CN114778823A - 人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，包括以下组分：第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。本发明将缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂组合使用，再配合连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体实现对试样中人去唾液酸糖蛋白受体的快速检测，同时确保测定结果的精度。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法。
背景技术
人去唾液酸糖蛋白受体(human asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是一种膜异源聚物，仅在肝细胞中表达。可溶性分泌形式sH2a不是通过在细胞表面脱落而产生的，而是通过其膜结合前体的细胞内切割而产生的，其由受体H2亚基的替代剪接形式编码。
ASGR2(asialoglycoprotein receptor 2)是异质低聚ASGPR的两个亚基之一，其在肝细胞上特异性表达。它也被称为H2，与另一个称为H1的亚基具有高同源性。ASGPR存在于肝细胞的质膜上，朝向正弦侧，并经历内吞循环。该受体是Ⅱ型膜蛋白，因此，ASGR2具有朝向细胞质的N端，一个跨膜区域，一个茎区和一个Ca2+依赖性CRD(碳水化合物识别结构域)。该亚基的分子量为～50kDa。
人去唾液酸糖蛋白受体H2亚基的H2a交替剪接变体与H2b变体的不同之处在于，膜跨旁边的外层域中存在额外的五肽EGHRG。当在细胞中没有H1亚基表达时，这种差异导致H2a在内质网中的保留和降解。相反，单表达的H2b的很大一部分被高尔基体处理并到达细胞表面。使用一种新的特异性抗H2a抗体，研究人员发现在HepG2细胞中，H2a被迅速切割成35-kDa片段，该片段包含整个外层域,其中大部分分泌到培养基中。分泌片段的裂解位点位于膜跨的腔端。没有膜结合的H2a离开ER，表明五肽是ER保留和膜形式降解的信号，但不阻碍裂解的可溶性形式的分泌。H2a不像H2b那样与H1l形成膜受体复合物。因此，H2a不是受体的亚基，而是蛋白质分泌形式的前体；信号肽酶可能是导致可溶性片段裂解的原因。因此，近膜序列作为信号锚序列(H2b)或作为切割的信号序列，调节Ⅱ型膜蛋白的跨膜结构域的功能，其产生分泌产物(H2a)。
在健康个体的血清中发现了一种称为sH2a的ASGR2亚基的替代剪接形式。这种形式的血清水平在肝纤维化中发生变化，并定义肝细胞功能的状态。因此，它具有作为肝功能和纤维化的非侵入性标志物的潜力。
我国肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生率居于所有肿瘤发生率的第4位，目前肝癌诊断主要依靠影像学检查、血清标志物、穿刺活检等手段。其中血清标志物主要以公认并进入临床应用的甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原等为代表，,随着蛋白质及分子生物学技术的发展，不断有新的标志物被发现并逐步应用于临床，如microRNA以及磷脂酰肌醇蛋白聚糖、N-糖标志物等，但是仍远远不能满足临床对肝癌早期诊断及疾病分层管理的需求。
目前常见的sH2a检测方法仅见ELISA，对判断肝纤维化的发生、发展、恢复，以及相关癌症筛查和复发判断有很好的参考价值。但上述方法试剂盒均为采用单克隆抗体的固相法，并需标记检测抗体，生产制备繁琐，与且不适用高通量全自动生化分析仪应用。
由于sH2a蛋白结构简单，与H1和H2b同源型强、结构近似，不易获得适用于免疫比浊类平台的有效抗体，故目前尚未发现应用于全自动生化分析仪的均相检测试剂盒。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂、试剂盒及定量方法，以至少解决上述相关技术中的不足。
本发明提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；
第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。
本发明的有益效果在于：将缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂组合使用，再配合连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体实现对试样中人去唾液酸糖蛋白受体的快速检测，同时确保测定结果的精度。
另外，根据本发明提供的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，还可以具有如下的技术特征：
所述缓冲液的浓度为10mmol/L～300mmol/L，且所述缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液中至少一种。
进一步的，所述抗干扰剂A包括表面活性剂、离液离子以及氨基酸；
其中，所述表面活性剂的浓度为0.01％～1.0％、且所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中至少一种；
所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、碘化钾中至少一种；
所述氨基酸为甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾、谷氨酸钠、谷氨酸中至少一种。
进一步的，所述分散剂为有机酸、糖类以及盐类中至少一种；
其中，所述有机酸的浓度为10mmol/L～200mmol/L，且所述有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及琥珀酸中至少一种；
所述糖类为蔗糖、山梨糖醇、甘露糖以及海藻糖中至少一种，所述蔗糖浓度为50g/L～300g/L，所述山梨糖醇的浓度为50mmol/L～300mmol/L，所述甘露糖的浓度为20mmol/L～150mmol/L，所述海藻糖的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
所述盐类为氯化钠、硫酸钠、磷酸盐中至少一种，所述氯化钠的浓度为50mmol/L～500mmol/L，所述硫酸钠的浓度为10mmol/L～100mmol/L，所述磷酸盐的浓度为20mmol/L～200mmol/L。
进一步的，所述促凝剂的浓度为0.1％～6.0％、且所述促凝剂为聚乙二醇6000，聚乙二醇20000中至少一种。
进一步的，所述抗人去唾液酸糖蛋白受体抗体被固定在不溶性载体上，所述不溶性载体包括乳胶粒子、磁性粒子、二氧化硅粒子。
进一步的，所述第一试剂还包括防腐剂、螯合剂以及稳定剂。
本发明的另一个目的在于提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的试剂盒，包括上述的测定试剂，所述试剂盒还包括含有已知浓度的sH2a浓度的标准试样。
进一步的，所述标准试样为含有缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、甘露糖醇、吐温、EDTA、防腐剂的水和/或血清混合溶液。
本发明的另一个目的在于提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，所述人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法应用于上述的测定试剂，所述人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法包括以下步骤：
(1)将试样与所述第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及分散暴露所述试样中的被测蛋白；
(2)将所述第一反应液与所述第二试剂混合反应，得到第二反应液；
(3)读取所述第二反应液在相应波长处的吸光度值，计算人去唾液酸糖蛋白受体的含量。
本发明中，利用缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂来排除高浓度乳糜、脂质的干扰，并分散暴露被测蛋白，保持sH2a抗原结构的稳定性，增强抗原抗体结合浊度的强度，进而使得测定结果更加准确。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例二中各浓度标准样本吸光度变化及标准曲线；
图2为本发明实施例三中试剂盒检测值与ELISA方法检测值的对比曲线图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。以下实施例中所描述的实验流程仅用于证明本发明的可行性，本发明的应用并不仅限于此。实施例中所提及的实验操作，如无特殊说明，均为常规实验方法；所提及的试剂耗材，如无特殊说明，均为常规试剂耗材。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例一
一种人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，包括以下步骤：
(1)将试样与含有缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂的第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及分散暴露所述试样中的被测蛋白；
(2)将所述第一反应液与含有连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体的第二试剂混合反应，得到第二反应液；
(3)读取所述第二反应液在600nm波长处的吸光度值，计算人去唾液酸糖蛋白受体的含量。
需要说明的是，上述定量方法所使用的仪器是本领域常规仪器，可以为日立7180全自动生化分析仪。
本实施例中的定量方法利用缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂来排除高浓度乳糜、脂质的干扰，并分散暴露被测蛋白，保持sH2a抗原结构的稳定性，增强抗原抗体结合浊度的强度，进而使得测定结果更加准确。
上述方法中采用的试剂为一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；
第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。
在本申请中，第一试剂是含有缓冲液、抗干扰剂A、分散剂、促凝剂的组合，其中，所述缓冲液选自Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液中的一种；
抗干扰剂A是含有表面活性剂、离液离子和氨基酸的组合，其中，表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中的一种；离液离子选自溴化钠、硫氰酸钠、碘化钾中的一种；氨基酸选自天门冬氨酸或谷氨酸；
分散剂选自有机酸、糖类、盐类，促凝剂为聚乙二醇。
通过第一试剂能够具有以下作用：(1)排除高浓度乳糜、脂质的干扰；(2)分散暴露被测蛋白，保持sH2a抗原结构的稳定性；(3)增强抗原抗体结合浊度的强度。
需要说明的是，作为本发明第一试剂中的缓冲液并无特别限制，其目的是提供检测溶液所需的pH范围，在本实施例中，所述缓冲液为Tris缓冲液，还可以采用Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液中一种或多种，缓冲液浓度为10mmol/L～300mmol/L，pH范围为5.0～10.0。
在本申请中，抗干扰剂A是含有表面活性剂、离液离子和氨基酸的组合，其中，在本实施例中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂：吐温-20、浓度为0.01％～1.0％，当然，在其他实施例中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中一种或多种，可选的非离子表面活性剂包括：吐温-20、吐温-80、Triton X-100、Triton X-405、NP-40、Brij-35；可选的阴离子表面活性剂包括：胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠；可选的两性离子表面活性剂包括：CHAPS、CHAPSO。
具体的，所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、碘化钾中至少一种，其作用是展开或解离抗原与血液蛋白的结合，而不破坏抗原特异性活性，其浓度为10mmol/L～300mmol/L。
在本实施例中，优选的，所述离液离子选用溴化钠。
进一步的，所述抗干扰剂A中的氨基酸有助于维持和稳定试样中sH2a抗原蛋白，可以是甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾、谷氨酸钠、谷氨酸中一种或多种的组合，选用甘氨酸的浓度范围为20mmol/L～150mmol/L；选用双甘氨肽的浓度范围为20mmol/L～150mmol/L；选用天门冬氨酸钾的浓度范围为50mmol/L～500mmol/L；选用谷氨酸钠的浓度范围为20mmol/L～800mmol/L。
在本实施例中，所述抗干扰剂A中的氨基酸选用甘氨酸，其浓度为50mmol/L～100mmol/L。
需要说明的是，作为本发明第一试剂中的分散剂为有机酸、糖类和盐类的组合，其有机酸选自柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸中的一种或多种。所述有机酸也可以选用其盐形式，如柠檬酸钠、酒石酸钾钠、苹果酸钠、琥珀酸钠。有机酸的浓度为10mmol/L～200mmol/L。
在本实施例中，有机酸选用柠檬酸，其浓度为20mmol/L～100mmol/L。
具体的，上述糖类有助于维持和稳定试样中sH2a抗原蛋白，可以是蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、海藻糖中一种或多种的组合，选用蔗糖的浓度范围为50g/L～300g/L；选用甘露糖的浓度范围为20mmol/L～150mmol/L；选用山梨糖醇的浓度范围为50mmol/L～300mmol/L；选用海藻糖的浓度范围为10mmol/L～100mmol/L。
在本实施例中，所述糖类选用蔗糖，浓度为100g/L～250g/L。
进一步的，上述盐类具有抗干扰和增强抗原抗体反应的作用，可以是氯化钠、硫酸钠、磷酸盐中一种或多种的组合，选用氯化钠的浓度范围为50mmol/L～500mmol/L；选用硫酸钠的浓度范围为10mmol/L～100mmol/L；选用磷酸盐的浓度范围为20mmol/L～200mmol/L。
在本实施例中，盐类选用氯化钠，浓度范围为100mmol/L～350mmol/L。
在本申请中，作为本发明第一试剂中的促凝剂，选自聚乙二醇6000、聚乙二醇20000，其浓度范围为0.1～6.0％。
在本实施例中，促凝剂选用聚乙二醇6000，浓度为0.2～2.0％。
另外，作为本申请中第一试剂的添加剂，防腐剂选用叠氮钠，在一些可选实施例中，该防腐剂还可以选用Proclin300、硫酸庆大霉素；螯合剂选用EDTA；稳定剂选用牛血清白蛋白，在一些可选实施例中，稳定剂还可以选用酪蛋白。
需要说明的是，本实施例的第一试剂中的化合物均为市售商品。
在本申请中，第二试剂是含有能够结合sH2a特征性结构域的多克隆抗体和单克隆抗体的组合，所述抗体经化学共价交联固定在乳胶微球表面，用于实现结合试样中sH2a抗原的工序；第二试剂中的多克隆抗体，无需区分捕获抗体和检测抗体，并无需对抗体进行荧光素、酶等的标记，即可在全自动生化分析仪上进行定量测定。
在本实施例中，作为本发明第二试剂中结合sH2a抗原的多克隆抗体为ASGR2抗体，单克隆抗体为抗sH2a特征性抗原结构域的抗体，所述sH2a特征性抗原结构域是指特异性结构域EGHRG五肽形成的蛋白结构区域。
作为抗体与不溶性载体的连接工艺，先经化学共价交联将其与牛血清白蛋白(BSA)结合，形成抗sH2a抗体-BSA联结物，然后再通过物理吸附或化学交联方式固定在不溶性载体上，从而实现抗体与所测sH2a抗原充分结合，增强测定浊度，使测定结果更加准确。经化学共价交联固定在乳胶微球表面，用于实现结合试样中sH2a抗原的工序，包括任何能够特异识别和结合sH2a的抗体或抗体片段，例如人源或动物源抗体、重组抗体、嵌合抗体。例如市售ThermoFisher公司兔多抗、鼠单抗，Abcam公司兔多抗、鼠单抗，义翘神舟生物科技公司的兔多抗、兔单抗，华美生物公司的兔多抗。
作为sH2a抗体的不溶性载体，包括各种乳胶微球、磁性颗粒、二氧化硅粒子。固定可通过化学共价交联或物理吸附工艺进行。优选的，通过化学共价交联固定，具有偶联效率高、灵敏度高、稳定性好的优点。
常用的偶联方法可采用以碳二亚胺(EDC)和/或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂。以乳胶微球为例：
(1)抗sH2a抗体-BSA连结工艺步骤：
(1.1)将所述抗sH2a抗体，浓度为5.0mg/mL的多克隆抗体，或单克隆抗体，或多克隆抗体与单克隆抗体的混合抗体，按照质量比1:3与BSA混匀于25mmol/L，pH6.20的MES缓冲液中；
(1.2)加入溶解于相同MES缓冲液中的EDC，室温搅拌作用30分钟，EDC终浓度为BSA浓度的50％；
(1.3)放置6℃备用。
在所述抗sH2a抗体-BSA连结工艺中，所述抗sH2a抗体的浓度范围大于等于1.0mg/mL，质量比为1:1～1:5，室温搅拌作用时间为10～120分钟，EDC终浓度为BSA浓度的20％～80％，放置温度为2～8℃。
(2)抗sH2a抗体-BSA联结物固定在乳胶微球上的工艺步骤：
(2.1)将羧基微球悬浮于30mmol/L，pH6.0的MES缓冲液中；
(2.2)按照EDC与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比5:1，向步骤(2.1)的溶液中加入EDC；按照NHS或sulfo-NHS与EDC的摩尔比为3:1，缓慢加入NHS或Sulfo-NHS，搅拌20分钟；
(2.3)离心，弃上清，加入50mmol/L、pH8.00硼酸缓冲液重悬浮，离心清洗2次；再加入50mmol/L、pH8.00硼酸缓冲液重悬浮；
(2.4)在步骤(2.3)溶液中，按终浓度500微克/毫升，缓慢加入所需固定的抗sH2a抗体-BSA联结物，边加入边搅拌；并持续搅拌2小时；
(2.5)离心，弃上清，加入稀释液重悬浮，如此反复离心清洗2次；再加入稀释液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.6％(W/V)；所述稀释液为100mmol/L的Tris-双甘氨肽缓冲液，含4.0％吐温-20，1.0％NaN3，pH8.00。
在所述抗sH2a抗体-BSA联结物固定在乳胶微球上的工艺中，步骤(2.1)中所述缓冲液的浓度为15～30mmol/L、pH为5.5～6.5；步骤(2.2)中EDC与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比为2～10:1，NHS或sulfo-NHS与EDC的摩尔比为3～5:1，搅拌时间为10～30分钟；步骤(2.3)中硼酸缓冲液重悬浮的浓度为30～100mmol/L，离心清洗1～3次后；步骤(2.4)中按终浓度10～1000微克/毫升，缓慢加入所需固定的抗sH2a抗体-BSA联结物，边加入边搅拌；并持续搅拌2～3小时；步骤(2.5)中反复离心清洗1～3次，所述乳胶微球溶液的终浓度为0.1％～0.8％(W/V)，所述稀释液为10～200mmol/L的Tris-双甘氨肽缓冲液，含0.1～10.0％吐温-20，1.0％NaN3，pH6.50～8.50。
作为第二试剂的稀释液，其化剂组分并无特别限制，只要能悬浮其中的乳胶微球，保持抗体稳定，各种配方均可。
在本申请中，所述的乳胶微球的直径范围为100～350nm，本实施例中所述的乳胶微球，为直径大小150nm的市售产品。
本发明另一目的在于提出一种人去唾液酸糖蛋白受体的试剂盒，包括上述的测定试剂，所述试剂盒还包括含有已知浓度的sH2a浓度的标准试样。
其中，所述标准式样中含有已知浓度的sH2a，其中sH2a可来源于患者的血清，或经基因工程学表达发酵获得。标准样本是含有1～6个不同浓度的sH2a标准样本，本实施例中，该标准样本是含有1～5个不同浓度的sH2a标准样本。sH2a标准样本的形态是缓冲液溶液或冻干制品，本实施例中为冻干制品，使用前用纯水复溶。所述缓冲液溶液是含有但不局限于：磷酸氢钠、牛血清白蛋白、吐温-20、氯化钠、蔗糖、甘露糖醇、EDTA、聚乙二醇6000，pH6.00～8.00的混合水和/或牛血清溶液。
所述标准试样的缓冲液溶液，是含有如下组分及浓度的水和/或牛血清溶液：磷酸氢钠浓度为20mmol/L～300mmol/L，本实施例中为150mmol/L；牛血清白蛋白浓度为0.1％～6.0％，本实施例中为3.0％；氯化钠浓度为50mmol/L～500mmol/L，本实施例中为150mmol/L；蔗糖浓度为20g/L～500g/L，本实施例中为200g/L；甘露糖醇浓度为20mmol/L～150mmol/L，本实施例中为50mmol/L；吐温-20浓度为0.1％～1.0％，本实施例中为0.5％；EDTA浓度为1.0mmol/L～15mmol/L，本实施例中为5mmol/L；聚乙二醇6000浓度为2g/L～60g/L，本实施例中为50g/L。
所述标准试样的缓冲液溶液，还含有防护剂，选自叠氮钠、庆大霉素、咪唑烷基脲、2-氯乙酰胺，在本实施例中，选用叠氮钠。
所述标准试样可以制成液体溶液或冻干品。
所述试剂盒检测试样中人去唾液酸糖蛋白受体的含量是在全自动生化分析仪上实施。
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明不受以下实施例限定。
实施例二
1.标准样本
采用如下缓冲液组分配制标准样本作为定标液，将相同3份的其中一份密闭放置2-8℃作为对照，其余两份分别开瓶放置于2～10℃一份和密闭放置37℃一份，结果如表1所示，定标液的稳定性满足日常检测要求。
定标液组分：
50mmol/L、pH7.4双甘氨肽缓冲液；
50.0g/L牛血清白蛋白；
35mmol/L谷氨酸；
5.0mmol/L EDTA.2Na；
0.9％氯化钠；
200g/L蔗糖；
10.0g/L聚乙二醇6000；
1.0L纯水；
0.1％叠氮钠；
在上述缓冲液中加入sH2a纯品。
表1
| 2-8℃密闭 | 2-10℃开瓶1天 | 37℃密闭7天 | 37℃密闭15天 |
| 57ng/mL | 55ng/mL | 60ng/mL | 62ng/mL |
采用上述定标缓冲液配5个浓度的sH2a标准试样：15.6ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL，以纯水作为0.0ng/mL。
2.试剂
试剂1作为第一试剂(R1)
50mmol/L、pH6.20MES缓冲液；
30mmol/L柠檬酸；
100mmol/L溴化钠；
50mmol/L天门冬氨酸；
11.0g/L PEG 20000；
0.2％吐温-20；
0.05％BSA；
0.05％叠氮钠。
试剂2作为第二试剂(R2)
(1)抗sH2a抗体-BSA连结工艺步骤：
(1.1)将抗sH2a多克隆抗体和单克隆抗体1:1混合，抗体浓度1.0mg/mL按照质量比1:2与BSA混匀于25mmol/L、pH6.20的MES缓冲液中；
(1.2)加入溶解于相同MES缓冲液中的EDC，室温搅拌作用20分钟，EDC终浓度为BSA浓度的50％；
(1.3)放置2～8℃备用。
(2)抗sH2a抗体-BSA联结物固定在乳胶微球上的工艺步骤：
(2.1)将280nm粒径，表面羧基含量为150ueq/g乳胶微球悬浮于20mmol/L、pH6.10MES缓冲液中；
(2.2)按照EDC与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比9:1，向步骤(2.1)的溶液中加入EDC；按照NHS或sulfo-NHS与EDC的摩尔比为3:1，缓慢加入NHS或Sulfo-NHS，搅拌20分钟；
(2.3)离心，弃上清，加入50mmol/L、pH8.00硼酸缓冲液重悬浮，离心清洗3次；再加入50mmol/L、pH8.00硼酸缓冲液重悬浮；
(2.4)在步骤(2.3)溶液中，按终浓度100微克/毫升，缓慢加入所需固定的sH2a-BSA联结物，边加入边搅拌；并持续搅拌2小时；
(2.5)离心，弃上清，加入稀释液重悬浮，如此反复离心清洗3次；再加入稀释液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.15％(W/V)；所述稀释液为50mmol/L Tris-双甘氨肽缓冲液，含0.5％吐温-20，0.1％NaN3，pH7.80。
3.测定参数
测定设备日立7180生化分析仪；
分析法两点终点法，测定波长600nm(不设副波长)；试剂样品比R1:S:R2＝200:10:50。
结果：定标曲线如图1。
实施例三
1.试剂
试剂1作为第一试剂(R1)
70mmol/L、pH7.50 Tris缓冲液；
30mmol/L丁二酸酸；
100mmol/L溴化钠；
35mmol/L谷氨酸钠；
15.0g/L PEG 20000；
0.3％吐温-20；
0.02％BSA；
0.03％叠氮钠。
试剂2作为第二试剂(R2)
(1)抗sH2a抗体-BSA连结工艺步骤：
(1.1)将抗sH2a多克隆抗体，抗体浓度6.0mg/mL，按照质量比2:3与BSA混匀于20mmol/L、pH6.10的MES缓冲液中；
(1.2)加入溶解于相同MES缓冲液中的EDC，室温搅拌作用20分钟，EDC终浓度为BSA浓度的50％；
(1.3)将抗sH2a单克隆抗体，抗体浓度1.0mg/mL，按照质量比2:3与BSA混匀于20mmol/L、pH6.10的MES缓冲液中；
(1.4)加入溶解于相同MES缓冲液中的EDC，室温搅拌作用20分钟，EDC终浓度为BSA浓度的50％；
(1.5)将上述多抗和单抗sH2a-BSA联结物放置2～8℃备用。
(2)将多抗sH2a抗体-BSA联结物和单抗sH2a抗体-BSA联结物，按下述步骤，分别固定在乳胶微球上：
(2.1)将300nm粒径，表面羧基含量为89ueq/g乳胶微球悬浮于25mmol/L、pH6.00MES缓冲液中；
(2.2)按照EDC与乳胶微球表面羧基含量的摩尔比5:1，向步骤(2.1)的溶液中加入EDC；按照NHS或sulfo-NHS与EDC的摩尔比为4:1，缓慢加入NHS或Sulfo-NHS，搅拌15分钟；
(2.3)离心，弃上清，加入80mmol/L、pH8.00硼酸缓冲液重悬浮，离心清洗3次；再加入80mM pH8.00硼酸缓冲液重悬浮；
(2.4)在步骤(2.3)溶液中，按终浓度200微克/毫升，缓慢加入所需固定的抗sH2a抗体-BSA联结物，边加入边搅拌；并持续搅拌2小时；
(2.5)离心，弃上清，加入稀释液重悬浮，如此反复离心清洗3次；再加入稀释液重悬浮，使所述乳胶微球溶液的终浓度为0.20％(W/V)；所述稀释液为50mmol/L Tris-双甘氨肽缓冲液，含0.6％吐温-20，0.2％NaN3，pH7.50。
(2.6)将多抗sH2a抗体-BSA联结物固化微球和单抗sH2a抗体-BSA联结物固化微球按1:1比例混合备用。
2.测定参数
测定设备日立7180生化分析仪；
分析法两点终点法，测定波长546nm(不设副波长)；试剂样品比R1:S:R2＝200:12:50。
3.试样
已经ELISA法确值的临床血清标本19份；
结果：如图2所示，本发明试剂盒与比对ELISA法有显著相关性。
实施例四
1.试剂
采用实施例二中的第一试剂(R1)，与实施例三中的第二试剂(R2)
2.试样
15份正常人血浆标本和13份肝纤维化患者血浆标本；
3.测定参数同实施例三
结果：如下表2显示，本试剂盒能显著区分临床血浆标本中CHI3L1的水平。
表2
实施例五
试剂的稳定性
将实施例2和实施例3的R1、R2试剂各取3份，其中一份密闭放置2～8℃作为对照，其余两份分别开瓶放置于2～10℃一份和密闭放置37℃一份，结果如表3所示，试剂的稳定性满足日常检测要求。
表3
综上，根据本发明提供的试剂盒，第一试剂由缓冲液、抗干扰剂A、分散剂、促凝剂组成，通过第一试剂能够排除高浓度乳糜、脂质的干扰，分散暴露被测蛋白，保持sH2a抗原结构的稳定性，以及增强抗原抗体结合浊度的强度；此外，第二试剂由连接不溶性载体的多克隆抗体、和抗sH2a特异性EGHRG五肽相关结构域的单克隆抗体组成，能够与试样中sH2a充分结合，从而用于实现测定浊度的工序，使测定结果更加准确，且该试剂盒能够用于筛查大量人群的高通量应用，本发明有助于肝纤维化疾病的确定和鉴别。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，包括以下组分：
第一试剂，包括缓冲液、抗干扰剂A、分散剂以及促凝剂；
第二试剂，包括连接不溶性载体的多克隆抗体、抗sH2a特异性结构域EGHRG五肽的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述缓冲液的浓度为10mmol/L～300mmol/L，且所述缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、双甘氨肽缓冲液中至少一种。
3.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述抗干扰剂A包括表面活性剂、离液离子以及氨基酸；
其中，所述表面活性剂的浓度为0.01％～1.0％、且所述表面活性剂为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中至少一种；
所述离液离子为溴化钠、硫氰酸钠、碘化钾中至少一种；
所述氨基酸为甘氨酸、双甘氨肽、天门冬氨酸钾、谷氨酸钠、谷氨酸中至少一种。
4.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述分散剂为有机酸、糖类以及盐类中至少一种；
其中，所述有机酸的浓度为10mmol/L～200mmol/L，且所述有机酸为柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及琥珀酸中至少一种；
所述糖类为蔗糖、山梨糖醇、甘露糖以及海藻糖中至少一种，所述蔗糖浓度为50g/L～300g/L，所述山梨糖醇的浓度为50mmol/L～300mmol/L，所述甘露糖的浓度为20mmol/L～150mmol/L，所述海藻糖的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
所述盐类为氯化钠、硫酸钠、磷酸盐中至少一种，所述氯化钠的浓度为50mmol/L～500mmol/L，所述硫酸钠的浓度为10mmol/L～100mmol/L，所述磷酸盐的浓度为20mmol/L～200mmol/L。
5.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述促凝剂的浓度为0.1％～6.0％、且所述促凝剂为聚乙二醇6000，聚乙二醇20000中至少一种。
6.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述抗人去唾液酸糖蛋白受体抗体被固定在不溶性载体上，所述不溶性载体包括乳胶粒子、磁性粒子、二氧化硅粒子。
7.根据权利要求1所述的人去唾液酸糖蛋白受体的测定试剂，其特征在于，所述第一试剂还包括防腐剂、螯合剂以及稳定剂。
8.一种人去唾液酸糖蛋白受体的试剂盒，包括如权利要求1至7任一项所述的测定试剂，其特征在于，所述试剂盒还包括含有已知浓度的sH2a浓度的标准试样。
9.根据权利要求8所述的人去唾液酸糖蛋白受体的试剂盒，其特征在于，所述标准试样为含有缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、甘露糖醇、吐温、EDTA、防腐剂的水和/或血清混合溶液。
10.一种人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，所述人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法应用于权利要求1至7任一项所述的测定试剂，其特征在于，所述人去唾液酸糖蛋白受体的定量方法包括以下步骤：
(1)将试样与所述第一试剂混合反应，得到第一反应液，所述第一试剂用于排除所述试样中高浓度乳糜和脂质的干扰，以及分散暴露所述试样中的被测蛋白；
(2)将所述第一反应液与所述第二试剂混合反应，得到第二反应液；
(3)读取所述第二反应液在相应波长处的吸光度值，计算人去唾液酸糖蛋白受体的含量。
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