pCP_H03、pCP_H04、pCP_H05。

得到的质粒及含对应的表达框架为：

pCP_G01(含αfactor leader+spacer-colG pro peptide-colG chain)

pCP_G02(含αfactor leader-colG pro peptide-colG chain)

pCP_G03(含αfactor pre-colG pro peptide-colG chain)

pCP_G04(含αfactor leader+space-colG chain)

pCP_G05(含αfactor leader-colG chain)

pCP_G06(含αfactor pre-colG chain)

pCP_G07(含colG pre peptide-colG pro peptide-colG Chain)

pCP_H01(含αfactor leader+spacer-colH pro peptide-colH chain)

pCP_H02(含αfactor leader-colH pro peptide-colH chain)

pCP_H03(含αfactor leader+spacer-colH chain)

pCP_H04(含αfactor leader-colH chain)

pCP_H05(含colH pre peptide-colH pro peptide-colH chain)

测序鉴定无误后，转入B184M中，得到相应菌株BG01、BG02、BG03、BG04、BG05、BG06、BG07、BH01、BH02、BH03、BH04、BH05。

构建得到的菌株培养后进行酶活检测，由图6、图7可知BG02表达胶原蛋白酶ColG的酶活最高，平板水解圈最明显。由图8、图9可知BH01表达胶原蛋白酶ColH的酶活最高，平板水解圈最明显。菌株BG02携带质粒为pCP_G02(SEQ ID No.9)，所含表达框为αfactorleader-colG pro peptide-colG chain；菌株BH01携带质粒为pCP_H01(SEQ ID No.8)，所含表达框为αfactor leader+spacer-colH pro peptide-colH chain。

后续实验采用上述菌株BG02和菌株BH01进行。

实施例5重组胶原蛋白酶对不同底物的降解

(1)降解明胶。在改良YPD培养基中额外添加1％的明胶。分别接种菌株B0、BG02和BH01至2.5mL改良YPD+明胶的培养基中，在30℃、200rpm条件下发酵96h。发酵结束后，取500μL发酵液进行离心，去除菌体细胞。再取20μL发酵上清液，加入5μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min后上样电泳至溴酚蓝到达预制胶底部。电泳完成后将蛋白胶置于染色液中染色30min，洗脱多余的染色液后用凝胶成像仪拍照。如图10所示，空白对照和对照菌株B0所对应的泳道明胶未分解，整条泳道均被染色；而菌株BG02和BH01所对应的泳道明胶明显被分泌的胶原蛋白酶所水解。

(2)降解不溶性牛骨胶原蛋白。接种菌株B0、BG02和BH01至40mL改良YPD培养基中，在30℃、200rpm条件下发酵96h。发酵结束后，取20mL发酵液进行离心，去除菌体细胞。将发酵所得的上清液用50kDa超滤离心管浓缩，再用50mM Tris·Cl稀释至合适浓度。在其中加入2mg不溶性牛骨胶原蛋白，37℃静置，观察胶原蛋白的溶解情况，并拍照记录。其中G+H组指BG02与BH01按1:1混合。从图11可以看到，与对照组相比，重组胶原蛋白酶处理后，胶原蛋白纤维明显溶胀，且两种重组胶原蛋白酶表现出协同效应。随着时间的推移，胶原蛋白纤维被酶解从而渐渐消失。处理24h后的胶原蛋白纤维在硅片上自然风干后，粘于导电胶上，喷金镀膜后使用超高分辨率冷场发扫描电镜(SU8220，Hitachi)观察形态和结构。结果如图12所示，相较于对照组紧密完整的纤维结构，用重组胶原蛋白酶ColG处理后的样品纤维呈现松散的状态，用重组胶原蛋白酶ColH处理后的样品纤维表面也发生了明显的变化。这些现象从微观结构上证实了重组胶原蛋白酶具有很好的胶原蛋白水解活性。

实施例6工程菌株摇瓶发酵生产重组胶原蛋白酶

菌株B0、BG02、BH01在YPD平板上划线活化后，用1μL接种环挑取单菌落转接至2.5mL改良YPD培养基中培养过夜得到种子液。取适当种子液转接至40mL新鲜的改良YPD培养基中，起始OD₆₀₀调整为0.005左右，在30℃、200rpm和10％的装液量条件下进行摇瓶发酵，间隔适当时间取样进行酶活检测。工程菌株摇瓶发酵所得的重组胶原蛋白酶产量如图13所示，胶原蛋白酶ColG和ColH的产量分别达到6.8×10⁴U/L和5.5×10⁴U/L。结果说明本发明构建得到的酿酒酵母工程菌株可高效分泌表达重组胶原蛋白酶，可用于对胶原蛋白资源的加工利用，具有广阔的产业化应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 表达胶原蛋白酶的重组质粒、酵母菌株及其发酵培养基和发酵培养方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagatttc catctatttt tactgctgtt ttgtttgctg cttcttctgc tttggctgct 60

ccagttaata ctactactga agatgaaact gctcaaattc cagctgaagc tgttattggt 120

tattctgatt tggagggtga ctttgatgtt gctgttttgc cattttctaa ctctactaac 180

aacggtttgc tattcatcaa cactactatc gcttctatcg ctgctaaaga agaaggtgtt 240

tctttggata aaagagaggc tgaagct 267

<210> 2

<211> 3219

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagccaatcg aaaacactaa cgacaccagc atcaagaacg ttgaaaagtt gagaaacgcc 60

ccaaacgaag aaaactctaa gaaagttgaa gactctaaga atgataaggt tgaacacgtt 120

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ggtaagttga ttggtaacgc ctctgctaac gctgaagttg ttaataactg tgtcccagtt 660

ttgaagcaat tcagagaaaa cttaaaccaa tacgctccag actacgtcaa aggtactgcc 720

gtaaatgaat tgatcaaggg tattgaattt gacttttccg gtgctgctta cgaaaaggac 780

gtcaagacca tgccatggta cggtaagatt gacccattca tcaatgaatt aaaggccttg 840

ggtctctacg gtaacatcac ttctgccact gaatgggctt cagatgttgg tatctactac 900

ttgtctaagt tcggtttgta ctcaaccaat cgtaacgaca ttgttcaatc cttagaaaag 960

gctgttgata tgtacaaata tggtaagatc gctttcgttg ctatggaaag aatcacctgg 1020

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aacggtgtct ccactgataa cggtggtttg tacatcgaac caagaggtac tttctacact 1380

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acccactact tgcaagctag atacttggtt gacggtttgt ggggtcaagg tcctttctac 1500

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ttctacaact acggttttgc tgttgctcac tacttatacg aaaaggacat gccaactttt 1740

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aaactgtctg acgacgctaa caagaacact gaataccaaa accacatcca agaactcgct 1860

gataagtacc aaggtgccgg tataccattg gtgtctgatg actacctgaa ggaccatggt 1920

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<211> 273

<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 11468

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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agaccctcgg caacagatgc accaagcttg ttggtagccc acttgcggat ctcagcgtga 2100

acctcttgag cttgctcagg ggtggcagtc ttaccagtac caatggccca gacaggctca 2160

taagcaatga caatcttgga ccagttctgg accttgtcag cgatggcgtt caattgacga 2220

acaacaacgt tgatggtctc gttagcctca cgctcggcca aagtctcacc aatgcaggca 2280

acgacagtaa gaccttgttc aagggcaaac ttggtcttgt cggcaacgaa ctcgtcagac 2340

tccttgaaga tggtacgacg ctcggagtga ccagtcaaag tgtaggtaat accagcatca 2400

atcaaagatt gagcactgtt ctcaccagtg taggcaccgt tcttcttgtc gaagacgttt 2460

tgggcaccaa cgccaatatc cttcttgact tgttggcggg tggtgatgag gtacatgttt 2520

tgagggaaga tgacagtttc gacatcacca acgttaagct tggtggtgtt caaaccctca 2580

ataatagtct tcatggactc caaagagcca ttcatcttaa agttaccacc gacaaagaat 2640

ttacgtgcca ttttgatcct agttctacta ttgaaatgta gttggggaga gacgagagtt 2700

ggcccgtccg ctcattatat ataacgtagc ggacagtcac acagttaagg ggaattaccg 2760

agcttcggca atttaccccg tcgatagcaa ccgttggcat ggatccggcc ggccagatct 2820

acgtatggtc atttcttctt cagattccct catggagaaa gtgcggcaga tgtatatgac 2880

agagtcgcca gtttccaaga gactttattc aggcacttcc atgataggca agagagaaga 2940

cccagagatg ttgttgtcct agttacacat ggtatttatt ccagagtatt cctgatgaaa 3000

tggtttagat ggacatacga agagtttgaa tcgtttacca atgttcctaa cgggagcgta 3060

atggtgatgg aactggacga atccatcaat agatacgtcc tgaggaccgt gctacccaaa 3120

tggactgatt gtgagggaga cctaactaca tagtgtttaa agattacgga tatttaactt 3180

acttagaata atgccatttt tttgagttat aataatccta cgttagtgtg agcgggattt 3240

aaactgtgag gaccttaata cattcagaca cttctgcggt atcaccctac ttattccctt 3300

cgagattata tctaggaacc catcaggttg gtggaagatt acccgttcta agacttttca 3360

gcttcctcta ttgatgttac acctggacac cccttttctg gcatccagtt tttaatcttc 3420

agtggcatgt gagattctcc gaaattaatt aaagcaatca cacaattctc tcggatacca 3480

cctcggttga aactgacagg tggtttgtta cgcatgctaa tgcaaaggag cctatatacc 3540

tttggctcgg ctgctgtaac agggaatata aagggcagca taatttagga gtttagtgaa 3600

cttgcaacat ttactatttt cccttcttac gtaaatattt ttctttttaa ttctaaatca 3660

atctttttca attttttgtt tgtattcttt tcttgcttaa atctataact acaaaaaaca 3720

catacataaa ctaaaaggta ccaacaaaat gagatttcca tctattttta ctgctgtttt 3780

gtttgctgct tcttctgctt tggctgctcc agttaatact actactgaag atgaaactgc 3840

tcaaattcca gctgaagctg ttattggtta ttctgatttg gagggtgact ttgatgttgc 3900

tgttttgcca ttttctaact ctactaacaa cggtttgcta ttcatcaaca ctactatcgc 3960

ttctatcgct gctaaagaag aaggtgtttc tttggataaa agagaagaag gtgaaccaaa 4020

agctgttgac aagaacaatg ccactgctgc cgtccaaaac gaatccaagc gttacactgt 4080

ttcttactta aagaccttga actattacga cttggtcgat ctattggtta agaccgaaat 4140

cgaaaactta ccagacttgt ttcaatactc ttccgacgct aaggaatttt acggtaacaa 4200

gactagaatg tcctttatca tggacgaaat tggtcgtaga gctccacaat acactgaaat 4260

tgaccacaag ggtataccaa ccctcgttga agtcgtcaga gccgggttct acttgggttt 4320

tcacaacaaa gaattgaatg aaatcaacaa gagatctttc aaagaaagag ttatcccgtc 4380

tatcttggct atccaaaaga acccaaactt caaattaggt actgaagttc aagacaagat 4440

tgtctctgct accggtctat tggctggtaa cgaaaccgct ccaccagaag ttgttaacaa 4500

cttcacccca atcttgcaag attgtatcaa gaacatcgac agatacgcct tggacgactt 4560

gaaaagtaaa gcattgttca acgttttggc cgccccaacc tacgacatta ctgaatacct 4620

cagagctacc aaggaaaagc cagaaaacac tccatggtac ggtaagatcg atggtttcat 4680

caacgaattg aagaagctcg ctttgtacgg taaaattaac gacaacaact cttggattat 4740

cgataacggt atttaccaca ttgctccatt gggtaaattg cactctaaca acaaaatcgg 4800

tatcgaaact ctaactgaag ttatgaaggt ctacccatac ttgtccatgc aacacttgca 4860

atccgctgac caaatcaaga gacactacga ctctaaggat gccgaaggta acaagatccc 4920

attagataag ttcaagaagg aaggcaagga aaagtactgc ccaaagacct acacttttga 4980

tgatggtaag gttatcatca aggccggtgc tcgtgtcgaa gaagaaaagg tcaaaagatt 5040

atactgggct tccaaggaag tcaacagtca attcttcaga gtttatggta ttgacaagcc 5100

attggaagaa ggtaacccag acgacatcct taccatggtt atttacaact ctccagaaga 5160

atacaaactt aactccgtct tgtacggtta cgataccaac aacggtggta tgtacattga 5220

accagaaggt acttttttca cttacgaaag agaagctcaa gaatctacgt acactttgga 5280

agaattattc agacacgaat acacccatta cttgcaaggt agatacgctg tcccaggtca 5340

atggggtcgt accaagttgt atgataacga cagattgacc tggtacgaag aaggtggtgc 5400

tgaactgttt gctggttcta ctagaacttc cggcatcttg ccaagaaagt ctattgtctc 5460

taacattcac aacaccacta gaaacaacag atacaagctg tctgacactg ttcattcgaa 5520

gtacggtgcc tctttcgaat tttacaacta cgcttgtatg ttcatggact acatgtacaa 5580

taaggacatg ggtattttga acaagttgaa tgatttggct aagaacaacg acgttgacgg 5640

ttacgacaat tacatcagag atttgtcatc taattacgct ttgaacgata agtaccaaga 5700

tcacatgcaa gaacgtattg acaactatga aaacttgacc gttccattcg ttgctgacga 5760

ctacttagtt agacacgctt acaagaaccc aaacgaaatt tactccgaaa tctccgaagt 5820

tgccaagttg aaggatgcta agtctgaagt taagaaatct caatacttct caactttcac 5880

tttgcgtggt agttacaccg gaggtgcttc caagggtaag ctggaagatc aaaaagctat 5940

gaacaagttc attgacgact ctttgaagaa gttggacacc tattcctggt ctggttacaa 6000

gactcttact gcttatttta ccaactacaa ggtcgattct tctaacagag ttacttacga 6060

tgtcgttttc catggttact tgccaaacga aggtgattcc aagaacagct tgccatacgg 6120

taagattaac ggtacttaca agggtactga gaaggaaaag attaagttct cctccgaagg 6180

ttctttcgac ccagacggaa agatagtttc ctacgaatgg gacttcggtg atggtaacaa 6240

gtccaacgaa gagaaccctg aacacagtta cgataaggtc ggtacttaca ctgtcaagtt 6300

gaaggttacc gatgataagg gtgaaagctc tgtttctact accactgctg aaatcaaaga 6360

tttgtctgaa aacaagttgc cagtcatcta tatgcacgtt cctaaatcgg gtgctttaaa 6420

ccaaaaggtt gtcttctacg gtaagggtac ttacgaccca gacggttcta tcgctggcta 6480

ccaatgggat ttcggtgacg gttctgactt ttcctctgaa cagaacccat ctcacgtcta 6540

caccaagaaa ggtgaataca ctgtgacctt gagagtcatg gattcttccg gtcaaatgtc 6600

tgaaaagacc atgaaaatca agatcactga tccagtatac cctattggta ctgaaaagga 6660

accaaacaac tctaaggaaa cagcctccgg tccaatcgtt ccgggtattc cagtctccgg 6720

tactatcgaa aacacctctg atcaagacta tttctacttc gatgttatta ctccaggtga 6780

agtcaagatc gacatcaaca agctaggtta cggtggtgct acatgggttg tttacgatga 6840

aaacaataac gctgtctcct acgctaccga tgacggtcaa aatttgtctg gtaaattcaa 6900

ggctgacaag cctgggagat actacattca tttgtacatg ttcaatggtt cttacatgcc 6960

atacagaatt aacattgaag gttctgttgg tagacaccac caccaccacc actaagctag 7020

cctcgagtct agaaactaag attaatataa ttatataaaa atattatctt cttttcttta 7080

tatctagtgt tatgtaaaat aaattgatga ctacggaaag cttttttata ttgtttcttt 7140

ttcattctga gccacttaaa tttcgtgaat gttcttataa gggacggtag atttacaagt 7200

gatacaacaa aaagcaaggc gctttttcta ataaaaagaa gaaaagcatt taacaattga 7260

acacctctat atcaacgaag aatattactt tgtctctaaa tccttgtaaa atgtgtacga 7320

tctctatatg ggttactcag aagtgtaccg aagactgcat tgaaagttta tgttttttca 7380

ctgcaagcgt cattttcgct ttgagaagat gttcttattc aaatttcaac tgttatatag 7440

aagagcaaaa aattgccaaa aaaaacaaca tttattcatt taaaatataa aatttgggct 7500

tctatatttt aatattgctt ttcaattact gttattaaat gtaagtactg cgtctatgaa 7560

aatatatgca aatgctaaga aaaatcctaa aaatttgaat atgagatatt cctcagtatt 7620

tctttttcat cctttcttct gcggctctag ccctttgttc tctcatcaat ctgcgtctct 7680

gttcatcggt caaagaattc aaattttgtt gctgaattga aggaataacg cgtgtacgca 7740

tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa gatcctccgg 7800

atcgtttcgc cggcgtttat ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 7860

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 7920

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 7980

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 8040

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 8100

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 8160

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 8220

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 8280

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 8340

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 8400

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 8460

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 8520

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 8580

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 8640

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 8700

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 8760

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 8820

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 8880

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 8940

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 9000

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 9060

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 9120

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 9180

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 9240

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 9300

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 9360

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 9420

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 9480

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 9540

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 9600

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 9660

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 9720

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 9780

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaacgaagca tctgtgcttc attttgtaga 9840

acaaaaatgc aacgcgagag cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct gcatttttac 9900

agaacagaaa tgcaacgcga aagcgctatt ttaccaacga agaatctgtg cttcattttt 9960

gtaaaacaaa aatgcaacgc gagagcgcta atttttcaaa caaagaatct gagctgcatt 10020

tttacagaac agaaatgcaa cgcgagagcg ctattttacc aacaaagaat ctatacttct 10080

tttttgttct acaaaaatgc atcccgagag cgctattttt ctaacaaagc atcttagatt 10140

actttttttc tcctttgtgc gctctataat gcagtctctt gataactttt tgcactgtag 10200

gtccgttaag gttagaagaa ggctactttg gtgtctattt tctcttccat aaaaaaagcc 10260

tgactccact tcccgcgttt actgattact agcgaagctg cgggtgcatt ttttcaagat 10320

aaaggcatcc ccgattatat tctataccga tgtggattgc gcatactttg tgaacagaaa 10380

gtgatagcgt tgatgattct tcattggtca gaaaattatg aacggtttct tctattttgt 10440

ctctatatac tacgtatagg aaatgtttac attttcgtat tgttttcgat tcactctatg 10500

aatagttctt actacaattt ttttgtctaa agagtaatac tagagataaa cataaaaaat 10560

gtagaggtcg agtttagatg caagttcaag gagcgaaagg tggatgggta ggttatatag 10620

ggatatagca cagagatata tagcaaagag atacttttga gcaatgtttg tggaagcggt 10680

attcgcaata ttttagtagc tcgttacagt ccggtgcgtt tttggttttt tgaaagtgcg 10740

tcttcagagc gcttttggtt ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagagaata 10800

ggaacttcgg aataggaact tcaaagcgtt tccgaaaacg agcgcttccg aaaatgcaac 10860

gcgagctgcg cacatacagc tcactgttca cgtcgcacct atatctgcgt gttgcctgta 10920

tatatatata catgagaaga acggcatagt gcgtgtttat gcttaaatgc gtacttatat 10980

gcgtctattt atgtaggatg aaaggtagtc tagtacctcc tgtgatatta tcccattcca 11040

tgcggggtat cgtatgcttc cttcagcact accctttagc tgttctatat gctgccactc 11100

ctcaattgga ttagtctcat ccttcaatgc tatcatttcc tttgatattg gatcatacta 11160

agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 11220

tc 11222

<210> 9

<211> 11462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataccac agcttttcaa ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 240

ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 300

agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 360

cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatctaaa 420

aaactgtatt ataagtaaat gcatgtatac taaactcaca aattagagct tcaatttaat 480

tatatcagtt attaccctat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 540

cgcatcagga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 600

tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 660

agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 720

tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 780

catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 840

aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 900

ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 960

taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtccatt cgccattcag 1020

gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctgga 1080

taaaggcgcg ccgtcgacaa tatagaaatt tcttagtttt aatgattgaa tgaatccatt 1140

tcgaacacgt caatgtactt ggacaagctt tgtagaacat gaagtacttg agcaatggac 1200

gcccaactgg aatttacttt agcgacacta ttccaagacc agcaactcaa agaagtaaat 1260

tctttttttc acaatagttg tttttttgat gatgtacgtc ccagcagcac ctaatggtat 1320

ttttatgagt attggcagtt tgccttatta attaagcaaa ccggtcatat attttaaaaa 1380

ataggaactt tgtagtcctt attaatgctg aataaaaaaa taggaagaga aatcagcaag 1440

tataaacagt taaatgtttt ttaactataa tggttgcatt caagaggaca tgtaaattgc 1500

gtactcggta caagttggta aaaacgttaa agcactccta cgagatttag tcagtcctgg 1560

cattaataaa caaaaagacc tgtatctata tttcatgaac tgggtaaaat caccacacaa 1620

aaaagaataa acaaatataa tgaactactt ttggtcttgg actcgcagtt tatagtttgt 1680

taaaattgac aaacacacat gttctgatta acttacttcc gcttcaaagt actgaaaaca 1740

tcatacgaac tggtataaga aggaagatag caaataaaaa taaatcaaat attgcttgta 1800

aaaaattagg atataaaaaa atctctattc attaaagaca aaaagctaaa ggaataaaaa 1860

agtcattcgc tttacgccaa ataaaacgtc tatgcacgtt tttaaaggct gtgaacatta 1920

acaatgttgt ggaattcagg cttgagagaa gcaccgccaa ccaagaaacc gtcaatatcg 1980

tggaacttga ggaactcctt gcagttacca ccgttaacgg aaccaccgta gatgacacgg 2040

agaccctcgg caacagatgc accaagcttg ttggtagccc acttgcggat ctcagcgtga 2100

acctcttgag cttgctcagg ggtggcagtc ttaccagtac caatggccca gacaggctca 2160

taagcaatga caatcttgga ccagttctgg accttgtcag cgatggcgtt caattgacga 2220

acaacaacgt tgatggtctc gttagcctca cgctcggcca aagtctcacc aatgcaggca 2280

acgacagtaa gaccttgttc aagggcaaac ttggtcttgt cggcaacgaa ctcgtcagac 2340

tccttgaaga tggtacgacg ctcggagtga ccagtcaaag tgtaggtaat accagcatca 2400

atcaaagatt gagcactgtt ctcaccagtg taggcaccgt tcttcttgtc gaagacgttt 2460

tgggcaccaa cgccaatatc cttcttgact tgttggcggg tggtgatgag gtacatgttt 2520

tgagggaaga tgacagtttc gacatcacca acgttaagct tggtggtgtt caaaccctca 2580

ataatagtct tcatggactc caaagagcca ttcatcttaa agttaccacc gacaaagaat 2640

ttacgtgcca ttttgatcct agttctacta ttgaaatgta gttggggaga gacgagagtt 2700

ggcccgtccg ctcattatat ataacgtagc ggacagtcac acagttaagg ggaattaccg 2760

agcttcggca atttaccccg tcgatagcaa ccgttggcat ggatccggcc ggccagatct 2820

acgtatggtc atttcttctt cagattccct catggagaaa gtgcggcaga tgtatatgac 2880

agagtcgcca gtttccaaga gactttattc aggcacttcc atgataggca agagagaaga 2940

cccagagatg ttgttgtcct agttacacat ggtatttatt ccagagtatt cctgatgaaa 3000

tggtttagat ggacatacga agagtttgaa tcgtttacca atgttcctaa cgggagcgta 3060

atggtgatgg aactggacga atccatcaat agatacgtcc tgaggaccgt gctacccaaa 3120

tggactgatt gtgagggaga cctaactaca tagtgtttaa agattacgga tatttaactt 3180

acttagaata atgccatttt tttgagttat aataatccta cgttagtgtg agcgggattt 3240

aaactgtgag gaccttaata cattcagaca cttctgcggt atcaccctac ttattccctt 3300

cgagattata tctaggaacc catcaggttg gtggaagatt acccgttcta agacttttca 3360

gcttcctcta ttgatgttac acctggacac cccttttctg gcatccagtt tttaatcttc 3420

agtggcatgt gagattctcc gaaattaatt aaagcaatca cacaattctc tcggatacca 3480

cctcggttga aactgacagg tggtttgtta cgcatgctaa tgcaaaggag cctatatacc 3540

tttggctcgg ctgctgtaac agggaatata aagggcagca taatttagga gtttagtgaa 3600

cttgcaacat ttactatttt cccttcttac gtaaatattt ttctttttaa ttctaaatca 3660

atctttttca attttttgtt tgtattcttt tcttgcttaa atctataact acaaaaaaca 3720

catacataaa ctaaaaggta ccaacaaaat gagatttcca tctattttta ctgctgtttt 3780

gtttgctgct tcttctgctt tggctgctcc agttaatact actactgaag atgaaactgc 3840

tcaaattcca gctgaagctg ttattggtta ttctgatttg gagggtgact ttgatgttgc 3900

tgttttgcca ttttctaact ctactaacaa cggtttgcta ttcatcaaca ctactatcgc 3960

ttctatcgct gctaaagaag aaggtgtttc tttggataaa agagaggctg aagctaagcc 4020

aatcgaaaac actaacgaca ccagcatcaa gaacgttgaa aagttgagaa acgccccaaa 4080

cgaagaaaac tctaagaaag ttgaagactc taagaatgat aaggttgaac acgttaagaa 4140

cattgaagaa gctaaggtcg aacaagttgc tccagaagtc aagtctaaaa gtaccttgag 4200

atctgcttct atagctaata caaattccga aaagtacgac ttcgaatatc ttaatggttt 4260

gagttacacc gaattgacta acttgatcaa gaacatcaag tggaaccaaa tcaacggttt 4320

attcaactac tccaccggtt cgcaaaaatt tttcggtgac aagaacagag tccaagccat 4380

catcaacgct ctacaagaat ctggtagaac ttacactgcc aatgacatga agggtattga 4440

aactttcacc gaagttttga gagccggttt ttacttgggc tattacaacg atggtctctc 4500

ctacctgaac gaccgtaatt tccaagacaa gtgtatccca gccatgattg ctattcaaaa 4560

gaacccaaac ttcaagttag gtactgctgt tcaagacgaa gttatcacat ctttgggtaa 4620

gttgattggt aacgcctctg ctaacgctga agttgttaat aactgtgtcc cagttttgaa 4680

gcaattcaga gaaaacttaa accaatacgc tccagactac gtcaaaggta ctgccgtaaa 4740

tgaattgatc aagggtattg aatttgactt ttccggtgct gcttacgaaa aggacgtcaa 4800

gaccatgcca tggtacggta agattgaccc attcatcaat gaattaaagg ccttgggtct 4860

ctacggtaac atcacttctg ccactgaatg ggcttcagat gttggtatct actacttgtc 4920

taagttcggt ttgtactcaa ccaatcgtaa cgacattgtt caatccttag aaaaggctgt 4980

tgatatgtac aaatatggta agatcgcttt cgttgctatg gaaagaatca cctgggatta 5040

cgatggtatc ggttccaacg ggaagaaggt cgaccacgat aagttcttgg acgatgcaga 5100

aaagcattat ttgccaaaga cctatacttt cgacaacgga accttcatca tcagagctgg 5160

agataaggtt tctgaagaaa agattaagag attgtactgg gcttcccgtg aagttaagtc 5220

tcaattccac agagttgttg gtaacgataa ggctttggaa gtgggtaacg ctgacgatgt 5280

cttgaccatg aaaatcttca actctccaga agaatacaag ttcaacacca acattaacgg 5340

tgtctccact gataacggtg gtttgtacat cgaaccaaga ggtactttct acacttacga 5400

aagaacccca caacaatcta ttttctcctt ggaagaactg ttcagacacg aatacaccca 5460

ctacttgcaa gctagatact tggttgacgg tttgtggggt caaggtcctt tctacgaaaa 5520

aaacagattg acttggttcg atgaaggtac tgctgaattt ttcgctggtt ccaccagaac 5580

ttctggtgtg ttgccaagaa agtccatctt gggttacctt gccaaggata aggtcgatca 5640

tagatactcc ttgaagaaaa ctttgaactc tggttacgat gactctgact ggatgttcta 5700

caactacggt tttgctgttg ctcactactt atacgaaaag gacatgccaa cttttattaa 5760

gatgaacaag gccatcttga acactgatgt taagtcttac gacgaaatca ttaaaaaact 5820

gtctgacgac gctaacaaga acactgaata ccaaaaccac atccaagaac tcgctgataa 5880

gtaccaaggt gccggtatac cattggtgtc tgatgactac ctgaaggacc atggttacaa 5940

gaaggcttcc gaagtttact cagaaatctc caaggctgcg tctttaacta acacttctgt 6000

taccgctgaa aagtctcaat acttcaacac attcactttg aggggtactt acactggtga 6060

aacctctaag ggtgaattta aggactggga cgaaatgtct aagaagttgg acggtacttt 6120

ggagtcttta gctaagaact cttggtctgg ttacaagact ttgaccgctt acttcaccaa 6180

ctacagagtc acttctgata acaaagtcca atatgatgtt gtcttccacg gtgttttgac 6240

tgacaacgcc gatatttcta acaacaaggc tcctattgct aaggtcaccg gtccatctac 6300

tggtgctgtt ggtagaaaca ttgaattttc tggtaaggat tccaaggacg aagatggcaa 6360

gattgtctct tatgactggg atttcggtga tggtgctacc tccagaggta agaactctgt 6420

ccacgcttac aagaaggctg gtacttacaa cgtcactttg aaggtcaccg atgacaaggg 6480

tgctacggct actgaaagtt tcactattga aattaaaaac gaagacacta ccaccccaat 6540

caccaaggaa atggaaccaa acgatgacat taaggaagcc aacggcccga ttgtcgaagg 6600

cgtcacggtc aaaggtgact tgaacggttc tgatgacgct gacactttct actttgatgt 6660

caaggaagac ggtgacgtta ccatcgaatt gccatactct ggttcctcta actttacctg 6720

gttagtctac aaggaaggtg acgaccaaaa ccacatcgcc tccggtatcg ataaaaacaa 6780

ctccaaggtt ggtactttca agtccactaa gggtcgtcat tacgttttca tctacaagca 6840

cgactctgct tccaacattt catactcctt gaacatcaag ggtttgggta acgaaaagtt 6900

gaaagagaag gaaaacaatg actcctctga caaggcaacc gttattccaa atttcaatac 6960

caccatgcaa ggttctctat taggggacga ttctagagac tactactcct tcgaagtcaa 7020

ggaagaaggt gaagttaaca ttgaattgga taaaaaggat gaatttggtg ttacttggac 7080

cttgcaccca gaaagcaaca tcaacgacag aattacctac ggtcaagtcg atggtaacaa 7140

ggtatccaac aaggtcaaat tgagaccagg taagtactac ttgttggttt acaagtacag 7200

tggttccggt aactacgaat tgcgggttaa caagcaccac caccaccacc actaagctag 7260

cctcgagtct agaaactaag attaatataa ttatataaaa atattatctt cttttcttta 7320

tatctagtgt tatgtaaaat aaattgatga ctacggaaag cttttttata ttgtttcttt 7380

ttcattctga gccacttaaa tttcgtgaat gttcttataa gggacggtag atttacaagt 7440

gatacaacaa aaagcaaggc gctttttcta ataaaaagaa gaaaagcatt taacaattga 7500

acacctctat atcaacgaag aatattactt tgtctctaaa tccttgtaaa atgtgtacga 7560

tctctatatg ggttactcag aagtgtaccg aagactgcat tgaaagttta tgttttttca 7620

ctgcaagcgt cattttcgct ttgagaagat gttcttattc aaatttcaac tgttatatag 7680

aagagcaaaa aattgccaaa aaaaacaaca tttattcatt taaaatataa aatttgggct 7740

tctatatttt aatattgctt ttcaattact gttattaaat gtaagtactg cgtctatgaa 7800

aatatatgca aatgctaaga aaaatcctaa aaatttgaat atgagatatt cctcagtatt 7860

tctttttcat cctttcttct gcggctctag ccctttgttc tctcatcaat ctgcgtctct 7920

gttcatcggt caaagaattc aaattttgtt gctgaattga aggaataacg cgtgtacgca 7980

tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa gatcctccgg 8040

atcgtttcgc cggcgtttat ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 8100

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 8160

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 8220

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 8280

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 8340

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 8400

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 8460

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 8520

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 8580

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 8640

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 8700

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 8760

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 8820

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 8880

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 8940

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 9000

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 9060

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 9120

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 9180

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 9240

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 9300

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 9360

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 9420

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 9480

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 9540

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 9600

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 9660

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 9720

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 9780

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 9840

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 9900

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 9960

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 10020

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaacgaagca tctgtgcttc attttgtaga 10080

acaaaaatgc aacgcgagag cgctaatttt tcaaacaaag aatctgagct gcatttttac 10140

agaacagaaa tgcaacgcga aagcgctatt ttaccaacga agaatctgtg cttcattttt 10200

gtaaaacaaa aatgcaacgc gagagcgcta atttttcaaa caaagaatct gagctgcatt 10260

tttacagaac agaaatgcaa cgcgagagcg ctattttacc aacaaagaat ctatacttct 10320

tttttgttct acaaaaatgc atcccgagag cgctattttt ctaacaaagc atcttagatt 10380

actttttttc tcctttgtgc gctctataat gcagtctctt gataactttt tgcactgtag 10440

gtccgttaag gttagaagaa ggctactttg gtgtctattt tctcttccat aaaaaaagcc 10500

tgactccact tcccgcgttt actgattact agcgaagctg cgggtgcatt ttttcaagat 10560

aaaggcatcc ccgattatat tctataccga tgtggattgc gcatactttg tgaacagaaa 10620

gtgatagcgt tgatgattct tcattggtca gaaaattatg aacggtttct tctattttgt 10680

ctctatatac tacgtatagg aaatgtttac attttcgtat tgttttcgat tcactctatg 10740

aatagttctt actacaattt ttttgtctaa agagtaatac tagagataaa cataaaaaat 10800

gtagaggtcg agtttagatg caagttcaag gagcgaaagg tggatgggta ggttatatag 10860

ggatatagca cagagatata tagcaaagag atacttttga gcaatgtttg tggaagcggt 10920

attcgcaata ttttagtagc tcgttacagt ccggtgcgtt tttggttttt tgaaagtgcg 10980

tcttcagagc gcttttggtt ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagagaata 11040

ggaacttcgg aataggaact tcaaagcgtt tccgaaaacg agcgcttccg aaaatgcaac 11100

gcgagctgcg cacatacagc tcactgttca cgtcgcacct atatctgcgt gttgcctgta 11160

tatatatata catgagaaga acggcatagt gcgtgtttat gcttaaatgc gtacttatat 11220

gcgtctattt atgtaggatg aaaggtagtc tagtacctcc tgtgatatta tcccattcca 11280

tgcggggtat cgtatgcttc cttcagcact accctttagc tgttctatat gctgccactc 11340

ctcaattgga ttagtctcat ccttcaatgc tatcatttcc tttgatattg gatcatacta 11400

agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 11460

tc 11462

Claims (6)

1.一种表达胶原蛋白酶的重组质粒，其特征在于：是在表达质粒中插入α factor的前导序列以及溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶ColG的前导肽序列和酶功能区序列propeptide-Chain；或者是在表达质粒中插入α factor的前导序列和间隔序列leader-spacer以及溶组织梭状芽孢杆菌胶原蛋白酶ColH的前导肽序列和酶功能区序列pro peptide-Chain；

所述α factor的前导序列如SEQ ID No.1所示；

所述ColG的前导肽序列和酶功能区序列pro peptide-Chain如SEQ ID No.2所示；

所述α factor的前导序列和间隔序列leader-spacer如SEQ ID No.3所示；

所述ColH的前导肽序列和酶功能区序列pro peptide-Chain如SEQ ID No.4所示；

所述的表达质粒为CPOTud。

2.一种分泌胶原蛋白酶的酿酒酵母，其特征在于：是将权利要求1所述的重组质粒转化出发酵母菌株后得到；

所述的出发酵母菌株为酿酒酵母B184M。

3.一种发酵培养基在培养权利要求2所述的酿酒酵母中的应用，其特征在于：是在YPD培养基中添加Ca²⁺和Zn²⁺；

所述Ca²⁺的浓度为10 mM，所述Zn²⁺的浓度为0.6 mM。

4.一种权利要求2所述酿酒酵母的发酵培养方法，其特征在于包括如下步骤：

将权利要求2所述酿酒酵母接种至添加Ca²⁺和Zn²⁺的YPD培养基中培养；

所述Ca²⁺的浓度为10 mM，所述Zn²⁺的浓度为0.6 mM；

所述的培养，是在30-37℃下培养至少96 h，即可收集重组胶原蛋白酶。

5.权利要求1所述的重组质粒、权利要求2所述的酿酒酵母在生产胶原蛋白酶中的应用。

6.权利要求1所述的重组质粒、权利要求2所述的酿酒酵母在降解明胶和胶原蛋白中的应用。