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CN114787372A - 从植物细胞表面获得材料的方法 - Google Patents

从植物细胞表面获得材料的方法 Download PDF

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CN114787372A
CN114787372A CN202080087743.0A CN202080087743A CN114787372A CN 114787372 A CN114787372 A CN 114787372A CN 202080087743 A CN202080087743 A CN 202080087743A CN 114787372 A CN114787372 A CN 114787372A
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B·雅恩
H·涅德克鲁格
J·科赫
A·布施
A·沙夫
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Ailifa Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种使表达材料从植物细胞的表面或质外体脱离的方法，其中所述植物细胞在液体介质中用转子‑定子处理，其中通过转子旋转而引入的转子‑定子的比热最大为3 kJ每kg所述液体介质和每g/L所述植物细胞干质量，并且引入到所述介质中的比热功率最大为1.5 kJ每kg所述液体介质每分钟和每g/L所述植物细胞干质量。

Description

从植物细胞表面获得材料的方法
发明领域
本发明涉及从细胞分离蛋白质。
发明背景
从细胞或细胞复合物分离蛋白质的方法包括渗透裂解、酶促或化学裂解、超声处理和机械消化。为了机械消化，通常均质器或混合器将细胞粉碎。
也可以使用短处理时间，以便分裂细胞复合物和使细胞处于悬浮状态，由此仅发生整个细胞量的部分裂解(Orellana-Escobedo 等人，Plant Cell Rep. 2015, 34(3):425-33)。
如果从单个细胞器或细胞区室分离蛋白质，通常在消化之前分离细胞器，然后使用分离物进行消化。
Witzel等人, Plant Methods 2011, 7:48；Leary等人, J Vis Exp. 2014;(94): 52113；和Córdoba-Pedregosa等人, Plant Physiology 1996, 112(3):1119-1125描述了从植物细胞的质外体中提取蛋白质的方法。将原生质体外部的空间称为质外体。它由细胞壁和细胞间隙组成。那些公开中描述的方法包括用不同的渗透溶液(例如盐)进行渗透提取和离心。然而，该方法的缺点在于，在该提取中，仅可提取可通过渗透获得的材料。
US 2015/0140644 A1和AU 2017 202473 B2描述了利用裂解细胞壁、孵育和提取的步骤从质外体获得蛋白质的方法。其中对蛋白质的酶促或化学修饰是可能的。
本发明的一个目的是提供改进的分离或提取质外体材料、特别是分泌到质外体中的材料的可能性。
发明简述
本发明涉及一种使表达材料从植物细胞的表面或从质外体中脱离的方法，其中植物细胞在液体介质中用转子-定子处理，其中通过转子旋转而引入的转子-定子的比热最大为3 kJ每kg液体介质和每g/L植物细胞干质量，并且引入到介质中的比热功率最大为1.5kJ每kg液体介质每分钟和每g/L植物细胞干质量。
同样地，在另一方面中，本发明涉及一种使表达材料从一种或多种植物细胞的表面或质外体脱离的方法，其中一种或多种植物细胞在液体介质中用转子-定子处理，其中通过转子旋转而引入的转子-定子的热量最大为30 kJ每kg液体介质，并且引入到介质中的热功率最大为1.5 kJ每kg液体介质和每分钟。
可以组合这两个方面的参数，特别是因为仅涉及不同的参考值，两种情况都符合本发明的精神。本文描述的所有详细的发明描述和优选实施方式涉及本发明的所有方面。
发明详述
本发明涉及对植物或植物细胞进行温和的转子-定子处理，与否则通常的均质化相反，该处理使材料从细胞或植物的质外体中脱离。在这种情况下，原生质体应保持基本完整，以避免要分离的表达材料被来自原生质体细胞内部的细胞成分污染。因此，根据本发明，用转子-定子处理的强度和持续时间受到限制。通过具有低能量输入(确定为比热或热功率)的转子-定子处理可以令人满意地使所需的表达材料脱离。在通过转子旋转而引入的转子-定子的比热最大为3 kJ每kg液体介质和每g/L植物细胞干质量时以及在通过转子旋转而引入到介质中的比热功率最大为1.5 kJ每kg液体介质每分钟和每g/L植物细胞干质量时可以发现出色的结果。等同于该发明构思，在通过转子旋转而引入的转子-定子的热量最大为30 kJ每kg液体介质时以及在引入到介质中的热功率最大为1.5 kJ每kg液体介质和每分钟时，获得了同样好的结果。根据本发明，在这种情况下，植物或植物细胞不被均质化，而仅被处理到使得表达材料从表面脱离或从质外体中脱离。
用根据本发明的方法，从细胞表面或质外体(整个细胞壁和细胞间隙)获得表达材料。这种材料通常通过分泌途径到达这些部位，并且通常也位于植物细胞的培养介质中。然而，在本发明的过程中已发现，大量分泌材料粘附于表面，特别是粘附于细胞壁或质外体。根据本发明获得该粘附材料，其中可以通过根据本发明的方法实现产量增加。与没有转子-定子处理的方法（即，分离分泌的表达材料）相比，可以观察到收率增加了大约10倍。
在根据本发明的最大参数内选择转子-定子的处理强度、处理持续时间和处理能力，以获得表达材料(所需产品)的足够的回收。然而，代表引入的能量且量化为热量或比热的处理强度、处理持续时间和处理能力受到限制，因为在更高的能量输入下发生产品污染。
优选地，通过转子旋转而引入的转子-定子的比热最大为3 kJ每kg液体介质和每g/L植物细胞干质量(缩写为3 kJ/kg/(g/L)或3 kJ/kg/g/L)。特别优选地，可以将比热保持较低，以进一步减少可能的残留污染。因此，优选地，引入的转子-定子的比热最大为2.75kJ/kg/(g/L)，或更优选最大为2.5 kJ/kg/(g/L)，最大为2.25 kJ/kg/(g/L)，最大为2 kJ/kg/(g/L)，最大为1.75 kJ/kg/(g/L)，最大为1.5 kJ/kg/(g/L)，最大为1.25 kJ/kg/(g/L)，或最大为1 kJ/kg/(g/L)。
不依赖于植物量，根据本发明还确定了引入的热量的任选参数。在一些实施方式中，这是相关的，因为转子-定子独立于植物细胞向细胞介质输送能量；这可以表现为加热。优选地，通过转子旋转而引入的转子-定子的热量最大为30 kJ每kg液体介质(缩写为kJ/kg)，优选最大为25 kJ/kg，最大为20 kJ/kg，最大为15 kJ/kg或最大为10 kJ/kg。
这种引入的比热或引入的热量可以例如通过时间限制的处理持续时间和/或处理强度来调节(比热功率或热功率的参数同样)：
在根据本发明的方法中，转子-定子以低强度运行，例如以低转数运行。以特定强度在所选参数下引入的特定方法的热量(或热功率)可以在比较实验中测量，例如通过提高水或具有已知热容的另一介质的温度来测量。在确定该方法的热量时，应能排除或在计算中考虑影响温度的其他作用，特别是温度损失，以便如此获得转子-定子自身的热量或热功率；优选地，热量或热功率在杜瓦瓶中确定。
不依赖于仪器，引入的比热功率或引入的热功率被认为是相关的(如上，“比”是指基于任选涉及的植物材料量计)。优选地，引入到介质中的比热功率最大为1.5 kJ每kg液体介质每分钟和每g/L植物细胞干质量(缩写为kJ/kg/min/(g/L)或kJ/kg/min/g/L)。特别优选地，该比热功率最大为1.25 kJ/kg/min/(g/L)，最大为1 kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.8kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.6 kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.5 kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.4kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.3 kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.2 kJ/kg/min/(g/L)，最大为0.15 kJ/kg/min/(g/L))，最大为0.125 kJ/kg/min/(g/L)，或最大为0.1 kJ/kg/min/(g/L)。与此类似，引入到介质中的热功率最大为1.5 kJ每kg液体介质和每分钟(缩写为kJ/kg/min)。优选地，该热功率最大为1.25 kJ/kg/min，最大为1 kJ/kg/min，最大为0.8 kJ/kg/min，最大为0.6 kJ/kg/min，最大为0.5 kJ/kg/min，或最大为0.4 kJ/kg/min。
处理强度越大或持续时间越长，获得的材料量就越大。优选地，通过转子的旋转而引入的(转子-定子的)热量为至少1 kJ每kg液体介质，特别优选至少2 kJ/kg，和/或转子-定子的比热为至少0.1 kJ每kg液体介质和每g/L植物细胞干质量，特别优选至少0.2 kJ/kg/(g/L)。
优选地，通过转子旋转引入到介质中的热功率为至少0.2 kJ每kg液体介质和每分钟，优选至少0.4 kJ/kg/min，和/或进入到介质中的比热功率为至少0.02 kJ每kg液体介质每分钟和每g/L植物细胞干质量，优选至少0.04 kJ/kg/min/(g/L)。
表达材料优选含有蛋白质。蛋白质，特别是重组表达的蛋白质，可以用相应的信号序列靶向性地调控至分泌途径，并因此被引导至富集在表面或质外体处。优选地，表达材料在植物细胞的质外体中，可以通过根据本发明的方法从质外体中获得该表达材料。同样优选地，表达材料是分泌材料，优选为通过细胞膜或细胞壁分泌的蛋白质。
根据本发明，使用转子-定子，以处理液体介质中的植物细胞以获得表达材料。
转子-定子包括至少一个转子，该转子通过其旋转运动而对植物细胞施加剪切力。通过该剪切力，植物细胞或质外体的表面和细胞壁(在结构上) 被松动、机械地影响或擦掉或表面部分地被去除。
转子相对于定子旋转。定子可以是外壳护套或转子的对应物。转子可以具有带有棱边或剪切面的切割或剪切元件。常见的构造具有梳状结构，其中通常平行于旋转轴布置的多个剪切突起(例如齿或尖齿)施加剪切或切割作用。在此，“多个”例如可以是2、3、4、5、6、7、8或更多个剪切突起。
定子可以布置为转子的对应物，并且特别是其切割或剪切元件。任选地，与转子类似，定子可以具有自己的切割或剪切元件，例如同样呈梳状结构。如DE 10 2005 031 459A1中所述，这种构造在棒式均质器中是已知的。
在其他实施方式中，定子可以是外壳结构，例如对于通流式均化器而言常见的。在WO 2009/062610 A1中描述了通流式转子-定子的一个实例。
转子-定子的实例是棒式均质器或剪切泵。剪切泵特别用于流通系统。
优选地，在转子和定子之间存在间隙，例如至少一个植物细胞的大小或更大，使得至少原生质体形式的植物细胞可以在转子和定子之间通过。合适的间隙大小为50μm、70μm、80μm、100μm、150μm或更大以及这些距离之间的任何范围，优选至多最大500μm或至多300μm或至多200μm。
如所指出的，保持低强度，以保护原生质体形式的植物细胞，以防止或减少要收获的分泌表达材料被细胞内部物污染。为此，在常规转子-定子模型中，降低转数，例如在转子以每分钟最大15,000转，优选每分钟1,000至15,000转的转数运行的实施方式。可能的转数为每分钟3,000至14,000、4,000至13,000、5,000至12,000或6,000至11,000转。
植物细胞可以存在于转子-定子引入其中的容器中。为此，可以将转子-定子引入到具有介质的容器中。这种“间歇式”构造(用于非连续方法)特别在棒式均化时使用。对于较大规模而言，优选使用通流-转子-定子。根据该实施方式，转子-定子可以具有内部空间，该内部空间至少具有各一个入口和出口，液体介质通过该入口和出口连续地输送通过该内部空间。对此的实例是用于连续方法的剪切泵。
优选地，定子限定10 cm3 (0.01 L)至1 m3 (1000 L)的体积。优选的体积为0.1 L至800 L，或0.5 L至600 L，或1 L至400 L，2 L至200 L。优选至多100 L的体积，特别优选0.65 L至50 L，例如1 L至 40 L。这些体积特别适用于处理植物细胞培养基。
优选地，处理的液体介质的量至多50000 kg，优选0.5 g至50,000 kg，例如1 g至25,000、2 g至10,000 kg、5 g至5,000 kg、10 g至2,500 kg、20 g至1,000 kg、30 g至500kg、50 g至250 kg、100 g至100 kg、200 g至50 kg、500 g至250 kg、1 kg至100 kg、2 kg至50 kg或4 kg至20 kg。这种量是在非连续方法中每次运行优选使用的量。
优选地，植物细胞以0.2 g/L至60 g/L的浓度存在于液体介质中(植物细胞的质量作为干质量)。其中，植物细胞的优选浓度(总是以干质量计)为0.5 g/L至50 g/L、1 g/L至40 g/L、2 g/L至30 g/L、4 g/L至20 g/L，特别优选约10 g/L，例如5 g/L至15 g/L。这些植物细胞浓度可以特别有效地用转子-定子处理。
优选地，植物细胞用转子-定子处理2分钟至150分钟。在连续方法中，这些时间是指植物细胞的平均处理时间。优选的时间特别是3分钟至120分钟、5分钟至100分钟、8分钟至80分钟、10分钟至60分钟，或特别优选12分钟至40分钟。在大培养体积下，可以进行更长时间的转子-定子处理。优选地，另外可能的时间是1小时至24小时，优选2小时至20小时，3小时至16小时，4小时至12小时。因此，所有优选的处理时间都在3分钟至24小时的范围内，并且涉及所提及的处理时间之间的每个范围亦或更长。
优选地，植物细胞可以在悬浮培养物中培养。在根据本发明的方法中，该悬浮液可以直接作为液体介质进行处理。或者，也可以首先从例如固体培养物、液体培养物或悬浮培养物中分离苔藓，然后在适合使用转子-定子处理的条件下将其悬浮在水性介质中。特别适用于根据本发明的方法的植物是非木本植物。优选的植物是藻类和苔藓（Moose），特别是苔藓类植物（Bryophyten）。优选地，苔藓类植物或细胞是苔藓，优选小立碗藓(P. patens)。苔藓类植物可以是任意的每种苔藓类植物，但优选地选自苔藓、地钱或角苔，特别优选地选自藓纲或小立碗藓属(Physcomitrella)、葫芦藓属(Funaria)、泥炭藓属(Sphagnum)、角齿藓属(Ceratodon)、地钱属(Marchantia)和囊果苔属(Sphaerocarpos)。小立碗藓是特别优选的。最优选地，根据本发明的方法使用来自植物组织的细胞进行，如来自小立碗藓的原丝体。优选的藻类选自绿藻，例如选自小球藻目(Chlorellales)，优选选自小球藻科(Chlorellaceae)，更优选选自原壳藻属(Auxenochlorella)或小球藻属(Chlorella)，特别是普通小球藻(Chlorella vulgaris)，和选自团藻目(Volvocales)，优选选自红球藻科(Haematococcaceae)，更优选选自红球藻属(Haematococcus)，特别是雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，和选自真眼藻目(Eustigmatales)，优选Loboceae、Chlorobothryaceae、拟小椿藻科(Pseudocharaciopsidaceae)和Eustigmataceae。进一步优选的植物是烟草、豆类或小扁豆。优选地，该植物是水生植物，例如来自浮萍属(Lemna)、紫萍属(Spirodela)、少根紫萍属(Landoltia)、无根萍属(Wolffia)或小芜萍属(Wolffiella)。
植物细胞构成本发明的主题。如本文所用，“植物细胞”可指分离的细胞、个体化细胞，但也指植物组织中或来自植物组织的细胞，优选选自愈合组织、原丝体、韧皮部、木质部、叶肉、茎、叶、叶状体、绿丝体、假根或配子托的组织，或植物有机体中的细胞。
在根据本发明的方法中，介质优选具有生理pH值，特别是以便如上所述保护原生质体(细胞壁内的细胞成分，特别是自细胞膜起)，以防止质外体中/细胞表面上表达材料的污染。液体介质的pH值优选为3.5-8.5，特别优选4-8，或4.5-7，或5-6.5，特别是5.5-6，或这些值的组合，如5-8的pH值。
同样为了保护原生质体，液体介质的渗透压优选是生理的，特别是以便避免膨胀应力，例如当渗透压太低时。任选地，也可以提供渗透压的上限以避免渗透收缩应力。优选地，介质具有至少0.1 osmol/L，或优选地至少0.150 osmol/L的渗透压。渗透压可以通过溶解物质如盐或其他介质组分如糖或糖醇来调节。优选地，提供碱金属盐如Na+和/或K+。优选地，提供卤离子如Cl-或F-或I-、磷酸根或乙酸根作为阴离子。其他可能是缓冲液组分如Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。
此外，为了进一步保护原生质体，可以将表面活性聚合物提供到用于转子-定子处理的液体介质中。表面活性聚合物例如在WO 2013/156504 A1中有所描述，并且优选涵盖不带电荷的聚合物，例如乳化剂，如聚烷基二醇，特别是聚乙二醇。特别地，所述聚合物是非离子水溶性表面活性聚合物。优选地，它不使蛋白质变性。实例是选自下述的聚合物或共聚物：聚醚如聚烷基二醇、聚山梨醇酯或聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，水溶性纤维素衍生物如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素或羟乙基纤维素，乙烯基吡咯烷酮乙酸乙烯酯共聚物(共聚维酮)，聚乙酸乙烯酯，部分水解的聚乙烯醇，聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物，以及它们的混合物。进一步的可能性是聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯，优选聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯，Tween® 80)、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。表面活性聚合物优选以至少0.05重量%，特别优选至少0.08%、至少0.1%或至少1.5%(所有%数据均以重量%计)的浓度存在于介质中。表面活性聚合物例如PEG等的分子量优选为至少500 Da，特别优选至少1,000 Da、至少1,500 Da、至少2,000 Da、至少3,000 Da、至少4,000 Da、在至少 6,000 Da、至少 8,000 Da、至少 10,000 Da、至少 20,000 Da、至少 30,000 Da。特别优选地，分子量为500 Da至2,000,000 Da，优选1,000 Da至200,000 Da或1,200 Da至80,000 Da。
液体介质优选是水性的，特别是水或与细胞相容的水混合物。特别地，它可以是用于植物细胞(和具有植物细胞)的培养介质，只要植物事先没有与它分离。
优选地，表达材料在用转子-定子处理植物细胞之前已经表达，从而其积聚在植物细胞的表面上或质外体中。在此，可以培养植物细胞和/或使其生长，例如在植物生长条件(营养培养基、光照)下在介质中，这是通常已知的(参见例如Frank等人 Plant Biol 7,(2005):220–227)。表达或培养优选进行13分钟至1个月(30天)或更长，例如2个月(60天)，例如1小时至22天，或5小时至15天，例如10小时至7天或20小时至3天。在为了获得产品(表达材料)而定期去除细胞的连续细胞培养中，这些时间范围或最短时间可以相应于培养细胞的平均时段。
应避免其他损坏或裂解或均质化原生质体的方法。细胞壁优选不被裂解，特别是不被酶促裂解和/或不被化学裂解和/或不被渗透裂解和/或不被超声裂解。优选地，除了根据本发明的转子-定子处理之外，细胞壁应该保持未触及或完整。特别地，细胞膜(原生质体)应该保持完整，其中在根据本发明的方法中，细胞的活力不起任何特殊作用，但是应避免细胞内部空间的组分特别是细胞质对液体介质的污染。
现在将通过以下附图和实例进一步描述本发明，但本发明并不限于这些实施方式。
附图：
图1：由T25 Ultraturrax棒状均质器(IKA/Staufen)确定水中的能量输入。(A)在10,000 rpm转数下在1.5 L水中的温度曲线。(B)计算的能量输入[KJ]。(C)计算的能量输入[KJ/kg]。
图 2：通过FSP712VC-2.2kW-FU 剪切泵均质器(Fristram/Hamburg)确定水中的能量输入。(A)在2,800 rpm转数下在50 L水中的温度曲线。(B)计算的能量输入[KJ]。(C)计算的能量输入[KJ/kg]。
图3：使用剪切泵(虚线)和T25 Ultraturrax棒(实线)处理期间生物质结合产物(moss-aGal)的释放百分比。反应器培养物的剪切泵处理在50 L的体积中进行。用T25Turrax棒处理反应器培养物在0.65 L的体积中进行。
图4：通过T25 Ultraturrax棒(A)和剪切泵(B)的特定能量输入，均对于10 g/L生物干质量而言。根据对比例T25 Ultraturrax棒在19,000 rpm下使用1 g/L生物干质量的特定能量输入(C)。
图5：使用剪切泵(虚线)和T25 Ultraturrax棒(实线)处理期间生物质结合产物(moss-aGal)的释放百分比。反应器培养物的剪切泵处理在50 L的体积中进行。用T25Turrax棒处理反应器培养物在0.65 L的体积中进行。生物质：9.2 g/L(剪切泵)，8.2 g/L(T25)。
图6：与细胞内标记蛋白(Rubisco，大亚基)释放相比，产品释放(moss-aGal)的蛋白质印迹分析。对于含盐培养基(例如20 mM Tris，100 mM NaCl，pH=7)中的细胞内蛋白质，可以以最小量检测到至多32.9 KJ/kg的能量输入。在渗透应力条件下(软化水)，可检测到大约10 KJ/kg。目标蛋白质量(moss-aGal)在含盐培养基中和在渗透应力条件下相应于输入能量增加。
图7：软化水中T25过程的显微分析。直至16.5 kJ/kg的能量输入，苔藓细胞保持完整性。在32.9 KJ/kg的能量输入下，细胞的完整性是存在的，但明显存在更多的颗粒，这表明细胞消化开始。
图8：含盐缓冲液(20 mM Tris，100 mM NaCl，pH=7)中T25过程的显微分析。直至16.5 kJ/kg的能量输入，苔藓细胞保持完整性。在32.9 KJ/kg的能量输入下，细胞的完整性是存在的，但明显存在更多的颗粒，这表明细胞消化开始。
图 9：含盐介质(反应器培养物)中剪切泵过程的显微分析。直至18.41 kJ/kg的能量输入，苔藓细胞保持完整性。自27.20 KJ/kg的能量输入起，细胞的完整性仍然存在，但明显存在更多颗粒，这表明细胞消化开始。
图10：软化水中剪切泵过程的显微分析。直至9.62 kJ/kg的能量输入，苔藓细胞保持完整性。自18.41 KJ/kg的能量输入起，细胞的完整性仍然存在，但明显存在更多的颗粒，这表明细胞消化开始。
图11：超声过程中苔藓细胞的显微分析，作为细胞消化的比较图像。在短时间后(超声处理1分钟)，细胞已经失去其完整性。3分钟后，已经只能看到细胞片段和空细胞碎片(100%在50 mL样品中)。
图12：对比例：使用T25均质工具(IKA/Staufen)在高能量、19,000 rpm转数下确定水中的能量输入。(A)1 L水中的温度曲线。(B)计算的能量输入[KJ]。(C)计算的能量输入[KJ/kg]。
图13：对比例：在19,000 rpm下产品释放明显更快。特别是直至7 KJ/kg的能量输入。自84 KJ/kg的能量输入起，由于高温和剪切应力导致产品损失。
实施例：
实施例1：借助于Turrax棒和剪切泵确定能量输入
作为水性培养基中能量输入的度量使用作为可测量变量的温度。对于T25-S25N-18G Turrax棒(IKA Staufen)，将1.5 L的H2O在杜瓦瓶中以10,000 rpm分散30分钟，并测量温度曲线。实验进行期间的室温为20.5至20.7℃。能量输入数据通过H2O的比热容(4,190 Jkg-1K-1)计算。相较于文献(Orellana-Escobedo等人, Plant cell Rep. 2015, 34(3),425–433)的能量输入数据在19,000 rpm下类似地进行。
用剪切泵(剪切泵FSP712，Fristam Hamburg)，通过织物稳定的 PVC 软管以 2800rpm 从 Nalgene 储存容器中循环输送50 L H2O。Nalgene储存容器中的温度测量通过温度传感器(精密温度计，G002.1，Carl Roth)进行。实验构建在调温到19℃的室中实现。在这个实验方法中忽略了进入到环境中的热量损失。能量输入数据通过比热容(4,190 J • kg-1K-1)计算。
实施例2：苔藓培养物的生产
在WaveTMRocking Motion生物反应器(Wave200，GE Healthcare)上，在200 L一次性生物反应器袋(Cellbag 200，GE Healthcare)中进行苔藓生产株的无菌培养，持续3-4周。培养参数为19至25 rpm的振摇频率，9°的振摇角度，24-26℃的温度，和2 L/min的供气速率，并且用2% CO2富集空气供应。利用安装在生物反应器袋上方的有“暖白”光色的LED的4个LED模块(序列号120268至120282，Infors AG)进行照明。苔藓培养在24小时持续照明下进行。补充有1000x Nitsch维生素(Nitsch维生素混合物，Duchefa，参见制造商的说明)的SM07 (100 mM NaCl, 6.6 mM KCl, 2.0 mM MgSO4 x 7H2O, 1.8 mM KH2PO4, 20.4 mM Ca(NO3)2 x 4H2O, 0.05 mM Fe Na-EDTA, 4.9mM MES, 0.1% (w/v) PEG4000, 100.26 µMH3BO3, 0.11 µM CoCl2 x 6H2O, 0.1 µM CuSO4 x 5H2O, 5 µM KI, 85.39 µM MnCl2 x4H2O, 1.03 µM Na2MoO4 x 2H2O, 0.11 mM NiCl2 x 6H2O, 0.04 Na2SeO3 x 5H2O, 0.039乙酸锌 x 2H2O)用作矿物盐介质。用WAVEPOD I和Pump20(GE Healthcare)通过自动添加0.25M H2SO4和0.25 M NaOH调节5-6的pH值。如WO 2016/146760 A1中所述表达重组α-半乳糖苷酶(aGal或α-Gal A)(“moss-aGal”)。
实施例3：苔藓结合产物的释放和分析方法
为了分析苔藓结合产物释放的时间曲线，用T25-S25N-18G Turrax棒以及用剪切泵FSP 712将从实施例2获得的培养物暴露于不同能量输入下。借助于moss-aGal ELISA(Biogenes/德国)进行释放产物的cPL产物浓度确定(cPL)。通过苔藓细胞的显微图像分析检测细胞消化程度（显微镜：Axiovert 200 oper Stemi SV11，配备 AxioCam 相机、AxioSoft软件和 KL 1500 LCD 冷光源（Carl Zeiss）。通过于显微分析100%功率下的50 mL超声消化(探头：UW2070，Bandelin；放大器：HD 2070，Bandelin)20分钟，与总消化的显微图像比较是可能的。在分子水平上，通过在释放产物以及细胞内标记蛋白Rubisco上的的蛋白质印迹进行定性分析。使用的一抗是抗aGal (H00002717-D01P, abnova)和抗Rubisco (AS03037,Agrisera)以及作为二抗使用抗兔HRP (abcam,AS03037)。
为了分析释放的(cPL)和可释放的苔藓结合产物(cPX)之间的比率，未经处理的培养物使用球磨机(钢球：RB-3/G20W，Schleer；球磨机：MM300，Retsch)进行细胞消化。分离细胞碎片后，使用ELISA (Biogenes)确定产物浓度。在这方面，测定在质外体空隙中表达的蛋白质aGal(α-半乳糖苷酶，也称为“moss-aGal”)。
实施例4：结果和讨论
在培养介质(kg)中的两种不同的均质器(T25-S25N-18G Turrax棒和FSP 712剪切泵)的能量输入(作为热量，以kJ/kg计，kg基于液体介质计)通过温度测量来确定(图1-5)。在此，均质器被设置为低转速，从而产生低热功率(以kJ/kg/min计)。如此可以确定特定时间段(0-60分钟)内的总热量。在此，水中的能量输入是基于测量的温度通过H2O的比热系数[4.182 KJ/kg*K]计算的。在此，计算热量(图1-3)或相对于植物部分的干质量的比热(图4-5)。
图3和5显示了沉积在表面上或质外体中的所需蛋白质(来自苔藓的重组aGal，“moss-aGal”)的产物释放。释放随着处理的增加也增加。
在对比实验中，Turrax棒在更高的热功率下运行，更确切地说在19,000 rpm下运行(图4C，12-13)。热功率大约是在10,000 rpm下的保护性处理的100倍(比较图4A和4C)。在较高热功率下的操作迅速导致产物释放，但也导致细胞(原生质体)的破坏，使得细胞外产物被细胞内部空间的成分污染。这些效果在1分钟时就已经出现了。
图6显示了胞外蛋白(moss aGal)和胞内蛋白Rubisco的产物释放的品质。Rubisco以高浓度存在于植物细胞中，并且因此被认为是细胞内容物溢出的高度敏感标志物。在生理盐溶液的实验中，在超过32.9 kJ/kg的较高能量(热量)输入下，显示出Rubisco的释放增加。在使用软化水(VE水)的对比实验中，Rubisco的污染更早已经发生，大约从10 kJ/kg开始，因为除了均质器的剪切应力外，还发生了渗透作用。通过处理时间控制不同的热量(能量输入)。
处理后细胞复合物的显微分析反映了这些结果。图7显示了用Ultraturrax转子-定子在软化水中处理后的结果；图8显示了在生理条件(20mM Tris, 100 mM NaCl, pH=7)下用Ultraturrax转子-定子处理后的结果。图9显示了在生理条件下用剪切泵处理后的细胞复合物。随着处理时间(热量)的增加，可能由被破坏的细胞形成的颗粒数量增加。从大约30 kJ/kg开始显示出增加的细胞消化。作为比较，图10显示了用剪切泵在软化水中进行的实验。在这里，可比较的颗粒在大约20 kJ/kg就已经出现。
通过与图7-10比较，图11显示了通过超声进行的细胞消化。在1分钟后，细胞就已经失去了其完整性。
由此表明，一方面，每单位时间的能量输入(转子-定子的旋转强度；热功率)应该受到限制，另一方面，此处实验中的绝对能量输入(热量)由处理持续时间控制。该参数可以作为其本身来考虑，或者基于生物质(生物干质量，TBM)计来考虑。脱离尽可能多的吸附或质外体结合产物并在此过程中保持原生质体基本完整的温和方法的有用数据是最大3 kJ/kg每g/L干质量和最大1.5 kJ/kg/min每g/L干质量，或最大30 kJ/kg和最大1.5 kJ/kg/min。在这种低热功率下可能的处理时间为2分钟至150分钟-取决于旋转的强度，通常比迄今为止常用的短暂但强烈的处理时间更长。

Claims (15)

1.使表达材料从植物细胞的表面或质外体脱离的方法，其中所述植物细胞在液体介质中用转子-定子处理，其中通过转子旋转而引入的转子-定子的比热最大为3 kJ每kg所述液体介质和每g/L所述植物细胞干质量，并且引入到所述介质中的比热功率最大为1.5 kJ每kg所述液体介质每分钟和每g/L所述植物细胞干质量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达材料在所述植物细胞的质外体中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过转子旋转而引入的转子-定子的热量为至少1 kJ每kg所述液体介质，和/或所述转子-定子的比热为至少0.1 kJ每kg所述液体介质和每g/L所述植物细胞干质量。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，通过转子旋转而引入到所述介质中的热功率为至少0.2 kJ每kg所述液体介质和每分钟，和/或进入所述介质的比热功率为至少0.02 kJ每kg所述液体培养基每分钟和每g/L所述植物细胞干质量。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述表达材料含有蛋白质，和/或所述表达材料是分泌材料，优选通过细胞膜分泌的蛋白质。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，将所述转子-定子引入到具有介质的容器中。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述转子-定子具有内部空间，所述内部空间至少具有各一个入口和出口，所述液体介质通过所述入口和出口连续地输送通过所述内部空间。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述定子限定10 cm3至1 m3的体积，和/或处理的液体介质的量为至多50 kg，优选0.5 g至50 kg。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物细胞在所述液体介质中以0.2 g/L至60 g/L的浓度存在(植物细胞的质量作为干质量)。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物细胞是苔藓细胞，优选小立碗藓(P. patens)细胞。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述转子以最大15,000转每分钟，优选1,000至15,000转每分钟的转数运行。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述转子-定子是棒式均质器或剪切泵，和/或其中所述定子具有梳状结构。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，通过转子旋转引入的转子-定子的热量最大为30 kJ每kg所述液体介质并且引入到所述介质中的热功率最大为1.5 kJ每kg所述液体介质和每分钟 。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述介质具有5至8的pH和/或至少0.1 osmol/L的渗透压。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述植物细胞用所述转子-定子处理2分钟至150分钟。
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