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CN114774573B - 与玉米南方锈病抗性相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

与玉米南方锈病抗性相关的kasp标记及其应用 Download PDF

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CN114774573B CN202210415127.4A CN202210415127A CN114774573B CN 114774573 B CN114774573 B CN 114774573B CN 202210415127 A CN202210415127 A CN 202210415127A CN 114774573 B CN114774573 B CN 114774573B
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邢锦丰
孙轩
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Abstract

本发明公开了与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记及其应用。本发明还公开了一种鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的方法，所述方法是检测待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA，根据所述待测玉米基因型确定南方锈病抗性：GG基因型和GA基因型的待测玉米表现为抗南方锈病；AA基因型的待测玉米表现为感南方锈病。通过实验证明：本发明提供的KASP标记可有效鉴定玉米南方锈病抗性，且鉴定方法操作简单，检测结果准确可靠，可用于玉米南方锈病抗性的鉴定及辅助选择育种，为选育南方锈病抗病玉米品种奠定理论基础。

Description

与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是我国种植面积最大，总产量最高的粮食和经济作物，在国民经济中占有重要地位。玉米南方锈病是由多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw.)引起的一种危害极大的气传性真菌病害，发病范围广。该病害可导致产量降低、籽粒品质变差，对玉米的安全生产构成很大威胁。在我国70年代，玉米南方锈病最早在海南(乐东、南滨、崖城等地)被发现。90年代，该病害在浙江淳安暴发，发病玉米占秋玉米面积的20％左右。近年来，南方锈病在我国北方黄淮海夏玉米生产区(河南、安徽、山东等)暴发流行，且有蔓延之势。夏玉米区如果遇到南方锈病大发生，一周左右叶片就会被病菌橘黄色的夏孢子堆所覆盖，导致叶片很快干枯死亡，造成20％～40％的生产损失；暴发流行时，除造成籽粒品质下降外，减产可达80％以上，甚至绝收。由于玉米推广品种对南方锈病的抗性水平普遍不理想，生产上对该病的控制主要依赖化学防治。但由于用药不及时或方法不当，以及病菌耐药性等诸多因素，导致防治效果普遍不佳。因此，培育和推广抗病品种是从根本上解决南方锈病危害的唯一出路，也已成为我国玉米生产的当务之急。
目前，针对南方锈病的玉米抗病品种的培育主要依靠经验和表型选择进行改良，存在育种周期长、效率低以及预见性差等问题。基于南方锈病病原菌自身的特点，抗性鉴定主要依靠田间自然发病，因此，对于玉米南方锈病低发病区或者遇到环境因素而不易发病的年份，表型鉴定就无法正常进行，大大降低品系选育的速度。而针对抗病基因开发分子标记，既可以对种质资源进行鉴定，筛选抗病种质，为品种选育提供抗源；也可以对改良自交系进行前景选择，快速高效地改良目标性状，显著提高抗病优良自交系的选育效率和预见性，对加快抗病新品种培育进程具有重要推动作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何快速、准确的鉴定玉米南方锈病抗性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的方法是检测待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA，根据所述待测玉米基因型确定南方锈病抗性：GG基因型和GA基因型的待测玉米表现为或候选表现为抗南方锈病；AA基因型的待测玉米表现为或候选表现为感南方锈病；
所述GG基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；
所述GA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体；
所述AA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体。
进一步的，所述检测待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA的方法可包括如下步骤：以待测玉米的基因组DNA为模板，采用KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判断待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA。
所述KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2及下游引物R组成；
所述上游引物F1为序列1所示的单链DNA；
所述上游引物F2为序列2所示的单链DNA；
所述下游引物R为序列3所示的单链DNA。
更进一步的，所述PCR扩增体系如下：30ng模板DNA，0.5μL 2×KASP Master Mix，0.486μL去离子水或超纯水，0.014μL引物工作液。
所述PCR扩增程序如下：95℃15min；94℃20s；61-55℃1min 10个循环；94℃20s；68℃1min；55℃1min 32个循环。
所述PCR扩增结束后用PHERA starplus SNP荧光检测仪读取荧光信号值，用Kraken软件导出基因分型结果，进而判断待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA：若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析呈现蓝色，则所述待测玉米的基因型为GG；若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析呈现红色，则所述待测玉米的基因型为AA；若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析呈现绿色，则所述待测玉米的基因型为GA。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了检测待测玉米第10染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质的新用途。
本发明提供了检测待测玉米第10染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在如下(a1)-(a8)中任一种中的应用：
(a1)鉴定或辅助鉴定待测玉米南方锈病抗性；
(a2)制备鉴定或辅助鉴定待测玉米南方锈病抗性的产品；
(a3)筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种；
(a4)制备筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种的产品；
(a5)玉米品种改良；
(a6)制备玉米品种改良的产品；
(a7)玉米育种；
(a8)制备玉米育种的产品。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如下(b1)-(b3)任一所述的产品：
(b1)上述KASP引物组；
(b2)含有(b1)所述的KASP引物组的PCR试剂；
(b3)含有(b1)所述的KASP引物组或(b2)所述的PCR试剂的试剂盒。
上述产品在如下(c1)-(c4)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测玉米南方锈病抗性；
(c2)筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种；
(c3)玉米品种改良；
(c4)玉米育种。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种的方法。
本发明提供的筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种的方法包括选择GG基因型或GA基因型的玉米品种的步骤；
所述GG基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；
所述GA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。
本发明提供的筛选或辅助筛选感南方锈病玉米品种的方法包括选择AA基因型的玉米品种的步骤；
所述AA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种玉米品种改良的方法。
本发明提供的玉米品种改良的方法包括将按照上述方法筛选得到的抗南方锈病玉米品种作为育种材料进行育种的步骤。所述改良为南方锈病抗性性状改良。
进一步的，所述育种的方法可包括如下步骤：将抗南方锈病玉米品种作为供体亲本，感南方锈病玉米品种作为轮回亲本进行回交。所述回交的次数可为三次。
更进一步的，所述供体亲本为京2416K，所述轮回亲本为京92H、京X005、京2416C92或京2416B92。
上述任一所述方法在玉米育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述育种的目的为培育抗南方锈病玉米品种。
上述任一所述方法或应用或产品中，所述玉米参考基因组版本号为B73_RefGen_v4。
上述任一所述方法或应用或产品中，所述玉米具体可为玉米自交系京2416K、玉米自交系京2416、玉米自交系京724、玉米自交系京MC01、玉米自交系京2416与玉米自交系京2416K的F1群体单株、玉米自交系京2416与玉米自交系京2416K组配的F2分离群体单株、以及玉米自交系京2416K作为受体亲本，玉米自交系京92H、玉米自交系京X005、玉米自交系京2416C92或玉米自交系京2416B92作为轮回亲本，通过3次回交和1次自交分别获得的BC3F2群体单株。
本发明首先通过比较玉米南方锈病抗病自交系和感病自交系的差异位点，发现一个与玉米南方锈病抗性相关的SNP位点，其位于玉米基因组第10号染色体第1608911位，该位点多态性为G/A，然后根据该SNP位点开发设计获得KASP标记KM23。通过实验证明：本发明提供的KASP标记KM23可有效鉴定玉米南方锈病抗性，且鉴定方法操作简单，检测结果准确可靠，可用于玉米南方锈病抗性的鉴定及辅助选择育种，为选育南方锈病抗病玉米品种奠定理论基础。
附图说明
图1为与玉米南方锈病抗性相关的SNP位点。
图2为与玉米南方锈病抗性相关的KM23标记对不同自交系KASP分型图。红色：A:A(AA基因型)；蓝色：G:G(GG基因型)；绿色：G:A(GA基因型)；黑色：NTC空白对照。
图3为F2群体单株表型与KM23标记的基因型分型。1-10：分离群体中的抗病单株；11-15：分离群体中的感病单株。
图4为KM23标记在回交转育中的应用。A：回交转育流程图。B：BC3F2群体中各类基因型植株数量。其中，B1：京2416K和京92H的回交群体；B2：京2416K和京X005的回交群体；B3：京2416K和京2416C92的回交群体；B4：京2416K和京2416B92的回交群体。C-F：4个回交群体单株的表型与基因型。RR代表纯合抗病；Rr代表杂合抗病；rr代表感病。
具体实施方
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米自交系京2416：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20080695.5，授权公告号：CNA004319G。玉米自交系京2416为高感南方锈病表型。
玉米自交系京2416K：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20170479.9，申请公告号：CNA017957E。玉米自交系京2416K为高抗南方锈病表型。
玉米自交系京92H：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20162099.6，申请公告号：CNA016888E。玉米自交系京92H为高感南方锈病表型。
玉米自交系京X005：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20160549.6，授权公告号：CNA014512G。玉米自交系京X005为高感南方锈病表型。
玉米自交系京2416C92：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20184308.7，申请公告号：CNA025328E。玉米自交系京2416C92为高感南方锈病表型。
玉米自交系京2416B92：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20184313.0，申请公告号：CNA025333E。玉米自交系京2416B92为高感南方锈病表型。
玉米自交系京724：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20110278.8，授权公告号：CNA005913G。玉米自交系京724为高感南方锈病表型。
玉米自交系京MC01：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20151547.7，授权公告号：CNA011488G。玉米自交系京MC01为高感南方锈病表型。
实施例1、与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记的开发
一、与玉米南方锈病抗性相关的SNP标记的发现
通过比较玉米自交系京2416K(抗病)、京2416(感病)、京724(感病)和京MC01(感病)的差异位点，发现一个与玉米南方锈病抗性相关的SNP位点，其位于玉米基因组第10号染色体第1608911位(参考基因组版本号：B73_RefGen_v4)(图1)，该位点多态性为G/A。
二、与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记的开发
根据步骤一发现的SNP位点，设计KASP标记KM23，KM23标记信息具体如表1所示。
表1、KM23标记信息
注：上游引物F1中下划线所示序列为FAM荧光序列，上游引物F2中下划线所示序列为HEX荧光序列；Y为兼并碱基，代表碱基C和T。
三、KASP标记的验证
供试材料：京2416K(抗病)、京2416(感病)、京724(感病)、京MC01(感病)以及京2416与京2416K的F1群体。
1、玉米南方锈病抗性鉴定
玉米南方锈病抗性鉴定在海南三亚依靠自然发病进行。在玉米乳熟期至蜡熟期(约授粉后15天)进行调查。调查重点部位为玉米果穗的上方和下方3叶。采用1、3、5、7、9级的分级标准，根据病害症状描述，逐份材料记载病情级别，再根据病情级别进行抗病性综合评价。玉米南方锈病的抗病等级划分标准具体如表2所示。
表2、玉米南方锈病的抗病等级划分
病情级别 症状描述 抗性
1 叶片上仅有无孢子堆的过敏性反应或无病斑 高抗(HR)
3 叶片上孢子堆为少量，占叶片面积少于25％ 抗(R)
5 叶片上孢子堆为中量，占叶片面积26～50％ 中抗(MR)
7 叶片上孢子堆为大量，占叶片面积51～75％ 感病(S)
9 叶片上孢子堆为大量，占叶片面积76～100％，叶片枯死 高感(HS)
2、基因型检测
利用KM23标记对玉米自交系京2416K(抗病)、京2416(感病)、京724(感病)、京MC01(感病)以及京2416与京2416K的F1单株进行基因型分型。具体方法如下：根据Laboratoryof the Government Chemist(LGC)公司的标准实验步骤进行KASP高通量SNP基因分型，其主要实验步骤为：利用植物DNA提取试剂盒提取玉米叶片基因组DNA后，经Nano分光光度计检测质量并测定浓度，最后稀释到30ng/μL左右备用；打开Kraken软件相应工程，输入样品板名称及条码号，设置DNA样品、对照样品及NTC空白对照的位置；样品信息导入，根据模板填写样品信息，包括样品条码号、样品板号、孔位号、样品板类型和样品板条码号；用Replikator孔板复制机将每个DNA样品1.5μL转移到对应的板材内，55℃烘干；按照LGC公司的KASP基因分型标准反应体系配制反应液，每个反应总体积为1μL，包含0.5μL 2×KASPMaster Mix，0.486μL去离子水或超纯水，0.014μL引物工作液，配制好后用Merdian微量分液器进行分液，离心后，使用手电查看孔中是否有缺失，之后用Fusion激光封膜仪封膜；在高通量水浴热循环仪中进行PCR扩增，PCR扩增程序：95℃15min；94℃20s；61-55℃1min 10个循环；94℃20s；68℃1min；55℃1min 32个循环；扩增结束后用PHERA starplus SNP荧光检测仪读取荧光信号值，用Kraken软件导出基因分型结果。
结果显示：京2416K的基因型为GG(纯合抗病，蓝色)；京2416与京2416K的F1单株的基因型为GA(杂合抗病，绿色)；京2416、京724、京MC01的基因型为AA(感病，红色)(图2)。
实施例2、与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记KM23的应用
一、鉴定待测玉米南方锈病抗性
供试材料：京2416与京2416K组配的F2分离群体的15个单株。
按照实施例1中的方法对供试材料进行玉米南方锈病抗性鉴定与基因型检测。
结果显示，15个单株中，共有10个抗病单株和5个感病单株，且10个抗病单株中有4个基因型为GG，6个基因型为GA；5个感病单株基因型均为AA(图3)。
二、玉米品种改良
玉米自交系京92H、京X005、京2416C92和京2416B92是由北京市农林科学院玉米研究所选育的优良自交系，配合力高，综合农艺性状优良，但是对南方锈病敏感。本发明以对玉米南方锈病高抗的自交系京2416K作为抗源，对感病自交系京92H、京X005、京2416C92和京2416B92进行南方锈病抗性改良，从而获得抗锈京92H、抗锈京X005、抗锈京2416C92和抗锈京2416B92。具体步骤如下：
将京2416K作为供体亲本，京92H、京X005、京2416C92和京2416B92分别作为轮回亲本，通过3次回交和抗性鉴定得到BC3，1次自交获得BC3F2群体(图4A)。其中京2416K和京92H的BC3F2群体共得到208个单株，京2416K和京X005的BC3F2群体共得到237个单株，京2416K和京2416C92的BC3F2群体共得到252个单株，京2416K和京2416B92的BC3F2群体共得到208个单株(图4B)。
按照实施例1中的方法对所有BC3F2单株利用标记KM23进行基因型分型和抗性鉴定。结果显示，在京92H的回交后代中，52个为纯合抗病，基因型为GG；101个为杂合抗病，基因型为GA；55个为感病，基因型为AA(图4B、C)。在京X005的回交后代中，57个为纯合抗病，基因型为GG；128个为杂合抗病，基因型为GA；52个为感病，基因型为AA(图4B、D)。在京2416C92的回交后代中，63个为纯合抗病，基因型为GG；131个为杂合抗病，基因型为GA；58个为感病，基因型为AA(图4B、E)。在京2416B92的回交后代中，56个为纯合抗病，基因型为GG；103个为杂合抗病，基因型为GA；49个为感病，基因型为AA(图4B、F)。所有BC3F2单株的田间抗性表型与标记KM23基因型分型一致。
上述结果表明，应用KASP标记KM23对分离群体和回交群体后代的基因型分型结果与田间抗性表型一致，证实该分子标记可用于玉米南方锈病的抗性鉴定及分子标记辅助选择育种。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 与玉米南方锈病抗性相关的KASP标记及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<222> 31
<223> Y为t或c
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tctgaagcta ycaattgggg ccac 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<222> 31
<223> Y为t或c
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tctgaagcta ycaattgggg ccat 44
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gcagcgcttc cctgaagaaa ccat 24

Claims (9)

1.一种鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的方法，是检测待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA，根据所述待测玉米基因型确定南方锈病抗性：GG基因型和GA基因型的待测玉米表现为或候选表现为抗南方锈病；AA基因型的待测玉米表现为或候选表现为感南方锈病；
所述GG基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；
所述GA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体；
所述AA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；
所述玉米基因组的参考基因组版本号为B73_RefGen_v4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA的方法包括如下步骤：以待测玉米的基因组DNA为模板，采用KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判断待测玉米第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型是GG、GA还是AA；
所述KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2及下游引物R组成；
所述上游引物F1为序列1所示的单链DNA；
所述上游引物F2为序列2所示的单链DNA；
所述下游引物R为序列3所示的单链DNA。
3.检测待测玉米第10染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸的基因型的物质在如下（a1）-（a8）中任一种中的应用：
（a1）鉴定或辅助鉴定待测玉米南方锈病抗性；
（a2）制备鉴定或辅助鉴定待测玉米南方锈病抗性的产品；
（a3）筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种；
（a4）制备筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种的产品；
（a5）玉米品种改良；
（a6）制备玉米品种改良的产品；
（a7）玉米育种；
（a8）制备玉米育种的产品；
所述玉米基因组的参考基因组版本号为B73_RefGen_v4。
4.如下（b1）-（b3）中任一种产品：
（b1）KASP引物组；所述KASP引物组由上游引物F1、上游引物F2及下游引物R组成；所述上游引物F1为序列1所示的单链DNA；所述上游引物F2为序列2所示的单链DNA；所述下游引物R为序列3所示的单链DNA；
（b2）含有（b1）所述KASP引物组的PCR试剂；
（b3）含有（b1）所述KASP引物组或（b2）所述PCR试剂的试剂盒。
5.权利要求4所述的产品在如下（c1）-（c4）中任一种中的应用：
（c1）鉴定或辅助鉴定待测玉米南方锈病抗性；
（c2）筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种或感南方锈病玉米品种；
（c3）玉米品种改良；
（c4）玉米育种。
6.一种筛选或辅助筛选抗南方锈病玉米品种的方法，包括选择GG基因型或GA基因型的玉米品种的步骤；
所述GG基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；
所述GA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体；
所述玉米基因组的参考基因组版本号为B73_RefGen_v4。
7.一种筛选或辅助筛选感南方锈病玉米品种的方法，包括选择AA基因型的玉米品种的步骤；所述AA基因型为玉米基因组第10号染色体第1608911位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述玉米基因组的参考基因组版本号为B73_RefGen_v4。
8.一种玉米品种改良的方法，包括将按照权利要求6所述方法筛选得到的抗南方锈病玉米品种作为育种材料进行育种的步骤。
9.权利要求6-8任一所述方法在玉米育种中的应用。
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