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CN114778248A - 一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法 - Google Patents

一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法 Download PDF

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CN114778248A
CN114778248A CN202210453210.0A CN202210453210A CN114778248A CN 114778248 A CN114778248 A CN 114778248A CN 202210453210 A CN202210453210 A CN 202210453210A CN 114778248 A CN114778248 A CN 114778248A
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曹际娟
胡冰
徐大军
石雨婷
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Dalian Minzu University
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China Association For Standardization
Dalian Minzu University
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Abstract

本发明属于食品检测领域，公开了一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，标准样品采用榛果仁作为原料，采用超微粉碎机低温研磨，得到榛果超微粉；得到的榛果超微粉标准样品最大限度地保持了榛果成分特性2S球蛋白基因核酸和过敏原蛋白Cora9特性量值，并且制备过程不添加任何辅料和防腐剂，纯绿色生产，高度纯化，能同时满足过敏原特性2S球蛋白基因检测和过敏蛋白Cora9检测，均匀性和稳定性符合国家标准样品的要求，填补了国际该类标准样品的空白，提高食品过敏原安全检测实验室的检测水平，可以用于食品致敏原榛果检测方法验证、检测试剂盒评价、实验室检测过程质量控制、实验室间能力验证和比对、人员检测能力考核。

Description

一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制 备方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，本发明涉及一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，具体为一种食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a9特性量值的榛果超微粉标准样品的制备方法。
背景技术
食品过敏原领域限制的过敏原成分榛果，其富含蛋白质、油脂(大多为不饱和脂肪酸)、胡萝卜素、维生素、矿物质等，有“坚果之王”的美称。榛果既可直接食用，也可作为食品配料用于制作各种糕点、糖果等。榛果虽营养丰富，但同时也是最常见的食品过敏原之一。过敏人群食用后，会出现胸闷、咽喉痛，呼吸困难以及恶心、胃痉挛、呕吐腹泻等症状，严重者会导致死亡。全世界约有3％-5％的成年人和8％的儿童患有食物过敏症，其中由坚果类食物引发的过敏占已知食物过敏总数的25％左右。为了避免榛果过敏患者因不知情误食而引起过敏反应，我国、美国、欧盟等均出台了相关法规，强制要求含有榛果成分的食品包装上必须进行明确标示。目前在世界范围内，过敏性疾病的发生率仍呈现不断上升的趋势，开展过敏原检测并加贴标识，以帮助消费者更好地避免食用过敏原是最有效的防控途径。食物过敏至今尚无特效疗法，预防食物过敏的重要途径是严防食用过敏原，而食品过敏原检测分析是最关键的环节。
榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a9是食品过敏原榛果成分最常见的检测项目。榛果成分特性2S球蛋白基因检测是针对过敏原核酸DNA的分子检测，食品高温加热处理会导致DNA降解，但过敏蛋白依然存在；而榛果过敏蛋白检测是针对过敏原蛋白Cora 9的免疫检测，过敏蛋白对热稳定但却易受外界贮存加工方式影响而失去抗原性，且易受到防腐剂、食品基质等复杂成分的干扰。两种完全不同的检测方式是对榛果过敏原检测有效性的相互补充，这使得在制备标准样品时需要考虑的制备方法必须同时满足上述两种检测方法的特性，即2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的稳定性要求。目前国内外尚没有过敏原榛果粉标准样品，由于榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏原蛋白质容易在加工过程中发生变性、聚集等现象，导致其线性表位以及构象表位发生改变，给榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的检测带来困难，更容易造成检测误差，出现假阳性以及假阴性结果，以上原因使得制备难度很大导致国内外目前还缺乏用于检测量值保障的富含过敏原榛果成分特定2S球蛋白基因和榛果过敏蛋白的榛果超微粉标准样品，对我国食品中榛果过敏原成分的检测带来了不便。
现有技术中存在多种榛子粉产品及相应的制备工艺，比如有专利公开了榛子粉的制取方法，包括以下步骤：取脱壳榛子果仁，用榨油机低温冷榨榛子果仁，分离出榛子油，得到粕饼，把粕饼粉碎成粒径是40～60目的粕饼粉，用二氧化碳超临界萃取的方法萃取粕饼粉，分离出萃取榛子油得到榛子粉。然而，该方法采用了二氧化碳超临界萃取脱脂处理，破坏和降解了榛果成分的特性2S球蛋白基因核酸含量，并会对过敏原蛋白抗原性测定产生干扰而降低了检测添加回收率。再如有专利公开了一种坚果粉的加工方法，包括以下步骤：选料—漂洗—机切—机选—色选—冷冻粉碎—高压灭菌—干燥—包装。其中高压灭菌是将冷冻粉碎后的坚果粉放入高压装置中进行高压灭菌，包装是将干燥后的坚果粉经检验合格后进行分装、密封。上述步骤的高压灭菌，在可以破坏微生物的菌体蛋白中的非共价键(如氢键、二硫键和离子键等)的同时，也使过敏蛋白质的高级结构被破坏，从而导致蛋白质的凝固及酶的失活，进而影响过敏蛋白特性量值的测定及添加回收率；此外，超高压在可造成菌体细胞膜破裂，使菌体内的化学组分产生外流等多种细胞损伤的同时，也会破坏坚果成分特性2S球蛋白基因核酸(DNA等遗传物质)，促使极大地破坏和降低榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9的特性量值；坚果粉分装未采用真空密封包装，易造成不饱合脂肪酸容易氧化变质，不利于长期贮存，无法保障特性量值2年以上的长期稳定性。又如有专利公开了一种榛子营养粉及其制备方法，具体包括榛仁经水磨碎、过筛，与人参汁搅拌混合、胶体磨粉碎、过筛、真空浓缩、140-170℃喷雾干燥等工序。然而，该方法经高温喷雾干燥，极大地破坏了榛果成分特性2S球蛋白基因，因而会影响DNA的检测，并添加混合的人参胶体基质会干扰过敏原特性过敏蛋白的免疫检测。再如公开发表的文章榛子粉制备工艺的研究，是以榛子压榨后的饼为基料，添加植脂末、白砂糖、麦芽糊精、乙基麦芽酚和羧甲基纤维素钠等制成榛子粉。然而，该方法添加复杂的基质成分会严重干扰过敏原DNA的分子检测和过敏蛋白的免疫检测。此外，更为重要的是，上述产品目标均不是提供用于过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值检测用标准样品，特性量值的均匀性和稳定性不符合国家标准样品的要求，因此，还需要开发用于过敏原成分特性量值检测用的榛果超微粉标准样品制备工艺。
发明内容
标准样品可用于食品安全检测实验室对测试方法验证、检测试剂盒评价以及检测过程中的质量控制，对于确保实验室检测结果的准确性和有效性具有重要意义；同时，标准样品的出现，将为考核评价食品过敏原检测实验室和技术人员的检测能力、结果比对提供了可靠的支持，是考核监控实验室能力方式的有效补充。
开展制备一种用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值保障的榛果超微粉标准样品的研究，将为食品过敏原检测实验室进行测试方法验证、检测试剂盒评价、检测过程中的质量控制等全面考核实验室的水平提供支撑，为提高我国食品过敏原检测能力，保障人民健康，维护我国食品行业的良好国际声誉具有十分重要意义。
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，所述食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品，该方法包括以下步骤：
(1)确定需要制备的食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品的重量，同时需要考虑制备过程中的损耗量为原料的10-20wt％；
(2)低温研磨：将干燥后榛果仁采用超微粉碎机粉碎，得到质量占比为98％以上的榛果超微粉；不同研磨温度影响到标准样品中过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值；
(3)冷冻真空干燥：将低温研磨后榛果超微粉进行冷冻真空干燥；不同含水量的榛果超微粉标准样品在贮存期的细菌总数具有一定的差异，这影响到标准样品特性量值的长期稳定性；
(4)筛分处理：将超微粉碎好的榛果超微粉过灭菌金属筛，得到颗粒的粒径符合检测要求的榛果超微粉；根据被检测食品基质的添加回收率质量控制需要，确定需要粉碎的榛果超微粉标准样品的颗粒粒径，同时需要考虑榛果超微粉在GB/T 38163-2019常见过敏蛋白的测定，液相色谱-串联质谱法标准指定条件下的食品基质添加回收率，不同颗粒粒径的榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值检测的添加回收率具有一定的差异；
(5)干粉搅拌混匀：过筛后的榛果超微粉装于无菌包装袋中置于干粉混匀器上摇晃混匀，将样品进一步混合均匀得到均匀性、稳定性且不确定度适中，含食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品；
(6)真空分装及储存：将榛果超微粉标准样品分装于棕色玻璃样品瓶，采用冷冻真空干燥机进行真空封盖，然后采用三级密封装置封存后置于环境中长期储存。
采用《SN/T 1961.8-2013出口食品过敏原成分检测第8部分实时荧光PCR方法标准》检测榛果成分特性2S球蛋白基因，采用《GB/T 38163-2019常见过敏蛋白的测定液相色谱-串联质谱方法标准》检测榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值，进行榛果成分的均匀性检验、稳定性检验和添加食品基质回收率评估。最后制备出一批均匀、稳定的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品。标准样品中含有的榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的均匀性和稳定性符合国家标准样品的相关要求。
进一步的，步骤(2)中所述低温研磨的温度为低于0℃，优选为-80～-20℃。
进一步的，步骤(2)中所述粉碎时间为5～10min。
进一步的，步骤(3)中所述真空干燥后得到含水量≤5％的榛果超微粉。
进一步的，步骤(4)中所述灭菌金属筛的直径为100um。
进一步的，步骤(5)中干粉混匀器摇晃混匀的时间为1天。
优选的，步骤(6)中进行真空封盖的盖子为硅胶盖。
优选的，步骤(6)中所述三级密封装置由硅胶盖、铝箔盖、塑胶盖组成。
进一步的，步骤(6)中所述长期储存的条件为环境温度为0-4℃。
本发明的关键技术点在于：
(1)工艺研究：榛果仁低温研磨工艺、冷冻真空干燥和超微粉颗粒的粒径及真空包装对过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值、添加回收率、均匀性和长期稳定性避免特性量值变化非常重要。榛果粉碎研磨温度过高会致使过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和榛果过敏蛋白Cor a 9受降解破坏而含量降低，榛果超微粉含水量过高会致使标准样品贮存期间细菌滋生生长而影响特性量值的长期稳定性，榛果超微粉颗粒的粒径过大会影响不同食品基质检测的添加回收率，所以需要考虑低温冷冻时间及榛果超微粉含水量、研磨温度、颗粒粒径、低温真空包装等工艺。
(2)样品的均匀性研究：研制的标准样品的特征量是分别基于实时荧光PCR检测榛果成分特性2S球蛋白基因、基于液相色谱-串联质谱法检测榛果过敏蛋白Cor a 9，特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9量值受制备试验的温度、样品颗粒粒径等诸多因素影响。因此需要严控样品的低温冷冻干燥温度、样品颗粒粒径，保证标准样品特性量值的均匀性。
(3)样品的稳定性研究：研制的标准样品的特征量值是分别基于实时荧光PCR检测榛果成分特性2S球蛋白基因、基于液相色谱-串联质谱法检测榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值，长期贮存条件下的特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值受含水量、不饱和脂肪酸易氧化等因素的影响。因此需要严控样品的低温冷冻干燥温度、含水量及低温真空包装，保证样品在一定的时间周期内榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值不随着时间的变化而产生变化。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明得到的食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品均匀性、稳定性且不确定度适中，在一定的时间内榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9量值不随着时间的变化而产生变化，样品的均匀性和稳定性符合国家标准样品的要求，填补了我国目前没有该类标准样品的空白，提高食品过敏原安全检测实验室的检测水平，可以用于食品致敏原榛果检测方法验证、检测试剂盒评价、实验室检测过程质量控制、实验室间能力验证和比对、人员检测能力考核。
具体实施方式
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
一、样品的制备
本实例每批次制备2.5kg，即500瓶，5g/瓶的食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品，首先需要考虑样品在研磨过程中的耗损率、低温冷冻干燥脱水，所以需要制备的样品数量约为3.2kg。
具体制备步骤如下：
(1)超低温冷冻研磨：将经过-80℃超低温冷冻48h后的榛果仁，采用超微粉碎机粉碎2～3min，得到榛果粉样品；未经超低温冷冻处理则会影响到标准样品中检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9的特性量值；
(2)真空冷冻干燥脱水处理：将榛果超微粉进行真空冷冻干燥脱水处理，即：-80℃预冷冻2h，然后0.1mbar在-45～-55℃冷冻真空冷冻10h，最后-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率≥1.0℃/min，得到含水量≤5％的冷冻干燥榛果超微粉；不同含水量的榛果超微粉标准样品在贮存期的细菌总数具有一定的差异，这影响到标准样品特性量值的长期稳定性；
(3)筛分处理：将超微粉碎好的榛果超微粉标准样品过100um的灭菌金属筛，得到颗粒的粒径小于100um的榛果超微粉标准样品；根据被检测食品基质的添加回收率质量控制需要，确定需要粉碎的榛果超微粉标准样品的颗粒的粒径，同时需要考虑榛果超微粉在《GB/T 38163-2019常见过敏蛋白的测定液相色谱-串联质谱法标准》指定的条件下的回收率，不同颗粒粒径的榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值检测添加回收率具有一定的差异；
(4)干粉搅拌混匀：过筛后的榛果超微粉标准样品放于无菌包装袋中置于干粉混匀器上摇晃混匀1天，将标准样品进一步混合均匀得到均匀性、稳定性且不确定度适中食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品；
(5)真空分装及存储：将榛果超微粉标准样品分装于棕色玻璃样品瓶，采用冷冻真空干燥机在0.05-～0.2mbar真空条件下封硅胶盖，之后采用三级密封装置，即硅胶盖、铝箔盖、塑胶盖封存，样品存放的环境温度保持在0-4℃条件以下长期储存。
对比例1
与实施例1相比，不同点在于研磨温度不同，本对比例采用常温研磨的方式，其他操作步骤同实施例1。
实验证明经低于0℃超低温冷冻预处理48h后的榛果仁，使榛果的硬度和脆性增加，研磨时，通过物理的外力将其粉碎，能减少标准样品中榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的降解，使得榛果仁容易粉碎成细小的颗粒而不凝结，促使标准样品中榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9的特性量值更高。相比之下，常温研磨则会影响到标准样品中检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9的特性量值。
对比例2
与实施例1相比，不同点在于干燥处理方式及含水量不同。本对比例未经真空冷冻干燥脱水处理，制备的榛果超微粉样品含水量约15％，其他操作步骤同实施例1。
实验证明经低温干燥真空脱水处理，是一个水分冻结膨胀产生榛果组织爆裂、冰的升华致使表面水分蒸发的物理过程，不能破坏和降解标准样品中榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9，使得榛果仁容易粉碎成细小的颗粒而不凝结。经低温真空干燥处理后含水量≤5％的榛果超微粉标准样品，促使标准样品长期稳定即有效期更长。相比之下，未经真空冷冻干燥脱水处理的榛果超微粉样品，含水量约15％，长期稳定性监测特性量值会发生明显的趋势性变化，即样品不稳定。
对比例3
与实施例1相比，不同点在于榛果超微粉样品颗粒的粒径不同。本对比例未经筛分处理，其他操作步骤同实施例1。
实验证明，由于榛果超微粉标准样品的特性量值，即榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9分析过程，需先充分提取核酸DNA或过敏蛋白，然后再测试量值，检测过程复杂，样品颗粒大小不一，则影响特性量值。经过筛分后粒径小于100um的榛果超微粉标准样品，会使内部结构物质充分释放，更有利于2S球蛋白基因DNA和过敏蛋白的均匀分散，促使检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白和榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值具有更好的均匀性和更高的量值。相比之下，未经筛分处理的榛果粉样品则会影响到榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值检测添加回收率。
对比例4
与实施例1相比，不同点在于榛果超微粉标准样品的真空封装不同。本对比例未经真空密封包装，其他操作步骤同实施例1。
由于榛果中油脂含量较高，油脂中不饱和脂肪酸占90％以上，不饱和脂肪酸容易氧化变质，所以通常情况下榛果粉的保质期短。经过低温真空干燥机进行真空处理后自动封盖(硅胶盖)，可以有效隔离空气，促使酶失活而停止酶的作用，避免氧化。采用三级密封装置(硅胶盖、铝箔盖、塑胶盖)封存的榛果超微粉标准样品，具有更好的特性量值稳定性，可保障过敏原榛果成分特性量值在2年内的长期稳定性。相比之下，未经真空密封而包装的榛果粉样品则影响到长期稳定性和运输条件下的稳定性。
对比例5
参考CN101336735A，包括以下步骤：取脱壳榛子果仁，用榨油机低温冷榨榛子果仁，分离出榛子油，得到粕饼，把粕饼粉碎成粒径是40～60目的粕饼粉，用二氧化碳超临界萃取的方法萃取粕饼粉，分离出萃取榛子油得到榛子粉，萃取压力是24～26MPa，萃取温度是50～60℃，萃取时间是2～3h，二氧化碳流量是110～130L/h。该对比例先是用低温冷榨的方法分离出榛子果仁内的部分榛子油，然后用二氧化碳超临界萃取的方法分离出粕饼中榛子油，榛子粉可以作为原料或配料加工出多种风味独特的食品。上述冷榨分离榛子油、萃取粕饼粉的步骤，会极大地破坏榛果成分过敏蛋白质的高级结构和榛果成分特性2S球蛋白基因，致使降低榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9的特性量值，不适用于制备以提供准确的特性量值为目标的榛果粉标准样品。
对比例6
参考CN104886663A，包括以下步骤：选料—漂洗—机切—机选—色选—冷冻粉碎—高压灭菌—干燥—包装。其中，冷冻粉碎是将色选后的坚果放入冷冻粉碎装置中进行冷冻粉碎，制冷剂采用液氮，控制冷冻温度-100℃，将坚果粉碎成坚果粉；高压灭菌是将冷冻粉碎后的坚果粉放入高压装置中进行高压灭菌，保持高压装置中的温度为20～40℃，保压时间为5～15min，压力为300～500MPa；干燥是收集高压灭菌后的坚果粉，并放入真空冷冻干燥器内，控制温度为-80℃，真空度为133×10－3mBar，干燥时间2～4h，原料中的水分含量≤7.0％；包装是将干燥后的坚果粉经检验合格后进行分装、密封。上述步骤制冷剂采用液氮会增大制备成本；高压灭菌，在可以破坏微生物的菌体蛋白中的非共价键的同时，如氢键、二硫键和离子键等，也使过敏蛋白质的高级结构被破坏，从而导致蛋白质的凝固及酶的失活，进而影响过敏蛋白特性量值；此外，超高压在可造成菌体细胞膜破裂，使菌体内的化学组分产生外流等多种细胞损伤的同时，也会破坏坚果成分DNA等遗传物质的特性量值，促使极大地破坏和降低榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9的特性量值；坚果粉分装未采用真空密封包装，易造成不饱合脂肪酸容易氧化变质，不利于长期贮存，无法保障榛果成分特性量值在2年内的长期稳定性；更重要的是，未进行筛分处理，无法保证样品颗粒粒径的均匀性符合国家标准样品要求，因此，不适用于制备以提供准确的特性量值为目标的榛果粉标准样品。
对比例7
参考CN1706287A，涉及一种榛子营养粉极其制备方法，目的是提供一种药食同源的榛子固体饮料，其是榛仁浆汁或和人参汁喷雾干燥的产物，包括以下步骤：榛仁兑2-12倍的水磨碎、过筛，50-55℃真空浓缩至固形物含量50-60％，进风温度140-170℃喷雾干燥，冷却后过筛。该对比例的140-170℃喷雾干燥过程，会极大地破坏榛果成分特性2S球蛋白基因及过敏蛋白的特性量值，不适用于制备以提供准确的榛果特性量值为目标的榛果超微粉标准样品。
实施例2
将本发明实施例1制备得到的榛果超微粉标准样品，以对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，通过实时荧光PCR方法测定榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值和液相色谱-串联质谱法测定榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值，来系统地评价其符合国家标准样品对均匀性性能、稳定性性能要求，以及在食品基质中特性量值的添加回收率。
一、标准样品均匀性检验
按照GB/T 15000.3-2008《国家标准样品定值的一般原则和统计方法》中随机顺序重复测量方法取样和进行均匀性检验。从分装成最小包装的样品中随机抽取15支进行均匀性检验，每支重复2次，采用SN/T 1961.6-2013中实时荧光PCR方法检测榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值，以测定榛果成分特性2S球蛋白基因为代表，用单因素方差分析法(F检验)来评价标准样品的均匀性。当F比值＜临界值F0.05(14，15)，单元间方差与单元内方差无显著性差异，表明标准样品是足够均匀；F比值>临界值F0.05(14，15)，单元间方差与单元内方差有显著性差异，表明标准样品是不均匀。
将本发明实施例1制备得到的榛果超微粉标准样品，对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，进行均匀性检验的统计量分析结果见表1。以榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值为代表进行均匀性测定。经F检验，本发明制备得到的榛果超微粉标准样品F比值为1.29，小于F临界值F0.05(14,15)＝2.42，样品间均匀性标准不确定度为0.0159％，表明在95％置信概率下，瓶间和瓶内不存在明显差异，标准样品的均匀性良好，能满足标准样品的预期用途。然而，对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，单元间方差与单元内方差均有显著性差异，表明标准样品是不均匀，不能满足国家标准样品对均匀性的性能评价要求。
表1榛果粉样品中榛果成分特性2S球蛋白基因均匀性方差分析结果
Figure BDA0003619667810000111
二、标准样品稳定性检验
1、长期稳定性检验
按照GB/T 15000.3-2008《国家标准样品定值的一般原则和统计方法》中随机顺序重复测量方法取样，以测定榛果成分2S球蛋白特性基因为代表，进行长期保存稳定性考察。采用SN/T 1961.6-2013中实时荧光PCR方法检测榛果成分2S球蛋白特性基因。针对长期稳定性检验，按照时间间隔前密后疏的抽样原则，本发明所选取的包装好的样品在0～4℃低温条件下历经了长时间保存，第一年每2个月、第二年每3个月，随机选取样品进行长期稳定性实验，每次抽取3支标准样品，每支样品重复测试2次。根据GB/T 15000.3推荐的标准样品稳定性检验方法用直线作为经验模型进行统计检验。榛果成分2S球蛋白特性基因Ct值的│b1│小于其t(0.95,n-2)×s(b1)，表明在稳定性检验时期内，标准样品的量值没有发生明显的趋势性变化，即稳定性良好。
将本发明实施例1制备得到的榛果超微粉标准样品，对比例2、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，进行长期稳定性检验结果，统计分析结果见表2。以榛果成分2S球蛋白特性基因为代表进行稳定性测定。经直线经验模型统计检验，本发明制备得到的榛果超微粉标准样品中榛果2S球蛋白特性基因Ct值的│b1│小于t(0.95,n-2)×s(b1)，表明标准样品稳定性良好，符合国家标准样品稳定性能要求。然而，对比例2、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7制备得到榛果粉样品中榛果2S球蛋白特性基因Ct值的│b1│均大于t(0.95,n-2)×s(b1)，即样品的量值已发生明显的趋势性变化，表明标准样品是不稳定，不能满足国家标准样品对稳定性的性能评价要求。
表2榛果粉样品中榛果特性2S球蛋白基因长期稳定性直线经验模型分析结果
Figure BDA0003619667810000121
2、运输条件下的短期稳定性检验
按照GB/T 15000.3-2008《国家标准样品定值的一般原则和统计方法》中随机顺序重复测量方法取样，以测定榛果成分特性2S球蛋白基因为代表，进行运输条件下的短期稳定性考察。考虑到标准样品的短期稳定性主要是温度改变条件下短期运输对特性量值的影响，本实验模拟运输极端条件，将样品在-20℃和50℃之间的极端条件下短期存储，选择-20℃、0～4℃、25℃、50℃进行运输条件下的稳定性研究，考察其短期稳定性。采用SN/T1961.6-2013中实时荧光PCR方法检测榛果成分特性2S球蛋白基因。榛果粉样品历经存储条件分别为测试前-20℃7天，0～4℃7天，25℃7天，50℃左右7天。每个温度条件下测试3支标准样品，每支重复测试2次。采用平均值一致性检验法进行检验并评价短期稳定性。历经运输条件后，榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值的统计t检验值小于临界值t(0.95,10)，表明运输条件在-20℃和50℃的条件下，四周时间之内，该标准样品的特性值没有发生显著性变化，短期稳定性良好。
将本发明制备得到的榛果超微粉标准样品，对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，进行短期稳定性检验结果，统计分析结果见表3。以榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值为代表进行短期稳定性测定。经一致性T检验，本发明制备得到的榛果超微粉标准样品榛果成分特性2S球蛋白基因的t检验值小于临界值t(0.95,10)，表明标准样品在运输条件下稳定性良好，国家标准样品对运输条件下稳定性的性能评价要求。然而，对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，榛果成分特性2S球蛋白基因的t检验值均大于临界值t(0.95,10)，表明样品在运输条件下是不稳定的，不能满足国家标准样品对运输条件下稳定性的性能评价要求。
表3榛果粉样品中榛果特性2S球蛋白基因短期稳定性一致性检验分析结果
Figure BDA0003619667810000131
三、标准样品添加食品基质的特性值测定
将本发明制备得到的榛果超微粉标准样品，对比例1、对比例3、对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，通过实时荧光PCR方法测定榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值和液相色谱-串联质谱法测定榛果过敏蛋白Cor a 9特性值，来系统地评价其符合国家标准样品对均匀性、稳定性性能要求，以及在食品基质中特性量值的检测添加回收率。
随机抽取本发明制备得到的榛果超微粉标准样品，以及对比例1、对比例3、对比例5、对比例6、对比例7制备得到的榛果粉样品，各3支，按照40mg/kg、20mg/kg的两个添加水平，添加到饼干基质小麦粉中，采用SN/T 1961.6-2013中实时荧光PCR方法检测榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值，采用GB/T 38163-2019常见过敏蛋白的测定液相色谱-串联质谱法分析榛果过敏蛋白Cor a 9特性值检测回收率。每支样品平行测定2次。对测定的结果数据，使用Kruskal Wallis检验用于比较实施例与对比例5、对比例6、对比例7的榛果成分特性2S球蛋白基因量值分析，统计显著性设定为0.05。
榛果粉在饼干基质不同添加水平中榛果成分特性2S球蛋白基因Ct值分析结果见表4。榛果粉在饼干基质不同添加水平中榛果过敏蛋白Cor a 9特性值检测回收率分析结果见表5。
表4榛果粉样品在饼干基质不同添加水平中榛果特性2S球蛋白基因分析结果
Figure BDA0003619667810000141
表5榛果粉样品在饼干基质不同添加水平中榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值检测回收率分析结果
Figure BDA0003619667810000142
本发明研制的榛果超微粉标准样品，最大限度地保持榛果成分特性2S球蛋白基因量值，Ct值越小，说明特性基因含量越高，以及榛果过敏蛋白Cor a 9特性量值，榛果过敏蛋白特性值回收率越高，说明过敏蛋白特性量值越高，并且制备过程不添加任何防腐剂，纯绿色生产，制备得到的榛果超微粉标准样品高度纯化。本发明提供的用于检测过敏原榛果超微粉标准样品制备方法简单，符合国家标准样品性能要求，并满足预期使用要求，生产成本低，具有很好的商业前景。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1)确定需要制备的食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品的重量，同时需要考虑制备过程中的损耗量为原料的10-20wt％；
(2)低温研磨：将干燥后榛果仁采用超微粉碎机粉碎，得到质量占比为98％以上的榛果超微粉；
(3)冷冻真空干燥：将低温研磨后榛果超微粉进行冷冻真空干燥；
(4)筛分处理：将超微粉碎好的榛果超微粉过灭菌金属筛，得到颗粒的粒径符合检测要求的榛果超微粉；
(5)干粉搅拌混匀：过筛后的榛果超微粉装于无菌包装袋中置于干粉混匀器上摇晃混匀，将样品进一步混合均匀得到均匀性、稳定性且不确定度适中，含食品过敏原领域限制的用于检测过敏原榛果成分特性2S球蛋白基因和过敏蛋白Cor a 9特性量值的榛果超微粉标准样品；
(6)真空分装及储存：将榛果超微粉标准样品分装于棕色玻璃样品瓶，采用冷冻真空干燥机进行真空封盖，然后采用三级密封装置封存后置于环境中长期储存。
2.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，其特征是，步骤(2)中所述低温研磨的温度为低于0℃。
3.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，其特征是，步骤(2)中所述低温研磨的温度为-80～-20℃。
4.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(2)中所述粉碎时间为5～10min。
5.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(3)中所述真空干燥后得到含水量≤5％的榛果超微粉。
6.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(4)中所述灭菌金属筛的直径为100um。
7.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(5)中干粉混匀器摇晃混匀的时间为1天。
8.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(6)中进行真空封盖的盖子为硅胶盖。
9.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(6)中所述三级密封装置由硅胶盖、铝箔盖、塑胶盖组成。
10.如权利要求1所述的一种用于检测食品过敏原特性量值的榛果超微粉标准样品制备方法，步骤(6)中所述长期储存的条件为环境温度为0-4℃。
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