[go: up one dir, main page]

CN114761541A - 有用物质的制造方法 - Google Patents

有用物质的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114761541A
CN114761541A CN202080080653.9A CN202080080653A CN114761541A CN 114761541 A CN114761541 A CN 114761541A CN 202080080653 A CN202080080653 A CN 202080080653A CN 114761541 A CN114761541 A CN 114761541A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
glutathione
promoter
leu
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080080653.9A
Other languages
English (en)
Inventor
松井美里
小林新吾
田冈直明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Publication of CN114761541A publication Critical patent/CN114761541A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
    • C12Y304/11004—Tripeptide aminopeptidase (3.4.11.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
    • C12Y108/01007—Glutathione-disulfide reductase (1.8.1.7), i.e. glutathione reductase (NADPH)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02002—Gamma-glutamyltransferase (2.3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02002—Glutamate-cysteine ligase (6.3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本说明书公开了谷胱甘肽等肽的制造方法、以及该方法所能够使用的微生物。第一方面的一个以上的实施方式涉及一种谷胱甘肽等肽的制造方法，该方法包括：将选自gshA基因、gshB基因及gshF基因中的1个以上基因的表达量比野生株增加了的原核微生物株在半胱氨酸及胱氨酸的总浓度为0.5g/L以下的培养基中进行培养。第二方面涉及一种微生物，其缺失了γ‑谷氨酰转移酶基因及谷胱甘肽还原酶基因、且增强了gshA基因及gshB、或gshF基因的表达。

Description

有用物质的制造方法
技术领域
第一方面的一个以上的实施方式涉及γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造方法。
第一方面的另外的一个以上的实施方式涉及能够过量产生γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的原核微生物株。
第二方面涉及缺失了谷胱甘肽还原酶基因的制造谷胱甘肽的微生物、以及使用了该微生物的谷胱甘肽的制造方法。
背景技术
谷胱甘肽已知存在还原型及氧化型，还原型谷胱甘肽是由L-半胱氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸这3种氨基酸构成的肽。另外，氧化型谷胱甘肽是2分子还原型谷胱甘肽的硫醇基经二硫键键合而成的化合物。不仅是人体，还存在于其它的动物、植物、微生物等很多的生物体内，在活性氧的消除作用、解毒作用、氨基酸的代谢等方面对于生物体而言是非常重要的化合物。因此，在医药品、食品、化妆品工业上备受关注。此外，近年来发现氧化型谷胱甘肽具有促进植物生长的效果，期待其在包括农业在内的各个领域的用途。
谷胱甘肽在生物体内以还原型谷胱甘肽(以下有时称为“GSH”)和氧化型谷胱甘肽(以下有时称为“GSSG”)中的任意形态存在，所述以还原型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被还原的SH的形态，所述氧化型谷胱甘肽是L-半胱氨酸残基的硫醇基被氧化而在2分子谷胱甘肽之间形成了二硫键的形态。
作为谷胱甘肽的制造方法，已知有使用酵母或大肠杆菌通过发酵而制造的方法(专利文献1)；使用微生物生产γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶，并将L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸进行酶促连接，从而进行制造的方法(专利文献3、4)等。
例如，专利文献1中记载了一种谷胱甘肽的制造方法，其特征在于，通过在培养基中培养硫醇氧化酶的活性比亲本株增大了的酵母，使其产生谷胱甘肽，然后从得到的培养液回收谷胱甘肽。
另外，专利文献2中记载了一种谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法，该方法包括：在培养基中培养具有谷胱甘肽转运活性的蛋白质的活性及谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸的生物合成相关蛋白质的活性比亲本株高的微生物，使谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸在该培养基中产生、积蓄，并从培养物中收集谷胱甘肽或γ-谷氨酰半胱氨酸。在专利文献2的实施例4中记载了，在添加了氨基酸的培养基中培养使gshA基因及gshB过量表达的大肠杆菌株，结果是培养基中的谷胱甘肽浓度为160mg/L，所述gshA基因是大肠杆菌来源的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因，所述gshB是谷胱甘肽合成酶基因。
在非专利文献1中记载了如下方法，该方法包括：将大肠杆菌在添加有作为谷胱甘肽的构成氨基酸的L-半胱氨酸、L-谷氨酸及甘氨酸的培养基中培养而制造谷胱甘肽，所述大肠杆菌通过包含被配置为组成型启动子控制下的双功能性谷胱甘肽合成酶gshF基因的表达载体进行了转化。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2016/140349
专利文献2：国际公开WO2008/126784
专利文献3：日本特开昭60-27396号公报
专利文献4：日本特开昭60-27397号公报
非专利文献
非专利文献1：Journal of Biotechnology(2018),https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.11.001
发明内容
发明要解决的课题
第一，要求能够生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的原核微生物株及使用了该原核微生物株的上述肽的制造方法的新方式。
第二，要求能够生产谷胱甘肽的微生物及使用了该微生物的谷胱甘肽的制造方法的新方式。
解决课题的方法
本说明书的第一方面包括以下的(1)～(14)所示的实施方式。
(1)一种γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：
将选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因及双功能性谷胱甘肽合成酶基因的1个以上基因的表达量比野生株增加了的原核微生物株在半胱氨酸及胱氨酸的总浓度为0.5g/L以下的培养基中进行培养。
(2)根据(1)所述的方法，其中，所述原核微生物株能够通过所述1个以上基因的诱导表达而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
(3)一种γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：
将选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因及双功能性谷胱甘肽合成酶基因的1个以上基因的表达量比野生株增加了的原核微生物株在培养基中进行培养，
该方法不包括在所述培养基中添加半胱氨酸或胱氨酸。
(4)根据(3)所述的方法，其中，所述原核微生物株能够通过所述1个以上基因的诱导表达而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
(5)一种能够过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的原核微生物株，其保持有可表达地连接于启动子的选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因，其中，
所述启动子是在所述1个以上基因为谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的情况下使所述原核微生物株的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的转录量为野生株的20倍以上的启动子。
(6)根据(5)所述的原核微生物株，其中，所述启动子是诱导型启动子。
(7)根据(6)所述的原核微生物株，其中，所述诱导型启动子是IPTG诱导型启动子、光诱导型启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。
(8)根据(7)所述的原核微生物株，其中，所述诱导型启动子是T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、tac启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。
(9)根据(8)所述的原核微生物株，其中，所述诱导型启动子为T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子或tac启动子。
(10)根据(9)所述的原核微生物株，其中，所述诱导型启动子为T5启动子。
(11)根据(5)～(10)中任一项所述的原核微生物株，其为肠道细菌的转化体。
(12)根据(5)～(10)中任一项所述的原核微生物株，其为大肠杆菌的转化体。
(13)根据(1)或(2)所述的方法，其中，所述原核微生物株为(5)～(12)中任一项所述的原核微生物株。
(14)根据(3)或(4)所述的方法，其中，所述原核微生物株为(5)～(12)中任一项所述的原核微生物株。
本说明书的第二方面包括以下的(15)～(22)所示的实施方式。
(15)一种微生物，其缺失了以下的[1]基因及[2]基因、且增强了[3]基因或[4]基因的表达：
[1]编码γ-谷氨酰转移酶(EC:2.3.2.2)的基因；
[2]编码谷胱甘肽还原酶(EC:1.8.1.7)的基因；
[3]编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EC:6.3.2.2)的基因、以及编码谷胱甘肽合成酶(EC:6.3.2.3)的基因；
[4]编码双功能性谷胱甘肽合成酶的基因。
(16)根据(15)所述的微生物，其缺失了以下的[5]基因：
[5]编码三肽肽酶(EC:3.4.11.4)的基因。
(17)根据(15)或(16)所述的微生物，其中，微生物为细菌的转化体。
(18)根据(15)或(16)所述的微生物，其中，微生物为肠道细菌的转化体。
(19)根据(15)或(16)所述的微生物，其中，微生物为革兰氏阴性菌的转化体。
(20)根据(15)或(16)所述的微生物，其中，微生物为大肠杆菌的转化体。
(21)一种谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：在培养基中培养(15)～(20)中任一项所述的微生物。
本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-211477号及日本专利申请号2020-002363号的公开内容。
发明的效果
根据本说明书的第一方面的方法，由于不需要添加半胱氨酸或胱氨酸的工序，因此能够以低成本制造γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
本说明书的第一方面的原核微生物株能够高效地生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
本说明书的第二方面的微生物的基于发酵的谷胱甘肽生产性高。
根据本说明书的第二方面的谷胱甘肽的制造方法，能够效率良好地制造谷胱甘肽。
具体实施方式
以下，对本说明书的第一方面及第二方面的优选实施方式具体进行说明，但本说明书的第一方面及第二方面的范围并不限定于这些实施方式。
＜1.酶＞
＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞
γ-谷氨酰转移酶(EC:2.3.2.2)是将谷胱甘肽等γ-谷氨酰肽进行水解的酶。
“γ-谷氨酰转移酶”也称为“γ-谷氨酰转肽酶”或“Ggt”。在本说明书中，“γ-谷氨酰转移酶”、“γ-谷氨酰转肽酶”及“Ggt”可以相互替换。
作为γ-谷氨酰转移酶的具体例，可以举出：
(1A)由序列号22所示的氨基酸序列构成的多肽；
(1B)由在序列号22所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列的多肽(特别优选为由在序列号22所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有γ-谷氨酰转移酶活性的多肽；
(1C)由相对于序列号22所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有γ-谷氨酰转移酶活性的多肽；或者
(1D)(1A)～(1C)中的任意多肽的具有γ-谷氨酰转移酶活性的片段。
在上述(1D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为200以上、更优选为300以上、更优选为400以上、更优选为500以上、更优选为550以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(1B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是指电荷、侧链、极性、芳香性等性质类似的氨基酸之间的置换。性质类似的氨基酸例如可以分类为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
在上述(1C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号22所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。序列同一性可以使用基于BLAST、FASTA的蛋白质检索系统而计算(Karlin,S.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877；Altschul,S.F.et al.,1990,J.Mol.Biol.,215:403-410；Pearson,W.R.et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448)。以下，在本说明书中，氨基酸序列的“序列同一性”以相同的含义使用。
“编码γ-谷氨酰转移酶(EC:2.3.2.2)的基因”是指编码γ-谷氨酰转移酶的氨基酸序列的核酸(DNA或RNA、优选为DNA)，其包含于使γ-谷氨酰转移酶缺失之前的野生型微生物的染色体上的基因组DNA中。
将大肠杆菌来源的编码γ-谷氨酰转移酶的序列号22所示的氨基酸序列的DNA的一例示于序列号21。其中，在野生型的微生物的基因组DNA中，序列号21的碱基序列并不限于以该状态存在，序列号21的碱基序列是外显子序列，其中可以夹杂1个以上的内含子序列。
即，作为编码γ-谷氨酰转移酶的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(1E)序列号21所示的碱基序列；
(1F)在序列号21所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号21所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有γ-谷氨酰转移酶活性的多肽的碱基序列；
(1G)相对于序列号21所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有γ-谷氨酰转移酶活性的多肽的碱基序列；
(1H)(1E)～(1G)中的任意碱基序列的编码具有γ-谷氨酰转移酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(1I)(1E)～(1H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(1J)编码(1A)～(1D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(1K)以(1E)～(1J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列。
在上述(1G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基序列一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号21的全部碱基数的比例(％)。序列同一性可以使用基于BLAST、FASTA的碱基序列检索系统而计算(Karlin,S.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877；Altschul,S.F.etal.,1990,J.Mol.Biol.,215:403-410；Pearson,W.R.et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448)。以下，在本说明书中，碱基序列的“序列同一性”以相同的含义使用。
＜1.2.谷胱甘肽还原酶＞
谷胱甘肽还原酶(EC:1.8.1.7)是催化在NADPH存在下将氧化型谷胱甘肽(二硫化谷胱甘肽)还原而生成还原型谷胱甘肽的反应的酶。
作为谷胱甘肽还原酶的具体例，可以举出：
(2A)由序列号26所示的氨基酸序列构成的多肽；
(2B)由在序列号26所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在序列号26所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽；
(2C)由相对于序列号26所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽；或者
(2D)(2A)～(2C)中的任意多肽的具有谷胱甘肽还原酶活性的片段。
在上述(2D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为200以上、更优选为300以上、更优选为400以上的多肽。
在上述(2B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(2C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(2C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号26所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。
“编码谷胱甘肽还原酶(EC:1.8.1.7)的基因”是指编码谷胱甘肽还原酶的氨基酸序列的核酸(DNA或RNA、优选为DNA)，包含于使谷胱甘肽还原酶缺失之前的野生型微生物的染色体上的基因组DNA中。
将大肠杆菌来源的编码谷胱甘肽还原酶的序列号26所示的氨基酸序列的DNA的一例示于序列号25。其中，在野生型的微生物的基因组DNA中，序列号25的碱基序列并不限于以该状态存在，序列号25的碱基序列是外显子序列，其中可以夹杂1个以上的内含子序列。
即，作为编码谷胱甘肽还原酶的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(2E)序列号25所示的碱基序列；
(2F)在序列号25所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号25所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽的碱基序列；
(2G)相对于序列号25所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽的碱基序列；
(2H)(2E)～(2G)中的任意碱基序列的编码具有谷胱甘肽还原酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(2I)(2E)～(2H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(2J)编码(2A)～(2D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(2K)以(2E)～(2J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列。
上述(2G)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1G)的说明所述。即，在上述(2G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号25的全部碱基数的比例(％)。
＜1.3.三肽肽酶＞
三肽肽酶(EC:3.4.11.4)是催化使末端氨基酸残基从三肽游离的反应的酶。
“三肽肽酶”也称为“肽酶T”或“PepT”。在本说明书中，“三肽肽酶”、“肽酶T”及“PepT”可以相互替换。
作为三肽肽酶的具体例，可以举出：
(5A)由序列号24所示的氨基酸序列构成的多肽；
(5B)由在序列号24所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在序列号24所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有三肽肽酶活性的多肽；
(5C)由相对于序列号24所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有三肽肽酶活性的多肽；或者
(5D)(5A)～(5C)中的任意多肽的具有三肽肽酶活性的片段。
在上述(5D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为200以上、更优选为300以上、更优选为350以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(5B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(5C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(5C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号24所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。
“编码三肽肽酶(EC:3.4.11.4)的基因”是指编码三肽肽酶的氨基酸序列的核酸(DNA或RNA、优选为DNA)，包含于使三肽肽酶缺失之前的野生型微生物的染色体上的基因组DNA中。
将大肠杆菌来源的编码三肽肽酶的序列号24所示的氨基酸序列的DNA的一例示于序列号23。其中，在野生型的微生物的基因组DNA中，序列号23的碱基序列并不限于以该状态存在，序列号23的碱基序列是外显子序列，其中可以夹杂1个以上的内含子序列。
即，作为编码三肽肽酶的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(5E)序列号23所示的碱基序列；
(5F)在序列号23所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号23所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有三肽肽酶活性的多肽的碱基序列；
(5G)相对于序列号23所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有三肽肽酶活性的多肽的碱基序列；
(5H)(5E)～(5G)中的任意碱基序列的编码具有三肽肽酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(5I)(5E)～(5H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(5J)编码(5A)～(5D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(5K)以(5E)～(5J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列。
上述(5G)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1G)的说明所述。即，在上述(5G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号23的全部碱基数的比例(％)。
＜1.4.谷氨酸-半胱氨酸连接酶＞
谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EC:6.3.2.2)是催化在ATP存在下将L-半胱氨酸识别为底物并使其与L-谷氨酸结合而生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应的酶，只要具有该活性即可，其来源、结构等没有特别限定。在本说明书中，将该活性称为谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol的γ-谷氨酰半胱氨酸的活性，是在以下的测定条件下测得的。
“谷氨酸-半胱氨酸连接酶”也称为“谷氨酸半胱氨酸连接酶”或“GshA”。在本说明书中，“谷氨酸-半胱氨酸连接酶”、“谷氨酸半胱氨酸连接酶”及“GshA”可以相互替换。
(测定条件)
将酶液添加于含有10mM的ATP、15mM的L-谷氨酸、15mM的L-半胱氨酸、10mM的硫酸镁的50mM Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)中，在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸使反应停止。使用高效液相色谱对反应液中的γ-谷氨酰半胱氨酸进行定量。
上述高效液相色谱的条件如下所述。在该条件下，按照还原型谷胱甘肽(GSH)、γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)、双-γ-谷氨酰胱氨酸(氧化型γ-GC)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的顺序溶出。
[HPLC条件]
色谱柱：ODS-HG-3(4.6mmφ×150mm、野村化学株式会社制)；
洗脱液：将磷酸二氢钾12.2g及庚烷磺酸钠3.6g用蒸馏水1.8L溶解后，用磷酸将该溶液调整为pH2.8，追加甲醇186ml而溶解得到的液体；
流速：1.0ml/分；
柱温：40℃；
测定波长：210nm
作为谷氨酸-半胱氨酸连接酶，优选使用每1mg蛋白质的谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性(比活性)为0.5U以上、优选为1U以上、进一步优选为5U以上、最优选为10U以上的谷氨酸-半胱氨酸连接酶。
谷氨酸-半胱氨酸连接酶的来源没有特别限定，可以使用微生物、动物、植物等来源的酶。优选为微生物来源的谷氨酸-半胱氨酸连接酶，特别优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等肠道细菌、杆状菌等细菌、酵母等真核微生物等来源的谷氨酸-半胱氨酸连接酶。
将大肠杆菌来源的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的碱基序列、以及由该碱基序列编码的氨基酸序列的具体例分别示于序列号12及序列号13。
另外，作为谷氨酸-半胱氨酸连接酶，并不限于由序列号13所示的氨基酸序列构成的谷氨酸-半胱氨酸连接酶，也可以使用其活性突变体、其它物种直系同源等具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的其它多肽。具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下显示出使用了由序列号13所示的氨基酸序列构成的谷氨酸-半胱氨酸连接酶时的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。
作为谷氨酸-半胱氨酸连接酶的具体例，可以举出：
(3-1A)由序列号13所示的氨基酸序列构成的多肽；
(3-1B)由在序列号13所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在序列号13所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的多肽；
(3-1C)由相对于序列号13所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的多肽；或者
(3-1D)(3-1A)～(3-1C)中的任意多肽的具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的片段。
在上述(3-1D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为200以上、更优选为300以上、更优选为400以上、更优选为450以上、更优选为500以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(3-1B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(3-1C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(3-1C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号13所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。
“编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EC:6.3.2.2)的基因”是指编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的氨基酸序列的核酸(DNA或RNA、优选为DNA)。
将大肠杆菌来源的编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的序列号13所示的氨基酸序列的DNA的一例示于序列号12。编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的氨基酸序列的核酸的碱基序列可以针对宿主进行密码子优化。
即，作为编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(3-1E)序列号12所示的碱基序列；
(3-1F)在序列号12所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号12所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的多肽的碱基序列；
(3-1G)相对于序列号12所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的多肽的碱基序列；
(3-1H)(3-1E)～(3-1G)中的任意碱基序列的编码具有谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(3-1I)(3-1E)～(3-1H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(3-1J)编码(3-1A)～(3-1D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(3-1K)以(3-1E)～(3-1J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列。
上述(3-1G)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1G)的说明所述。即，在上述(3-1G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号12的全部碱基数的比例(％)。
＜1.5.谷胱甘肽合成酶＞
谷胱甘肽合成酶(EC:6.3.2.3)是催化在ATP存在下将γ-谷氨酰半胱氨酸识别为底物并使其与甘氨酸结合而生成GSH的反应的酶，只要具有该活性即可，其来源、结构等没有特别限定。在本说明书中，将该活性称为谷胱甘肽合成酶活性。该活性的1U是指在30℃下1分钟生成1μmol的谷胱甘肽的活性，是在以下的测定条件下测得的。
“谷胱甘肽合成酶”也称为“GshB”。在本说明书中，“谷胱甘肽合成酶”与“GshB”可以相互替换。
(测定条件)
将酶液添加于含有10mM的ATP、15mM的γ-谷氨酰半胱氨酸、15mM的甘氨酸、10mM的硫酸镁的50mM Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)中，在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸使反应停止。使用高效液相色谱对反应液中的谷胱甘肽进行定量。
高效液相色谱的条件采用与谷氨酸-半胱氨酸连接酶的活性测定法相关的上述相同的条件。
作为谷胱甘肽合成酶，优选使用每1mg蛋白质的谷胱甘肽合成酶活性(比活性)为0.5U以上、优选为1U以上、进一步优选为5U以上、最优选为10U以上的谷胱甘肽合成酶。
谷胱甘肽合成酶没有特别限定，可以使用微生物、动物、植物等来源的酶。优选为微生物来源的谷胱甘肽合成酶，特别优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等肠道细菌、杆状菌等细菌、酵母等真核微生物、属于嗜氢菌科(Hydrogenophilales)的微生物等来源的谷胱甘肽合成酶。
属于嗜氢菌科(Hydrogenophilales)的微生物来源的谷胱甘肽合成酶优选为属于硫杆菌(Thiobacillus)属的微生物来源的谷胱甘肽合成酶，更优选为属于脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)的微生物来源的谷胱甘肽合成酶。特别优选为脱氮硫杆菌ATCC25259株来源的谷胱甘肽合成酶。
(大肠杆菌来源的谷胱甘肽合成酶或其突变体的优选实施方式)
将大肠杆菌来源的谷胱甘肽合成酶的碱基序列、以及由该碱基序列编码的氨基酸序列的具体例分别示于序列号14及序列号15。
另外，作为谷胱甘肽合成酶，并不限于由序列号15所示的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶，也可以使用其活性突变体、其它物种直系同源等具有谷胱甘肽合成酶活性的其它多肽。具有谷胱甘肽合成酶活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下显示出使用了由序列号15所示的氨基酸序列构成的谷胱甘肽合成酶时的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。
作为大肠杆菌来源的谷胱甘肽合成酶或其突变体的具体例，可以举出：
(3-2A)由序列号15所示的氨基酸序列构成的多肽；
(3-2B)由在序列号15所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在序列号15所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽；
(3-2C)由相对于序列号15所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽；或者
(3-2D)(3-2A)～(3-2C)中的任意多肽的具有谷胱甘肽合成酶活性的片段。
在上述(3-2D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为200以上、更优选为250以上、更优选为300以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(3-2B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(3-2C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(3-2C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号15所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。
“编码谷胱甘肽合成酶(EC:6.3.2.3)的基因”是指编码谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列的核酸(DNA或RNA、优选为DNA)。
将大肠杆菌来源的编码谷胱甘肽合成酶的序列号15所示的氨基酸序列的DNA的一例示于序列号14。编码谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列的核酸的碱基序列可以针对宿主进行密码子优化。
即，作为编码大肠杆菌来源的谷胱甘肽合成酶或其突变体的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(3-2E)序列号14所示的碱基序列；
(3-2F)在序列号14所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号14所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽的碱基序列；
(3-2G)相对于序列号14所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽的碱基序列；
(3-2H)(3-2E)～(3-2G)中的任意碱基序列的编码具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(3-2I)(3-2E)～(3-2H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(3-2J)编码(3-2A)～(3-2D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(3-2K)以(3-2E)～(3-2J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列。
上述(3-2G)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1G)的说明所述。即，在上述(3-2G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号14的全部碱基数的比例(％)。
(脱氮硫杆菌来源的谷胱甘肽合成酶或其突变体的优选实施方式)
谷胱甘肽合成酶的其它的适宜的具体例是脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)ATCC25259株来源的野生型谷胱甘肽合成酶或其活性突变体。将脱氮硫杆菌ATCC25259株的野生型谷胱甘肽合成酶的碱基序列、以及由该碱基序列编码的氨基酸序列的具体例分别示于序列号16及序列号17。上述野生型谷胱甘肽合成酶的活性突变体优选为在上述的活性测定条件下显示出使用了由序列号17所示的氨基酸序列构成的野生型谷胱甘肽合成酶时的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。
作为脱氮硫杆菌ATCC25259株的谷胱甘肽合成酶或其突变体的具体例，可以举出：
(3-3A)由序列号17所示的氨基酸序列构成的多肽；
(3-3B)由在序列号17所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在序列号17所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽；
(3-3C)由相对于序列号17所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽；或者
(3-3D)(3-3A)～(3-3C)中的任意多肽的具有谷胱甘肽合成酶活性的片段。
在上述(3-3D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为200以上、更优选为250以上、更优选为300以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(3-3B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(3-3C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(3-3C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号17所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。
将编码脱氮硫杆菌ATCC25259株的谷胱甘肽合成酶的序列号17所示的氨基酸序列的DNA的一例示于序列号16。编码谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列的核酸的碱基序列可以针对宿主进行密码子优化。
即，作为编码脱氮硫杆菌ATCC25259株的谷胱甘肽合成酶或其突变体的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(3-3E)序列号16所示的碱基序列；
(3-3F)在序列号16所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号16所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽的碱基序列；
(3-3G)相对于序列号16所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽的碱基序列；
(3-3H)(3-3E)～(3-3G)中的任意碱基序列的编码具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(3-3I)(3-3E)～(3-3H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(3-3J)编码(3-3A)～(3-3D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(3-3K)以(3-3E)～(3-3J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列。
上述(3-3G)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1G)的说明所述。即，在上述(3-3G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号16的全部碱基数的比例(％)。
(脱氮硫杆菌来源的谷胱甘肽合成酶的活性突变体的优选实施方式)
谷胱甘肽合成酶的其它优选例是包含序列号17所示的氨基酸序列的脱氮硫杆菌ATCC25259株的野生型谷胱甘肽合成酶的活性突变体，特别优选为国际公开WO2018/084165中记载的多肽。
上述活性突变体具体可以举出：
(3-4A)由序列号17所示的氨基酸序列中选自第13、17、20、23、39、70、78、101、113、125、126、136、138、149、152、154、155、197、200、215、226、227、230、239、241、246、249、254、260、262、263、270、278、299、305、307及310位的1个或多个氨基酸被置换的氨基酸序列3-4A构成的多肽；
(3-4B)由在上述氨基酸序列3-4A中除上述氨基酸部位以外的氨基酸中的1个～多个氨基酸发生了添加、缺失或置换而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在上述氨基酸序列3-4A的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽；
(3-4C)由相对于上述氨基酸序列3-4A、上述氨基酸部位一致且在除上述氨基酸部位以外的部分具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有谷胱甘肽合成酶活性的多肽；或者
(3-4D)(3-4A)～(3-4C)中的任意多肽的具有谷胱甘肽合成酶活性的片段。
在上述(3-4D)中，作为片段，可以使用氨基酸数优选为150以上、更优选为200以上、更优选为300以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(3-4B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(3-4C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(3-4C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，上述氨基酸序列3-4A的上述氨基酸部位以外的相同氨基酸残基相对于上述氨基酸部位以外的全部氨基酸残基数的比例(％)。
上述氨基酸序列3-4A更优选为在序列号17所示的氨基酸序列中导入了选自下组中的1个或多个氨基酸置换的氨基酸序列：
第13位被置换为丝氨酸、第17位被置换为谷氨酸、第20位被置换为苏氨酸、第23位被置换为亮氨酸、第39位被置换为苏氨酸、第70位被置换为丝氨酸、第78位被置换为亮氨酸、第101位被置换为天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、第113位被置换为组氨酸、第125位被置换为缬氨酸、第126位被置换为天冬酰胺、第136位被置换为苏氨酸、第138位被置换为丙氨酸、第149位被置换为谷氨酰胺、第152位被置换为谷氨酰胺、第154位被置换为天冬酰胺、第155位被置换为亮氨酸、第197位被置换为谷氨酰胺、第200位被置换为丝氨酸、第215位被置换为天冬氨酸、第226位被置换为精氨酸、第227位被置换为丝氨酸、第230位被置换为脯氨酸、第239位被置换为丝氨酸、第241位被置换为组氨酸、第246位被置换为精氨酸、第249位被置换为谷氨酸、第254位被置换为天冬氨酸、第260位被置换为丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、第262位被置换为半胱氨酸、第263位被置换为精氨酸、第270位被置换为异亮氨酸、第278位被置换为甘氨酸、丙氨酸、第299位被置换为丙氨酸、第305位被置换为甘氨酸、第307位被置换为缬氨酸、以及第310位被置换为苏氨酸。
上述氨基酸序列3-4A特别优选为在序列号17所示的氨基酸序列中导入了以下的(1)～(35)中任一项所示的氨基酸置换而成的氨基酸序列：
(1)第13位为丝氨酸、
(2)第17位为谷氨酸、第113位为组氨酸、第230位为脯氨酸、
(3)第20位为苏氨酸、第215位为天冬氨酸、
(4)第20位为苏氨酸、第241位为组氨酸、
(5)第23位为亮氨酸、第126位为天冬酰胺、
(6)第39位为苏氨酸、第260位为丙氨酸、
(7)第70位为丝氨酸、第260位为丙氨酸、
(8)第78位为亮氨酸、第278位为丙氨酸、
(9)第101位为天冬酰胺、
(10)第101位为谷氨酰胺、
(11)第101位为丝氨酸、
(12)第101位为丝氨酸、第260位为丙氨酸、
(13)第101位为苏氨酸、
(14)第125位为缬氨酸、第249位为谷氨酸、
(15)第125位为缬氨酸、第152位为谷氨酰胺、
(16)第136位为苏氨酸、
(17)第138位为丙氨酸、第149位为谷氨酰胺、第241位为组氨酸、第263位为谷氨酰胺、
(18)第154位为天冬酰胺、第246位为精氨酸、
(19)第155位为亮氨酸、第239位为丝氨酸、
(20)第197位为谷氨酰胺、
(21)第200位为丝氨酸、第260位为丙氨酸、
(22)第226位为精氨酸、第260位为丙氨酸、
(23)第227位为丝氨酸、第260位为丙氨酸、
(24)第254位为天冬氨酸、第260位为丙氨酸、
(25)第260位为丙氨酸、
(26)第260位为丙氨酸、第278位为甘氨酸、第307位为缬氨酸、
(27)第260位为丙氨酸、第299位为丙氨酸、
(28)第260位为丙氨酸、第305位为甘氨酸、
(29)第260位为丙氨酸、第310位为苏氨酸、
(30)第260位为半胱氨酸、
(31)第260位为甘氨酸、
(32)第260位为谷氨酰胺、
(33)第260位为苏氨酸、
(34)第262位为半胱氨酸、
(35)第270位为异亮氨酸。
可以利用编码上述(3-4A)～(3-4D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列作为“编码谷胱甘肽合成酶(EC:6.3.2.3)的基因”。
将编码活性突变体的氨基酸序列的碱基序列的一例示于序列号18，所述活性突变体是在脱氮硫杆菌ATCC25259株的谷胱甘肽合成酶的序列号17所示的氨基酸序列中第260位的缬氨酸被置换为丙氨酸而成的。编码脱氮硫杆菌ATCC25259株的谷胱甘肽合成酶的活性突变体的氨基酸序列的核酸的碱基序列可以针对宿主进行密码子优化。
＜1.6.双功能性谷胱甘肽合成酶＞
双功能性谷胱甘肽合成酶是同时具有如下活性的酶，所述活性为催化在ATP存在下将L-半胱氨酸识别为底物并使其与L-谷氨酸结合而生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应的活性、以及催化在ATP存在下将γ-谷氨酰半胱氨酸识别为底物并使其与甘氨酸结合而生成GSH的反应的活性，只要具有该活性即可，其来源、结构等没有特别限定。在本说明书中，将该活性称为双功能性谷胱甘肽合成酶活性。该活性的1U指在30℃下1分钟生成1μmol的GSH的活性，是在以下的测定条件下测得的。
“双功能性谷胱甘肽合成酶”也称为“GshF”。在本说明书中，“双功能性谷胱甘肽合成酶”与“GshF”可以相互替换。
(测定条件)
将酶液添加于含有10mM的ATP、15mM的L-谷氨酸、15mM的L-半胱氨酸、15mM的甘氨酸、10mM的硫酸镁的50mM Tris盐酸盐缓冲液(pH8.0)中，在30℃下保温，由此进行反应，通过添加6N盐酸使反应停止。使用高效液相色谱对反应液中的谷胱甘肽进行定量。
高效液相色谱的条件采用与谷氨酸-半胱氨酸连接酶的活性测定法相关的上述相同的条件。
作为双功能性谷胱甘肽合成酶，优选使用每1mg蛋白质的双功能性谷胱甘肽合成酶活性(比活性)为0.5U以上、优选为1U以上、进一步优选为5U以上、最优选为10U以上的双功能性谷胱甘肽合成酶。
双功能性谷胱甘肽合成酶的来源没有特别限定，可以使用微生物、动物、植物等来源的酶。优选为微生物来源的双功能性谷胱甘肽合成酶。特别优选为细菌来源的双功能性谷胱甘肽合成酶，具体而言，优选为下述细菌中至少1种来源的双功能性谷胱甘肽合成酶：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、猪链球菌(Streptococcus suis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等链球菌(Streptococcus)属细菌；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等乳杆菌(Lactobacillus)属细菌；嗜冷脱硫枝条菌(Desulfotalea psychrophila)等脱硫枝条菌(Desulfotalea)属细菌；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)等梭菌(Clostridium)属细菌；无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等李斯特氏菌(Listeria)属细菌；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)等肠球菌(Enterococcus)属细菌；麦氏巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)等巴斯德氏菌(Pasteurella)属细菌；产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniciprodecens)等海姆氏菌(Mannheimia)属细菌；以及睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)等嗜血杆菌(Haemophilus)属细菌。
将无乳链球菌来源的双功能性谷胱甘肽合成酶的碱基序列、以及由该碱基序列编码的氨基酸序列的具体例分别示于序列号19及序列号20。需要说明的是，序列号19的碱基序列是编码由序列号20所示的氨基酸序列构成的无乳链球菌来源的双功能性谷胱甘肽合成酶的碱基序列，是使其符合了大肠杆菌中密码子使用频率的碱基序列。
另外，作为双功能性谷胱甘肽合成酶，并不限于由序列号20所示的氨基酸序列构成的双功能性谷胱甘肽合成酶，也可以使用其活性突变体、其它物种直系同源等具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的其它多肽。具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的其它多肽优选为在上述的活性测定条件下显示出使用了由序列号20所示的氨基酸序列构成的双功能性谷胱甘肽合成酶时的10％以上、优选为40％以上、更优选为60％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上的活性的多肽。
作为双功能性谷胱甘肽合成酶的具体例，可以举出：
(4A)由序列号20所示的氨基酸序列构成的多肽；
(4B)由在序列号20所示的氨基酸序列中添加、缺失或置换了1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽(特别优选为由在序列号20所示的氨基酸序列的N末端及C末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽)、且是具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的多肽；
(4C)由相对于序列号20所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的多肽、且是具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的多肽；或者
(4D)(4A)～(4C)中的任意多肽的具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的片段。
在上述(4D)中，作为片段，可以是氨基酸数优选为400以上、更优选为500以上、更优选为600以上、更优选为700以上、更优选为730以上的多肽。
上述各多肽可以适当进行化学修饰。
在上述(4B)中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，氨基酸的置换优选为保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1B)的说明所述。
上述(4C)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1C)的说明所述。即，在上述(4C)中，“序列同一性”是指，将两个氨基酸序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的氨基酸一致性达到最高时，相同氨基酸残基相对于序列号20所示的蛋白质的全部氨基酸残基数的比例(％)。
“编码双功能性谷胱甘肽合成酶的基因”是指编码双功能性谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列的核酸(DNA或RNA、优选为DNA)。
作为编码双功能性谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列的基因的碱基序列的具体例，可以举出：
(4E)序列号19所示的碱基序列；
(4F)在序列号19所示的碱基序列中添加、缺失或置换了1个～多个碱基而成的碱基序列(特别优选为在序列号19所示的碱基序列的5’末端及3’末端的一者或两者置换、缺失和/或添加、优选缺失和/或添加了总计1个～多个碱基而成的碱基序列)、且是编码具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的多肽的碱基序列；
(4G)相对于序列号19所示的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的碱基序列、且是编码具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的多肽的碱基序列；
(4H)(4E)～(4G)中的任意碱基序列的编码具有双功能性谷胱甘肽合成酶活性的多肽的氨基酸序列的部分碱基序列；
(4I)(4E)～(4H)中的碱基序列中导入了沉默突变(不使待编码的氨基酸残基发生改变的碱基置换)的碱基序列；
(4J)编码(4A)～(4D)中的任意多肽的氨基酸序列的碱基序列；或者
(4K)以(4E)～(4J)中的任意碱基序列作为外显子序列、且其中夹杂有1个以上内含子序列的碱基序列
上述(4G)中的“序列同一性”如＜1.1.γ-谷氨酰转移酶＞一栏中关于(1G)的说明所述。即，在上述(4G)中，“序列同一性”是指，将两个碱基序列进行排列(比对)，并根据需要引入空位，在使两者的碱基一致性达到最高时，相同碱基相对于序列号19的全部碱基数的比例(％)。
＜2.第一方面＞
对于本说明书的第一方面的γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造方法、以及原核微生物株进行说明。
＜2.1.本说明书的第一方面的原核微生物株＞
第一方面的一个以上的实施方式涉及一种原核微生物株，其选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因的表达量比野生株增加，能够过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株能够通过在培养基中进行培养，从而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽，并使其积蓄在上述培养基中，因此可以出于高效地生产上述肽的目的而利用。对于第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物而言，即使在半胱氨酸及胱氨酸的总浓度为0.5g/L以下的培养基中、或者在未添加半胱氨酸或胱氨酸而制备的培养基中进行培养的情况下，也能够生产上述肽，因此可以降低上述肽的生产成本。
第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株优选为能够通过上述1个以上基因的诱导表达而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的原核微生物株。第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株能够通过在培养基中培养并诱导表达上述1个以上基因，从而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽，并使其积蓄在上述培养基中，因此可以出于高效地生产上述肽的目的而利用。
在第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株中，基因表达量增加了的酶只要是选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶、以及双功能性谷胱甘肽合成酶中的1种以上的酶即可。各酶的具体例如上所述。在为了用于γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸和/或γ-谷氨酰胱氨酸的制造而利用上述原核微生物株的情况下，优选谷氨酸-半胱氨酸连接酶、和/或双功能性谷胱甘肽合成酶的基因表达量比野生株增加。在为用于还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造而利用上述原核微生物株的情况下，优选谷氨酸-半胱氨酸连接酶及谷胱甘肽合成酶的基因表达量比亲本株增加、或者双功能性谷胱甘肽合成酶的基因表达量比野生株增加。
在第一方面的一个以上的实施方式中，作为成为宿主的原核微生物株，可以举出细菌、特别是属于埃希杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、短杆菌(Brevibacterium)属或棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物的细胞，特别优选为属于埃希杆菌属的微生物的细胞，最优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的细胞。另外，成为宿主的原核微生物株可以是肠道细菌。第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株可以是在原核微生物中保持有给定基因的转化体。
“野生株”是指，导入选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因之前的宿主株，也可以称为“亲本株”。
这里，“选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因的表达量比野生株增加”包括以下两个方面：在野生株原本表达上述1个以上基因的情况下，上述1个以上基因的表达量比野生株增加；以及，在野生株原本不表达上述1个以上基因的情况下，对野生株赋予了表达上述1个以上基因的能力。
上述1个以上基因的表达量的增加可以通过以下方式实现：在原核微生物株的细胞内使上述1个以上基因的拷贝数增加；在原核微生物株的细胞的基因组DNA上将控制上述1个以上基因的表达的启动子置换成更强力的表达启动子。
原核微生物的细胞内的上述1个以上基因的拷贝数的增加可以通过以下方式实现。
(1)将包含上述1个以上基因的表达载体导入原核微生物的细胞内、或者
(2)将上述1个以上基因导入原核微生物的细胞的基因组DNA。
作为上述(1)的方式中使用的表达载体，可以使用包含上述1个以上基因的质粒载体等。表达载体优选能够在原核微生物细胞内自主复制。表达载体优选含有：编码选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶、以及双功能性谷胱甘肽合成酶中的1种以上酶的DNA、和可操作地连接至能够转录该DNA的位置的启动子。表达载体优选为能够在原核微生物细胞中自主复制、且包含由启动子、核糖体结合序列、编码上述1种以上酶的氨基酸序列的碱基序列、以及转录终止序列构成的碱基序列的重组DNA。
作为适宜的质粒载体，可以示例出：pQEK1、pCA24N(DNA RESEARCH,12,191-299(2005))、pACYC177、pACYC184(可由Nippon Gene公司获得)、pQE30、pQE60、pQE70、pQE80及pQE9(可由Qiagen公司获得)；pTipQC1(可由Qiagen或Hokkaido System Science公司获得)、pTipRT2(可由Hokkaido System Science公司获得)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A及pNH46A(可由Stratagene公司获得)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(可由Addgene公司获得)；pRSF(可由MERCK公司获得)；以及pAC(可由Nippon Gene公司获得)、pUCN18(可将pUC18(可由Takara Bio公司获得)进行修饰而制备)、pSTV28(可由Takara Bio公司获得)、pUCNT(国际公开第94/03613号公报)等。
上述表达载体优选包含控制上述1个以上基因的转录的启动子。
在第一方面的一个以上的实施方式中，启动子优选为诱导型启动子。
作为诱导型启动子，可以示例出：异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子、在光的照射下诱导基因表达的光诱导型启动子、araBAD启动子(阿拉伯糖诱导型)、rhaBAD启动子(鼠李糖诱导型)、tet启动子(药物诱导型)、penP启动子(药物诱导型)、cspA启动子(对低温应答的温度诱导型启动子)、包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子等，优选为IPTG诱导型启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。
作为IPTG诱导型启动子的具体例，可以示例出：T5启动子、lacUV5启动子、lac启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、tac启动子等。作为诱导型启动子，特别优选为IPTG诱导型启动子，在IPTG诱导型启动子当中，特别优选为T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子或tac启动子。
作为启动子，也可以使用利用各种报告基因将现有启动子修饰为高活性型的启动子。例如，通过使启动子区域内的-35、-10区域接近共有序列，可以提高启动子的活性(国际公开WO2000/018935号)。作为高活性型启动子的例子，可以举出各种tac样启动子(Katashkina JI et al.Russian Federation Patent application 2006134574)。启动子的强度的评价方法及强力启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等。
在将包含上述1个以上基因的表达载体导入原核微生物的细胞内的情况下，优选细胞内的上述表达载体的拷贝数优选为2以上、更优选为3以上、更优选为5以上、更优选为10以上、更优选为15以上、更优选为20以上。
在原核微生物的细胞中，在使上述基因中的2个以上基因的表达量增加时，可以在1个表达载体内包含上述2个以上基因，在该情况下，上述2个以上基因可以被配置在1个表达启动子的控制下。另外，2个以上基因也可以分别包含在单独的表达载体内。
在通过上述(2)的方式将上述1个以上基因导入原核微生物的细胞的基因组DNA的情况下，可以利用同源重组。
在原核微生物的细胞的基因组DNA上将上述1个以上基因的启动子置换为更强力的表达启动子的情况下，作为表达启动子，可以利用与表达载体相同的启动子、更优选利用诱导型启动子。优选的启动子的具体例如上所述。
在第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株中，上述1个以上基因的表达量的增加的程度没有特别限定。上述1个以上基因的表达量可以表示为从细胞中提取出的与上述1个以上基因相对应的mRNA(即，编码选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶、以及双功能性谷胱甘肽合成酶中的1种以上酶的氨基酸序列的mRNA)的量。基于该mRNA的表达量优选以相对于编码适当的内标蛋白质的mRNA的量的相对值表示。在谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的表达量增加的实施方式中，原核微生物株中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的表达量(优选为将原核微生物株中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)优选为野生株中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的表达量(优选为将野生株中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)的5倍以上、更优选为10倍以上、更优选为20倍以上。在谷胱甘肽合成酶基因的表达量增加的实施方式中，原核微生物株中的谷胱甘肽合成酶的表达量(优选为将原核微生物株中的谷胱甘肽合成酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)优选为野生株中的谷胱甘肽合成酶的表达量(优选为将野生株中的谷胱甘肽合成酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)的5倍以上、更优选为10倍以上、更优选为20倍以上。作为内标蛋白质，可以示例出已知为管家基因的hcaT(序列号27)所编码的蛋白质。
在第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株中，更优选：具有将半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽分解的活性的酶的基因、或者谷胱甘肽摄取转运体基因的表达量比野生株降低、或丧失了上述基因的表达。在对这样的原核微生物株进行培养的情况下，上述肽容易积蓄在培养基中。
作为具有将γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽分解的活性的酶，可以示例出γ-谷氨酰转移酶及三肽肽酶。作为具有将半胱氨酸分解的活性的酶的基因，可以示例出色氨酸酶基因tnaA。作为谷胱甘肽摄取转运体基因，可以示例出yliABCD。
γ-谷氨酰转移酶的具体例如上所述。
三肽肽酶的具体例如上所述。
具有将半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽或氧化型谷胱甘肽分解的活性的酶的基因、或谷胱甘肽摄取转运体基因的表达量比野生株降低的原核微生物株、或者丧失了上述基因的表达的原核微生物株可以通过向原核微生物株的基因组DNA上的编码上述酶的碱基序列导入碱基的缺失、置换或添加的方法而制造。作为这样的方法，可以举出利用了同源重组的方法，具体可以使用日本特开2004-344029中记载的方法。
上述的第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株的更优选的实施方式是一种原核微生物株，其保持有可表达地连接于诱导型启动子的选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因，其中，
上述诱导型启动子是在上述1个以上基因为谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的情况下使上述原核微生物株的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的转录量为野生株的20倍以上的诱导型启动子，
通过上述1个以上基因的诱导表达，所述原核微生物株能够过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
在该更优选的实施方式的原核微生物株中，可表达地连接于诱导型启动子的上述1个以上基因可以以被包含于原核微生物株的基因组DNA的一部分的状态而保持，也可以以被包含于原核微生物株中存在的表达载体的状态而保持。表达载体的具体例如上所述。
作为诱导型启动子，只要在上述1个以上基因为谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的情况下使上述原核微生物株的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的转录量为野生株的20倍以上即可，没有特别限定。这里，转录量可以基于mRNA量进行评价。这里，用于确认诱导型启动子具有给定的表达能力的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因优选与野生株所具有的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因为相同种类。
这样的高表达诱导型启动子可以从上述的诱导型启动子的例子中选择，可以优选示例出IPTG诱导型启动子、光诱导型启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。作为高表达诱导型启动子，特别优选为IPTG诱导型启动子，在IPTG诱导型启动子当中，特别优选为T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子或tac启动子。
作为高表达诱导型启动子，如上所述，也可以使用利用各种报告基因修饰成高活性型的诱导型启动子。
＜2.2.本说明书的第一方面的基于细胞培养的有用物质的制造方法＞
第一方面的另外的一个以上的实施方式涉及一种γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽(以下称为“目标肽”)的制造方法，该方法包括：
将选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因的1个以上基因的表达量比野生株增加了的原核微生物株在半胱氨酸及胱氨酸的总浓度为0.5g/L以下的培养基中进行培养。
该方法中使用的上述原核微生物株优选为能够通过上述1个以上基因的诱导表达而过量生产上述目标肽的原核微生物株。
第一方面的另外的一个以上的实施方式涉及上述目标肽的制造方法，该方法包括：
将选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因的1个以上基因的表达量比野生株增加了的原核微生物株在培养基中进行培养，
该方法不包括在上述培养基中添加半胱氨酸或胱氨酸。
该方法中使用的上述原核微生物株优选为能够通过上述1个以上基因的诱导表达而过量生产上述目标肽的原核微生物株。
该方法基于以下的预料不到的发现：上述的第一方面的一个以上的实施方式的原核微生物株即使在半胱氨酸及胱氨酸的总浓度为0.5g/L以下的低浓度的培养基、或者在不进行添加半胱氨酸或胱氨酸的工序而制备的培养基中进行培养的情况下，也能够在培养基中积蓄包含半胱氨酸或胱氨酸作为组成氨基酸的上述目标肽。根据该方法，能够以低成本制造上述目标肽。
上述方法所使用的培养基只要包含碳源、氮源、无机盐、维生素等第一方面中使用的微生物的增殖及上述目标肽的生物合成所必需的营养素即可，可以是合成培养基、天然培养基的任意一种。
作为碳源，只要是待使用的微生物能够同化的碳源即可，可以列举：葡萄糖、果糖这样的糖质、乙醇、甘油这样的醇类、乙酸这样的有机酸类等。
作为氮源，可以列举：氨、硫酸铵等铵盐、胺等氮化合物、蛋白胨、大豆水解物这样的天然氮源等。
作为无机盐，可以列举：磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、碳酸钾等。
作为维生素，可以举出生物素、硫胺素等。进一步，可以根据需要添加第一方面的微生物的生长所要求的物质(例如，在氨基酸营养缺陷型的微生物的情况下为营养缺陷型氨基酸)。
优选在上述培养基中添加硫源及甘氨酸中的至少一者，优选添加两者。作为甘氨酸向培养基的添加浓度，可以举出例如100mM～2000mM、优选为400mM～1200mM。作为硫源向培养基的添加浓度，可以举出例如100mM～2000mM、优选为400mM～1200mM。
作为硫源，可以添加硫酸、硫代硫酸、亚硫酸、连二亚硫酸、硫化物或其盐等无机硫化合物的1种或多种。硫酸、硫代硫酸、亚硫酸、连二亚硫酸或硫化物可以是游离形式，也可以是盐，还可以是它们的任意的混合物。作为盐，没有特别限制，可以列举：钠盐、钙盐、铵盐、钾盐等。
甘氨酸可以是游离形式，也可以是盐，还可以是它们的任意的混合物。作为盐，没有特别限制，可以列举：硫酸盐、盐酸盐等。
硫源和/或甘氨酸可以在培养开始时或培养的过程中添加至培养基中。硫源和/或甘氨酸可以一次性添加于培养基，也可以连续地或间歇地添加于培养基。
硫源和/或甘氨酸可以在培养的整个期间包含于培养基中，也可以仅在培养的一部分期间包含于培养基中。例如，硫源及甘氨酸的添加量不需要在生产积蓄上述目标肽的阶段的整个期间为上述的范围，可以在培养过程中使培养基中含有含量达到上述范围的硫源和/或甘氨酸，随着培养时间的经过，硫源和/或甘氨酸含量减少。另外，可以连续地或间歇地添加、追加硫源和/或甘氨酸。需要说明的是，对于除硫源和/或甘氨酸以外的培养基成分，在培养期间浓度可以发生变动，也可以追加添加。
培养优选在振荡培养、通气搅拌培养这样的需氧条件下进行。培养温度为20～50℃、优选为20～42℃、更优选为28～38℃。培养时的pH为5～9、优选为6～7.5。培养时间为3小时～5天、优选为5小时～3天。
培养物中积蓄的上述目标肽可以通过通常的纯化方法收集。例如，在培养结束后，可以在通过离心分离等去除了培养物中的菌体、固体物质后，通过离子交换、浓缩、结晶分级进行收集。
＜3.第二方面＞
对于本说明书的第二方面的微生物及谷胱甘肽的制造方法进行说明。
在本说明书中，“谷胱甘肽”可以是还原型谷胱甘肽，也可以是氧化型谷胱甘肽，还可以是还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的混合物。在本说明书中，“谷胱甘肽”与“还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽”可以相互替换。
＜3.1.宿主微生物＞
第二方面的1个以上实施方式的成为缺失了下述的[1]基因及[2]基因、且增强了[3]基因或[4]基因的表达的微生物的宿主(亲本株)的微生物优选为细菌。上述细菌可以是肠道细菌。上述细菌可以是埃希杆菌(Escherichia)属细菌、泛菌(Pantoea)属细菌等革兰氏阴性菌，也可以是芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、短杆菌(Brevibacterium)属细菌、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌等革兰氏阳性细菌，优选为革兰氏阴性菌，特别优选为大肠杆菌。
第二方面的1个以上实施方式的微生物可以是在微生物中使给定基因缺失、且可表达地保持了给定基因的转化体。
＜3.2.本说明书的第二方面的微生物＞
第二方面的1个以上实施方式涉及使以下的[1]基因及[2]基因缺失、且使[3]基因或[4]基因的表达增强的微生物：
[1]编码γ-谷氨酰转移酶(EC:2.3.2.2)的基因；
[2]编码谷胱甘肽还原酶(EC:1.8.1.7)的基因；
[3]编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EC:6.3.2.2)的基因、以及编码谷胱甘肽合成酶(EC:6.3.2.3)的基因；
[4]编码双功能性谷胱甘肽合成酶的基因。
上述微生物的基于发酵的谷胱甘肽生产能力高，因此适合于谷胱甘肽的制造。上述微生物通过在培养基中的培养，可以生产谷胱甘肽。
上述微生物更优选为进一步缺失了以下的[5]基因的微生物。
[5]编码三肽肽酶(EC:3.4.11.4)的基因。
进一步缺失了三肽肽酶基因的上述微生物的谷胱甘肽生产能力特别高，因此优选。
成为第二方面的1个以上实施方式的微生物的宿主的微生物如上所述。
对于第二方面的1个以上实施方式的微生物中的给定基因的缺失进行说明。
第二方面的1个以上实施方式的微生物中的编码γ-谷氨酰转移酶的基因及编码谷胱甘肽还原酶的基因、或者进一步编码三肽肽酶的基因(以下有时称为“缺失对象基因”)的“缺失”是指，上述缺失对象基因所编码的酶的活性比亲本株降低，包括活性完全消失的情况。第二方面的1个以上实施方式的微生物是处于上述缺失对象基因的功能丧失的状态、或该功能降低的状态的微生物，具体可以举出：处于作为上述缺失对象基因的转录产物的mRNA、作为翻译产物的蛋白质的表达量降低的状态的微生物；处于作为上述缺失对象基因的转录产物的mRNA、作为翻译产物的蛋白质不能作为mRNA或蛋白质而正常发挥功能的状态的微生物。
上述缺失对象基因的缺失例如可以通过人工修饰微生物亲本株的基因而实现。这样的修饰例如可以通过突变处理、基因重组技术、使用了RNAi的基因表达抑制处理、基因编辑等而实现。
作为突变处理，可以举出利用紫外线照射、或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等通常诱变处理所使用的诱变剂进行的处理。
作为基因重组技术，例如可以利用公知的技术(FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340、JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Dec.1995,p7171-7177、Curr Genet 1986；10(8):573-578、WO 98/14600等)。
编码γ-谷氨酰转移酶、谷胱甘肽还原酶或三肽肽酶的基因除了各蛋白质的氨基酸序列的编码区域以外，还不加区别地表示其表达调控序列(启动子序列等)、外显子序列、内含子序列等。在对表达调控序列进行修饰的情况下，表达调控序列优选1个碱基以上、更优选2个碱基以上、特别优选3个碱基以上被修饰。
第二方面的上述缺失对象基因的缺失更优选为微生物的基因组DNA中的上述缺失对象基因的缺失。作为上述缺失对象基因的缺失，可以是表达调控序列的一部分或全部的缺失，也可以是上述酶的氨基酸序列的编码区域的一部分或全部的缺失。这里，“缺失”是指缺失或损伤，优选为缺失。
在微生物亲本株的基因组DNA中，可以使包含上述缺失对象基因的前后的序列在内的基因整体缺失。在使上述缺失对象基因所编码的酶的氨基酸序列的编码区域的一部分或全部缺失的情况下，只要能够实现酶活性的降低，可以使N末端区域、内部区域、C末端区域等任意区域缺失。通常，缺失的区域长者能够可靠地将基因失活。另外，缺失的区域的前后的序列优选与阅读框不一致。在优选的实施方式中为一种微生物，其在基因组DNA中，上述缺失对象基因中氨基酸序列的编码区域和/或表达调控序列的至少一部分、例如由相对于编码区域和/或表达调控序列的总体的碱基数优选为50％以上、更优选为60％以上、更优选为70％以上、更优选为80％以上、更优选为90％以上、更优选为100％的碱基数构成区域发生了缺失。特别优选为在基因组DNA中上述缺失对象基因中从起始密码子至终止密码子的区域发生了缺失的微生物。
另外，作为酶活性降低这样的上述缺失对象基因的缺失的其它例子，可以示例出：在基因组DNA上的上述缺失对象基因的氨基酸序列编码区域导入氨基酸置换(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失1～2个碱基的移码突变等上述基因的损伤。
另外，酶活性降低这样的上述缺失对象基因的缺失例如也可以通过在基因组DNA上的上述缺失对象基因的表达调控序列或氨基酸序列编码区域中插入其它序列而实现。插入部位可以是基因的任意区域，待插入的序列长者能够可靠地将基因失活。另外，插入部位的前后的序列优选与阅读框不一致。作为其它序列，只要能够使被编码的蛋白质的功能降低或消失即可，没有特别限制，可以具有例如标记基因、对谷胱甘肽等γ-谷氨酰化合物的生产有用的基因。
如上所述使基因组DNA上的上述缺失对象基因缺失例如可以通过以下方式实现：将上述缺失对象基因制备成以不产生正常发挥功能的蛋白质的方式进行了修饰的失活基因，用包含该失活基因的重组DNA对微生物进行转化，通过失活基因和基因组DNA上的基因发生同源重组，从而将基因组DNA上的基因置换为失活基因。此时，根据宿主的营养缺陷性等性状，如果重组DNA中预先包含标记基因，则易于操作。另外，上述重组DNA如果预先通过利用限制酶进行切断等而形成直链状，则能够效率良好地获得基因组DNA中导入了重组DNA的菌株。由失活基因编码的蛋白质即使生成，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能会降低或消失。
另外，例如，用线状DNA对微生物进行转化，在微生物的基因组DNA的置换对象部位的上游及下游分别引起同源重组，由此，能够通过一个步骤将置换对象部位置换为上述线状DNA的序列，所述线状DNA是包含任意序列、且在该任意序列的两端具备基因组DNA上的置换对象部位(代表性地为上述缺失对象基因的一部分或全部)的上游及下游的序列的线状DNA、或者是在基因组DNA上的上述置换对象部位的上游及下游的序列直接连接而成的线状DNA。上述任意序列例如可以包含标记基因序列。标记基因可以在随后根据需要而去除。在去除标记基因的情况下，可以将同源重组用的序列添加于标记基因的两端，以便高效地去除标记基因。
微生物中上述缺失对象基因缺失的确认可以通过上述缺失对象基因所编码的酶的活性的降低来确认。上述酶的活性降低的确认可以通过测定上述酶的活性来进行。例如，谷胱甘肽还原酶的活性可以通过公知的方法(Cosmo Bio公司制谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(Glutathione Reductase Assay Kit)型号7510-100-K等)来测定。
上述缺失对象基因的转录量降低的确认可以通过将由该基因转录的mRNA的量与亲本株比较来进行。作为对mRNA的量进行评价的方法，可以列举：Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor LaboratoryPress,Cold spring Harbor(USA),2001))。与亲本株相比，mRNA的量例如优选降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
上述缺失对象基因所编码的酶的量降低的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold springHarbor(USA),2001))。在第二方面的1个以上实施方式的微生物中，与亲本株相比，上述缺失对象基因所编码的酶的量例如优选降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
接下来，对第二方面的1个以上实施方式的微生物中的给定基因的表达的增强进行说明。
给定的表达增强基因(谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因及谷胱甘肽合成酶基因、或者双功能性谷胱甘肽合成酶基因)的“表达增强了的”微生物包括以下两方面：在该微生物的亲本株(野生株)原本表达上述表达增强基因的情况下，上述表达增强基因的表达量比亲本株增加；以及在亲本株原本不表达上述表达增强基因的情况下，对亲本株赋予了表达上述表达增强基因的能力。
上述表达增强基因的表达量的增加可以通过以下方式实现：使微生物的细胞内的上述表达增强基因的拷贝数增加、将微生物的细胞的基因组DNA上控制上述表达增强基因的表达的启动子置换成更强力的表达启动子。
微生物的细胞内的上述表达增强基因的拷贝数的增加可以通过以下方式实现。
(A)将包含上述表达增强基因的表达载体导入微生物的细胞内、或者
(B)将上述表达增强基因导入微生物的细胞的基因组DNA。
作为上述(A)的方式中使用的表达载体，可以使用包含上述表达增强基因的质粒载体等。表达载体优选能够在微生物细胞内自主复制。表达载体优选含有：编码选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶、以及双功能性谷胱甘肽合成酶中的1种以上酶的DNA、和可操作地连接至能够转录该DNA的位置的启动子。表达载体优选为能够在微生物细胞中自主复制、且包含由启动子、核糖体结合序列、编码上述1种以上酶的氨基酸序列的碱基序列、以及转录终止序列构成的碱基序列的重组DNA。
第二方面的1个以上实施方式的微生物优选保持有包含编码上述表达增强基因的碱基序列的表达载体。该微生物能够由上述表达载体表达上述表达增强基因。
作为适宜的质粒载体，可以示例出：pQEK1、pCA24N(DNA RESEARCH,12,191-299(2005))、pACYC177、pACYC184(可由Nippon Gene公司获得)、pQE30、pQE60、pQE70、pQE80及pQE9(可由Qiagen公司获得)；pTipQC1(可由Qiagen或Hokkaido System Science公司获得)、pTipRT2(可由Hokkaido System Science公司获得)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A及pNH46A(可由Stratagene公司获得)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(可由Addgene公司获得)；pRSF(可由MERCK公司获得)；以及pAC(可由Nippon Gene公司获得)、pUCN18(可将pUC18(可由Takara Bio公司获得)进行修饰而制备)、pSTV28(可由Takara Bio公司获得)、pUCNT(国际公开第94/03613号公报)等。
上述表达载体优选包含控制上述表达增强基因的转录的启动子。
在第二方面的1个以上实施方式中，启动子优选为诱导型启动子。
作为诱导型启动子，可以示例出：异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子、在光的照射下诱导基因表达的光诱导型启动子、araBAD启动子(阿拉伯糖诱导型)、rhaBAD启动子(鼠李糖诱导型)、tet启动子(药物诱导型)、penP启动子(药物诱导型)、cspA启动子(对低温的应答的温度诱导型启动子)、包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子等，优选为IPTG诱导型启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。
作为IPTG诱导型启动子的具体例，可以示例出：T5启动子、lacUV5启动子、lac启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、tac启动子等。作为诱导型启动子，特别优选为IPTG诱导型启动子，在IPTG诱导型启动子当中，特别优选为T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子或tac启动子。
作为启动子，也可以使用利用各种报告基因将现有启动子修饰为高活性型的启动子。例如，通过使启动子区域内的-35、-10区域接近共有序列，可以提高启动子的活性(国际公开WO2000/018935号)。作为高活性型启动子的例子，可以举出各种tac样启动子(Katashkina JI et al.Russian Federation Patent application 2006134574)。启动子的强度的评价方法及强力启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等。
在将包含上述表达增强基因的表达载体导入微生物的细胞内的情况下，细胞内的上述表达载体的拷贝数优选为2以上、更优选为3以上、更优选为5以上、更优选为10以上、更优选为15以上、更优选为20以上。
在微生物的细胞中，在使上述表达增强基因中的2个以上的表达量增加的情况下，可以在1个表达载体内包含2个以上的基因，在该情况下，2个以上的基因可以被配置在1个表达启动子的控制下。另外，2个以上的基因也可以分别包含在单独的表达载体内。
在通过上述(B)的方式将上述表达增强基因导入微生物的细胞的基因组DNA的情况下，可以利用同源重组。
在微生物的细胞的基因组DNA上将上述表达增强基因的启动子置换为更强力的表达启动子的情况下，作为表达启动子，可以利用与表达载体相同的启动子、更优选利用诱导型启动子。优选的启动子的具体例如上所述。
在第二方面的1个以上实施方式的微生物中，上述表达增强基因的表达的增强(表达量的增加)的程度没有特别限定。上述表达增强基因的表达量可以表示为从细胞中提取出的与上述表达增强基因相对应的mRNA(即，编码选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶、以及双功能性谷胱甘肽合成酶中的1种以上酶的氨基酸序列的mRNA)的量。基于该mRNA的表达量优选以相对于编码适当的内标蛋白质的mRNA的量的相对值表示。在谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的表达增强的微生物的1个以上的实施方式中，微生物中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的表达量(优选为将微生物中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)优选为亲本株中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的表达量(优选为将野生株中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)的5倍以上、更优选为10倍以上、更优选为20倍以上。在谷胱甘肽合成酶基因的表达增强的微生物的1个以上的实施方式中，微生物中的谷胱甘肽合成酶的表达量(优选为将微生物中的谷胱甘肽合成酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)优选为野生株中的谷胱甘肽合成酶的表达量(优选为将野生株中的谷胱甘肽合成酶的mRNA量除以同一株中编码内标蛋白质的mRNA量而得到的相对值)的5倍以上、更优选为10倍以上、更优选为20倍以上。作为内标蛋白质，可以示例出已知为管家基因的hcaT基因所编码的蛋白质。
＜3.3.本说明书的第二方面的谷胱甘肽的制造方法＞
第二方面的另外的1个以上的实施方式涉及一种谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：
在培养基中培养上述的第二方面的1个以上实施方式的微生物。
根据本实施方式的谷胱甘肽的制造方法，能够高效地制造谷胱甘肽。
上述培养基只要包含碳源、氮源、无机盐、维生素等第二方面中使用的微生物的增殖及谷胱甘肽的生物合成所必需的营养素即可，可以是合成培养基、天然培养基的任意一种。优选使用M9培养基。
作为碳源，只要是待使用的微生物能够同化的碳源即可，可以列举：葡萄糖、果糖这样的糖质、乙醇、甘油这样的醇类、乙酸这样的有机酸类等。
作为氮源，可以列举：氨、硫酸铵等铵盐、胺等氮化合物、蛋白胨、大豆水解物这样的天然氮源等。
作为无机盐，可以列举：磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、碳酸钾等。
作为维生素，可以举出生物素、硫胺素等。进一步，可以根据需要添加第二方面的1个以上实施方式的微生物的生长所要求的物质(例如，在氨基酸营养缺陷型的微生物的情况下为营养缺陷型氨基酸)。
优选在上述培养基中添加硫源及甘氨酸中的至少一者，优选添加两者。作为甘氨酸向培养基的添加浓度，可以举出例如100mM～2000mM、优选为400mM～1200mM。作为硫源向培养基的添加浓度，可以举出例如100mM～2000mM、优选为400mM～1200mM。
作为硫源，可以添加硫酸、硫代硫酸、亚硫酸、连二亚硫酸、硫化物或其盐等无机硫化合物的1种或多种。硫酸、硫代硫酸、亚硫酸、连二亚硫酸或硫化物可以是游离形式，也可以是盐，还可以是它们的任意的混合物。作为盐，没有特别限制，可以列举：钠盐、钙盐、铵盐、钾盐等。
甘氨酸可以是游离形式，也可以是盐，还可以是它们的任意的混合物。作为盐，没有特别限制，可以列举：硫酸盐、盐酸盐等。
硫源和/或甘氨酸可以在培养开始时或培养的过程中添加至培养基中。硫源和/或甘氨酸可以一次性添加于培养基，也可以连续地或间歇地添加于培养基。
硫源和/或甘氨酸可以在培养的整个期间包含于培养基中，也可以仅在培养的一部分期间包含于培养基中。例如，硫源及甘氨酸的添加量不需要在生产积蓄谷胱甘肽的阶段的整个期间为上述的范围，可以在培养过程中使培养基中含有含量达到上述范围的硫源和/或甘氨酸，随着培养时间的经过，硫源和/或甘氨酸含量减少。另外，可以连续地或间歇地添加、追加硫源和/或甘氨酸。需要说明的是，对于除硫源和/或甘氨酸以外的培养基成分，在培养期间浓度可以发生变动，也可以追加添加。
培养优选在振荡培养、通气搅拌培养这样的需氧条件下进行。培养温度为20～50℃、优选为20～42℃、更优选为28～38℃。培养时的pH为5～9、优选为6～7.5。培养时间为3小时～5天、优选为5小时～3天。
培养物中积蓄的谷胱甘肽可以通过通常的纯化方法收集。例如，在培养结束后，可以在通过离心分离等去除了培养物中的菌体、固体物质后，通过离子交换、浓缩、结晶分级进行收集。
实施例
以下，列举实施例对本说明书的第一方面及第二方面更详细地进行说明，但本说明书的第一方面及第二方面并不限定于这些实施例。
以下说明的基因操作可以参照Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))的记载而实施。另外，基因操作所使用的酶、克隆宿主等可以从市场的供应商购入，并按照其说明使用。需要说明的是，作为上述酶，只要能够用于基因操作即可，没有特别限定。
＜第一方面＞
以下示出用于说明本说明书的第一方面的实验结果。
[实施例1-1]谷胱甘肽合成系基因表达载体的构建(1)
在序列号4中记载的质粒载体pQEK1-term的SmaI位点与HindIII位点之间插入了T5启动子、大肠杆菌来源的gshA基因(序列号12)、以及大肠杆菌来源的gshB基因(序列号14)。基于NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England Biolabs公司制)的说明书设计引物，按照记载的步骤进行了载体构建。将构建成的质粒载体称为pQEK1-PT5-ABEc-term。pQEK1-PT5-ABEc-term也可以表记为pQEK1-PT5-gshA-gshB。
[实施例1-2]谷胱甘肽合成系基因表达载体的构建(2)
在序列号4中记载的质粒载体pQEK1-term的SmaI位点与HindIII位点之间插入了T5启动子、大肠杆菌来源的gshA基因(序列号12)、以及编码作为硫细菌的脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的谷胱甘肽合成酶的突变型酶(WO2018/084165)的TDgshB(V260A)基因(序列号18)。基于NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NewEngland Biolabs公司制)的说明书设计引物，按照记载的步骤进行了载体构建。将构建成的质粒载体称为pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term。pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term也可以表记为pQEK1-PT5-gshA-TDgshB(V260A)。
[实施例1-3]谷胱甘肽合成系基因表达载体的构建(3)
在序列号4中记载的质粒载体pQEK1-term的SmaI位点与HindIII位点之间插入了T5启动子及编码无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)来源的双功能性谷胱甘肽合成酶的SAgshF基因(序列号19)。基于NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NewEngland Biolabs公司制)的说明书设计引物，按照记载的步骤进行了载体构建。将构建成的质粒载体称为pQEK1-PT5-FSa-term。pQEK1-PT5-AFSa-term也可以表记为pQEK1-PT5-SAgshF。
[实施例1-4]谷胱甘肽合成系基因表达载体的构建(4)
在序列号4中记载的质粒载体pQEK1-term的SmaI位点与HindIII位点之间插入了lac启动子、大肠杆菌来源的gshA基因(序列号12)、以及编码作为硫细菌的脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的谷胱甘肽合成酶的突变型酶(WO2018/084165)的TDgshB(V260A)基因(序列号18)。基于NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NewEngland Biolabs公司制)的说明书设计引物，按照记载的步骤进行了载体构建。将构建成的质粒载体称为pQEK1-Plac-ABTd(V260A)-term。pQEK1-Plac-ABTd(V260A)-term也可以表记为pQEK1-Plac-gshA-TDgshB(V260A)。
[实施例1-5]谷胱甘肽合成系基因表达载体的构建(5)
在序列号4中记载的质粒载体pQEK1-term的SmaI位点与HindIII位点之间插入了lacUV5启动子、大肠杆菌来源的gshA基因(序列号12)、以及编码作为硫细菌的脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的谷胱甘肽合成酶的突变型酶(WO2018/084165)的TDgshB(V260A)基因(序列号18)。基于NEB uilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NewEngland Biolabs公司制)的说明书设计引物，按照记载的步骤进行了载体构建。将构建成的质粒载体称为pQEK1-PlacUV5-ABTd(V260A)-term。pQEK1-PlacUV5-ABTd(V260A)-term也可以表记为pQEK1-PlacUV5-gshA-TDgshB(V260A)。
[实施例1-6]宿主株的制备
对于由国立大学遗传学研究所获得的大肠杆菌株BW25113使用由该机构获得的质粒pTH18cs1，与日本特开2004-344029中作为胞嘧啶脱氨酶缺失株的制备方法而公开的方法同样地制备了使γ-谷氨酰转移酶基因(序列号21)及三肽肽酶基因(序列号23)缺失后的菌株。
[实施例1-7]谷胱甘肽合成基因增强株的制备
按照通常方法制备实施例1-6中制成的宿主株的感受态细胞，用实施例1-1～5中制成的质粒载体进行转化，得到了各自的转化体。
[实施例1-8]谷胱甘肽的发酵生产评价
将实施例1-6中制成的宿主株(无质粒)或实施例1-7中制成的谷胱甘肽合成基因增强株接种于5mL的LB培养基(包含20μg/mL四环素)，以300rpm、30℃振荡培养8小时。将该培养液1mL接种于添加有20μg/mL四环素的M9培养基(6g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、1mM硫酸镁、0.001％硫胺素-盐酸、0.1mM氯化钙、2％葡萄糖)100mL。使用培养装置(Able公司制Bio Jr.8)在34℃、pH6.5、搅拌1000rpm、通气100mL/min的条件下将接种后的培养液培养18小时。将18小时培养后的培养液20mL接种于添加有20μg/mL四环素的M9培养基2L中。使用培养装置(Marubishi Bioengineering公司制Bioneer-Neo)在34℃、pH6.7、搅拌600rpm、通气4L/min的条件下将第2次接种后的培养液进一步进行培养。在培养中，随时添加50w/v％葡萄糖溶液，将体系中的葡萄糖浓度调整为不低于15g/L。在6小时培养后添加0.1mM异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷，同时也添加了780mM甘氨酸及780mM硫酸钠。在培养第24小时适量取样培养液，通过离心分离将菌体与上清分离。用蒸馏水将上清适当稀释，按照WO2016/002884中记载的方法将培养上清中的GSH以及GSSG定量，求出了总浓度。将培养上清中的GSH与GSSG的总浓度的定量结果示于表1。以上的实验中使用的培养液实质上不包含半胱氨酸及胱氨酸，它们的总浓度低于0.5g/L。
表1
Figure BDA0003653743690000431
[实施例1-9]谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因及谷胱甘肽合成酶基因的转录分析
通过实时PCR，进行了使用质粒而过量表达的基因的表达量分析。在实施例1-8中记载的培养中，在将第2次接种后的培养液培养6小时后，添加0.1mM异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷，在1小时后适量取样。使用由Takara Bio公司购入的NucleoSpin RNA，按照附带的说明书提取了RNA。通过用水稀释各RNA样品，调整为浓度50ng/μL。使用由Takara Bio公司购入的PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)，按照附带的说明书进行逆转录，由RNA合成了cDNA。使用由Takara Bio公司购入的TB Green Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)及Thermo Fisher Scientific公司制QuantStudio 3实时PCR系统，对各样品中的gshA、TDgshB(V260A)、gshB、SAgshF进行了定量。作为内标，使用了已知为管家基因的hcaT(序列号27)。对于hcaT、gshA、gshB，使用宿主大肠杆菌的基因组DNA与样品同时供于实时PCR反应，制作了校准曲线。基于校准曲线，对各cDNA中包含的各基因的量进行了定量。对于TDgshB(V260A)、对于WO2018/084165中记载的质粒pTDGSH2m15、SAgshF，使用WO2016/017631中记载的质粒pNGSHF制作了校准曲线。在同一样品中，通过用各基因的定量值除以作为内标的hcaT的定量值而进行了标准化，将该标准化后的的值作为各基因的表达量。用于扩增hcaT的正向引物使用了序列号28所示的引物，反向引物使用了序列号29所示的引物，用于扩增gshA的正向引物使用了序列号30所示的引物，反向引物使用了序列号31所示的引物，用于扩增TDgshB(V260A)的正向引物使用了序列号32所示的引物，反向引物使用了序列号33所示的引物，用于扩增gshB的正向引物使用了序列号34所示的引物，反向引物使用了序列号35所示的引物，用于扩增SAgshF的正向引物使用了序列号36所示的引物，反向引物使用了序列号37所示的引物。
将实施例1-6中制备的未转化的宿主株的大肠杆菌来源的gshA基因的表达量(将宿主株的gshA基因的表达量的定量值除以同一宿主株中的hcaT的表达量的定量值进行标准化而得到的表达量)设为1时，以相对量求出导入了作为包含大肠杆菌来源的gshA基因的质粒载体的pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term、pQEK1-Plac-ABTd(V260A)-term、pQEK1-PlacUV5-ABTd(V260A)-term或pQEK1-PT5-ABEc-term的转化体的大肠杆菌来源的gshA基因的表达量(将各转化体的gshA基因的表达量的定量值除以同一转化体中的hcaT的表达量的定量值进行标准化而得到的表达量)，将上述相对量为5以上且小于10评价为“+”，将10以上且小于20评价为“++”，将20以上评价为“+++”。同样地，将未转化的宿主株的大肠杆菌来源的gshB基因的表达量(将宿主株的gshB基因的表达量的定量值除以同一宿主株中的hcaT的表达量的定量值进行标准化而得到的表达量)设为1时，以相对量求出导入了作为包含大肠杆菌来源的gshB基因的质粒载体的pQEK1-PT5-ABEc-term的转化体的大肠杆菌来源的gshB基因的表达量(将各转化体的gshB基因的表达量的定量值除以同一转化体中的hcaT的表达量的定量值进行标准化而得到的表达量)，将上述相对量为5以上且小于10评价为“+”，将10以上且小于20评价为“++”，将20以上评价为“+++”。将结果示于表2。
表2
Figure BDA0003653743690000441
将未转化的宿主株的各基因的表达量设为1时的相对值
+：相对于宿主株为5以上且小于10
++：相对于宿主株为10以上且小于20
+++：相对于宿主株为20以上
对于转化体的TDgshB(V260A)基因或SAgshF基因的表达量，通过将各基因的表达量的定量值除以同一样品中的hcaT基因的定量值而进行了标准化，所述转化体是导入了包含作为大肠杆菌的上述宿主株原本不具有的TDgshB(V260A)基因或SAgshF基因的质粒载体pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term、pQEK1-Plac-ABTd(V260A)-term、pQEK1-PlacUV5-ABTd(V260A)-term或pQEK1-PT5-FSa-term而得到的。作为阴性对照，对于未转化的上述宿主株(无质粒)也同样地求出了基因表达量。将结果示于表3。
表3
Figure BDA0003653743690000451
将同一样品的hcaT基因的表达量设为1时的相对值
＜第二方面＞
接下来，将用于说明本说明书的第二方面的实验结果示于以下。
(培养液中的谷胱甘肽浓度的分析)
培养液中的谷胱甘肽浓度使用高效液相色谱仪(HPLC、株式会社岛津制作所)进行了测定。
HPLC的分析条件如下所述。
色谱柱：Develosil ODS-HG-3 4.6mm x 250mm(野村化学)
流动相：将磷酸二氢钾30.5g、庚烷磺酸钠18g溶解于蒸馏水4.5L后，用磷酸调整为pH3。添加甲醇250mL，然后再次用磷酸调整至pH3。
流速：1mL/min
检测：UV检测器，λ＝210nm
柱温：40℃
注入量：10μL
在对培养液中包含的谷胱甘肽浓度进行分析时，通过离心分离去除了菌体之后，使上清通过注射器过滤器(Advantech、φ＝0.2μm)，由此测到了培养上清。将得到的培养上清用蒸馏水稀释至10倍，供于HPLC。
(制造例2-1)BW25113Δggt株的制备
首先，制备了用于破坏ggt(γ-谷氨酰转移酶)基因(序列号21)的质粒载体。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有ggt基因的上游序列和下游序列的DNA片段(序列号1)。将获得的片段用XbaI和HindIII消化，将温度敏感型质粒pTH18cs1(GenBank accessionnumber AB019610)〔Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,241,185-191(2000)〕用XbaI和HindIII消化，将得到的片段用Ligation high Ver.2(东洋纺株式会社)进行连接，得到了质粒载体pTH18cs1-ggt-UD。
接着，使用pTH18cs1-ggt-UD制备了BW25113Δggt株。通过电穿孔法将pTH18cs1-ggt-UD导入大肠杆菌BW25113株，涂布于含有氯霉素10μg/mL的LB琼脂板，在30℃下进行培养，得到了转化体。用含有氯霉素10μg/mL的LB液体培养基在30℃下将获得的转化体振荡培养过夜，将培养液涂布于含有氯霉素10μg/mL的LB琼脂板并在42℃下进行培养，得到了转化体。将获得的转化体在42℃下用LB液体培养基培养过夜后，涂布于LB琼脂板，得到了菌落。将获得的菌落分别复制铺板于LB琼脂板和含有氯霉素10μg/mL的LB琼脂板，筛选了显示出氯霉素敏感性的转化体。通过基于PCR及DNA测序仪的分析，从筛选出的转化体中分离出1株缺失了染色体上ggt基因的起始密码子至终止密码子的菌株。将该基因破坏株命名为BW25113Δggt株。
BW25113Δggt株是以大肠杆菌BW25113株作为宿主、且缺失了染色体上ggt基因的起始密码子至终止密码子的菌株。
(制造例2-2)BW25113ΔggtΔpepT株的制备
首先，制备了用于破坏pepT(三肽肽酶)基因(序列号23)的质粒载体。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有pepT基因的上游序列和下游序列的DNA片段(序列号2)。将获得的片段用XbaI和HindIII消化，将pTH18cs1用XbaI和HindIII消化，将得到的片段用Ligation high Ver.2进行连接，得到了质粒载体pTH18cs1-pepT-UD。
接着，将制造例2-1中制备的BW25113Δggt株作为亲本株，使用pTH18cs1-pepT-UD，通过与制造例2-1相同的方法分离出1株缺失了染色体上pepT基因的起始密码子至终止密码子的菌株。将该基因破坏株命名为BW25113ΔggtΔpepT株。
BW25113ΔggtΔpepT株是以大肠杆菌BW25113株作为宿主、且缺失了染色体上ggt基因及pepT基因的起始密码子至终止密码子的菌株。
(制造例2-3)pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term的制备
首先，为了构建用于对大肠杆菌进行基因导入的载体，以pQE-80L(QIAGEN)为基础，将耐药标记变更为四环素耐性基因，构建了序列号3所示的pQEK1载体。进一步，将λ噬菌体来源的终止子序列插入pQEK1的HindIII基因座，构建了序列号4所示的pQEK1-term载体。
接着，通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了由T5启动子、大肠杆菌来源的gshA基因、脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)来源的gshB基因(具有V260A突变)构成的DNA片段(序列号5)。使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New EnglandBiolabs)将获得的片段连接于将pQEK1-term用SpeI及HindIII消化而得到的片段，得到了序列号6所示的pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term。
(制造例2-4)BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株的制备
使用电穿孔法将制造例2-3中制备的pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term导入制造例2-2中制备的BW25113ΔggtΔpepT株，涂布于含有四环素20μg/mL的LB琼脂板，筛选了转化体。通过基于PCR的分析从筛选出的转化体中分离出1株导入了pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term的菌株。将该菌株命名为BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株。
(制造例2-5)BW25113ΔggtΔpepTΔgor株的制备
首先，制备了用于破坏gor(谷胱甘肽还原酶)基因的质粒载体。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有gor基因的上游序列和下游序列的DNA片段(序列号7)。将获得的片段用XbaI和HindIII消化，将pTH18cs1用XbaI和HindIII消化，将得到的片段用Ligationhigh Ver.2进行连接，得到了质粒载体pTH18cs1-gor-UD。
接着，将制造例2-2中制备的BW25113ΔggtΔpepT株作为亲本株，使用pTH18cs1-gor-UD，通过与制造例2-1相同的方法分离出1株缺失了染色体上gor基因的起始密码子至终止密码子的菌株。将该基因破坏株命名为BW25113ΔggtΔpepTΔgor株。
(制造例2-6)BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株的制备
使用电穿孔法将制造例2-3中制备的pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term导入制造例2-5中制备的BW25113ΔggtΔpepTΔgor株，涂布于含有四环素20μg/mL的LB琼脂板，筛选了转化体。通过基于PCR的分析，从筛选出的转化体分离出1株导入了pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term的菌株。将该菌株命名为BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株。
(制造例2-7)pQEK1-PT5-ABEc-term的制备
通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了由T5启动子、大肠杆菌来源的gshA基因、大肠杆菌来源的gshB基因构成的DNA片段(序列号8)。使用NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix将获得的片段连接于将pQEK1-term用SpeI及HindIII消化而得到的片段，得到了序列号9所示的pQEK1-PT5-ABEc-term。
(制造例2-8)BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABEc-term株的制备
使用电穿孔法将制造例2-7中制备的pQEK1-PT5-ABEc-term导入制造例2-2中制备的BW25113ΔggtΔpepT株，涂布于含有四环素20μg/mL的LB琼脂板，筛选了转化体。通过基于PCR的分析，从筛选出的转化体中分离出1株导入了pQEK1-PT5-ABEc-term的菌株。将该株命名为BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABEc-term株。
(制造例2-9)BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABEc-term株的制备
使用电穿孔法将制造例2-3中制备的pQEK1-PT5-ABEc-term导入制造例2-5中制备的BW25113ΔggtΔpepTΔgor株，涂布于含有四环素20μg/mL的LB琼脂板，筛选了转化体。通过基于PCR的分析，从筛选出的转化体中分离出1株导入了pQEK1-PT5-ABEc-term的菌株。将该株命名为BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABEc-term株。
(制造例2-10)pQEK1-PT5-FSa-term的制备
通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了由T5启动子、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)来源的gshF基因构成的DNA片段(序列号10)。使用NEBuilder HiFi DNAAssembly Master Mix将获得的片段连接于将pQEK1-term用SpeI及HindIII消化而得到的片段，得到了序列号11所示的pQEK1-PT5-FSa-term。
(制造例2-11)BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-FSa-term株的制备
使用电穿孔法将制造例2-10中制备的pQEK1-PT5-FSa-term导入制造例2-2中制备的BW25113ΔggtΔpepT株，涂布于含有四环素20μg/mL的LB琼脂板，筛选了转化体。通过基于PCR的分析，从筛选出的转化体中分离出1株导入了pQEK1-PT5-FSa-term的菌株。将该株命名为BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-FSa-term株。
(制造例2-12)BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-FSa-term株的制备
使用电穿孔法将制造例2-10中制备的pQEK1-PT5-FSa-term导入制造例2-5中制备的BW25113ΔggtΔpepTΔgor株，涂布于含有四环素20μg/mL的LB琼脂板，筛选了转化体。通过基于PCR的分析，从筛选出的转化体中分离出1株导入了pQEK1-PT5-FSa-term的菌株。将该株命名为BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-FSa-term株。
(实施例2-1)利用BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-ter m株进行的谷胱甘肽的发酵生产
在以下的条件下培养制造例2-6中得到的BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株，生产了GSH及GSSG。接种于5mL的LB培养基(包含20μg/mL四环素)，在300rpm、30℃下振荡培养8小时。将该培养液1mL接种于添加有20μg/mL四环素的M9培养基(6g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、1mM硫酸镁、0.001％硫胺素-盐酸、0.1mM氯化钙、2％葡萄糖)100mL，使用培养装置(Able公司制Bio Jr.8)在34℃、pH6.5、搅拌1000rpm、通气100mL/min的条件下培养18小时。将培养18小时后的培养液20mL接种于添加有20μg/mL四环素的M9培养基2L，使用培养装置(Marubishi Bioengineering公司制Bioneer-Neo)在34℃、pH6.7、搅拌600rpm、通气4L/min的条件下进行培养。在培养中，随时添加50％(w/v)葡萄糖溶液，将体系中葡萄糖浓度调整为不低于15g/L。在培养6小时后，添加0.1mM异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷，同时添加甘氨酸及硫酸钠，使得最终浓度为100mM。在培养第30小时，适量取样培养液，通过离心分离将菌体与上清分离。将上清用蒸馏水适当稀释，通过HPLC分析对GSH及GSSG进行了定量。将定量结果示于表4。
(比较例2-1)利用BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株进行的谷胱甘肽的发酵生产
在与实施例2-1相同的条件下培养制造例2-4中得到的BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term株，生产了GSH及GSSG。将结果示于表4。
表4
Figure BDA0003653743690000501
＜考察＞
将表4的实施例2-1与比较例2-1的结果进行比较可知，通过破坏gor基因，谷胱甘肽生产性(GSH+GSSG)大幅增加。由此可知，在谷胱甘肽发酵生产中，gor基因的破坏是有效的。
(实施例2-2)利用BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABEc-term株进行的谷胱甘肽的发酵生产
在与实施例2-1相同的条件下培养制造例2-9中得到的BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-ABEc-term株，生产了GSH及GSSG。将结果示于表5。
(比较例2-2)利用BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABEc-term株进行的谷胱甘肽的发酵生产
在与实施例2-1相同的条件下培养制造例2-8中得到的BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-ABEc-term株，生产了GSH及GSSG。将结果示于表5。
表5
Figure BDA0003653743690000502
＜考察＞
将表5的实施例2-2与比较例2-2的结果进行比较可知，通过破坏gor基因，谷胱甘肽生产性(GSH+GSSG)大幅增加。由此可知，在谷胱甘肽发酵生产中，gor基因的破坏是有效的。
(实施例2-3)利用BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-FSa-term株进行的谷胱甘肽的发酵生产
在与实施例2-1相同的条件下培养制造例2-12中得到的BW25113ΔggtΔpepTΔgor/pQEK1-PT5-FSa-term株，生产了GSH及GSSG。将结果示于表6。
(比较例2-3)利用BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-FSa-term株进行的谷胱甘肽的发酵生产
在与实施例2-1相同的条件下培养制造例2-11中得到的BW25113ΔggtΔpepT/pQEK1-PT5-FSa-term株，生产了GSH及GSSG。将结果示于表6。
表6
Figure BDA0003653743690000511
＜考察＞
将表6的实施例2-3与比较例2-3的结果进行比较可知，通过破坏gor基因，谷胱甘肽生产性(GSH+GSSG)大幅增加。由此可知，在谷胱甘肽发酵生产中，gor基因的破坏是有效的。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请均通过直接引用而引入本说明书。
序列表
<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）
<120> 有用物质的制造方法
<130> B190003
<150> JP 2019-211477
<151> 2019-11-22
<150> JP 2020-002363
<151> 2020-01-09
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ggt-UD
<400> 1
gcgcgctcta gagtcgccgt ttctcctctc cggcagcata tgctgctgat tcaacgaact 60
atccggatta cggttgctgt ttaacatccc gccgttggtg ttgggcagca tttgctgccg 120
ggcgggattt cgctcccccg gctgtgactg caacacccgc tgagaattat tgtttatctg 180
gttttctaaa tgctgctgtt gcaactgagt ttgcgttttc agttgctgat tcagcatccc 240
tttttgctgg atttgctgag tctgcatctg ggtttgcatc cgctgctggc tgggtatctg 300
ataccccggc tggttagggt tgttcagagt attaatgggc tgtgcaaagc cgacaaacgg 360
caggagtgcc gtaagaatca gaagtcgttt catcgcgtat cctcctctga agatatcctt 420
taagtttact cgcttcccga caaaacgatg attaattcag agttatatac caggcttagc 480
tggggttgcc ccttaatctc tggagaataa cgggttagcg gccctcttcg tgggaagagg 540
gctattttgt cagggcaagc cgaaggtagc cttttttatt tcgtaatcct gtagatattc 600
ttccagcggt tttgccgttc ccagagaatg aatttcacca ctgtctttat caataataaa 660
aggtgcgtta ccagctaagc gcgcggcctc atctccagtt tcgagaaatt ctcgtgcttc 720
gaaacagaaa taccagccct ggctaaagcg tccatgtaga gtaatgacga ccgggagatc 780
tgcatcatca aggtaatggt tcgctttcgc gaatgcgtcg tgataagtaa tcataattat 840
aataaatatt attgttgagt gttatattat tattcctgtg tgatacattg agcaaagacg 900
cgttcatctt cgtcaaagat attattaaat gctggttttg aaaaaagttc atcggataag 960
atatagtcac gaaataagta tctgctaata ttttatgatt tctttttcag aacgtcgaac 1020
gggattaagc ttgcgcgc 1038
<210> 2
<211> 1057
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pepT-UD
<400> 2
gcgcgctcta gaacgtgggt gatgtcctcg ttatccagca tgatgcgtcc ggaatcaaca 60
gtttccagac ctgcaatcag gcgaagaacg gttgttttac cgcagccaga agggccaagc 120
agcgtgagga actcgccatt gttgatagtc agatccagct ggggaatgac ctctttacca 180
tcaaagcatt tgcgaattcc cgccaattgc accagcggtg aaagcgaact cggttgttta 240
ttcaattttt tactctgtcc catgtaaacg caacggatgg cttaccgatg cggggtttgt 300
ggttaaccac cttggtgact cttaatgagg gcggtaattc tacggcaaac cgcttgaatc 360
gccaatcttt gttgtgaatt actggcttag ctttatattc attaaggtaa tgctgataaa 420
tattcccgct tgcaggggta aaagtgacct gacgcaatat ttgtcttttc ttgcttctta 480
ataatgttgt cacaaaaagt gagggtgact acgcgaaaag ggatgcggca tgtgatgccg 540
catccggctt aaatccaaac ttacccttcg aagaaccaat acccgctatt gaccagcgcc 600
gcgagcatcg cgaggaatga cggatcttcc agcgcatcgc caaaattctc cgcagtcagc 660
gcaatgttgc tggcgagtgc atccagtgcc ggacggtgcg gggaatcgat cttctcacca 720
ttggcataca cgtcgtcgcc aatgcgcaat acgcgcagac cacccaggcg caccagcact 780
tcaccttgtt tcagcgcatc gtagatttca tccggctgat aaggcggctc tggcggcgcg 840
atatccagtt catgacgtga ctgggatata aactcgccaa accattgctt aaagtgttcc 900
ggctggttga tcaattcgag catcatctca cgcagtttat ccatctcttg cggcagaaca 960
tccgcaggat gagcgcgagg tggaacatcc ggatcgctgt agtagttgcc gcccagttca 1020
cgttgcagca cataatcggc aaatcaagct tgcgcgc 1057
<210> 3
<211> 4130
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pQEK1
<400> 3
gcttaaagga tcctaactcg agagatccct gccatttggc ggggatttgc tagcttgagg 60
catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 120
tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccctcta gattacgtgc agtcgatgat 180
aagctgtcaa acatgagaat tgtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc 240
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 300
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt 360
gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg 420
tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata 480
taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc 540
agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc 600
atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg 660
gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta 720
tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg 780
atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg 840
gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca 900
ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc 960
agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg 1020
cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc 1080
gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc 1140
aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc 1200
atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg 1260
cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt 1320
ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag 1380
gttttgcacc attcgatggt gtcggaattt cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc 1440
gcatgatcta gagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc 1500
agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc 1560
agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg 1620
atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 1680
ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 1740
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 1800
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 1860
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 1920
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 1980
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 2040
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 2100
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 2160
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 2220
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 2280
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 2340
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 2400
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 2460
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 2520
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 2580
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 2640
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gtcaggtcga ggtggcccgg 2700
ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc 2760
catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt 2820
ccagtgatcg aagttaggct ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg 2880
tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa 2940
gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg 3000
tagcccagcg cgtcggccgc catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg 3060
gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc 3120
gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc 3180
gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg 3240
atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc 3300
ggtcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 3360
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 3420
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 3480
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 3540
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tccacaggac gggtgtggtc 3600
gccatgatcg cgtagtcgat agtggctcca agtagcgaag cgagcaggac tgggcggcgg 3660
ccaaagcggt cggacagtgc tccgagaacg ggtgcgcata gaaattgcat caacgcatat 3720
agcgctagca gcacgccata gtgactggcg atgctgtcgg aatggacgat atcccgcaag 3780
aggcccggca gtaccggcat aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg 3840
aggatgacga tgagcgcatt gttagatttc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 3900
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 3960
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 4020
attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc 4080
gagggtaccg aattccccgg gctgcagact agtgagctcc atatgcccaa 4130
<210> 4
<211> 4230
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pQEK1-term
<400> 4
gcttgactcc tgttgataga tccagtaatg acctcagaac tccatctgga tttgttcaga 60
acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt ggtgagaata gcttaaagga tcctaactcg 120
agagatccct gccatttggc ggggatttgc tagcttgagg catcaaataa aacgaaaggc 180
tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 240
taggacaaat ccgccctcta gattacgtgc agtcgatgat aagctgtcaa acatgagaat 300
tgtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 360
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 420
ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt 480
gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag 540
caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 600
atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc 660
gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc 720
ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg 780
ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag 840
acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc 900
gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat 960
gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac 1020
agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc 1080
gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac 1140
caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg 1200
cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag 1260
ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc 1320
ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga 1380
gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa 1440
ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcacc attcgatggt 1500
gtcggaattt cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcta gagctgcctc 1560
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 1620
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 1680
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 1740
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat 1800
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 1860
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 1920
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 1980
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 2040
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2100
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2160
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2220
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 2280
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 2340
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 2400
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 2460
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 2520
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 2580
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 2640
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 2700
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 2760
tgagtaaact tggtctgaca gtcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa 2820
cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt 2880
gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct 2940
ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga 3000
cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg 3060
gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc 3120
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3180
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3240
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3300
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3360
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg 3420
cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 3480
aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 3540
catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 3600
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 3660
gatgcgtccg gcgtagagga tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat 3720
agtggctcca agtagcgaag cgagcaggac tgggcggcgg ccaaagcggt cggacagtgc 3780
tccgagaacg ggtgcgcata gaaattgcat caacgcatat agcgctagca gcacgccata 3840
gtgactggcg atgctgtcgg aatggacgat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat 3900
aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt 3960
gttagatttc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4020
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4080
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 4140
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagggtaccg aattccccgg 4200
gctgcagact agtgagctcc atatgcccaa 4230
<210> 5
<211> 2691
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PT5-ABTd(V260A) 插入
<400> 5
cgggctgcag actagtaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat 60
aatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcaaaagat ctaagaagga 120
gatatacata tatgatcccg gacgtatcac aggcgctggc ctggctggaa aaacatcctc 180
aggcgttaaa ggggatacag cgtgggctgg agcgcgaaac tttgcgtgtt aatgctgatg 240
gcacactggc aacaacaggt catcctgaag cattaggttc cgcactgacg cacaaatgga 300
ttactaccga ttttgcggaa gcattgctgg aattcattac accagtggat ggtgatattg 360
aacatatgct gacctttatg cgcgatctgc atcgttatac ggcgcgcaat atgggcgatg 420
agcggatgtg gccgttaagt atgccatgct acatcgcaga aggtcaggac atcgaactgg 480
cacagtacgg cacttctaac accggacgct ttaaaacgct gtatcgtgaa gggctgaaaa 540
atcgctacgg cgcgctgatg caaaccattt ccggcgtgca ctacaatttc tctttgccaa 600
tggcattctg gcaagcgaag tgcggtgata tctcgggcgc tgatgccaaa gagaaaattt 660
ctgcgggcta tttccgcgtt atccgcaatt actatcgttt cggttgggtc attccttatc 720
tgtttggtgc atctccggcg atttgttctt ctttcctgca aggaaaacca acgtcgctgc 780
cgtttgagaa aaccgagtgc ggtatgtatt acctgccgta tgcgacctct cttcgtttga 840
gcgatctcgg ctataccaat aaatcgcaaa gcaatcttgg tattaccttc aacgatcttt 900
atgagtacgt agcgggcctt aaacaggcaa tcaaaacgcc atcggaagag tacgcgaaga 960
ttggtattga gaaagacggt aagaggctgc aaatcaacag caacgtgttg cagattgaaa 1020
acgaactgta cgcgccgatt cgtccaaaac gcgttacccg cagcggcgag tcgccttctg 1080
atgcgctgtt acgtggcggc attgaatata ttgaagtgcg ttcgctggac atcaacccgt 1140
tctcgccgat tggtgtagat gaacagcagg tgcgattcct cgacctgttt atggtctggt 1200
gtgcgctggc tgatgcaccg gaaatgagca gtagcgaact tgcctgtaca cgcgttaact 1260
ggaaccgggt gatcctcgaa ggtcgcaaac cgggtctgac gctgggtatc ggctgcgaaa 1320
ccgcacagtt cccgttaccg caggtgggta aagatctgtt ccgcgatctg aaacgcgtcg 1380
cgcaaacgct ggatagtatt aacggcggcg aagcgtatca gaaagtgtgt gatgaactgg 1440
ttgcctgctt cgataatccc gatctgactt tctctgcccg tatcttaagg tctatgattg 1500
atactggtat tggcggaaca ggcaaagcat ttgcagaagc ctaccgtaat ctgctgcgtg 1560
aagagccgct ggaaattctg cgcgaagagg attttgtagc cgagcgcgag gcgtctgaac 1620
gccgtcagca ggaaatggaa gccgctgata ccgaaccgtt tgcggtgtgg ctggaaaaac 1680
acgcctgata aggtacctaa ggaggttaca atgaaactgc tgttcgtcgt tgatcccctg 1740
gccagcttga aaccgtacaa ggatagctcc gttgccatga tgcgcgcagc gtgtgctcgt 1800
ggtcatgccg tgttcgcagc agaagcgcgc gcactgctgg ttcgtgatgg ggtggctcgt 1860
tctcgtgcag atgctgtcga aacgcgtggc gacgatgact ggtatcgcgt taccgaaacg 1920
cgtgaatttg ccttaaccga ctttgatgca gtggtgatgc gcgcagatcc gcccgttgac 1980
gtggattacc ttctcgcgac gcacctgtta ggcgtagccg aaaccaacgg tgcacgtgtc 2040
ctgaatcgcc cgcgtgcctt gcgcgatttc aacgagaaac tggccattct ggaatttccg 2100
cagtttgtcg cacctaccct ggtaagtgcg gacgcaaccg aaattgccca ctttctggct 2160
gctcatgcgg atatcatcgt caaaccgctg actgagatgg gtggctccgg tgtgtttcgc 2220
ctgggagtta gcgatccgaa tcggaacgcg attctggaga cattaacccg tcgtggctct 2280
cgcccaatca tggctcagcg gtatttgcca gcgatctcag agggcgacaa acgcatcctg 2340
ctgatcgacg gcgaagtagt gccatgggcc ttggcgcgca ttccgctgac cggtgaaact 2400
cgcgggaatc ttgcggctgg tggtacagcg cgcgcgcaac cgctcagtga acgggatcgc 2460
gaaatcgccg aaacgattgc cccttgggca cgcagccagg gcattttcct tgcgggctta 2520
gacgtgattg gggattgcct caccgagatt aacgtgacat cgcctactgg atttcaggag 2580
attaccgccc aatcgggcca tgatgttgcg gaccagttca ttgcggcgat cgaacgcgcg 2640
acgcgtccgg aatgataaca tatgcccaag cttgactcct gttgatagat c 2691
<210> 6
<211> 6866
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pQEK1-PT5-ABTd(V260A)-term
<400> 6
gcttgactcc tgttgataga tccagtaatg acctcagaac tccatctgga tttgttcaga 60
acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt ggtgagaata gcttaaagga tcctaactcg 120
agagatccct gccatttggc ggggatttgc tagcttgagg catcaaataa aacgaaaggc 180
tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 240
taggacaaat ccgccctcta gattacgtgc agtcgatgat aagctgtcaa acatgagaat 300
tgtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 360
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 420
ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt 480
gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag 540
caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 600
atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc 660
gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc 720
ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg 780
ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag 840
acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc 900
gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat 960
gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac 1020
agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc 1080
gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac 1140
caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg 1200
cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag 1260
ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc 1320
ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga 1380
gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa 1440
ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcacc attcgatggt 1500
gtcggaattt cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcta gagctgcctc 1560
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 1620
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 1680
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 1740
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat 1800
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 1860
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 1920
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 1980
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 2040
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2100
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2160
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2220
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 2280
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 2340
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 2400
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 2460
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 2520
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 2580
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 2640
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 2700
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 2760
tgagtaaact tggtctgaca gtcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa 2820
cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt 2880
gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct 2940
ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga 3000
cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg 3060
gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc 3120
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3180
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3240
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3300
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3360
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg 3420
cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 3480
aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 3540
catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 3600
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 3660
gatgcgtccg gcgtagagga tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat 3720
agtggctcca agtagcgaag cgagcaggac tgggcggcgg ccaaagcggt cggacagtgc 3780
tccgagaacg ggtgcgcata gaaattgcat caacgcatat agcgctagca gcacgccata 3840
gtgactggcg atgctgtcgg aatggacgat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat 3900
aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt 3960
gttagatttc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4020
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4080
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 4140
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagggtaccg aatttcccgg 4200
gctgcagact agtaaatcat aaaaaattta tttgctttgt gagcggataa caattataat 4260
agattcaatt gtgagcggat aacaatttca cacagaattc aaaagatcta agaaggagat 4320
atacatatat gatcccggac gtatcacagg cgctggcctg gctggaaaaa catcctcagg 4380
cgttaaaggg gatacagcgt gggctggagc gcgaaacttt gcgtgttaat gctgatggca 4440
cactggcaac aacaggtcat cctgaagcat taggttccgc actgacgcac aaatggatta 4500
ctaccgattt tgcggaagca ttgctggaat tcattacacc agtggatggt gatattgaac 4560
atatgctgac ctttatgcgc gatctgcatc gttatacggc gcgcaatatg ggcgatgagc 4620
ggatgtggcc gttaagtatg ccatgctaca tcgcagaagg tcaggacatc gaactggcac 4680
agtacggcac ttctaacacc ggacgcttta aaacgctgta tcgtgaaggg ctgaaaaatc 4740
gctacggcgc gctgatgcaa accatttccg gcgtgcacta caatttctct ttgccaatgg 4800
cattctggca agcgaagtgc ggtgatatct cgggcgctga tgccaaagag aaaatttctg 4860
cgggctattt ccgcgttatc cgcaattact atcgtttcgg ttgggtcatt ccttatctgt 4920
ttggtgcatc tccggcgatt tgttcttctt tcctgcaagg aaaaccaacg tcgctgccgt 4980
ttgagaaaac cgagtgcggt atgtattacc tgccgtatgc gacctctctt cgtttgagcg 5040
atctcggcta taccaataaa tcgcaaagca atcttggtat taccttcaac gatctttatg 5100
agtacgtagc gggccttaaa caggcaatca aaacgccatc ggaagagtac gcgaagattg 5160
gtattgagaa agacggtaag aggctgcaaa tcaacagcaa cgtgttgcag attgaaaacg 5220
aactgtacgc gccgattcgt ccaaaacgcg ttacccgcag cggcgagtcg ccttctgatg 5280
cgctgttacg tggcggcatt gaatatattg aagtgcgttc gctggacatc aacccgttct 5340
cgccgattgg tgtagatgaa cagcaggtgc gattcctcga cctgtttatg gtctggtgtg 5400
cgctggctga tgcaccggaa atgagcagta gcgaacttgc ctgtacacgc gttaactgga 5460
accgggtgat cctcgaaggt cgcaaaccgg gtctgacgct gggtatcggc tgcgaaaccg 5520
cacagttccc gttaccgcag gtgggtaaag atctgttccg cgatctgaaa cgcgtcgcgc 5580
aaacgctgga tagtattaac ggcggcgaag cgtatcagaa agtgtgtgat gaactggttg 5640
cctgcttcga taatcccgat ctgactttct ctgcccgtat cttaaggtct atgattgata 5700
ctggtattgg cggaacaggc aaagcatttg cagaagccta ccgtaatctg ctgcgtgaag 5760
agccgctgga aattctgcgc gaagaggatt ttgtagccga gcgcgaggcg tctgaacgcc 5820
gtcagcagga aatggaagcc gctgataccg aaccgtttgc ggtgtggctg gaaaaacacg 5880
cctgataagg tacctaagga ggttacaatg aaactgctgt tcgtcgttga tcccctggcc 5940
agcttgaaac cgtacaagga tagctccgtt gccatgatgc gcgcagcgtg tgctcgtggt 6000
catgccgtgt tcgcagcaga agcgcgcgca ctgctggttc gtgatggggt ggctcgttct 6060
cgtgcagatg ctgtcgaaac gcgtggcgac gatgactggt atcgcgttac cgaaacgcgt 6120
gaatttgcct taaccgactt tgatgcagtg gtgatgcgcg cagatccgcc cgttgacgtg 6180
gattaccttc tcgcgacgca cctgttaggc gtagccgaaa ccaacggtgc acgtgtcctg 6240
aatcgcccgc gtgccttgcg cgatttcaac gagaaactgg ccattctgga atttccgcag 6300
tttgtcgcac ctaccctggt aagtgcggac gcaaccgaaa ttgcccactt tctggctgct 6360
catgcggata tcatcgtcaa accgctgact gagatgggtg gctccggtgt gtttcgcctg 6420
ggagttagcg atccgaatcg gaacgcgatt ctggagacat taacccgtcg tggctctcgc 6480
ccaatcatgg ctcagcggta tttgccagcg atctcagagg gcgacaaacg catcctgctg 6540
atcgacggcg aagtagtgcc atgggccttg gcgcgcattc cgctgaccgg tgaaactcgc 6600
gggaatcttg cggctggtgg tacagcgcgc gcgcaaccgc tcagtgaacg ggatcgcgaa 6660
atcgccgaaa cgattgcccc ttgggcacgc agccagggca ttttccttgc gggcttagac 6720
gtgattgggg attgcctcac cgagattaac gtgacatcgc ctactggatt tcaggagatt 6780
accgcccaat cgggccatga tgttgcggac cagttcattg cggcgatcga acgcgcgacg 6840
cgtccggaat gataacatat gcccaa 6866
<210> 7
<211> 1024
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> gor-UD
<400> 7
gcgcgctcta gagtcgaaaa agccgacggt ttccagcagc ttaaggccaa actgccgccg 60
gtttcccgcc gtggtttaat ccttatcgac ccgccgtatg aaatgaaaac tgactatcaa 120
gcggtggtca gcgggatagc agaaggttac aaacgtttcg ccactggtat ttacgcactg 180
tggtatccgg tggtgctgcg tcagcaaatt aagcgcatga tccacgatct ggaagcgacc 240
ggtattcgca aaattctgca aattgaactg gcggtactgc cagacagcga tcgccgtggc 300
atgaccgctt ccggcatgat tgtgattaac ccgccgtgga aactggaaca acagatgaat 360
aacgtgctgc cgtggctgca cagcaaactg gttccggcag gcaccgggca cgccaccgta 420
agctggatcg tgccggagta attgcagcca ttgctggcac ctattacgtc tcgcgctaca 480
atcgcggtaa tcaacgataa ggacactttg tcatgttaaa gggctaagag tagtgtgctc 540
ttagccctta attacgtttc cgctatcagt tcagaagctg aagcagaaag cggatcagtt 600
ccagcagcgc aattaacgcc cctagaacga tgattgcttt atcaatcacc cgttttctcc 660
atgcgatgga gtgagaatgc atccgcttac tcatccactg cctgtcacgg cgcatgtctc 720
attgttagat aagaactctc tcactccggc cagagcatca gttaacggca ccacccgtac 780
ttctgaccag gactttgaaa gcgtttatgc gcattgccag agtgaaaatg cctcagagct 840
aactggataa tcatacagta catgcaggtt ataaaaccag cacgtccttg caatagtttc 900
agtatggtat tagcattgat gcgttagatg atggctatct cactccagtc agagccacca 960
actcagggct ggaaagtaaa aaaccgacgc aaagtcggtt tttttacatc cgaagcttgc 1020
gcgc 1024
<210> 8
<211> 2685
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PT5-ABEc 插入
<400> 8
cgggctgcag actagtaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat 60
aatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcaaaagat ctaagaagga 120
gatatacata tatgatcccg gacgtatcac aggcgctggc ctggctggaa aaacatcctc 180
aggcgttaaa ggggatacag cgtgggctgg agcgcgaaac tttgcgtgtt aatgctgatg 240
gcacactggc aacaacaggt catcctgaag cattaggttc cgcactgacg cacaaatgga 300
ttactaccga ttttgcggaa gcattgctgg aattcattac accagtggat ggtgatattg 360
aacatatgct gacctttatg cgcgatctgc atcgttatac ggcgcgcaat atgggcgatg 420
agcggatgtg gccgttaagt atgccatgct acatcgcaga aggtcaggac atcgaactgg 480
cacagtacgg cacttctaac accggacgct ttaaaacgct gtatcgtgaa gggctgaaaa 540
atcgctacgg cgcgctgatg caaaccattt ccggcgtgca ctacaatttc tctttgccaa 600
tggcattctg gcaagcgaag tgcggtgata tctcgggcgc tgatgccaaa gagaaaattt 660
ctgcgggcta tttccgcgtt atccgcaatt actatcgttt cggttgggtc attccttatc 720
tgtttggtgc atctccggcg atttgttctt ctttcctgca aggaaaacca acgtcgctgc 780
cgtttgagaa aaccgagtgc ggtatgtatt acctgccgta tgcgacctct cttcgtttga 840
gcgatctcgg ctataccaat aaatcgcaaa gcaatcttgg tattaccttc aacgatcttt 900
acgagtacgt agcgggcctt aaacaggcaa tcaaaacgcc atcggaagag tacgcgaaga 960
ttggtattga gaaagacggt aagaggctgc aaatcaacag caacgtgttg cagattgaaa 1020
acgaactgta cgcgccgatt cgtccaaaac gcgttacccg cagcggcgag tcgccttctg 1080
atgcgctgtt acgtggcggc attgaatata ttgaagtgcg ttcgctggac atcaacccgt 1140
tctcgccgat tggtgtagat gaacagcagg tgcgattcct cgacctgttt atggtctggt 1200
gtgcgctggc tgatgcaccg gaaatgagca gtagcgaact tgcctgtaca cgcgttaact 1260
ggaaccgggt gatcctcgaa ggtcgcaaac cgggtctgac gctgggtatc ggctgcgaaa 1320
ccgcacagtt cccgttaccg caggtgggta aagatctgtt ccgcgatctg aaacgcgtcg 1380
cgcaaacgct ggatagtatt aacggcggcg aagcgtatca gaaagtgtgt gatgaactgg 1440
ttgcctgctt cgataatccc gatctgactt tctctgcccg tatcttaagg tctatgattg 1500
atactggtat tggcggaaca ggcaaagcat ttgcagaagc ctaccgtaat ctgctgcgtg 1560
aagagccgct ggaaattctg cgcgaagagg attttgtagc cgagcgcgag gcgtctgaac 1620
gccgtcagca ggaaatggaa gccgctgata ccgaaccgtt tgcggtgtgg ctggaaaaac 1680
acgcctgata aggtacctaa ggaggttaca atgatcaagc tcggcatcgt gatggacccc 1740
atcgcaaaca tcaacatcaa gaaagattcc agttttgcta tgttgctgga agcacagcgt 1800
cgtggttacg aacttcacta tatggagatg ggcgatctgt atctgatcaa tggtgaagcc 1860
cgcgcccata cccgcacgct gaacgtgaag cagaactacg aagagtggtt ttcgttcgtc 1920
ggtgaacagg atctgccgct ggccgatctc gatgtgatcc tgatgcgtaa agacccgccg 1980
tttgataccg agtttatcta cgcgacctat attctggaac gtgccgaaga gaaagggacg 2040
ctgatcgtta acaagccgca gagcctgcgc gactgtaacg agaaactgtt taccgcctgg 2100
ttctctgact taacgccaga aacgctggtt acgcgcaata aagcgcagct aaaagcgttc 2160
tgggagaaac acagcgacat cattcttaag ccgctggacg gtatgggcgg cgcgtcgatt 2220
ttccgcgtga aagaaggcga tccaaacctc ggcgtgattg ccgaaaccct gactgagcat 2280
ggcactcgct actgcatggc gcaaaattac ctgccagcca ttaaagatgg cgacaaacgc 2340
gtgctggtgg tggatggcga gccggtaccg tactgcctgg cgcgtattcc gcaggggggc 2400
gaaacccgtg gcaatctggc tgccggtggt cgcggtgaac ctcgtccgct gacggaaagt 2460
gactggaaaa tcgcccgtca gatcgggccg acgctgaaag aaaaagggct gatttttgtt 2520
ggtctggata tcatcggcga ccgtctgact gaaattaacg tcaccagccc aacctgtatt 2580
cgtgagattg aagcagagtt tccggtgtcg atcaccggaa tgttaatgga tgccatcgaa 2640
gcacgtttac agcagcagta aaagcttgac tcctgttgat agatc 2685
<210> 9
<211> 6860
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pQEK1-PT5-ABEc-term
<400> 9
gcttgactcc tgttgataga tccagtaatg acctcagaac tccatctgga tttgttcaga 60
acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt ggtgagaata gcttaaagga tcctaactcg 120
agagatccct gccatttggc ggggatttgc tagcttgagg catcaaataa aacgaaaggc 180
tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 240
taggacaaat ccgccctcta gattacgtgc agtcgatgat aagctgtcaa acatgagaat 300
tgtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 360
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 420
ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt 480
gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag 540
caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 600
atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc 660
gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc 720
ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg 780
ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag 840
acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc 900
gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat 960
gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac 1020
agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc 1080
gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac 1140
caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg 1200
cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag 1260
ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc 1320
ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga 1380
gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa 1440
ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcacc attcgatggt 1500
gtcggaattt cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcta gagctgcctc 1560
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 1620
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 1680
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 1740
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat 1800
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 1860
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 1920
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 1980
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 2040
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2100
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2160
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2220
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 2280
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 2340
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 2400
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 2460
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 2520
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 2580
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 2640
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 2700
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 2760
tgagtaaact tggtctgaca gtcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa 2820
cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt 2880
gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct 2940
ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga 3000
cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg 3060
gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc 3120
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3180
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3240
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3300
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3360
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg 3420
cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 3480
aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 3540
catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 3600
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 3660
gatgcgtccg gcgtagagga tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat 3720
agtggctcca agtagcgaag cgagcaggac tgggcggcgg ccaaagcggt cggacagtgc 3780
tccgagaacg ggtgcgcata gaaattgcat caacgcatat agcgctagca gcacgccata 3840
gtgactggcg atgctgtcgg aatggacgat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat 3900
aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt 3960
gttagatttc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4020
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4080
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 4140
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagggtaccg aatttcccgg 4200
gctgcagact agtaaatcat aaaaaattta tttgctttgt gagcggataa caattataat 4260
agattcaatt gtgagcggat aacaatttca cacagaattc aaaagatcta agaaggagat 4320
atacatatat gatcccggac gtatcacagg cgctggcctg gctggaaaaa catcctcagg 4380
cgttaaaggg gatacagcgt gggctggagc gcgaaacttt gcgtgttaat gctgatggca 4440
cactggcaac aacaggtcat cctgaagcat taggttccgc actgacgcac aaatggatta 4500
ctaccgattt tgcggaagca ttgctggaat tcattacacc agtggatggt gatattgaac 4560
atatgctgac ctttatgcgc gatctgcatc gttatacggc gcgcaatatg ggcgatgagc 4620
ggatgtggcc gttaagtatg ccatgctaca tcgcagaagg tcaggacatc gaactggcac 4680
agtacggcac ttctaacacc ggacgcttta aaacgctgta tcgtgaaggg ctgaaaaatc 4740
gctacggcgc gctgatgcaa accatttccg gcgtgcacta caatttctct ttgccaatgg 4800
cattctggca agcgaagtgc ggtgatatct cgggcgctga tgccaaagag aaaatttctg 4860
cgggctattt ccgcgttatc cgcaattact atcgtttcgg ttgggtcatt ccttatctgt 4920
ttggtgcatc tccggcgatt tgttcttctt tcctgcaagg aaaaccaacg tcgctgccgt 4980
ttgagaaaac cgagtgcggt atgtattacc tgccgtatgc gacctctctt cgtttgagcg 5040
atctcggcta taccaataaa tcgcaaagca atcttggtat taccttcaac gatctttacg 5100
agtacgtagc gggccttaaa caggcaatca aaacgccatc ggaagagtac gcgaagattg 5160
gtattgagaa agacggtaag aggctgcaaa tcaacagcaa cgtgttgcag attgaaaacg 5220
aactgtacgc gccgattcgt ccaaaacgcg ttacccgcag cggcgagtcg ccttctgatg 5280
cgctgttacg tggcggcatt gaatatattg aagtgcgttc gctggacatc aacccgttct 5340
cgccgattgg tgtagatgaa cagcaggtgc gattcctcga cctgtttatg gtctggtgtg 5400
cgctggctga tgcaccggaa atgagcagta gcgaacttgc ctgtacacgc gttaactgga 5460
accgggtgat cctcgaaggt cgcaaaccgg gtctgacgct gggtatcggc tgcgaaaccg 5520
cacagttccc gttaccgcag gtgggtaaag atctgttccg cgatctgaaa cgcgtcgcgc 5580
aaacgctgga tagtattaac ggcggcgaag cgtatcagaa agtgtgtgat gaactggttg 5640
cctgcttcga taatcccgat ctgactttct ctgcccgtat cttaaggtct atgattgata 5700
ctggtattgg cggaacaggc aaagcatttg cagaagccta ccgtaatctg ctgcgtgaag 5760
agccgctgga aattctgcgc gaagaggatt ttgtagccga gcgcgaggcg tctgaacgcc 5820
gtcagcagga aatggaagcc gctgataccg aaccgtttgc ggtgtggctg gaaaaacacg 5880
cctgataagg tacctaagga ggttacaatg atcaagctcg gcatcgtgat ggaccccatc 5940
gcaaacatca acatcaagaa agattccagt tttgctatgt tgctggaagc acagcgtcgt 6000
ggttacgaac ttcactatat ggagatgggc gatctgtatc tgatcaatgg tgaagcccgc 6060
gcccataccc gcacgctgaa cgtgaagcag aactacgaag agtggttttc gttcgtcggt 6120
gaacaggatc tgccgctggc cgatctcgat gtgatcctga tgcgtaaaga cccgccgttt 6180
gataccgagt ttatctacgc gacctatatt ctggaacgtg ccgaagagaa agggacgctg 6240
atcgttaaca agccgcagag cctgcgcgac tgtaacgaga aactgtttac cgcctggttc 6300
tctgacttaa cgccagaaac gctggttacg cgcaataaag cgcagctaaa agcgttctgg 6360
gagaaacaca gcgacatcat tcttaagccg ctggacggta tgggcggcgc gtcgattttc 6420
cgcgtgaaag aaggcgatcc aaacctcggc gtgattgccg aaaccctgac tgagcatggc 6480
actcgctact gcatggcgca aaattacctg ccagccatta aagatggcga caaacgcgtg 6540
ctggtggtgg atggcgagcc ggtaccgtac tgcctggcgc gtattccgca ggggggcgaa 6600
acccgtggca atctggctgc cggtggtcgc ggtgaacctc gtccgctgac ggaaagtgac 6660
tggaaaatcg cccgtcagat cgggccgacg ctgaaagaaa aagggctgat ttttgttggt 6720
ctggatatca tcggcgaccg tctgactgaa attaacgtca ccagcccaac ctgtattcgt 6780
gagattgaag cagagtttcc ggtgtcgatc accggaatgt taatggatgc catcgaagca 6840
cgtttacagc agcagtaaaa 6860
<210> 10
<211> 2408
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PT5-FSa 插入
<400> 10
cgggctgcag actagtaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat 60
aatagattca attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcaaaagat ctaagaagga 120
gatatacata tatgattatt gaccgtctgc tgcaacgctc ccatagccat ctgccgatcc 180
tgcaagccac ctttggtctg gaacgtgaat ccctgcgcat tcatcagccg acccagcgtg 240
tggcccagac gccgcatccg aaaaccctgg gctctcgcaa ctatcacccg tacatccaaa 300
cggattatag tgaaccgcag ctggaactga ttaccccgat cgccaaagac tctcaggaag 360
caatccgttt tctgaaagcc atttcagatg ttgcaggtcg ctcgattaat catgacgaat 420
atctgtggcc gctgagtatg ccgccaaaag tccgtgaaga agatattcaa atcgctcagc 480
tggaagatgc gttcgaatat gactaccgca aatatctgga aaaaacctac ggcaaactga 540
ttcagtccat ctcaggtatt cactataacc tgggcctggg tcaagaactg ctgacctcgc 600
tgtttgaact gagccaggcg gataacgcca ttgacttcca gaatcaactg tatatgaaac 660
tgtctcagaa ttttctgcgt taccgctggc tgctgaccta tctgtacggc gccagtccgg 720
tggcagaaga agatttcctg gaccagaaac tgaacaatcc ggtccgttcc ctgcgcaact 780
cacatctggg ttatgtgaat cacaaagata ttcgtatctc gtataccagc ctgaaagatt 840
acgtgaacga cctggaaaat gctgttaaat ctggccagct gattgcggaa aaagaatttt 900
atagcccggt tcgtctgcgc ggctctaaag cctgccgtaa ctatctggaa aaaggtatca 960
cgtacctgga atttcgcacc ttcgatctga atccgtttag tccgattggt atcacccagg 1020
aaacggtgga taccgttcac ctgtttctgc tggcgctgct gtggattgac agctctagtc 1080
acatcgatca ggacattaaa gaagccaacc gcctgaatga tctgatcgca ctgagccatc 1140
cgctggaaaa actgccgaac caggctccgg tttcagatct ggtcgacgca atgcaatcgg 1200
tgattcagca ctttaatctg agcccgtatt accaagatct gctggaaagt gttaaacgtc 1260
agatccaatc cccggaactg accgttgcgg gtcagctgct ggaaatgatt gaaggtctgt 1320
ccctggaaac cttcggccag cgccagggtc agatctatca tgattacgca tgggaagctc 1380
cgtatgcgct gaaaggctac gaaacgatgg aactgagcac ccaactgctg ctgttcgatg 1440
ttattcagaa aggtgtgaac tttgaagttc tggatgaaca agaccagttc ctgaaactgt 1500
ggcataattc ccacatcgaa tatgtgaaaa acggcaatat gacgtcaaaa gataactaca 1560
tcgttccgct ggcgatggcc aataaagtgg ttaccaagaa aattctggac gaaaaacact 1620
ttccgacgcc gttcggtgat gaatttaccg accgtaaaga agcgctgaac tatttttcgc 1680
aaatccagga taaaccgatt gtcgtgaaac cgaaaagcac gaacttcggc ctgggtattt 1740
ctatctttaa aaccagtgcc aatctggcat cctacgaaaa agctattgat atcgcgttta 1800
cggaagacag cgcgatcctg gtcgaagaat atattgaagg caccgaatac cgtttctttg 1860
tgctggaggg tgattgtatc gcggtcctgc tgcgtgtggc cgcaaatgtt gttggtgacg 1920
gtatccatac catttcccaa ctggtgaaac tgaaaaacca gaatccgctg cgtggctatg 1980
atcaccgctc accgctggaa gttatcgaac tgggtgaagt cgaacagctg atgctggaac 2040
agcaaggcta cacggtgaac tcgatcccgc cggaaggtac caaaattgaa ctgcgtcgca 2100
actctaatat cagtacgggc ggtgatagca ttgacgttac caatacgatg gatccgacct 2160
ataaacagct ggcagctgaa atggcagaag ctatgggcgc atgggtctgt ggtgtggatc 2220
tgattatccc gaacgctacg caggcgtaca gcaaagacaa gaaaaacgcg acctgcattg 2280
aactgaactt taatccgctg atgtatatgc atacctactg tcaagaaggt ccgggtcaga 2340
gcatcacgcc gcgcatcctg gcaaaactgt ttccggaact gtaaaagctt gactcctgtt 2400
gatagatc 2408
<210> 11
<211> 6866
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pQEK1-PT5-FSa-term
<400> 11
gcttgactcc tgttgataga tccagtaatg acctcagaac tccatctgga tttgttcaga 60
acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt ggtgagaata gcttaaagga tcctaactcg 120
agagatccct gccatttggc ggggatttgc tagcttgagg catcaaataa aacgaaaggc 180
tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 240
taggacaaat ccgccctcta gattacgtgc agtcgatgat aagctgtcaa acatgagaat 300
tgtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 360
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 420
ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt 480
gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag 540
caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 600
atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc 660
gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc 720
ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg 780
ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag 840
acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc 900
gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat 960
gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac 1020
agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc 1080
gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac 1140
caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg 1200
cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag 1260
ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc 1320
ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga 1380
gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa 1440
ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcacc attcgatggt 1500
gtcggaattt cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcta gagctgcctc 1560
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 1620
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 1680
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 1740
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat 1800
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 1860
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 1920
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 1980
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 2040
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 2100
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 2160
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 2220
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 2280
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 2340
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 2400
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 2460
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 2520
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 2580
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 2640
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 2700
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 2760
tgagtaaact tggtctgaca gtcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa 2820
cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt 2880
gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct 2940
ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga 3000
cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg 3060
gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc 3120
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3180
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3240
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3300
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3360
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg 3420
cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 3480
aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 3540
catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 3600
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 3660
gatgcgtccg gcgtagagga tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat 3720
agtggctcca agtagcgaag cgagcaggac tgggcggcgg ccaaagcggt cggacagtgc 3780
tccgagaacg ggtgcgcata gaaattgcat caacgcatat agcgctagca gcacgccata 3840
gtgactggcg atgctgtcgg aatggacgat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat 3900
aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt 3960
gttagatttc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4020
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 4080
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 4140
taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagggtaccg aatttcccgg 4200
gctgcagact agtaaatcat aaaaaattta tttgctttgt gagcggataa caattataat 4260
agattcaatt gtgagcggat aacaatttca cacagaattc aaaagatcta agaaggagat 4320
atacatatat gatcccggac gtatcacagg cgctggcctg gctggaaaaa catcctcagg 4380
cgttaaaggg gatacagcgt gggctggagc gcgaaacttt gcgtgttaat gctgatggca 4440
cactggcaac aacaggtcat cctgaagcat taggttccgc actgacgcac aaatggatta 4500
ctaccgattt tgcggaagca ttgctggaat tcattacacc agtggatggt gatattgaac 4560
atatgctgac ctttatgcgc gatctgcatc gttatacggc gcgcaatatg ggcgatgagc 4620
ggatgtggcc gttaagtatg ccatgctaca tcgcagaagg tcaggacatc gaactggcac 4680
agtacggcac ttctaacacc ggacgcttta aaacgctgta tcgtgaaggg ctgaaaaatc 4740
gctacggcgc gctgatgcaa accatttccg gcgtgcacta caatttctct ttgccaatgg 4800
cattctggca agcgaagtgc ggtgatatct cgggcgctga tgccaaagag aaaatttctg 4860
cgggctattt ccgcgttatc cgcaattact atcgtttcgg ttgggtcatt ccttatctgt 4920
ttggtgcatc tccggcgatt tgttcttctt tcctgcaagg aaaaccaacg tcgctgccgt 4980
ttgagaaaac cgagtgcggt atgtattacc tgccgtatgc gacctctctt cgtttgagcg 5040
atctcggcta taccaataaa tcgcaaagca atcttggtat taccttcaac gatctttatg 5100
agtacgtagc gggccttaaa caggcaatca aaacgccatc ggaagagtac gcgaagattg 5160
gtattgagaa agacggtaag aggctgcaaa tcaacagcaa cgtgttgcag attgaaaacg 5220
aactgtacgc gccgattcgt ccaaaacgcg ttacccgcag cggcgagtcg ccttctgatg 5280
cgctgttacg tggcggcatt gaatatattg aagtgcgttc gctggacatc aacccgttct 5340
cgccgattgg tgtagatgaa cagcaggtgc gattcctcga cctgtttatg gtctggtgtg 5400
cgctggctga tgcaccggaa atgagcagta gcgaacttgc ctgtacacgc gttaactgga 5460
accgggtgat cctcgaaggt cgcaaaccgg gtctgacgct gggtatcggc tgcgaaaccg 5520
cacagttccc gttaccgcag gtgggtaaag atctgttccg cgatctgaaa cgcgtcgcgc 5580
aaacgctgga tagtattaac ggcggcgaag cgtatcagaa agtgtgtgat gaactggttg 5640
cctgcttcga taatcccgat ctgactttct ctgcccgtat cttaaggtct atgattgata 5700
ctggtattgg cggaacaggc aaagcatttg cagaagccta ccgtaatctg ctgcgtgaag 5760
agccgctgga aattctgcgc gaagaggatt ttgtagccga gcgcgaggcg tctgaacgcc 5820
gtcagcagga aatggaagcc gctgataccg aaccgtttgc ggtgtggctg gaaaaacacg 5880
cctgataagg tacctaagga ggttacaatg aaactgctgt tcgtcgttga tcccctggcc 5940
agcttgaaac cgtacaagga tagctccgtt gccatgatgc gcgcagcgtg tgctcgtggt 6000
catgccgtgt tcgcagcaga agcgcgcgca ctgctggttc gtgatggggt ggctcgttct 6060
cgtgcagatg ctgtcgaaac gcgtggcgac gatgactggt atcgcgttac cgaaacgcgt 6120
gaatttgcct taaccgactt tgatgcagtg gtgatgcgcg cagatccgcc cgttgacgtg 6180
gattaccttc tcgcgacgca cctgttaggc gtagccgaaa ccaacggtgc acgtgtcctg 6240
aatcgcccgc gtgccttgcg cgatttcaac gagaaactgg ccattctgga atttccgcag 6300
tttgtcgcac ctaccctggt aagtgcggac gcaaccgaaa ttgcccactt tctggctgct 6360
catgcggata tcatcgtcaa accgctgact gagatgggtg gctccggtgt gtttcgcctg 6420
ggagttagcg atccgaatcg gaacgcgatt ctggagacat taacccgtcg tggctctcgc 6480
ccaatcatgg ctcagcggta tttgccagcg atctcagagg gcgacaaacg catcctgctg 6540
atcgacggcg aagtagtgcc atgggccttg gcgcgcattc cgctgaccgg tgaaactcgc 6600
gggaatcttg cggctggtgg tacagcgcgc gcgcaaccgc tcagtgaacg ggatcgcgaa 6660
atcgccgaaa cgattgcccc ttgggcacgc agccagggca ttttccttgc gggcttagac 6720
gtgattgggg attgcctcac cgagattaac gtgacatcgc ctactggatt tcaggagatt 6780
accgcccaat cgggccatga tgttgcggac cagttcattg cggcgatcga acgcgcgacg 6840
cgtccggaat gataacatat gcccaa 6866
<210> 12
<211> 1557
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 12
atgatcccgg acgtatcaca ggcgctggcc tggctggaaa aacatcctca ggcgttaaag 60
gggatacagc gtgggctgga gcgcgaaact ttgcgtgtta atgctgatgg cacactggca 120
acaacaggtc atcctgaagc attaggttcc gcactgacgc acaaatggat tactaccgat 180
tttgcggaag cattgctgga attcattaca ccagtggatg gtgatattga acatatgctg 240
acctttatgc gcgatctgca tcgttatacg gcgcgcaata tgggcgatga gcggatgtgg 300
ccgttaagta tgccatgcta catcgcagaa ggtcaggaca tcgaactggc acagtacggc 360
acttctaaca ccggacgctt taaaacgctg tatcgtgaag ggctgaaaaa tcgctacggc 420
gcgctgatgc aaaccatttc cggcgtgcac tacaatttct ctttgccaat ggcattctgg 480
caagcgaagt gcggtgatat ctcgggcgct gatgccaaag agaaaatttc tgcgggctat 540
ttccgcgtta tccgcaatta ctatcgtttc ggttgggtca ttccttatct gtttggtgca 600
tctccggcga tttgttcttc tttcctgcaa ggaaaaccaa cgtcgctgcc gtttgagaaa 660
accgagtgcg gtatgtatta cctgccgtat gcgacctctc ttcgtttgag cgatctcggc 720
tataccaata aatcgcaaag caatcttggt attaccttca acgatcttta cgagtacgta 780
gcgggcctta aacaggcaat caaaacgcca tcggaagagt acgcgaagat tggtattgag 840
aaagacggta agaggctgca aatcaacagc aacgtgttgc agattgaaaa cgaactgtac 900
gcgccgattc gtccaaaacg cgttacccgc agcggcgagt cgccttctga tgcgctgtta 960
cgtggcggca ttgaatatat tgaagtgcgt tcgctggaca tcaacccgtt ctcgccgatt 1020
ggtgtagatg aacagcaggt gcgattcctc gacctgttta tggtctggtg tgcgctggct 1080
gatgcaccgg aaatgagcag tagcgaactt gcctgtacac gcgttaactg gaaccgggtg 1140
atcctcgaag gtcgcaaacc gggtctgacg ctgggtatcg gctgcgaaac cgcacagttc 1200
ccgttaccgc aggtgggtaa agatctgttc cgcgatctga aacgcgtcgc gcaaacgctg 1260
gatagtatta acggcggcga agcgtatcag aaagtgtgtg atgaactggt tgcctgcttc 1320
gataatcccg atctgacttt ctctgcccgt atcttaaggt ctatgattga tactggtatt 1380
ggcggaacag gcaaagcatt tgcagaagcc taccgtaatc tgctgcgtga agagccgctg 1440
gaaattctgc gcgaagagga ttttgtagcc gagcgcgagg cgtctgaacg ccgtcagcag 1500
gaaatggaag ccgctgatac cgaaccgttt gcggtgtggc tggaaaaaca cgcctga 1557
<210> 13
<211> 518
<212> PRT
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 13
Met Ile Pro Asp Val Ser Gln Ala Leu Ala Trp Leu Glu Lys His Pro
1 5 10 15
Gln Ala Leu Lys Gly Ile Gln Arg Gly Leu Glu Arg Glu Thr Leu Arg
20 25 30
Val Asn Ala Asp Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly His Pro Glu Ala Leu
35 40 45
Gly Ser Ala Leu Thr His Lys Trp Ile Thr Thr Asp Phe Ala Glu Ala
50 55 60
Leu Leu Glu Phe Ile Thr Pro Val Asp Gly Asp Ile Glu His Met Leu
65 70 75 80
Thr Phe Met Arg Asp Leu His Arg Tyr Thr Ala Arg Asn Met Gly Asp
85 90 95
Glu Arg Met Trp Pro Leu Ser Met Pro Cys Tyr Ile Ala Glu Gly Gln
100 105 110
Asp Ile Glu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Asn Thr Gly Arg Phe Lys
115 120 125
Thr Leu Tyr Arg Glu Gly Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Ala Leu Met Gln
130 135 140
Thr Ile Ser Gly Val His Tyr Asn Phe Ser Leu Pro Met Ala Phe Trp
145 150 155 160
Gln Ala Lys Cys Gly Asp Ile Ser Gly Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile
165 170 175
Ser Ala Gly Tyr Phe Arg Val Ile Arg Asn Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp
180 185 190
Val Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ser Phe
195 200 205
Leu Gln Gly Lys Pro Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Glu Cys Gly
210 215 220
Met Tyr Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asp Leu Gly
225 230 235 240
Tyr Thr Asn Lys Ser Gln Ser Asn Leu Gly Ile Thr Phe Asn Asp Leu
245 250 255
Tyr Glu Tyr Val Ala Gly Leu Lys Gln Ala Ile Lys Thr Pro Ser Glu
260 265 270
Glu Tyr Ala Lys Ile Gly Ile Glu Lys Asp Gly Lys Arg Leu Gln Ile
275 280 285
Asn Ser Asn Val Leu Gln Ile Glu Asn Glu Leu Tyr Ala Pro Ile Arg
290 295 300
Pro Lys Arg Val Thr Arg Ser Gly Glu Ser Pro Ser Asp Ala Leu Leu
305 310 315 320
Arg Gly Gly Ile Glu Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro
325 330 335
Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu
340 345 350
Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser
355 360 365
Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly
370 375 380
Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe
385 390 395 400
Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val
405 410 415
Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val
420 425 430
Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser
435 440 445
Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly
450 455 460
Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu
485 490 495
Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val
500 505 510
Trp Leu Glu Lys His Ala
515
<210> 14
<211> 951
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 14
atgatcaagc tcggcatcgt gatggacccc atcgcaaaca tcaacatcaa gaaagattcc 60
agttttgcta tgttgctgga agcacagcgt cgtggttacg aacttcacta tatggagatg 120
ggcgatctgt atctgatcaa tggtgaagcc cgcgcccata cccgcacgct gaacgtgaag 180
cagaactacg aagagtggtt ttcgttcgtc ggtgaacagg atctgccgct ggccgatctc 240
gatgtgatcc tgatgcgtaa agacccgccg tttgataccg agtttatcta cgcgacctat 300
attctggaac gtgccgaaga gaaagggacg ctgatcgtta acaagccgca gagcctgcgc 360
gactgtaacg agaaactgtt taccgcctgg ttctctgact taacgccaga aacgctggtt 420
acgcgcaata aagcgcagct aaaagcgttc tgggagaaac acagcgacat cattcttaag 480
ccgctggacg gtatgggcgg cgcgtcgatt ttccgcgtga aagaaggcga tccaaacctc 540
ggcgtgattg ccgaaaccct gactgagcat ggcactcgct actgcatggc gcaaaattac 600
ctgccagcca ttaaagatgg cgacaaacgc gtgctggtgg tggatggcga gccggtaccg 660
tactgcctgg cgcgtattcc gcaggggggc gaaacccgtg gcaatctggc tgccggtggt 720
cgcggtgaac ctcgtccgct gacggaaagt gactggaaaa tcgcccgtca gatcgggccg 780
acgctgaaag aaaaagggct gatttttgtt ggtctggata tcatcggcga ccgtctgact 840
gaaattaacg tcaccagccc aacctgtatt cgtgagattg aagcagagtt tccggtgtcg 900
atcaccggaa tgttaatgga tgccatcgaa gcacgtttac agcagcagta a 951
<210> 15
<211> 316
<212> PRT
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 15
Met Ile Lys Leu Gly Ile Val Met Asp Pro Ile Ala Asn Ile Asn Ile
1 5 10 15
Lys Lys Asp Ser Ser Phe Ala Met Leu Leu Glu Ala Gln Arg Arg Gly
20 25 30
Tyr Glu Leu His Tyr Met Glu Met Gly Asp Leu Tyr Leu Ile Asn Gly
35 40 45
Glu Ala Arg Ala His Thr Arg Thr Leu Asn Val Lys Gln Asn Tyr Glu
50 55 60
Glu Trp Phe Ser Phe Val Gly Glu Gln Asp Leu Pro Leu Ala Asp Leu
65 70 75 80
Asp Val Ile Leu Met Arg Lys Asp Pro Pro Phe Asp Thr Glu Phe Ile
85 90 95
Tyr Ala Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Ala Glu Glu Lys Gly Thr Leu Ile
100 105 110
Val Asn Lys Pro Gln Ser Leu Arg Asp Cys Asn Glu Lys Leu Phe Thr
115 120 125
Ala Trp Phe Ser Asp Leu Thr Pro Glu Thr Leu Val Thr Arg Asn Lys
130 135 140
Ala Gln Leu Lys Ala Phe Trp Glu Lys His Ser Asp Ile Ile Leu Lys
145 150 155 160
Pro Leu Asp Gly Met Gly Gly Ala Ser Ile Phe Arg Val Lys Glu Gly
165 170 175
Asp Pro Asn Leu Gly Val Ile Ala Glu Thr Leu Thr Glu His Gly Thr
180 185 190
Arg Tyr Cys Met Ala Gln Asn Tyr Leu Pro Ala Ile Lys Asp Gly Asp
195 200 205
Lys Arg Val Leu Val Val Asp Gly Glu Pro Val Pro Tyr Cys Leu Ala
210 215 220
Arg Ile Pro Gln Gly Gly Glu Thr Arg Gly Asn Leu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Arg Gly Glu Pro Arg Pro Leu Thr Glu Ser Asp Trp Lys Ile Ala Arg
245 250 255
Gln Ile Gly Pro Thr Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Phe Val Gly Leu
260 265 270
Asp Ile Ile Gly Asp Arg Leu Thr Glu Ile Asn Val Thr Ser Pro Thr
275 280 285
Cys Ile Arg Glu Ile Glu Ala Glu Phe Pro Val Ser Ile Thr Gly Met
290 295 300
Leu Met Asp Ala Ile Glu Ala Arg Leu Gln Gln Gln
305 310 315
<210> 16
<211> 945
<212> DNA
<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)
<400> 16
atgaagctgc tgttcgtcgt cgatccgctg gcgagcctca agccgtacaa ggacagttcg 60
gtcgcgatga tgcgcgcggc ctgtgcgcgc ggccacgccg tgttcgcggc cgaagcacgc 120
gcgctgctgg tgcgcgacgg agtcgcgcgg tcgcgcgccg acgccgtcga gacgcgcggc 180
gacgacgatt ggtatcgcgt gaccgaaacg cgcgaattcg cgctcacgga tttcgatgcc 240
gttgtgatgc gcgccgaccc gccggtcgac gtcgactacc tgctcgcgac ccacctgctc 300
ggcgtcgccg agaccaacgg cgcgcgcgtg ctgaaccggc cgcgcgcgct gcgcgacttc 360
aacgaaaaac tcgccatcct cgagtttccg caatttgtcg ccccgacgct ggtttcggcc 420
gacgcgacag aaatcgccca cttcctcgcc gcccacgccg acatcatcgt caagccgctc 480
accgagatgg gcggcagcgg cgtcttccgc ctcggcgttt ccgacccgaa ccgcaacgcc 540
atcctcgaaa cgctcacccg acgcggcagc cggccgatca tggcgcagcg ttatctgccg 600
gcgatcagcg aaggcgacaa gcgcatcctg ctgatcgacg gcgaggtggt gccgtgggcc 660
ctcgcgcgga ttccgctgac gggcgagacg cgcggcaatc tcgccgcggg cggcacggcg 720
cgtgcccagc cgctttcgga acgcgaccgc gagatcgccg agacgatcgc gccctgggtg 780
cgctcgcaag gcatcttcct cgccggcctc gacgtgatcg gcgactgcct caccgaaatc 840
aacgtcacga gcccgaccgg ctttcaggaa atcacggcgc agagcggcca cgacgtcgcg 900
gaccagttca tcgccgcgat cgagcgtgcc acgcgtccgg aataa 945
<210> 17
<211> 314
<212> PRT
<213> 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)
<400> 17
Met Lys Leu Leu Phe Val Val Asp Pro Leu Ala Ser Leu Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Ser Ser Val Ala Met Met Arg Ala Ala Cys Ala Arg Gly His
20 25 30
Ala Val Phe Ala Ala Glu Ala Arg Ala Leu Leu Val Arg Asp Gly Val
35 40 45
Ala Arg Ser Arg Ala Asp Ala Val Glu Thr Arg Gly Asp Asp Asp Trp
50 55 60
Tyr Arg Val Thr Glu Thr Arg Glu Phe Ala Leu Thr Asp Phe Asp Ala
65 70 75 80
Val Val Met Arg Ala Asp Pro Pro Val Asp Val Asp Tyr Leu Leu Ala
85 90 95
Thr His Leu Leu Gly Val Ala Glu Thr Asn Gly Ala Arg Val Leu Asn
100 105 110
Arg Pro Arg Ala Leu Arg Asp Phe Asn Glu Lys Leu Ala Ile Leu Glu
115 120 125
Phe Pro Gln Phe Val Ala Pro Thr Leu Val Ser Ala Asp Ala Thr Glu
130 135 140
Ile Ala His Phe Leu Ala Ala His Ala Asp Ile Ile Val Lys Pro Leu
145 150 155 160
Thr Glu Met Gly Gly Ser Gly Val Phe Arg Leu Gly Val Ser Asp Pro
165 170 175
Asn Arg Asn Ala Ile Leu Glu Thr Leu Thr Arg Arg Gly Ser Arg Pro
180 185 190
Ile Met Ala Gln Arg Tyr Leu Pro Ala Ile Ser Glu Gly Asp Lys Arg
195 200 205
Ile Leu Leu Ile Asp Gly Glu Val Val Pro Trp Ala Leu Ala Arg Ile
210 215 220
Pro Leu Thr Gly Glu Thr Arg Gly Asn Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala
225 230 235 240
Arg Ala Gln Pro Leu Ser Glu Arg Asp Arg Glu Ile Ala Glu Thr Ile
245 250 255
Ala Pro Trp Val Arg Ser Gln Gly Ile Phe Leu Ala Gly Leu Asp Val
260 265 270
Ile Gly Asp Cys Leu Thr Glu Ile Asn Val Thr Ser Pro Thr Gly Phe
275 280 285
Gln Glu Ile Thr Ala Gln Ser Gly His Asp Val Ala Asp Gln Phe Ile
290 295 300
Ala Ala Ile Glu Arg Ala Thr Arg Pro Glu
305 310
<210> 18
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TDgshB(V260A)
<400> 18
atgaaactgc tgttcgtcgt tgatcccctg gccagcttga aaccgtacaa ggatagctcc 60
gttgccatga tgcgcgcagc gtgtgctcgt ggtcatgccg tgttcgcagc agaagcgcgc 120
gcactgctgg ttcgtgatgg ggtggctcgt tctcgtgcag atgctgtcga aacgcgtggc 180
gacgatgact ggtatcgcgt taccgaaacg cgtgaatttg ccttaaccga ctttgatgca 240
gtggtgatgc gcgcagatcc gcccgttgac gtggattacc ttctcgcgac gcacctgtta 300
ggcgtagccg aaaccaacgg tgcacgtgtc ctgaatcgcc cgcgtgcctt gcgcgatttc 360
aacgagaaac tggccattct ggaatttccg cagtttgtcg cacctaccct ggtaagtgcg 420
gacgcaaccg aaattgccca ctttctggct gctcatgcgg atatcatcgt caaaccgctg 480
actgagatgg gtggctccgg tgtgtttcgc ctgggagtta gcgatccgaa tcggaacgcg 540
attctggaga cattaacccg tcgtggctct cgcccaatca tggctcagcg gtatttgcca 600
gcgatctcag agggcgacaa acgcatcctg ctgatcgacg gcgaagtagt gccatgggcc 660
ttggcgcgca ttccgctgac cggtgaaact cgcgggaatc ttgcggctgg tggtacagcg 720
cgcgcgcaac cgctcagtga acgggatcgc gaaatcgccg aaacgattgc cccttgggca 780
cgcagccagg gcattttcct tgcgggctta gacgtgattg gggattgcct caccgagatt 840
aacgtgacat cgcctactgg atttcaggag attaccgccc aatcgggcca tgatgttgcg 900
gaccagttca ttgcggcgat cgaacgcgcg acgcgtccgg aatgataa 948
<210> 19
<211> 2253
<212> DNA
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 19
atgattattg accgtctgct gcaacgctcc catagccatc tgccgatcct gcaagccacc 60
tttggtctgg aacgtgaatc cctgcgcatt catcagccga cccagcgtgt ggcccagacg 120
ccgcatccga aaaccctggg ctctcgcaac tatcacccgt acatccaaac ggattatagt 180
gaaccgcagc tggaactgat taccccgatc gccaaagact ctcaggaagc aatccgtttt 240
ctgaaagcca tttcagatgt tgcaggtcgc tcgattaatc atgacgaata tctgtggccg 300
ctgagtatgc cgccaaaagt ccgtgaagaa gatattcaaa tcgctcagct ggaagatgcg 360
ttcgaatatg actaccgcaa atatctggaa aaaacctacg gcaaactgat tcagtccatc 420
tcaggtattc actataacct gggcctgggt caagaactgc tgacctcgct gtttgaactg 480
agccaggcgg ataacgccat tgacttccag aatcaactgt atatgaaact gtctcagaat 540
tttctgcgtt accgctggct gctgacctat ctgtacggcg ccagtccggt ggcagaagaa 600
gatttcctgg accagaaact gaacaatccg gtccgttccc tgcgcaactc acatctgggt 660
tatgtgaatc acaaagatat tcgtatctcg tataccagcc tgaaagatta cgtgaacgac 720
ctggaaaatg ctgttaaatc tggccagctg attgcggaaa aagaatttta tagcccggtt 780
cgtctgcgcg gctctaaagc ctgccgtaac tatctggaaa aaggtatcac gtacctggaa 840
tttcgcacct tcgatctgaa tccgtttagt ccgattggta tcacccagga aacggtggat 900
accgttcacc tgtttctgct ggcgctgctg tggattgaca gctctagtca catcgatcag 960
gacattaaag aagccaaccg cctgaatgat ctgatcgcac tgagccatcc gctggaaaaa 1020
ctgccgaacc aggctccggt ttcagatctg gtcgacgcaa tgcaatcggt gattcagcac 1080
tttaatctga gcccgtatta ccaagatctg ctggaaagtg ttaaacgtca gatccaatcc 1140
ccggaactga ccgttgcggg tcagctgctg gaaatgattg aaggtctgtc cctggaaacc 1200
ttcggccagc gccagggtca gatctatcat gattacgcat gggaagctcc gtatgcgctg 1260
aaaggctacg aaacgatgga actgagcacc caactgctgc tgttcgatgt tattcagaaa 1320
ggtgtgaact ttgaagttct ggatgaacaa gaccagttcc tgaaactgtg gcataattcc 1380
cacatcgaat atgtgaaaaa cggcaatatg acgtcaaaag ataactacat cgttccgctg 1440
gcgatggcca ataaagtggt taccaagaaa attctggacg aaaaacactt tccgacgccg 1500
ttcggtgatg aatttaccga ccgtaaagaa gcgctgaact atttttcgca aatccaggat 1560
aaaccgattg tcgtgaaacc gaaaagcacg aacttcggcc tgggtatttc tatctttaaa 1620
accagtgcca atctggcatc ctacgaaaaa gctattgata tcgcgtttac ggaagacagc 1680
gcgatcctgg tcgaagaata tattgaaggc accgaatacc gtttctttgt gctggagggt 1740
gattgtatcg cggtcctgct gcgtgtggcc gcaaatgttg ttggtgacgg tatccatacc 1800
atttcccaac tggtgaaact gaaaaaccag aatccgctgc gtggctatga tcaccgctca 1860
ccgctggaag ttatcgaact gggtgaagtc gaacagctga tgctggaaca gcaaggctac 1920
acggtgaact cgatcccgcc ggaaggtacc aaaattgaac tgcgtcgcaa ctctaatatc 1980
agtacgggcg gtgatagcat tgacgttacc aatacgatgg atccgaccta taaacagctg 2040
gcagctgaaa tggcagaagc tatgggcgca tgggtctgtg gtgtggatct gattatcccg 2100
aacgctacgc aggcgtacag caaagacaag aaaaacgcga cctgcattga actgaacttt 2160
aatccgctga tgtatatgca tacctactgt caagaaggtc cgggtcagag catcacgccg 2220
cgcatcctgg caaaactgtt tccggaactg taa 2253
<210> 20
<211> 750
<212> PRT
<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
<400> 20
Met Ile Ile Asp Arg Leu Leu Gln Arg Ser His Ser His Leu Pro Ile
1 5 10 15
Leu Gln Ala Thr Phe Gly Leu Glu Arg Glu Ser Leu Arg Ile His Gln
20 25 30
Pro Thr Gln Arg Val Ala Gln Thr Pro His Pro Lys Thr Leu Gly Ser
35 40 45
Arg Asn Tyr His Pro Tyr Ile Gln Thr Asp Tyr Ser Glu Pro Gln Leu
50 55 60
Glu Leu Ile Thr Pro Ile Ala Lys Asp Ser Gln Glu Ala Ile Arg Phe
65 70 75 80
Leu Lys Ala Ile Ser Asp Val Ala Gly Arg Ser Ile Asn His Asp Glu
85 90 95
Tyr Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Lys Val Arg Glu Glu Asp Ile
100 105 110
Gln Ile Ala Gln Leu Glu Asp Ala Phe Glu Tyr Asp Tyr Arg Lys Tyr
115 120 125
Leu Glu Lys Thr Tyr Gly Lys Leu Ile Gln Ser Ile Ser Gly Ile His
130 135 140
Tyr Asn Leu Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Glu Leu
145 150 155 160
Ser Gln Ala Asp Asn Ala Ile Asp Phe Gln Asn Gln Leu Tyr Met Lys
165 170 175
Leu Ser Gln Asn Phe Leu Arg Tyr Arg Trp Leu Leu Thr Tyr Leu Tyr
180 185 190
Gly Ala Ser Pro Val Ala Glu Glu Asp Phe Leu Asp Gln Lys Leu Asn
195 200 205
Asn Pro Val Arg Ser Leu Arg Asn Ser His Leu Gly Tyr Val Asn His
210 215 220
Lys Asp Ile Arg Ile Ser Tyr Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Val Asn Asp
225 230 235 240
Leu Glu Asn Ala Val Lys Ser Gly Gln Leu Ile Ala Glu Lys Glu Phe
245 250 255
Tyr Ser Pro Val Arg Leu Arg Gly Ser Lys Ala Cys Arg Asn Tyr Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Glu Phe Arg Thr Phe Asp Leu Asn Pro
275 280 285
Phe Ser Pro Ile Gly Ile Thr Gln Glu Thr Val Asp Thr Val His Leu
290 295 300
Phe Leu Leu Ala Leu Leu Trp Ile Asp Ser Ser Ser His Ile Asp Gln
305 310 315 320
Asp Ile Lys Glu Ala Asn Arg Leu Asn Asp Leu Ile Ala Leu Ser His
325 330 335
Pro Leu Glu Lys Leu Pro Asn Gln Ala Pro Val Ser Asp Leu Val Asp
340 345 350
Ala Met Gln Ser Val Ile Gln His Phe Asn Leu Ser Pro Tyr Tyr Gln
355 360 365
Asp Leu Leu Glu Ser Val Lys Arg Gln Ile Gln Ser Pro Glu Leu Thr
370 375 380
Val Ala Gly Gln Leu Leu Glu Met Ile Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr
385 390 395 400
Phe Gly Gln Arg Gln Gly Gln Ile Tyr His Asp Tyr Ala Trp Glu Ala
405 410 415
Pro Tyr Ala Leu Lys Gly Tyr Glu Thr Met Glu Leu Ser Thr Gln Leu
420 425 430
Leu Leu Phe Asp Val Ile Gln Lys Gly Val Asn Phe Glu Val Leu Asp
435 440 445
Glu Gln Asp Gln Phe Leu Lys Leu Trp His Asn Ser His Ile Glu Tyr
450 455 460
Val Lys Asn Gly Asn Met Thr Ser Lys Asp Asn Tyr Ile Val Pro Leu
465 470 475 480
Ala Met Ala Asn Lys Val Val Thr Lys Lys Ile Leu Asp Glu Lys His
485 490 495
Phe Pro Thr Pro Phe Gly Asp Glu Phe Thr Asp Arg Lys Glu Ala Leu
500 505 510
Asn Tyr Phe Ser Gln Ile Gln Asp Lys Pro Ile Val Val Lys Pro Lys
515 520 525
Ser Thr Asn Phe Gly Leu Gly Ile Ser Ile Phe Lys Thr Ser Ala Asn
530 535 540
Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ile Asp Ile Ala Phe Thr Glu Asp Ser
545 550 555 560
Ala Ile Leu Val Glu Glu Tyr Ile Glu Gly Thr Glu Tyr Arg Phe Phe
565 570 575
Val Leu Glu Gly Asp Cys Ile Ala Val Leu Leu Arg Val Ala Ala Asn
580 585 590
Val Val Gly Asp Gly Ile His Thr Ile Ser Gln Leu Val Lys Leu Lys
595 600 605
Asn Gln Asn Pro Leu Arg Gly Tyr Asp His Arg Ser Pro Leu Glu Val
610 615 620
Ile Glu Leu Gly Glu Val Glu Gln Leu Met Leu Glu Gln Gln Gly Tyr
625 630 635 640
Thr Val Asn Ser Ile Pro Pro Glu Gly Thr Lys Ile Glu Leu Arg Arg
645 650 655
Asn Ser Asn Ile Ser Thr Gly Gly Asp Ser Ile Asp Val Thr Asn Thr
660 665 670
Met Asp Pro Thr Tyr Lys Gln Leu Ala Ala Glu Met Ala Glu Ala Met
675 680 685
Gly Ala Trp Val Cys Gly Val Asp Leu Ile Ile Pro Asn Ala Thr Gln
690 695 700
Ala Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Asn Ala Thr Cys Ile Glu Leu Asn Phe
705 710 715 720
Asn Pro Leu Met Tyr Met His Thr Tyr Cys Gln Glu Gly Pro Gly Gln
725 730 735
Ser Ile Thr Pro Arg Ile Leu Ala Lys Leu Phe Pro Glu Leu
740 745 750
<210> 21
<211> 1743
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 21
atgataaaac cgacgttttt acgccgggtg gccattgctg ctctgctctc aggaagttgt 60
tttagcgccg ccgccgcgcc tcctgcgccg cccgtctcgt atggtgtgga ggaagatgtc 120
ttccacccgg tacgcgcgaa acagggaatg gtagcgtctg tggacgccac tgccactcag 180
gtgggggtgg atattctcaa ggagggcggg aatgccgttg atgccgccgt ggcggtgggc 240
tacgcgctgg cggtaacgca tccgcaggca gggaatctgg gcggtggtgg ttttatgtta 300
atccgctcga aaaatggcaa taccacggct atcgatttcc gcgaaatggc acccgccaaa 360
gcgacccgcg atatgttcct cgatgatcag ggcaacccgg acagcaaaaa atcactcact 420
tcgcatctgg cttccggcac accgggtacg gtagcaggtt tctcgctggc gctggataaa 480
tacggcacca tgccgctgaa caaagtcgtg cagcccgcgt ttaaactggc acgcgatggt 540
tttatcgtta acgacgcgct ggctgacgat ctcaaaacct acggtagcga agtgttgccg 600
aatcacgaaa acagtaaagc tatcttctgg aaagagggcg agccgctgaa aaagggcgac 660
acgctggtgc aggcgaacct ggcaaagagc ctggagatga ttgctgaaaa cggcccggac 720
gaattctata aaggcacgat tgcggaacag atcgcccagg agatgcagaa aaacggtggc 780
ttgatcacta aagaagattt agcagcctat aaagcggtcg aacgcactcc gataagcggc 840
gattatcgcg ggtatcaggt ttactccatg ccaccgccat cctccggcgg gatccatatc 900
gtacaaatcc tcaatattct ggaaaacttc gatatgaaga aatacggctt tggcagcgcc 960
gatgcgatgc aaatcatggc agaagcggag aaatacgcct acgccgaccg ctcggaatat 1020
cttggcgacc cggattttgt caaagtaccg tggcaggcgc tgaccaataa agcctatgcc 1080
aaatctattg ccgatcaaat tgatatcaat aaagcgaagc catccagcga aattcgcccc 1140
ggcaagcttg cgccttatga gagtaatcaa actacccatt actcagtggt ggataaagat 1200
ggtaacgcgg tggcggtgac ctatacgctg aacaccacct tcggtacggg cattgtcgcg 1260
ggcgagagcg gtattctgct taataaccag atggatgatt tctccgccaa accgggcgta 1320
ccgaacgttt acgggctggt gggcggtgat gccaacgccg tcgggccgaa caaacgcccg 1380
ctgtcgtcga tgtcgccgac cattgtggtg aaagacggta aaacctggct ggttaccggt 1440
agcccaggcg gtagccggat catcactaca gtgctgcaaa tggtggtgaa tagcatcgat 1500
tatggcttga acgtcgccga agcgaccaat gcgccgcgtt tccaccatca gtggttgccg 1560
gacgagctgc gtgtcgaaaa agggtttagc ccggatacgc tcaagctgct ggaagcaaaa 1620
ggtcagaaag tggcgctgaa agaggcgatg ggcagtacac aaagcattat ggttgggccg 1680
gacggtgagt tgtacggcgc atccgacccg cgctcggtgg atgatttaac ggcggggtac 1740
taa 1743
<210> 22
<211> 580
<212> PRT
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 22
Met Ile Lys Pro Thr Phe Leu Arg Arg Val Ala Ile Ala Ala Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gly Ser Cys Phe Ser Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val
20 25 30
Ser Tyr Gly Val Glu Glu Asp Val Phe His Pro Val Arg Ala Lys Gln
35 40 45
Gly Met Val Ala Ser Val Asp Ala Thr Ala Thr Gln Val Gly Val Asp
50 55 60
Ile Leu Lys Glu Gly Gly Asn Ala Val Asp Ala Ala Val Ala Val Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Ala Val Thr His Pro Gln Ala Gly Asn Leu Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Phe Met Leu Ile Arg Ser Lys Asn Gly Asn Thr Thr Ala Ile Asp
100 105 110
Phe Arg Glu Met Ala Pro Ala Lys Ala Thr Arg Asp Met Phe Leu Asp
115 120 125
Asp Gln Gly Asn Pro Asp Ser Lys Lys Ser Leu Thr Ser His Leu Ala
130 135 140
Ser Gly Thr Pro Gly Thr Val Ala Gly Phe Ser Leu Ala Leu Asp Lys
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Met Pro Leu Asn Lys Val Val Gln Pro Ala Phe Lys Leu
165 170 175
Ala Arg Asp Gly Phe Ile Val Asn Asp Ala Leu Ala Asp Asp Leu Lys
180 185 190
Thr Tyr Gly Ser Glu Val Leu Pro Asn His Glu Asn Ser Lys Ala Ile
195 200 205
Phe Trp Lys Glu Gly Glu Pro Leu Lys Lys Gly Asp Thr Leu Val Gln
210 215 220
Ala Asn Leu Ala Lys Ser Leu Glu Met Ile Ala Glu Asn Gly Pro Asp
225 230 235 240
Glu Phe Tyr Lys Gly Thr Ile Ala Glu Gln Ile Ala Gln Glu Met Gln
245 250 255
Lys Asn Gly Gly Leu Ile Thr Lys Glu Asp Leu Ala Ala Tyr Lys Ala
260 265 270
Val Glu Arg Thr Pro Ile Ser Gly Asp Tyr Arg Gly Tyr Gln Val Tyr
275 280 285
Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ile His Ile Val Gln Ile Leu
290 295 300
Asn Ile Leu Glu Asn Phe Asp Met Lys Lys Tyr Gly Phe Gly Ser Ala
305 310 315 320
Asp Ala Met Gln Ile Met Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Ala Tyr Ala Asp
325 330 335
Arg Ser Glu Tyr Leu Gly Asp Pro Asp Phe Val Lys Val Pro Trp Gln
340 345 350
Ala Leu Thr Asn Lys Ala Tyr Ala Lys Ser Ile Ala Asp Gln Ile Asp
355 360 365
Ile Asn Lys Ala Lys Pro Ser Ser Glu Ile Arg Pro Gly Lys Leu Ala
370 375 380
Pro Tyr Glu Ser Asn Gln Thr Thr His Tyr Ser Val Val Asp Lys Asp
385 390 395 400
Gly Asn Ala Val Ala Val Thr Tyr Thr Leu Asn Thr Thr Phe Gly Thr
405 410 415
Gly Ile Val Ala Gly Glu Ser Gly Ile Leu Leu Asn Asn Gln Met Asp
420 425 430
Asp Phe Ser Ala Lys Pro Gly Val Pro Asn Val Tyr Gly Leu Val Gly
435 440 445
Gly Asp Ala Asn Ala Val Gly Pro Asn Lys Arg Pro Leu Ser Ser Met
450 455 460
Ser Pro Thr Ile Val Val Lys Asp Gly Lys Thr Trp Leu Val Thr Gly
465 470 475 480
Ser Pro Gly Gly Ser Arg Ile Ile Thr Thr Val Leu Gln Met Val Val
485 490 495
Asn Ser Ile Asp Tyr Gly Leu Asn Val Ala Glu Ala Thr Asn Ala Pro
500 505 510
Arg Phe His His Gln Trp Leu Pro Asp Glu Leu Arg Val Glu Lys Gly
515 520 525
Phe Ser Pro Asp Thr Leu Lys Leu Leu Glu Ala Lys Gly Gln Lys Val
530 535 540
Ala Leu Lys Glu Ala Met Gly Ser Thr Gln Ser Ile Met Val Gly Pro
545 550 555 560
Asp Gly Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Asp Pro Arg Ser Val Asp Asp Leu
565 570 575
Thr Ala Gly Tyr
580
<210> 23
<211> 1227
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 23
atggataaac tacttgagcg atttttgaac tacgtgtctc tggataccca atcaaaagca 60
ggggtgagac aggttcccag cacggaaggc caatggaagt tattgcatct gctgaaagag 120
cagctcgaag agatggggct tatcaatgtg accttaagtg agaagggcac tttgatggcg 180
acgttaccgg ctaacgtccc tggcgatatc ccggcgattg gctttatttc tcatgtggat 240
acctcaccgg attgcagcgg caaaaatgtg aatccgcaaa ttgttgaaaa ctatcgcggt 300
ggcgatattg cgctgggtat cggcgatgaa gttttatcac cggttatgtt cccggtgctg 360
catcagctac tgggtcagac gctgattacc accgatggta aaaccttgtt aggtgccgat 420
gacaaagcag gtattgcaga aatcatgacc gcgctggcgg tattgcaaca gaaaaaaatt 480
ccgcatggtg atattcgcgt cgcctttacc ccggatgaag aagtgggcaa aggggcgaaa 540
cattttgatg ttgacgcctt cgatgcccgc tgggcttaca ctgttgatgg tggtggcgta 600
ggcgaactgg agtttgaaaa cttcaacgcc gcgtcggtca atatcaaaat tgtcggtaac 660
aatgttcatc cgggcacggc gaaaggagtg atggtaaatg cgctgtcgct ggcggcacgt 720
attcatgcgg aagttccggc ggatgaaagc ccggaaatga cagaaggcta tgaaggtttc 780
tatcatctgg cgagcatgaa aggcaccgtt gaacgggccg atatgcacta catcatccgt 840
gatttcgacc gtaaacagtt tgaagcgcgt aaacgtaaaa tgatggagat cgccaaaaaa 900
gtgggcaaag ggttacatcc tgattgctac attgaactgg tgattgaaga cagttactac 960
aatatgcgcg agaaagtggt tgagcatccg catattctcg atatcgccca gcaggcgatg 1020
cgcgattgcg atattgaacc ggaactgaaa ccgatccgcg gtggtaccga cggcgcgcag 1080
ttgtcgttta tgggattacc gtgcccgaac ctgttcactg gcggttacaa ctatcatggt 1140
aagcatgagt ttgtgactct ggaaggtatg gaaaaagcgg tgcaggtgat cgtccgtatt 1200
gccgagttaa cggcgcaacg gaagtaa 1227
<210> 24
<211> 408
<212> PRT
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 24
Met Asp Lys Leu Leu Glu Arg Phe Leu Asn Tyr Val Ser Leu Asp Thr
1 5 10 15
Gln Ser Lys Ala Gly Val Arg Gln Val Pro Ser Thr Glu Gly Gln Trp
20 25 30
Lys Leu Leu His Leu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Glu Met Gly Leu Ile
35 40 45
Asn Val Thr Leu Ser Glu Lys Gly Thr Leu Met Ala Thr Leu Pro Ala
50 55 60
Asn Val Pro Gly Asp Ile Pro Ala Ile Gly Phe Ile Ser His Val Asp
65 70 75 80
Thr Ser Pro Asp Cys Ser Gly Lys Asn Val Asn Pro Gln Ile Val Glu
85 90 95
Asn Tyr Arg Gly Gly Asp Ile Ala Leu Gly Ile Gly Asp Glu Val Leu
100 105 110
Ser Pro Val Met Phe Pro Val Leu His Gln Leu Leu Gly Gln Thr Leu
115 120 125
Ile Thr Thr Asp Gly Lys Thr Leu Leu Gly Ala Asp Asp Lys Ala Gly
130 135 140
Ile Ala Glu Ile Met Thr Ala Leu Ala Val Leu Gln Gln Lys Lys Ile
145 150 155 160
Pro His Gly Asp Ile Arg Val Ala Phe Thr Pro Asp Glu Glu Val Gly
165 170 175
Lys Gly Ala Lys His Phe Asp Val Asp Ala Phe Asp Ala Arg Trp Ala
180 185 190
Tyr Thr Val Asp Gly Gly Gly Val Gly Glu Leu Glu Phe Glu Asn Phe
195 200 205
Asn Ala Ala Ser Val Asn Ile Lys Ile Val Gly Asn Asn Val His Pro
210 215 220
Gly Thr Ala Lys Gly Val Met Val Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Ile His Ala Glu Val Pro Ala Asp Glu Ser Pro Glu Met Thr Glu Gly
245 250 255
Tyr Glu Gly Phe Tyr His Leu Ala Ser Met Lys Gly Thr Val Glu Arg
260 265 270
Ala Asp Met His Tyr Ile Ile Arg Asp Phe Asp Arg Lys Gln Phe Glu
275 280 285
Ala Arg Lys Arg Lys Met Met Glu Ile Ala Lys Lys Val Gly Lys Gly
290 295 300
Leu His Pro Asp Cys Tyr Ile Glu Leu Val Ile Glu Asp Ser Tyr Tyr
305 310 315 320
Asn Met Arg Glu Lys Val Val Glu His Pro His Ile Leu Asp Ile Ala
325 330 335
Gln Gln Ala Met Arg Asp Cys Asp Ile Glu Pro Glu Leu Lys Pro Ile
340 345 350
Arg Gly Gly Thr Asp Gly Ala Gln Leu Ser Phe Met Gly Leu Pro Cys
355 360 365
Pro Asn Leu Phe Thr Gly Gly Tyr Asn Tyr His Gly Lys His Glu Phe
370 375 380
Val Thr Leu Glu Gly Met Glu Lys Ala Val Gln Val Ile Val Arg Ile
385 390 395 400
Ala Glu Leu Thr Ala Gln Arg Lys
405
<210> 25
<211> 1353
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 25
atgactaaac actatgatta catcgccatc ggcggcggca gcggcggtat cgcctccatc 60
aaccgcgcgg ctatgtacgg ccagaaatgt gcgctgattg aagccaaaga gctgggcggc 120
acctgcgtaa atgttggctg tgtgccgaaa aaagtgatgt ggcacgcggc gcaaatccgt 180
gaagcgatcc atatgtacgg cccggattat ggttttgata ccactatcaa taaattcaac 240
tgggaaacgt tgatcgccag ccgtaccgcc tatatcgacc gtattcatac ttcctatgaa 300
aacgtgctcg gtaaaaataa cgttgatgta atcaaaggct ttgcccgctt cgttgatgcc 360
aaaacgctgg aggtaaacgg cgaaaccatc acggccgatc atattctgat cgccacaggc 420
ggtcgtccga gccacccgga tattccgggc gtggaatacg gtattgattc tgatggcttc 480
ttcgcccttc ctgctttgcc agagcgcgtg gcggttgttg gcgcgggtta catcgccgtt 540
gagctggcgg gcgtgattaa cggcctcggc gcgaaaacgc atctgtttgt gcgtaaacat 600
gcgccgctgc gcagcttcga cccgatgatt tccgaaacgc tggtcgaagt gatgaacgcc 660
gaaggcccgc agctgcacac caacgccatc ccgaaagcgg tagtgaaaaa taccgatggt 720
agcctgacgc tggagctgga agatggtcgc agtgaaacgg tggattgcct gatttgggcg 780
attggtcgcg agcctgccaa tgacaacatc aacctggaag ccgctggcgt taaaactaac 840
gaaaaaggct atatcgtcgt cgataaatat caaaacacca atattgaagg tatttacgcg 900
gtgggcgata acacgggtgc agtggagctg acaccggtgg cagttgcagc gggtcgccgt 960
ctctctgaac gcctgtttaa taacaagccg gatgagcatc tggattacag caacattccg 1020
accgtggtct tcagccatcc gccgattggt actgttggtt taacggaacc gcaggcgcgc 1080
gagcagtatg gcgacgatca ggtgaaagtg tataaatcct ctttcaccgc gatgtatacc 1140
gccgtcacca ctcaccgcca gccgtgccgc atgaagctgg tgtgcgttgg atcggaagag 1200
aagattgtcg gtattcacgg cattggcttt ggtatggacg aaatgttgca gggcttcgcg 1260
gtggcgctga agatgggggc aaccaaaaaa gacttcgaca ataccgtcgc cattcaccca 1320
acggcggcag aagagttcgt gacaatgcgt taa 1353
<210> 26
<211> 450
<212> PRT
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 26
Met Thr Lys His Tyr Asp Tyr Ile Ala Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Ile Asn Arg Ala Ala Met Tyr Gly Gln Lys Cys Ala Leu
20 25 30
Ile Glu Ala Lys Glu Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn Val Gly Cys Val
35 40 45
Pro Lys Lys Val Met Trp His Ala Ala Gln Ile Arg Glu Ala Ile His
50 55 60
Met Tyr Gly Pro Asp Tyr Gly Phe Asp Thr Thr Ile Asn Lys Phe Asn
65 70 75 80
Trp Glu Thr Leu Ile Ala Ser Arg Thr Ala Tyr Ile Asp Arg Ile His
85 90 95
Thr Ser Tyr Glu Asn Val Leu Gly Lys Asn Asn Val Asp Val Ile Lys
100 105 110
Gly Phe Ala Arg Phe Val Asp Ala Lys Thr Leu Glu Val Asn Gly Glu
115 120 125
Thr Ile Thr Ala Asp His Ile Leu Ile Ala Thr Gly Gly Arg Pro Ser
130 135 140
His Pro Asp Ile Pro Gly Val Glu Tyr Gly Ile Asp Ser Asp Gly Phe
145 150 155 160
Phe Ala Leu Pro Ala Leu Pro Glu Arg Val Ala Val Val Gly Ala Gly
165 170 175
Tyr Ile Ala Val Glu Leu Ala Gly Val Ile Asn Gly Leu Gly Ala Lys
180 185 190
Thr His Leu Phe Val Arg Lys His Ala Pro Leu Arg Ser Phe Asp Pro
195 200 205
Met Ile Ser Glu Thr Leu Val Glu Val Met Asn Ala Glu Gly Pro Gln
210 215 220
Leu His Thr Asn Ala Ile Pro Lys Ala Val Val Lys Asn Thr Asp Gly
225 230 235 240
Ser Leu Thr Leu Glu Leu Glu Asp Gly Arg Ser Glu Thr Val Asp Cys
245 250 255
Leu Ile Trp Ala Ile Gly Arg Glu Pro Ala Asn Asp Asn Ile Asn Leu
260 265 270
Glu Ala Ala Gly Val Lys Thr Asn Glu Lys Gly Tyr Ile Val Val Asp
275 280 285
Lys Tyr Gln Asn Thr Asn Ile Glu Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp Asn
290 295 300
Thr Gly Ala Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Val Ala Ala Gly Arg Arg
305 310 315 320
Leu Ser Glu Arg Leu Phe Asn Asn Lys Pro Asp Glu His Leu Asp Tyr
325 330 335
Ser Asn Ile Pro Thr Val Val Phe Ser His Pro Pro Ile Gly Thr Val
340 345 350
Gly Leu Thr Glu Pro Gln Ala Arg Glu Gln Tyr Gly Asp Asp Gln Val
355 360 365
Lys Val Tyr Lys Ser Ser Phe Thr Ala Met Tyr Thr Ala Val Thr Thr
370 375 380
His Arg Gln Pro Cys Arg Met Lys Leu Val Cys Val Gly Ser Glu Glu
385 390 395 400
Lys Ile Val Gly Ile His Gly Ile Gly Phe Gly Met Asp Glu Met Leu
405 410 415
Gln Gly Phe Ala Val Ala Leu Lys Met Gly Ala Thr Lys Lys Asp Phe
420 425 430
Asp Asn Thr Val Ala Ile His Pro Thr Ala Ala Glu Glu Phe Val Thr
435 440 445
Met Arg
450
<210> 27
<211> 1140
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 27
atggttttgc aatccacgcg ctggttggcg ctcggctatt tcacatactt ttttagttac 60
ggcatttttc tacctttctg gagcgtctgg cttaaaggga ttggtttaac gccagaaacc 120
atcggcctgt tattgggggc aggtctggtt gcccgtttcc tcgggagttt gctcatcgcg 180
ccccgcgtca gcgatccttc ccgcctgatt tccgccttgc gcgtgctggc actgctgaca 240
cttctctttg ctgtcgcctt ctgggcgggg gcgcacgtag cgtggctgat gctggtgatg 300
attggcttta acctcttttt ctcaccactg gtaccgttga ccgatgcact ggcgaatacg 360
tggcaaaagc agttcccgct tgattacggc aaagtgcgac tgtggggctc ggtggcgttt 420
gtcattggct cggcgctgac gggcaaactg gtcactatgt ttgattatcg ggtgatcctc 480
gcgctgttga cgttgggcgt ggcatccatg ctgctcggct ttctcatccg tccgacgatt 540
cagccacaag gggcaagtcg ccagcaggag agcaccggtt ggtctgcgtg gttggcgctg 600
gttcgccaga actggcgctt tctggcctgc gtttgtttat tgcagggggc acatgcggcc 660
tattacggtt ttagcgccat ttactggcag gcagctggct actcggcctc ggcggtgggg 720
tatttgtggt cgctgggcgt ggtggcggaa gtcattatct ttgcgctgag taataaactt 780
ttccgccgtt gtagtgcacg cgatatgctg ttgatctcgg cgatttgcgg cgtagtgcgc 840
tggggcatta tgggagcaac tacggcgttg ccgtggttga tagtggtgca aattctgcat 900
tgcggcacct tcacggtctg ccacctggcc gccatgcgtt atattgctgc tcgccagggt 960
agcgaagtca tccgtttaca ggcggtttac tctgccgtcg cgatgggcgg cagtatcgct 1020
atcatgaccg ttttcgccgg tttcctgtat caatatctgg gccacggcgt gttctgggta 1080
atggcgctgg tggcgcttcc ggcaatgttt ttgcgcccga aagttgttcc ctcatgctga 1140
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> hcaT 正向引物
<400> 28
gctgctcggc tttctcatcc 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> hcaT 反向引物
<400> 29
ccaaccacgc agaccaacc 19
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> gshA 正向引物
<400> 30
ctggctggaa aaacatcctc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> gshA 反向引物
<400> 31
tcagtgcgga acctaatgct 20
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TDgshB(V260A) 正向引物
<400> 32
tttccttgcg ggcttaga 18
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TDgshB(V260A) 反向引物
<400> 33
attgggcggt aatctcctga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> gshB 正向引物
<400> 34
tgtttaccgc ctggttctct 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> gshB 反向引物
<400> 35
tgatgtcgct gtgtttctcc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> SAgshF 正向引物
<400> 36
cggataacgc cattgacttc 20
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> SAgshF 反向引物
<400> 37
cggattgttc agtttctggt c 21

Claims (16)

1.一种γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：
将原核微生物株在半胱氨酸及胱氨酸的总浓度为0.5g/L以下的培养基中进行培养，所述原核微生物株的选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因的表达量比野生株增多，所述原核微生物株能够通过所述1个以上基因的诱导表达而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
2.一种γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：
在培养基中对原核微生物株进行培养，
该方法不包括在所述培养基中添加半胱氨酸或胱氨酸，
所述原核微生物株的选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因的表达量比野生株增多，所述原核微生物株能够通过所述1个以上基因的诱导表达而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
3.一种原核微生物株，其保持有可表达地连接于诱导型启动子的选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因、谷胱甘肽合成酶基因、以及双功能性谷胱甘肽合成酶基因中的1个以上基因，其中，
所述诱导型启动子是在所述1个以上基因为谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的情况下使所述原核微生物株的谷氨酸-半胱氨酸连接酶基因的转录量为野生株的20倍以上的诱导型启动子，
所述原核微生物株能够通过所述1个以上基因的诱导表达而过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸、双-γ-谷氨酰胱氨酸、γ-谷氨酰胱氨酸、还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。
4.根据权利要求3所述的原核微生物株，其中，
所述诱导型启动子为IPTG诱导型启动子、光诱导型启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。
5.根据权利要求4所述的原核微生物株，其中，
所述诱导型启动子为T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、tac启动子、araBAD启动子、rhaBAD启动子、tet启动子、penP启动子、cspA启动子、或者包含tetO或lacO操纵子作为操纵子序列的启动子。
6.根据权利要求5所述的原核微生物株，其中，
所述诱导型启动子为T5启动子、T7启动子、lacT5启动子、lacT7启动子或tac启动子。
7.根据权利要求6所述的原核微生物株，其中，
所述诱导型启动子为T5启动子。
8.根据权利要求3～7中任一项所述的原核微生物株，其为肠道细菌的转化体。
9.根据权利要求3～7中任一项所述的原核微生物株，其为大肠杆菌的转化体。
10.一种微生物，其缺失了以下的[1]基因及[2]基因、且增强了[3]基因或[4]基因的表达：
[1]编码γ-谷氨酰转移酶(EC:2.3.2.2)的基因；
[2]编码谷胱甘肽还原酶(EC:1.8.1.7)的基因；
[3]编码谷氨酸-半胱氨酸连接酶(EC:6.3.2.2)的基因、以及编码谷胱甘肽合成酶(EC:6.3.2.3)的基因；
[4]编码双功能性谷胱甘肽合成酶的基因。
11.根据权利要求10所述的微生物，其缺失了以下的[5]基因：
[5]编码三肽肽酶(EC:3.4.11.4)的基因。
12.根据权利要求10或11所述的微生物，其中，
微生物为细菌的转化体。
13.根据权利要求10或11所述的微生物，其中，
微生物为肠道细菌的转化体。
14.根据权利要求10或11所述的微生物，其中，
微生物为革兰氏阴性菌的转化体。
15.根据权利要求10或11所述的微生物，其中，
微生物为大肠杆菌的转化体。
16.一种谷胱甘肽的制造方法，该方法包括：
在培养基中培养权利要求10～15中任一项所述的微生物。
CN202080080653.9A 2019-11-22 2020-11-20 有用物质的制造方法 Pending CN114761541A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-211477 2019-11-22
JP2019211477 2019-11-22
JP2020002363 2020-01-09
JP2020-002363 2020-01-09
PCT/JP2020/043356 WO2021100846A1 (ja) 2019-11-22 2020-11-20 有用物質の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114761541A true CN114761541A (zh) 2022-07-15

Family

ID=75980127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080080653.9A Pending CN114761541A (zh) 2019-11-22 2020-11-20 有用物质的制造方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220290203A1 (zh)
CN (1) CN114761541A (zh)
WO (1) WO2021100846A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202311258D0 (en) * 2023-07-21 2023-09-06 Neobe Therapeutics Ltd Methods and compostions

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101715490A (zh) * 2007-04-06 2010-05-26 协和发酵生化株式会社 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法
WO2013054447A1 (ja) * 2011-10-14 2013-04-18 味の素株式会社 γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素
CN108456664A (zh) * 2018-03-29 2018-08-28 上海理工大学 一种乳杆菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶表达盒及其构建和应用
CN109055291A (zh) * 2018-07-31 2018-12-21 张家港市华天药业有限公司 用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8188241B2 (en) * 2006-03-22 2012-05-29 University Of Utah Research Foundation Immobilized proteins and methods and uses thereof
WO2012075045A2 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Salk Institute For Biological Studies Release factor 1 (rf1) in escherichia coli
US20180044710A1 (en) * 2015-03-04 2018-02-15 Kaneka Corporation Method for producing glutathione

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101715490A (zh) * 2007-04-06 2010-05-26 协和发酵生化株式会社 谷胱甘肽及γ-谷氨酰半胱氨酸的制造方法
WO2013054447A1 (ja) * 2011-10-14 2013-04-18 味の素株式会社 γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素
CN108456664A (zh) * 2018-03-29 2018-08-28 上海理工大学 一种乳杆菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶表达盒及其构建和应用
CN109055291A (zh) * 2018-07-31 2018-12-21 张家港市华天药业有限公司 用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALINA V. SMIRNOVA等: "Extracellular superoxide provokes glutathione efflux from Escherichia coli cells", RESEARCH IN MICROBIOLOGY, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 612 *
KENTARO KIRIYAMA等: "Oxidized glutathione fermentation using Saccharomyces cerevisiae engineered for glutathione metabolism", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 97, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 1 - 2 *
XIONG ZQ等: "Functional analysis and heterologous expression of bifunctional glutathione synthetase from Lactobacillus", J. DAIRY SCI., 31 December 2018 (2018-12-31), pages 7 - 29 *
ZHANG JING等: "Systematic manipulation of glutathione metabolis m in Escherichia coli for improved glutathione production", MICROB CELL FACT, vol. 15, no. 38, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 3 *
林军: "用于生物合成谷胱甘肽的重组大肠杆菌-酵母耦合系统的高效运行机制", CNKI博士电子期刊, no. 12, 15 December 2010 (2010-12-15), pages 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220290203A1 (en) 2022-09-15
WO2021100846A1 (ja) 2021-05-27
JPWO2021100846A1 (zh) 2021-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7638297B2 (en) Compositions of orthogonal lysyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pairs and uses thereof
EP2013353B1 (en) Process for the production of cadaverine
JP2023507482A (ja) グアニジノ酢酸の発酵生産方法
US20090029425A1 (en) Process for the production of beta-lysine
US20110027829A1 (en) Methods and Compositions
US20240117295A1 (en) Microorganisms and uses thereof
JP2012085637A (ja) γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法
WO2020257707A1 (en) Biosynthesis of enzymes for use in treatment of maple syrup urine disease (msud)
CN114761541A (zh) 有用物质的制造方法
CN108623696B (zh) 一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法
KR20230006803A (ko) 미생물 공정을 통한 nmn 및 이의 유도체 생산
US8211688B2 (en) Process for producing L-glutamine using Escherichia coli with deficient glnB and glnE function
US20240117298A1 (en) Microorganism that produces useful substance and method for producing useful substance
JP7664847B2 (ja) 有用物質の製造方法
KR20230079228A (ko) 람노스 대사 장애를 갖는 숙주 세포에서 재조합 단백질을 제조하는 방법 및 그의 발현 벡터, 숙주 세포 및 재조합 단백질
CN109385390A (zh) 驹形杆菌属重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产所述微生物的方法
US20230304061A1 (en) Microorganism that produces useful substance and method for producing useful substance
CN118931855A (zh) 高癸酸耐受性的达托霉素高产工程菌株及其构建和应用
CN118995681A (zh) 一种酶活提高的甲基转移酶突变体及其应用
KR20200010901A (ko) 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법
Fisher ex vivo DNA cloning
JPH0355108B2 (zh)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination