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CN114774382A - 立体选择性制备6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烯化合物的方法 - Google Patents

立体选择性制备6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烯化合物的方法 Download PDF

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CN114774382A
CN114774382A CN202210365498.6A CN202210365498A CN114774382A CN 114774382 A CN114774382 A CN 114774382A CN 202210365498 A CN202210365498 A CN 202210365498A CN 114774382 A CN114774382 A CN 114774382A
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gly
thr
leu
pro
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CN202210365498.6A
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杜艳华
信铭雁
吴瑞方
王宁波
李岩
李以群
李洁萍
丁勇
巫朦朦
王杰
李想
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Guangdong Zhuotin Pharmaceutical Co ltd
Yangzhou Lianao Biomedical Co ltd
Original Assignee
Guangdong Zhuotin Pharmaceutical Co ltd
Yangzhou Lianao Biomedical Co ltd
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Publication date
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12Y104/03004—Monoamine oxidase (1.4.3.4)
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Abstract

本发明提供了一系列来源于青霉菌的催化活性高、手型选择性强的单胺氧化酶(PMAON)，以及使用该酶立体选择性制备6,6‑二甲基‑3‑氮杂双环[3.1.0]己烯化合物的方法。本发明还提供了编码该系列单胺氧化酶的基因，含有该系列基因的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法。

Description

立体选择性制备6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烯化合物 的方法
技术领域
本发明涉及医药中间体技术领域，具体涉及6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烯化合物的生物催化方法以及该方法中使用的生物催化酶。
背景技术
奈玛特韦(Nirmatrelvir)是辉瑞公司开发的一种抗病毒药物，为具有口服活性的新冠病毒SARS-CoV-2-3CL蛋白酶抑制剂。奈玛特韦是一种共价抑制剂，可直接与蛋白酶的半胱氨酸催化残基(Cys145)结合。该药与利托那韦的复方制剂，以帕克斯洛维德(Paxlovid)为商品名，现在已经被FDA批准为治疗新冠病毒的一线临床治疗用药，其化学结构式如下所示：
Figure BDA0003585709920000011
波西普韦(Boceprevir)是先灵葆雅公司研发的丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂，于2011年5月13日获FDA批准与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合治疗成人慢性丙型肝炎，其化学结构式如下所示：
Figure BDA0003585709920000012
从奈玛特韦和波西普韦的结构式中可以看出，两者拥有共同的6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷片段，中间体(1R,2S,5S)-6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己-2-羧酸甲酯(以下简称式I化合物)是合成这两个产品的一个关键中间体。
Figure BDA0003585709920000013
制备式I化合物的方法主要有：
一、WO2004113295报道了一种制备式I化合物盐酸盐的合成方法，合成路线如路线1所示：
Figure BDA0003585709920000021
路线1步骤多、路线长，关键是最终产物的ee值不高。
二、WO2007075790报道了一种可以得到90％以上ee值的式I化合物盐酸盐的合成方法，但该方法采用的是最终产物的非对映体盐拆分法，不经济，其合成路线如路线2所示：
Figure BDA0003585709920000022
三、为解决上述问题，WO2010008828中报道了一种使用生物酶催化法立体选择性制备得到式I化合物的合成方法，其合成路线如路线3所示：
Figure BDA0003585709920000023
路线3第一步酶催化氧化反应可以得到100％ee值的氧化产物(1R,5S)-6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己-2-烯(以下简称式III化合物)，进而很容易得到100％ee值的式I化合物，因此催化氧化反应在式I化合物的制备中尤为关键，而单胺氧化酶更是此反应的最重要因素。WO2010008828报道的单胺氧化酶从米曲霉及黑曲霉中分离后进行基因构建得到，该原始序列底物浓度较低(<10g/L投料量)，每批生产产量低，不适合工业化大生产。
因此本领域仍然需要寻找新的单胺氧化酶来解决现有技术中存在的产能低的缺陷。
发明内容
本发明提供了一系列来源于青霉菌中单胺氧化酶，催化活性高、手型选择性强，且反应底物浓度可达200g/L投料量，解决了现有技术中的单胺氧化酶用于酶催化氧化时产量低、不适合工业化生产的问题。
本发明的第一个方面公开了一组来源于青霉菌的单胺氧化酶，其特征在于，所述单胺氧化酶由青霉菌(Penicillium sp.ART)、青霉菌(Penicillium polonicum)及青霉菌(Penicillium brasilianum)获得。
优选地，所述的单胺氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ IDNo：6。在另一优选例中，这种融合蛋白的序列可以是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6及与上述序列同源性高于80％的天然或者人工蛋白序列。
优选地，所述的单胺氧化酶的mRNA序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5及与上述序列同源性高于80％的mRNA序列。
将SEQ ID NO.2、4、6所示的单胺氧化酶序列与其他已知单胺氧化酶进行序列比对，与土曲霉(Aspergillus terreus)单胺氧化酶之间的同一性分别为67.7％、63.2％和51.4％，与来自黑曲霉(A.niger)的单胺氧化酶的同一性低于60％。
本发明的第二个方面公开了编码所述的单胺氧化酶的核酸。
本发明的第三个方面公开了含有所述的核酸的重组表达载体。
优选地，构建重组表达载体所用的质粒为pET28a。
本发明的第四个方面公开了含有所述的重组表达载体的重组表达转化体。
根据所述的重组表达转化体，其特征在于，优选地，宿主细胞为大肠杆菌。
更为优选地，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第五个方面，提供了本发明的单胺氧化酶(PMAON)在不对称催化氧化反应中的应用，即将其应用于催化式II化合物的不对称氧化反应制备目标产物式III化合物，反应式如下所示(反应式1)：
Figure BDA0003585709920000031
所述的催化氧化反应中，单胺氧化酶为100毫克-10克每升；过氧化氢酶的用量为10毫克-300毫克；所述的水溶液为pH范围在5.0～8.0的缓冲液，所述的氧化反应在振荡或搅拌条件下进行；所述的氧化反应的反应温度为20～60℃。
式III化合物可通过WO2008082508实施例3-5的方法转化为式I化合物，反应式如下所示(反应式2)：
Figure BDA0003585709920000041
本发明的不对称催化氧化反应底物式II化合物可以通过WO2008082508实施例1的方法制备得到。
与现有技术相比，本发明取得了如下优势：
1、本发明源于青霉菌中单胺氧化酶，催化活性高、手型选择性强；
2、本发明解决了现有技术产能低的缺陷，反应底物浓度可达200g/L投料量，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例2中本发明的单胺氧化酶重组表达载体图。
图2为实施例3中本发明的单胺氧化酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为实施例4中本发明的单胺氧化酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4为实施例5中本发明的单胺氧化酶粗酶底物转化活性气相色谱图(产物：10.891min，底物：11.187min)。
具体实施方式
下面通过实施例和附图来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不受下列实施例限制。
实施例1
从收集的土壤真菌样品库中选取21种真菌(其中4株为黑曲霉、1株为土曲霉，16株为青霉菌)，挑选单菌落到100mL液体YPD培养基中进行培养，超声破壁，以6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷(式II化合物)为底物进行单胺氧化酶酶活性检测，其中5株菌株检测到底物转化活性，经过鉴定，分别是土曲霉Aspergillus terreus，黑曲霉Aspergillusniger，Penicillium sp.ART，Penicillium polonicum以及Penicillium brasilianum。根据之前已经获得的基因组测序结果，获得了上述三个有活性的青霉菌单胺氧化酶(PMAON)的mRNA(cDNA)序列分别为：Seq ID No：1、3、5，并翻译成蛋白质序列分别为：Seq ID No：2、4、6。
实施例2
本发明还提供了一种包含本发明所述的编码单胺氧化酶的核苷酸序列的重组表达载体。通常的该领域的人员都可以通过分子生物学常规方法将本发明所述的编码单胺氧化酶或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒载体等，优选质粒pET28a。
可通过类似于下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过DNA合成所得的核酸产物与表达载体pET28a分别用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4-DNA连接酶连接，形成含有本发明的三种单胺氧化酶基因的重组表达质粒pET28a-His-PMAON重组表达质粒。
实施例3
本发明还提供了一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的单胺氧化酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coli BL21(DE3)。
将前述重组表达质粒pET28a-His-PMAON或其突变体转化至E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-His-PMAON或其突变体(结果见图2)。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等，较佳地选择热击法进行转化。
实施例4
本发明提供了一种重组单胺氧化酶的制备方法，包括培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组单胺氧化酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的单胺氧化酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的单胺氧化酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。
对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵生产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET28a-His-PMAON或其突变体)接种至含氨苄霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.01～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度20～40℃，160～240rpm培养10～18h，即可高效表达本发明所述重组单胺氧化酶。培养完成后，收集菌体，匀浆或者超声后得到粗酶液，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(结果见图3)。
实施例5单胺氧化酶PMAON的酶催化反应
在50mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中加入终浓度为5-200g/L的式II化合物，通入氧气，在密封容器中搅拌20-30分钟，加入根据实施例4制备的单胺氧化酶的粗酶液至蛋白质终浓度为1g/L，同时加入终浓度1g/L的过氧化氢酶，30～50℃反应，薄气相色谱监测整个反应进程，底物剩余低于1％时视为反应结束。反应结束后，调pH至10.0，用甲基叔丁基醚萃取，得式III化合物的甲基叔丁基醚溶液，可直接用于下一步反应。也可减压蒸去溶剂得式III化合物，手性GC检测分析，未检测到(1S,5R)-异构体。
本发明中催化手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物的催化剂，可以是上述产生的重组单胺氧化酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的单胺氧化酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化获得的固定化酶制剂。
实施例6式I化合物盐酸盐的制备
室温下反应瓶中，向670mL 10％亚硫酸氢钠溶液中滴加入实施例5得到的含70g式III化合物的甲基叔丁基醚溶液500mL，控制反应温度低于35℃。滴毕，室温下继续搅拌1小时。静置，分层，水相用50mL甲基叔丁基醚洗涤后直接用于下一步反应。
将水相转移入反应瓶中，分次加入35g氰化钠，控制反应温度低于25℃。加毕，室温下继续搅拌1小时。加入300mL甲基叔丁基醚，搅拌5分钟。静置，分层，有机相用100mL 20％NaCl水溶液分两次洗涤后直接用于下一步反应。
室温下将有机相滴加350mL 28％氯化氢甲醇溶液，控制反应温度低于30℃。滴毕，加热至回流，回流5小时。减压蒸去溶剂，残留物中加入500mL甲基叔丁基醚。冷却至0-5℃，搅拌下加入500mL水，使澄清。用NaOH水溶液调pH至pH9-10，继续搅拌15分钟。静置，分层，用200mL甲基叔丁基醚分两次萃取水相。合并有机相，用100mL 20％NaCl水溶液洗涤。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏回收溶剂。
残留物中加入异丙醇70mL，使溶解。冷却至0-5℃，滴加入25-28％氯化氢甲醇溶液，至反应混合液pH为4-5。滴毕，继续搅拌30分钟。滴加200mL甲基叔丁基醚，滴加过程中逐渐析出白色固体。滴毕，保温析晶4小时。过滤，滤饼用少量甲基叔丁基醚淋洗，40℃真空干燥得到白色固体式I化合物盐酸盐95g，ee值100％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 扬州联澳生物医药有限公司
广东省卓肽医药有限公司
<120> 立体选择性制备6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烯化合物的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacctctc gcgacggatt tcaatggaca ccacaggctg gattggccca aggggtgcca 60
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cgaggtgtga accactttca actgcgcact gacaatggag atactgtaat gagccacgaa 420
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gatgagatgt cttgcaaaga tcgcctacta cagatcaact tatcccttac accgaacgag 600
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ttttttgaat ttctacattg gtgggcattg tgcggctata cctatcgtgg ctgtatggat 720
tctttaatct catacaagtt caagggaggc cagtcgtcat ttgctatcaa gtttttccaa 780
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<211> 492
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Gly Gly Val Pro Ser Ile Gly Val Ile Ser Pro Ser Thr Ala Ile Ser
20 25 30
Ser Ser Ala Gly Ser Thr Ala Val Val Val Val Gly Gly Gly Thr Ser
35 40 45
Gly Leu Thr Ala Thr Ala Ala Leu Cys Val Ala Gly Pro Leu Val Leu
50 55 60
Leu Val Gly Ala Ala Ala Ala Ile Gly Gly Ala Ser Thr Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ile Gly Gly Thr Pro Thr Gly Met Gly Gly Thr Thr Val His Thr Gly
85 90 95
Gly Pro His Val Thr Ala Gly Ile Ser Ala Thr Gly Met Ala Thr Gly
100 105 110
Leu Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ser Ala Gly Val Ala His Pro Gly Leu
115 120 125
Ala Thr Ala Ala Gly Ala Thr Val Met Ser His Gly Ala Gly Ala Ala
130 135 140
Leu Leu Ala Gly Ala Leu Gly Leu Pro Val Ala Val Ala Gly Ala Met
145 150 155 160
Gly Ala Leu Val Val Pro Thr Ala His Ala Ser Pro His Val Pro Gly
165 170 175
Ala Ala Leu Thr Ala Gly Met Ser Cys Leu Ala Ala Leu Leu Gly Ile
180 185 190
Ala Leu Ser Leu Thr Pro Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Ser Pro Ile
195 200 205
Leu Leu Cys Ser Cys Gly Thr Leu Gly Thr Thr Ser Pro Pro Gly Pro
210 215 220
Leu His Thr Thr Ala Leu Cys Gly Thr Thr Thr Ala Gly Cys Met Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ile Ser Thr Leu Pro Leu Gly Gly Gly Ser Ser Pro Ala Ile
245 250 255
Leu Pro Pro Gly Gly Ala Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ser Thr Val Pro
260 265 270
Ser Ala Pro Val Leu Ser Ile Thr Ala Gly Gly Ala Ala Val Thr Leu
275 280 285
Ser Thr Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Ala Leu Ala Leu Val Ser Thr
290 295 300
Ile Pro Leu Ala Val Leu Ala Ser Ile Ser Pro Ser Pro Pro Leu Ala
305 310 315 320
Thr His Ala Ala Ser Ala Thr Ala Ile Gly His Val Ala Gly Cys Val
325 330 335
Leu Val His Ala Gly Val Ser Ala Ala Ala Met Ala Ser Thr Thr Gly
340 345 350
Ile Ser Thr Pro Pro Ala Leu Leu Met Thr Ala Ile Gly Ala Gly Thr
355 360 365
Thr Pro Ala Gly Ala Thr His Ile Val Cys Pro Gly Gly Ala Ala Ala
370 375 380
His Ile Gly Pro Gly Gly Ala Val Ala Gly Thr Leu Gly Ala Val Gly
385 390 395 400
Ser Leu Ala Pro Gly Ala Met Ala Ile Gly Ala Leu Val Pro His Ala
405 410 415
Thr Ser Leu Ala Gly Pro Ala Leu Gly Ala Thr Pro Pro Ser Ser Pro
420 425 430
Leu Pro Leu Ser Thr Ser Leu Ala Ser Leu Ala Ala Ala His Gly Ala
435 440 445
Val Val Pro Ala Ala Ser Ala Thr Ala Val Gly Thr Ala Ser Pro Ile
450 455 460
Ala Gly Ala Ile Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Met Thr Val Leu Gly
465 470 475 480
Gly Leu Gly Pro Ile Val Pro Pro Ala Val Ala Leu
485 490
<210> 3
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgacttccc gcgacggttt ccaatggacg cctgaaactg gccttgcaca aggtgtgcct 60
tcaattggtg tcatttcgcc tcctacaaaa atctcgactt catcagcaac gtatgacgtt 120
atcgttgtcg gcggcggata tgctggtctc acggccactc gtgacttgac tattgccggt 180
cttcgtgttc tcctggttga ggctcgtgat cggattggtg gacgttcttg gtcctccaac 240
attggcgact atccgtttga gatgggtgga acttgggtgc actggggtca gcctcacgtt 300
tggcgcgaga tatcgcgata caacatgcga accgagctgg aggaatcttt tgatttctct 360
cgcggagtaa accacttcca gttgcgcaca agccagggtg cttcaataat gagccacgaa 420
gaggaggaca ctattcttgc cgctggcctc gagagatttg tcaatgtcga tggtgatatg 480
ggcaggaaaa tcattccttt ccctcacgac gcattccatg tccctgaggc tcgccgctac 540
gatgaaatgt ccgcacagga ccgggtaaac gagattgctt cgtctcttac cccgaacgaa 600
cgtgcatccc ttgagagttt tatccttctt tgcagctgcg gaacattgga aacaaccagc 660
ttccttgaat tacttcattg gtgggctcta tgtggctact cctatcgtgg ctgcatggcc 720
tccctgatct cgtacaagtt caagggaggt caatcgacct tcgcaatcaa gttcttcata 780
gaggcactcg ccactggaag actctcgtat gtgttcaata gccctgtcag ctcaatcagt 840
gatcgaggtg ataaagtcac tcttaccact cgtgatggtc atcagtatac cggtgctcgt 900
ctggtctcta ctattcctct caatgttctt aattccgtat ctttcgatcc tcctctgggc 960
acccagcgag cgacagccac caatatcggt catgtcaacc aatgtgtgaa ggtagacgcg 1020
gaaatttcca gcaaggacat gcgttcgtgg actggagtct cctatccctt caacaagctc 1080
atgtatggca ttggtgatgg aactacaccc tcaggaaaca cccacatcgt ttgctttggc 1140
ggttctagca accacattca tccggaggaa gatattaacg aaaccaagaa ggccgtcgag 1200
agcatggctc ccggtaacat ggatgttaag cgattggttt ttcataattg gagcaaagat 1260
gagttttcca agggcgcctg gttcttctcg cctccccggc ttttgtccac atcattggat 1320
gcgatgcggg ctcggcatgg aaacattgtc tttgcaagct ctgattgggc tattggctgg 1380
cgtggcttca ttgatggtgc tattgaagag ggtacacggg cggctatgac ggtgaagggg 1440
gagcttcaac ctgctcctgt cccgcgttct tatctatag 1479
<210> 4
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Thr Ser Ala Ala Gly Pro Gly Thr Thr Pro Gly Thr Gly Leu Ala
1 5 10 15
Gly Gly Val Pro Ser Ile Gly Val Ile Ser Pro Pro Thr Leu Ile Ser
20 25 30
Thr Ser Ser Ala Thr Thr Ala Val Ile Val Val Gly Gly Gly Thr Ala
35 40 45
Gly Leu Thr Ala Thr Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Leu Ala Val Leu
50 55 60
Leu Val Gly Ala Ala Ala Ala Ile Gly Gly Ala Ser Thr Ser Ser Ala
65 70 75 80
Ile Gly Ala Thr Pro Pro Gly Met Gly Gly Thr Thr Val His Thr Gly
85 90 95
Gly Pro His Val Thr Ala Gly Ile Ser Ala Thr Ala Met Ala Thr Gly
100 105 110
Leu Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ser Ala Gly Val Ala His Pro Gly Leu
115 120 125
Ala Thr Ser Gly Gly Ala Ser Ile Met Ser His Gly Gly Gly Ala Thr
130 135 140
Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Ala Pro Val Ala Val Ala Gly Ala Met
145 150 155 160
Gly Ala Leu Ile Ile Pro Pro Pro His Ala Ala Pro His Val Pro Gly
165 170 175
Ala Ala Ala Thr Ala Gly Met Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Gly Ile
180 185 190
Ala Ser Ser Leu Thr Pro Ala Gly Ala Ala Ser Leu Gly Ser Pro Ile
195 200 205
Leu Leu Cys Ser Cys Gly Thr Leu Gly Thr Thr Ser Pro Leu Gly Leu
210 215 220
Leu His Thr Thr Ala Leu Cys Gly Thr Ser Thr Ala Gly Cys Met Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ile Ser Thr Leu Pro Leu Gly Gly Gly Ser Thr Pro Ala Ile
245 250 255
Leu Pro Pro Ile Gly Ala Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ser Thr Val Pro
260 265 270
Ala Ser Pro Val Ser Ser Ile Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Thr Leu
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Gly His Gly Thr Thr Gly Ala Ala Leu Val Ser Thr
290 295 300
Ile Pro Leu Ala Val Leu Ala Ser Val Ser Pro Ala Pro Pro Leu Gly
305 310 315 320
Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ile Gly His Val Ala Gly Cys Val
325 330 335
Leu Val Ala Ala Gly Ile Ser Ser Leu Ala Met Ala Ser Thr Thr Gly
340 345 350
Val Ser Thr Pro Pro Ala Leu Leu Met Thr Gly Ile Gly Ala Gly Thr
355 360 365
Thr Pro Ser Gly Ala Thr His Ile Val Cys Pro Gly Gly Ser Ser Ala
370 375 380
His Ile His Pro Gly Gly Ala Ile Ala Gly Thr Leu Leu Ala Val Gly
385 390 395 400
Ser Met Ala Pro Gly Ala Met Ala Val Leu Ala Leu Val Pro His Ala
405 410 415
Thr Ser Leu Ala Gly Pro Ser Leu Gly Ala Thr Pro Pro Ser Pro Pro
420 425 430
Ala Leu Leu Ser Thr Ser Leu Ala Ala Met Ala Ala Ala His Gly Ala
435 440 445
Ile Val Pro Ala Ser Ser Ala Thr Ala Ile Gly Thr Ala Gly Pro Ile
450 455 460
Ala Gly Ala Ile Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Met Thr Val Leu Gly
465 470 475 480
Gly Leu Gly Pro Ala Pro Val Pro Ala Ser Thr Leu
485 490
<210> 5
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaccaatc aaccaaaaag ccgcgacggc tatcagtgga ccaaggccac gggcctagtc 60
caaggagttc caactctcgg tctgatccaa ccacccactc acttcacaag ggggaagaac 120
tacgacgtaa ttgtaatcgg aggcggatac gccggcataa ccacgtgtcg ggatctcacc 180
cttgccggca acaacgtgct actcgtcgaa gcgcgagacc gtattggtgg gcggtcatgg 240
tcatctaata ttgacggata cccctatgag atgggtggaa cgtgggtgca ttggcatcaa 300
ccttttgtgt ggcgggagtt gagacggtac gggatggtcg atcaattgga gatttcgcca 360
aggaagaatg ttgagggcgg ggcgagagtt actgttaact tggatggaga gatgaagcat 420
ctgacgcatg acgatgagga tgccattgtc gagtccgcat tcaagaaatt tatcaatgtg 480
gacggccaat tcggccgcac tgtggttccc ttcccgcacg atatcgaatt acacatggcg 540
ggcgtagagg agtacgacca catgtctatg gccgaccgca tggtacaagt tgcacctcac 600
ttgacaccat tggaaaagaa catgttcgag ggattcctat ccatcacgca cggcggaaaa 660
tgggaagaag catctttctt cgagctgctg cggtggtggg cattgatgga ttacaatctc 720
cccaacttca tggaacttgg actcatgtac aagatccgtg atggtcagtc tgcgctggcg 780
agacggattt tcgatgaagc tgtcagcacg ggtagattgg actatacttt ctctacgccg 840
gtcaaggacg taattgatca tggacacgga gttgaagtta tcgctcgaag tggaggggag 900
gttttcaagg cgagacgttt ggtctgcact gtgccgttga atgtcttgca taccttggcc 960
ttttcgccaa agctgccgac tctcaagacg gaagcttctc tagctggtca tgtcaacaaa 1020
gtcgtcaaat gtcatgccga agttgcgaat cccgagatgc gctcgctcgg ggcaacgaac 1080
tacccccacg gcagactcac ctacactttc ggtgatggaa ctacgcccgc gggaaatact 1140
cacctcgttg cctttggcag ctcccttcct ggagttcact tggatcccga gcaggatatt 1200
gaagtcacta agaaggcctt tgaggccttc cacccgggca tgaatgtgca gaagttggtg 1260
ttccacaact ggcacaagga tgaatttgcc cagggtgcgt gggagtggtt gcggccgggt 1320
atgacaacaa agtacctgaa ggcgctgcga gagcgacatg gaaatgtgtt ctttgccagc 1380
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atcgcgaagc tcgttcatga tgagttgaag gacgtgcgtc ccattgcttc taagctttga 1500
<210> 6
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Thr Ala Gly Pro Leu Ser Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Thr Gly Leu Val Gly Gly Val Pro Thr Leu Gly Leu Ile Gly Pro Pro
20 25 30
Thr His Pro Thr Ala Gly Leu Ala Thr Ala Val Ile Val Ile Gly Gly
35 40 45
Gly Thr Ala Gly Ile Thr Thr Cys Ala Ala Leu Thr Leu Ala Gly Ala
50 55 60
Ala Val Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Ala Ile Gly Gly Ala Ser Thr
65 70 75 80
Ser Ser Ala Ile Ala Gly Thr Pro Thr Gly Met Gly Gly Thr Thr Val
85 90 95
His Thr His Gly Pro Pro Val Thr Ala Gly Leu Ala Ala Thr Gly Met
100 105 110
Val Ala Gly Leu Gly Ile Ser Pro Ala Leu Ala Val Gly Gly Gly Ala
115 120 125
Ala Val Thr Val Ala Leu Ala Gly Gly Met Leu His Leu Thr His Ala
130 135 140
Ala Gly Ala Ala Ile Val Gly Ser Ala Pro Leu Leu Pro Ile Ala Val
145 150 155 160
Ala Gly Gly Pro Gly Ala Thr Val Val Pro Pro Pro His Ala Ile Gly
165 170 175
Leu His Met Ala Gly Val Gly Gly Thr Ala His Met Ser Met Ala Ala
180 185 190
Ala Met Val Gly Val Ala Pro His Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Met
195 200 205
Pro Gly Gly Pro Leu Ser Ile Thr His Gly Gly Leu Thr Gly Gly Ala
210 215 220
Ser Pro Pro Gly Leu Leu Ala Thr Thr Ala Leu Met Ala Thr Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Met Gly Leu Gly Leu Met Thr Leu Ile Ala Ala Gly Gly
245 250 255
Ser Ala Leu Ala Ala Ala Ile Pro Ala Gly Ala Val Ser Thr Gly Ala
260 265 270
Leu Ala Thr Thr Pro Ser Thr Pro Val Leu Ala Val Ile Ala His Gly
275 280 285
His Gly Val Gly Val Ile Ala Ala Ser Gly Gly Gly Val Pro Leu Ala
290 295 300
Ala Ala Leu Val Cys Thr Val Pro Leu Ala Val Leu His Thr Leu Ala
305 310 315 320
Pro Ser Pro Leu Leu Pro Thr Leu Leu Thr Gly Ala Ser Leu Ala Gly
325 330 335
His Val Ala Leu Val Val Leu Cys His Ala Gly Val Ala Ala Pro Gly
340 345 350
Met Ala Ser Leu Gly Ala Thr Ala Thr Pro His Gly Ala Leu Thr Thr
355 360 365
Thr Pro Gly Ala Gly Thr Thr Pro Ala Gly Ala Thr His Leu Val Ala
370 375 380
Pro Gly Ser Ser Leu Pro Gly Val His Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ile
385 390 395 400
Gly Val Thr Leu Leu Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Gly Met Ala Val
405 410 415
Gly Leu Leu Val Pro His Ala Thr His Leu Ala Gly Pro Ala Gly Gly
420 425 430
Ala Thr Gly Thr Leu Ala Pro Gly Met Thr Thr Leu Thr Leu Leu Ala
435 440 445
Leu Ala Gly Ala His Gly Ala Val Pro Pro Ala Ser Ser Ala Ser Ser
450 455 460
Pro Gly Thr Ala Gly Pro Ile Ala Gly Ala Met Ala Ala Gly Gly Ala
465 470 475 480
Ile Ala Leu Leu Val His Ala Gly Leu Leu Ala Val Ala Pro Ile Ala
485 490 495
Ser Leu Leu

Claims (12)

1.一组来源于青霉菌的单胺氧化酶，其特征在于，所述单胺氧化酶由青霉菌(Penicillium sp.ART)、青霉菌(Penicillium polonicum)及青霉菌(Penicilliumbrasilianum)获得。
2.根据权利要求1所述的单胺氧化酶，其特征在于，所述的单胺氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ ID No：6。
3.根据权利要求1所述的单胺氧化酶，其特征在于，所述的单胺氧化酶的mRNA序列为SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5。
4.编码权利要求1-3任一项所述的单胺氧化酶的核酸。
5.含有权利要求4所述的核酸的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，构建重组表达载体所用的质粒为pET28a。
7.含有权利要求5-6所述的重组表达载体的重组表达转化体。
8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
9.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其特征在于，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
10.权利要求1-3任一项所述的单胺氧化酶，在水溶液中，在有过氧化氢酶存在的条件下，催化6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷氧化得到(1R,5S)-6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己-2-烯的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的单胺氧化酶为100毫克-10克每升；过氧化氢酶的用量为10毫克-300毫克。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的水溶液为pH范围在5.0～8.0的缓冲液，所述的氧化反应在振荡或搅拌条件下进行；所述的氧化反应的反应温度为20～60℃。
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