CN114831109B - 一种黄鳝胚胎保存液及其保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄鳝胚胎保存液及其保存方法，属于鱼类生物技术领域。一种黄鳝胚胎保存液，包括含7.3～7.4g/L氯化钠、0.28～0.32g/L氯化钾、4.0～4.2g/L十二水和磷酸氢二钠、0.25～0.35g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛的溶液I和含6.7～6.8g/L氯化钠、0.25～0.35g/L氯化钾、3.5～3.9g/L十二水和磷酸氢二钠、0.25～0.30g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛的溶液II。用溶液I浸泡单细胞期‑肌肉效应期胚胎，用溶液II浸泡肌肉效应期‑出壳期胚胎，可使黄鳝胚胎不变型、卵黄不破裂，可用显微镜直观观察黄鳝胚胎发育状态或者用于胚胎原位杂交等试验。
Description
技术领域
本发明属于鱼类生物技术领域，具体涉及一种黄鳝胚胎保存液及其保存方法。
背景技术
黄鳝(Monopterus albus)是一种典型的性逆转生物，出生为雌性，待产卵后逐渐转变为雄性，极具科研价值。黄鳝卵颗粒较大，受精卵直径为2-3毫米，卵黄物质较多。目前，人们常常通过对黄鳝胚胎进行保存，以便在显微镜下观察黄鳝胚胎的形态，来达到人们对黄鳝胚胎不同发育时期的形态特征研究的目的。
目前，黄鳝胚胎常采用PBS溶液进行保存，长期保存的黄鳝胚胎容易发生变型，卵黄破裂等现象，影响黄鳝胚胎后续正常发育和存活，不能满足黄鳝胚胎长期保存的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄鳝胚胎保存液及其保存方法，使保存的黄鳝胚胎不变型、卵黄不破裂，利用显微镜直观观察黄鳝胚胎发育状态或者用于胚胎原位杂交等研究。
本发明提供了一种黄鳝胚胎保存液，包括独立分装的溶液I和溶液II；
所述溶液I是包含以下成分的水溶液：7.3～7.4g/L氯化钠、0.28～0.32g/L氯化钾、4.0～4.2g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.35g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛；
所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.7～6.8g/L氯化钠、0.25～0.35g/L氯化钾、3.5～3.9g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.30g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛。
优选的，所述溶液I是包含以下成分的水溶液：7.5g/L氯化钠、0.3g/L氯化钾、4.1g/LNa2HPO4·12H2O、0.3g/L磷酸二氢钾和40g/L多聚甲醛；
所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.75g/L氯化钠、0.27g/L氯化钾、3.7g/LNa2HPO4·12H2O、0.27g/L磷酸二氢钾和40g/L多聚甲醛。
本发明提供了所述黄鳝胚胎保存液在黄鳝胚胎保存中的应用。
本发明提供了一种黄鳝胚胎保存方法，包括以下步骤：
用所述黄鳝胚胎保存液的溶液I浸泡处于单细胞期-肌肉效应期的黄鳝胚胎，用所述黄鳝胚胎保存液的溶液II浸泡处于肌肉效应期-出壳期的黄鳝胚胎，将浸泡后的黄鳝胚胎进行保存。
优选的，所述浸泡的温度为20～28℃。
优选的，所述浸泡的时间为25～40min。
优选的，所述浸泡的次数包括2～4次。
优选的，所述浸泡的次数包括3次。
优选的，所述浸泡时，每毫升所述溶液I或溶液II浸泡1个黄鳝胚胎。
优选的，所述保存的温度为3～5℃。
本发明提供了一种黄鳝胚胎保存液，包括独立分装的溶液I和溶液II；所述溶液I是包含以下成分的水溶液：7.3～7.4g/L氯化钠、0.28～0.32g/L氯化钾、4.0～4.2g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.35g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛；所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.7～6.8g/L氯化钠、0.25～0.35g/L氯化钾、3.5～3.9g/L Na2HPO4·12H2O、0.25～0.30g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛。本发明对常规化学试剂的剂量进行优化调整获得一种具有能够保证保存的黄鳝胚胎不变型、卵黄不破裂，满足显微镜直观观察黄鳝胚胎发育状态或者用于胚胎原位杂交等试验的要求。可见本提供了提供提供的黄鳝胚胎保存液能够满足黄鳝胚胎长期保存的要求，为黄鳝材料研究提供了基础。
附图说明
图1为胚盾期胚胎保存检测(普通显微镜)结果，显示胚体完整，无变形破裂；
图2为肌肉效应期胚胎保存检测(荧光显微镜)结果，显示胚体完整，无变形破裂。
具体实施方式
本发明提供了一种黄鳝胚胎保存液，包括独立分装的溶液I和溶液II；
所述溶液I是包含以下成分的水溶液：7.3～7.4g/L氯化钠、0.28～0.32g/L氯化钾、4.0～4.2g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.35g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛；
所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.7～6.8g/L氯化钠、0.25～0.35g/L氯化钾、3.5～3.9g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.30g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛。
在本发明中，所述溶液I优选是包含以下成分的水溶液：7.5g/L氯化钠、0.3g/L氯化钾、4.1g/L Na2HPO4·12H2O、0.3g/L磷酸二氢钾和40g/L多聚甲醛。如果溶液I的盐浓度高于剂量范围，胚胎组织会发生向内坍塌收缩导致胚胎外观变形；如果溶液I的盐浓度低于剂量范围，胚胎组织会发生破裂，胚胎内含物释放在溶液中，胚胎组织解体。
在本发明中，所述溶液II优选是包含以下成分的水溶液：6.75g/L氯化钠、0.27g/L氯化钾、3.7g/LNa2HPO4·12H2O、0.27g/L磷酸二氢钾和40g/L多聚甲醛。如果溶液II的盐浓度高于剂量范围，胚胎组织会发生向内坍塌收缩导致外观变形；如果溶液II的盐浓度低于剂量范围，胚胎组织会破裂，胚胎内含物可能释放在溶液中，胚胎组织解体。
在本发明中，氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O、磷酸二氢钾和多聚甲醛，在本发明中，氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O、磷酸二氢钾起到细胞压渗透平衡作用，多聚甲醛则起到保护细胞膜的作用。
本发明对所述溶液I或溶液II的配制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的常规溶液的配制方法即可。
本发明提供了所述黄鳝胚胎保存液在黄鳝胚胎保存中的应用。
本发明提供了一种黄鳝胚胎保存方法，包括以下步骤：
用所述黄鳝胚胎保存液的溶液I浸泡处于单细胞期-肌肉效应期的黄鳝胚胎，用所述黄鳝胚胎保存液的溶液II浸泡处于肌肉效应期-出壳期的黄鳝胚胎，将浸泡后的黄鳝胚胎进行保存。
在本发明中，优选预先观察黄鳝胚胎的发育状态，根据胚胎的形态特点判断黄鳝胚胎所处的发育期。单细胞期-肌肉效应期的胚胎特点为胚胎发育不完全，胚尚未全部包括卵黄囊，胚胎组织较为娇弱，细胞膜尚未形成完全的体表皮肤，对外界液体渗透压不平衡较为敏感。肌肉效应期-出壳期的胚胎特点为胚胎组织发育完全，肌肉和皮肤组织较为坚固，对外界液体渗透压变化敏感型略弱。
在本发明中，所述浸泡的温度优选为20～28℃，更优选为22～6℃，最优选为25℃。所述浸泡的时间优选为25～40min，更优选为30～35℃。所述浸泡时，每毫升所述溶液I或溶液II优选浸泡1个黄鳝胚胎。所述浸泡的次数优选包括2～4次，最优选为3次。浸泡后，将去除溶液I或溶液II后再次添加溶液I或溶液II进行浸泡，如此重复浸泡2～3次。所述保存的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
本发明提供的保存方法，能够使黄鳝胚胎长期保存而不发生胚胎不变型、卵黄不破裂，保存的黄鳝胚胎可以利用显微镜直观观察黄鳝胚胎发育状态或者用于胚胎原位杂交等试验，为研究黄鳝提供了材料保障。
下面结合实施例对本发明提供的一种黄鳝胚胎保存液及其保存方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
药品及材料来源说明
1.药品
氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，Na2HPO4·12H2O，磷酸二氢钾(KH2PO4)，多聚甲醛(PFA)分别购正规试剂公司。
2.黄鳝胚胎材料
黄鳝胚胎购自行孵化。
实施例1
一种黄鳝胚胎保存液
1)分别称量目标重量的氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O，磷酸二氢钾和多聚甲醛，配制溶液I和溶液II，溶液I为包含以下浓度组分的水溶液：氯化钠7.5g/L、氯化钾0.3g/L、Na2HPO4·12H2O 4.1g/L、磷酸二氢钾0.3g/L和多聚甲醛40g/L；
溶液II为包含以下浓度组分的水溶液：氯化钠6.75g/L、氯化钾0.27g/L、Na2HPO4·12H2O 3.7g/L、磷酸二氢钾0.27g/L和多聚甲醛40g/L。
实施例2
一种黄鳝胚胎保存液
1)分别称量目标重量的氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O，磷酸二氢钾和多聚甲醛，配制溶液I和溶液II，溶液I是包含以下浓度组分的水溶液：7.3g/L氯化钠、0.32g/L氯化钾、4.0g/LNa2HPO4·12H2O、0.35g/L磷酸二氢钾和38g/L多聚甲醛；
所述溶液II为包含以下成分的水溶液：6.8g/L氯化钠、0.25g/L氯化钾、3.9g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L磷酸二氢钾和42g/L多聚甲醛。
实施例3
一种黄鳝胚胎保存液
1)分别称量目标重量的氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O，磷酸二氢钾和多聚甲醛，配制溶液I和溶液II，使制备的溶液I如下：7.4g/L氯化钠、0.28g/L氯化钾、4.2g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L磷酸二氢钾和42g/L多聚甲醛；
所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.8g/L氯化钠、0.25g/L氯化钾、3.9g/LNa2HPO4·12H2O、0.25g/L磷酸二氢钾和42g/L多聚甲醛。
对比例1
一种黄鳝胚胎保存液
分别称量目标重量的氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O，磷酸二氢钾和多聚甲醛，配制溶液，使制备的溶液如下：6g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、4g/LNa2HPO4·12H2O、0.2g/L磷酸二氢钾和42g/L多聚甲醛。
对比例2
一种黄鳝胚胎保存液
分别称量目标重量的氯化钠、氯化钾、Na2HPO4·12H2O，磷酸二氢钾和多聚甲醛，配制溶液，使制备的溶液如下：8g/L氯化钠、0.3g/L氯化钾、4.5g/LNa2HPO4·12H2O、0.3g/L磷酸二氢钾和42g/L多聚甲醛。
实施例4
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取实施例1制备的溶液I和溶液II各5毫升各自装入10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液I的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液II的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟；
4.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存。
实施例5
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取实施例1制备的溶液I和溶液II各5毫升各自装入10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液I的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液II的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟；
4.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存。
实施例6
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取实施例2制备的溶液I和溶液II各5毫升各自装入10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液I的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液II的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟；
4.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存，每个处理重复20次。
实施例7
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取实施例3制备的溶液I和溶液II各5毫升各自装入10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液I的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液II的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟；
4.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存，每个处理重复20次。
对比例3
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取对比例1制备的溶液分别装入2个10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将两个装有胚胎离心管中的溶液分别吸出，再次对应加入溶液5毫升进行室温浸泡30分钟；
4.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液分别吸出，再次分别加入溶液5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存，每个处理重复20次。
对比照4
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取对比例2制备的溶液分别装入2个10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将两个装有胚胎离心管中的溶液分别吸出，再次对应加入溶液5毫升进行室温浸泡30分钟；
4.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液分别吸出，再次分别加入溶液5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存，每个处理重复20次。
对比例5
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取实施例1制备的溶液I和溶液II各5毫升各自装入10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液I的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液II的离心管中，常温浸泡90分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存，每个处理重复20次。
实施例8
一种黄鳝胚胎的保存方法
1.吸取实施例3制备的溶液I和溶液II各5毫升各自装入10毫升的离心管，做好标记。
2.利用解刨镜观察黄鳝胚胎发育状态，判断黄鳝胚胎的发育期，将单细胞期-肌肉效应期的胚胎5颗放入装有溶液I的离心管中，将肌肉效应期-出壳期的胚胎胚胎5颗放入装有溶液II的离心管中，常温浸泡30分钟；
3.用吸管将装有胚胎离心管中的溶液I、II分别吸出，再次对应加入溶液I、II 5毫升进行室温浸泡30分钟，放入4度冰箱即可进行长期保存，每个处理重复20次。
将本发明实施例4～7和对比例3～5保存1天、10天和30天的黄鳝胚胎取出，在解剖显微境下进行形态观察，记录形态变化特点。结果见表1。
表1不同保存液保存的黄鳝胚胎形态特点一览表
2010.2
图1为实施例4中胚盾期胚胎保存检测(普通显微镜)结果。由图1可见，保存的胚胎胚体完整，无变形破裂。图2为实施例4中肌肉效应期胚胎保存检测(荧光显微镜)结果。由图2可知，胚胎的胚体完整，无变形破裂。而经过对比例3～5保存的胚盾期胚胎和肌肉效应期胚胎发生胚胎破裂或胚胎收缩变性的问题，说明盐度过高或过低的溶液不适合黄鳝胚胎的保存。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种黄鳝胚胎保存液，其特征在于，包括独立分装的溶液I和溶液II；
所述溶液I是包含以下成分的水溶液：7.3～7.4g/L氯化钠、0.28～0.32g/L氯化钾、4.0～4.2g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.35g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛；
所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.7～6.8g/L氯化钠、0.25～0.35g/L氯化钾、3.5～3.9g/LNa2HPO4·12H2O、0.25～0.30g/L磷酸二氢钾和38～42g/L多聚甲醛。
2.根据权利要求1所述黄鳝胚胎保存液，其特征在于，所述溶液I是包含以下成分的水溶液：7.5g/L氯化钠、0.3g/L氯化钾、4.1g/LNa2HPO4·12H2O、0.3g/L磷酸二氢钾和40g/L多聚甲醛；
所述溶液II是包含以下成分的水溶液：6.75g/L氯化钠、0.27g/L氯化钾、3.7g/LNa2HPO4·12H2O、0.27g/L磷酸二氢钾和40g/L多聚甲醛。
3.权利要求1或2所述黄鳝胚胎保存液在黄鳝胚胎保存中的应用。
4.一种黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
用权利要求1或2所述黄鳝胚胎保存液中的溶液I浸泡处于单细胞期-肌肉效应期的黄鳝胚胎，用权利要求1或2所述黄鳝胚胎保存液中的溶液II浸泡处于肌肉效应期-出壳期的黄鳝胚胎，将浸泡后的黄鳝胚胎进行保存。
5.根据权利要求4所述黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，所述浸泡的温度为20～28℃。
6.根据权利要求4所述黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，所述浸泡的时间为25～40min。
7.根据权利要求4所述黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，所述浸泡的次数包括2～4次。
8.根据权利要求7所述黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，所述浸泡的次数包括3次。
9.根据权利要求4所述黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，所述浸泡时，每毫升所述溶液I或溶液II浸泡1个黄鳝胚胎。
10.根据权利要求4～9任意一项所述黄鳝胚胎保存方法，其特征在于，所述保存的温度为3～5℃。
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