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CN114752532B - 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用 - Google Patents

一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用 Download PDF

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CN114752532B CN202210479049.4A CN202210479049A CN114752532B CN 114752532 B CN114752532 B CN 114752532B CN 202210479049 A CN202210479049 A CN 202210479049A CN 114752532 B CN114752532 B CN 114752532B
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Abstract

本发明公开了一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株F4NT，所述大肠杆菌分离株F4NT保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022090，保藏日期为2022年1月18日。该分离株同时表达Peg和F4两种菌毛黏附素抗原，在小鼠体内持续定植7天并诱导小鼠产生针对Peg菌毛和F4菌毛的特异性抗体，其中Peg菌毛抗体滴度在21天达1:8，具有作为诱导小鼠宿主产生免疫应答的大肠杆菌活疫苗候选株的潜在应用价值。值得注意的是，产肠毒素致病性大肠杆菌（ETEC）F4 ETEC标准株C83902仅能在小鼠体内1天内存在（黏附定植），且无特异性抗体产生。

Description

一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠 杆菌分离株的鉴定及其潜在应用。
背景技术
产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4(或K88)是导致新生和断奶仔猪腹泻的重要病原 菌，可引发仔猪黄痢和白痢等多种疾病，对养猪生产构成严重威胁，养猪业每年因此遭 受巨大的经济损失。F4菌毛抗原可分为F4ab、F4ac和F4ad 3种血清变异型、流行性病 调查发现，3种血清型中，F4ac为优势变异型。研究表明对断奶仔猪腹泻的237个F4 ETEC菌株进行PCR检测，发现F4ac占98.0％，F4ab占0.8％，F4ad占1.3％。病原大 肠杆菌F4致病性由两个因素决定，一是菌体在宿主小肠上皮细胞的黏附定植能力；二 是其产生肠毒素的能力，通常通过菌体表面菌毛黏附素特异性结合到小肠上皮细胞刷状 缘特定的受体上。ETEC在致病腹泻中的关键毒力因子包括肠毒素和黏附定植因子抗原 或菌毛。这些黏附定植因子抗原或菌毛介导细菌附着到宿主上皮细胞并促进细菌黏附定 植。F4菌毛由faeA～faeJ十个基因编码，其中FaeG蛋白为主要结构蛋白和黏附亚单位。 FaeG与仔猪小肠上皮上的特异性F4菌毛受体结合，从而介导F4 ETEC的黏附和定植。 通过研究ETEC在动物模型中致病性，发现小鼠对ETEC不易感，且ETEC并不能使小 鼠黏附定植致病，包括不能在小鼠肠上皮细胞黏附定植。研究表明在口服接种ETEC菌 株后，小鼠没有出现腹泻或脱水，并且ETEC菌株在小鼠小肠中不能黏附定植。
菌毛在细菌与宿主细胞附着中起着重要的作用，通过黏附作用在宿主的肠道上皮细 胞和肠粘膜中黏附定植、增殖从而感染侵袭宿主。peg操纵子存在于多种沙门氏菌中，包括表达于鸡白痢(不具有鞭毛)、鸡伤寒(不具有鞭毛)和肠炎沙门氏菌(鞭毛)中， 目前没有peg菌毛操纵子在大肠杆菌中表达的相关研究报道。研究表明pegA在鸡肠道 中的黏附定植发挥着重要作用。pegA缺失菌株接种鸡后第3天和第7天，对于盲肠黏 附定植有明显的减弱作用，仅在第10天逐渐恢复。表明peg菌毛操纵子突变菌株在鸡 盲肠中的黏附定植显著减弱。此外，在小鼠体内竞争试验表明peg缺失菌株在动物体内 脏器组织的黏附定植也显著减弱，表明peg操纵子对于肠炎沙门氏菌在肝脏和脾脏中的 黏附定植必不可少，也是肠炎沙门氏菌在小鼠感染致病不可缺少的致病因子。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一株能够表达Peg和F4菌毛的大肠杆菌分离株F4NT，该菌株F4NT同时表达Peg和F4两种菌毛抗原，该大肠杆菌分离 株能够有效在小鼠体内黏附定植，并且能够诱导小鼠宿主产生针对Peg菌毛和F4菌毛 的特异性抗体。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一株能同时黏附定植和改变小鼠 易感性的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT，所述大肠杆菌分离株(Escherichia coli) F4NT保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022090，保藏日 期为2022年1月18日。
其中，所述的表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT经血清学测试和PCR验证表明该菌株能表达Peg菌毛和F4菌毛，培养情况和生化特性与F4大肠杆菌标准株C83902一致。
其中，将表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT传60代，每10代通过 PCR和血清学方法检测所述分离株Peg菌毛和F4菌毛的遗传稳定性，表明Peg菌毛和 F4菌毛能够稳定存在于所述分离菌株F4NT中。
其中，所述的表达Peg菌毛的猪源无致病性F4大肠杆菌分离株F4NT以1×109CFU灌胃6周龄的BALB/c小鼠，不会导致小鼠发病和死亡，并能有效定植于小鼠肠道内并 诱导宿主产生F4和Peg菌毛的特异性抗体。
本发明内容还包括所述的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT的培养方法，包 括以下步骤：从保存的菌种中挑取少量划线于LB或麦康凯培养基的固体平板，培养温度为37℃，其中在LB琼脂平板中，37℃培养后可形成黄白色圆形光滑菌落；在麦康 凯琼脂平板中，37℃培养后可形成桃红色圆形菌落；之后挑取菌落于摇管中，震荡培养 获得该菌株的新鲜菌液。
本发明内容还包括所述的能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT在制备检测抗原介导间接凝集试验中的载体中的应用或在制备检测抗体介导间接凝集试验中的载体中的应用。
其中，所述大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT与F4菌毛多克隆抗体和Peg菌毛多克隆抗体均发生凝集，与生理盐水不发生凝集。
本发明内容还包括所述的能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT在制备易感性小鼠生物载体候选载体中的应用。
本发明内容还包括所述的能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT在制备大肠杆菌F4和Peg菌毛的特异性抗体中的应用。
本发明内容还包括一种特异性抗体，所述特异性抗体是由所述的能同时黏附定植和 改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT免疫动物获得。
本发明内容还包括所述的能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株(Escherichia coli)F4NT在制备干预F4和Peg菌毛黏附素黏附定植中的应用。
作为本发明的具体的内容，本发明检测了表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT在小鼠体内中黏附定植能力，所述分离株对6周龄的BALB/c小鼠不感染致病， 临床剖检未发现明显病变，小鼠未出现任何感染症状，对小鼠在感染后第1天、第3天、 第5天、第7天和第14天进行粪便细菌分离和PCR检测，证明所述分离株能有效黏附 定植于小鼠肠道，表明所述分离株具有成为改变宿主小鼠易感性生物载体菌候选载体的 潜力。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明的分离株F4NT能够在小鼠体内持续黏附定植7天并诱导小鼠产生针对Peg和F4菌毛的特异性抗体，其中Peg 抗体滴度在21天达1∶8，而产肠毒素致病性大肠杆菌(ETEC)F4 ETEC标准株C83902 仅能在小鼠体内存在(黏附定植)1天，且无特异性抗体产生。该分离株F4NT能够较 有效黏附定植于小鼠体内，有效改变了大肠杆菌对小鼠宿主黏附定植和易感性，具有作 为诱导小鼠宿主免疫应答的大肠杆菌载体菌候选株的潜在应用价值。
附图说明
图1为表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT的peg操纵子PCR鉴定结 果；
图2为表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT的Peg菌毛表达验证；图 2-1：a：F4NT菌株与生理盐水不反应；b：F4NT菌株与F4菌毛多克隆抗体发生凝集反 应；c：F4NT菌株与Peg菌毛多克隆抗体发生凝集反应。图2-2：a：C83902菌株与生 理盐水不反应；b：C83902菌株与F4菌毛多克隆抗体发生凝集反应；c：C83902菌株 与Peg菌毛多克隆抗体不反应。图2-3：a：CMCC50336菌株与生理盐水不反应；b： CMCC50336菌株与F4菌毛多克隆抗体不反应；c：CMCC50336菌株与Peg菌毛多克隆 抗体发生凝集反应。
图3为表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT和标准菌株C83902的生长 曲线；
图4为大肠杆菌分离株F4NT和标准菌株C83902免疫小鼠血清中F4及Peg菌毛抗 体滴度测定结果；
图5为表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT和标准菌株C83902在小鼠 粪便中载菌量测定结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理 解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT的分离和鉴定
将45日龄断奶仔猪(源自江苏扬州郊县一散养猪场的仔猪粪便样品，该猪场较少发生大肠杆菌感染)，张晓洁于2021年4月16日采集45日龄断奶仔猪30份粪便样品 按照国家标准方法(GB 4789.6-2016)(中华人民共和国国家标准，GB4789.6-2016，食 品微生物学检验：致泻大肠埃希氏菌检验[S]，2016.)进行细菌学检测。将样品进行实 验室留样，取约25g样品放置于含有225mL无菌液体LB培养基的无菌烧杯中，充分 搅拌后置于无菌锥形瓶中180r/min震荡培养6h。取10μL培养物接种于30mL肠道菌 增菌培养基(成分为每100mL水中含明胶胰酶水解物1g，二水合磷酸氢二钠0.8g， 牛胆盐0.2g，亮绿0.0015g，葡萄糖0.5g，磷酸二氢钾0.2g，pH值7.2±0.2)置于42℃ 增菌18h。将增菌液划线接种麦康凯平板，置于37℃培养16h，挑取桃红色圆形可疑 菌落。
挑取可疑菌落于三糖铁培养基中斜面划线，再于底层穿刺，置于37℃培养箱静置培 养48小时。同时挑取单个可疑菌落接种于乳糖、靛基质、蛋白胨水、硫化氢、尿素、 氰化钾(KCN)生化微量反应管中，24小时内观察生化反应结果(见表2)。
挑取分离株的单菌落接种于LB培养基，37℃过夜培养后，于洁净玻片上分别滴加10μL鼠源K88ac(F4)多克隆抗体和Peg菌毛多克隆抗体(王思权.抗沙门氏菌Peg 菌毛单克隆抗体制备的一种简捷方法与初步应用[D].扬州大学，2021.)，然后混合上述分 离菌株培养物，观察其是否能产生血清凝集反应，判断其血清型。(所述诊断血清均由 本实验室保存，羊扬，厚华艳，郁磊，等.大肠杆菌K99菌毛fan操纵子的克隆、表达 及活性[J].微生物学报，2012)。将菌液与血清混匀上下晃动玻片，2min内呈现明显凝 集颗粒者为阳性，呈均匀混浊者为阴性。同时以生理盐水、F4产肠毒素大肠杆菌C83902 菌株(F4ac+，LT+，STb+)(周明旭.K88ac+产肠毒素大肠杆菌相关新毒力因子的研究[D]. 扬州大学，2016.)、标准肠炎沙门氏菌菌株CMCC 50336(朱春红.肠炎沙门氏菌SEF14 菌毛功能探索[D].扬州大学，2010.)作为对照(结果见表3)。
利用F4菌毛faeG基因和peg操纵子特异性引物对上述分离菌株进行PCR鉴定， 以标准F4产肠毒素大肠杆菌C83902菌株和标准肠炎沙门氏菌菌株CMCC 50336作为 对照。引物序列见表1，序列从上至下依次为SEQ IDNo.1-4。
三糖铁试验结果为斜面产酸呈黄色，底部产酸呈黄色，不产硫化氢。同时结合微量生化管试验可初步判断该分离株为猪源大肠杆菌。
表1分离株F4NT血清型和肠毒素鉴定的PCR扩增引物表
Figure BDA0003623588270000051
表2分离株F4NT的生化鉴定情况
Figure BDA0003623588270000052
表3分离株F4NT的血清学鉴定情况
Figure BDA0003623588270000053
Figure BDA0003623588270000061
注：“+”代表血清学凝集反应阳性；“-”代表血清学凝集反应阴性。
以faeG up/lo和peg up/do引物经PCR扩增，faeG及peg扩增的反应体系均为20μL，包含2×Taq Master Mix(Dye Plus)10μL，faeG up/lo或peg up/do(10μM)各1μL， DNA模板分别为：本实验室分离株F4NT或本实验保存的F4大肠杆菌标准株C83902 (朱春红，朱国强.大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初 步研究[J].生物技术通讯，2008(02)：236-239.)或由扬州大学焦新安教授惠赠肠炎沙门氏菌 标准株CMCC50336菌株(杨溢.特定沙门氏菌鞭毛相关假基因的探索研究[D].江苏： 扬州大学，2020.)DNA模板(震荡培养至OD600为1时获得该菌株的新鲜菌液100℃5 分钟后的上清液为DNA模板)2μL，灭菌超纯水6μL补足20μL；faeG PCR反应条件： 94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，进行25个循环；72℃10min。Peg PCR 反应条件：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃5min，进行25个循环；72℃10 min。结果显示，分离株可同时扩增出约446bp和4829bp大小的片段，F4标准菌株 C83902对照仅有446bp的faeG片段，标准肠炎沙门氏菌菌株CMCC 50336仅有4829bp 的peg操纵子片段，结果见图1。该结果说明上述分离株的基因组中同时携带F4菌毛和 Peg菌毛基因。分离株与大肠杆菌F4菌毛和Peg菌毛多克隆抗体均发生凝集，与生理盐水不凝集；F4强毒标准株C83902仅与F4多克隆抗体发生凝集，而与Peg菌毛多克 隆抗体不发生凝集；肠炎沙门氏菌标准株CMCC 50336则仅与Peg菌毛多克隆抗体发生 凝集，结果见图2。该结果表明上述分离株为一株同时表达F4菌毛和Peg菌毛的猪源 大肠杆菌F4NT。该分离株F4NT保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武 汉，保藏编号为CCTCCNO：M 2022090，保藏日期为2022年1月18日，分类命名为 大肠杆菌(Escherichia coli)F4NT。
实施例2：表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT的Peg菌毛和F4菌毛遗传稳定性检测
将表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT在麦康凯固体培养基上划线， 挑取单菌落接种至无抗性LB培养基中进行纯化，然后经上述PCR和血清学方法进行鉴 定，以生理盐水作为对照。随后将上述分离株F4NT在无抗性LB培养基中连续传代60 次，每10代通过PCR和血清学方法检测所述分离株Peg菌毛和F4菌毛的遗传稳定性。
上述分离株验证正确后，连续传10代、20代、30代、40代、50代和60代通过上 述faeG up/lo和peg up/do引物PCR扩增均可扩增出约446bp和4829bp大小的条带。 将上述代次的细菌菌液与Peg菌毛和F4菌毛多克隆抗体进行混合后均有显著的凝集反 应。上述结果表明Peg菌毛和F4菌毛能够稳定存在于所述分离菌株中，结果见表4。
表4 F4NT分离株F4菌毛和Peg菌毛遗传稳定性检测结果
Figure BDA0003623588270000071
实施例3：表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT的生物学研究
将上述大肠杆菌分离株F4NT和F4强毒标准株C83902的单个菌落接种于液体LB 中37℃过夜震荡培养，次日吸取菌液划线于麦康凯平板进行培养特性比较。同时将两种 菌株进行蔗糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、麦芽糖、甘露醇、靛基质、甘露糖、枸橼酸、 卫矛醇、鸟氨酸、赖氨酸、氰化钾、硫化氢、尿素、ONPG、MR试验、V-P试验、半 固体琼脂、侧金盏花、硝酸盐还原等微量生化反应比较以及两种菌株的生长曲线比较(表 5所示)。
在麦康凯平板上分离株F4NT和F4强毒标准株C83902均长出桃红色圆形光滑菌落，两者无显著性差异。
表5分离株F4NT和F4标准株C83902的生化特性比较
Figure BDA0003623588270000081
注：“+”代表生化反应阳性；“-”代表生化反应阴性。
上述分离株F4NT和F4标准株C83902的生长曲线测定结果如图3所示，并用SPSS17.0中非参数检验方法对两种菌株的迟缓期、对数期、稳定期的生长曲线进行对比，发 现分离株的生长速度与F4强毒标准株C83902无显著性差异(P＞0.05)。
实施例5：检测表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株在小鼠体内定植情况和诱导 抗体水平
将84只6周龄BALB/c小鼠随机分为3组，每组28只，将上述分离株F4NT和F4 强毒标准株C83902以1×109CFU/mL灌胃，另设磷酸盐缓冲液对照组，灌胃量为200μL， 每组隔离饲养，无抗生素饲料饲喂，仔细观察一周，每天对小鼠进行观察。分别于1天、 3天、5天、7天和14天采粪便，按照前述国家标准方法(GB 4789.6-2016)进行细菌学分 离，挑选疑似菌落用前述faeG up/do和peg up/do引物、体系和程序进行PCR鉴定。同 时在第1天、第7天、第14天、第21天和第28天利用断尾采血获得各组小鼠血清， 然后将上述各组血清分别与分离株、F4强毒标准株C83902和表达Peg菌毛的猪源无致 病性F4大肠杆菌分离株的细菌悬液混合，观察凝集结果，并对血清进行倍比稀释，测 试血清抗体效价。
饲养过程中各组小鼠状态良好，无任何症状及不良反应。说明表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株F4NT与F4强毒标准株C83902均不会引起小鼠的发病。粪便的 载菌结果如图5，直至第7天仍能在小鼠粪便中分离到上述分离株，而F4强毒标准株 C83902在小鼠体内仅能在存在(黏附定植)1天。
血清抗体凝集试验检测结果，从第7天起便可以在分离株黏附定植和感染小鼠的血 清中检测到针对分离株的特异性抗体，所述血清与分离株细菌悬液发生显著的凝集反应， 并且抗体效价在感染后21天达到峰值(图4)；但是磷酸盐缓冲液处理组以及F4强毒 标准株C83902感染组小鼠血清均不与分离株发生凝集反应。F4强毒标准株C83902和 肠炎沙门氏菌标准株CMCC 50336的细菌悬液仅与分离株感染7天后的小鼠血清发生凝 集，而与其他所有血清均不发生凝集反应。
上述结果表明表达Peg和F4菌毛的猪源大肠杆菌分离株能够有效黏附定植于小鼠肠道，并有效诱导宿主小鼠的免疫应答，成功改变了宿主小鼠黏附定植和易感性。而 F4大肠杆菌标准株C83902黏附定植小鼠肠道时间极短，无法引起宿主的免疫应答。
综上，本申请发明的分离鉴定方法、基本特性、和表达Peg和F4菌毛的猪源大肠 杆菌分离株的重要功能。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提 下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都要求在保护本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌（Escherichia coli）分离株F4NT，其特征在于，所述大肠杆菌（Escherichia coli）分离株F4NT保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022090，保藏日期为2022年1月18日。
2.权利要求1所述的大肠杆菌分离株（Escherichia coli）F4NT的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：从保存的菌种中挑取少量划线于LB或麦康凯培养基的固体平板，培养温度为37 ℃，其中在LB琼脂平板中，37 ℃培养后可形成黄白色圆形光滑菌落；在麦康凯琼脂平板中，37 ℃培养后可形成桃红色圆形菌落；之后挑取菌落于摇管中，震荡培养获得该菌株的新鲜菌液。
3.权利要求1所述的能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌（Escherichia coli）分离株F4NT在制备检测抗原介导间接凝集试验中的载体中的应用或在制备检测抗体介导间接凝集试验中的载体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌（Escherichia coli）分离株F4NT与F4菌毛多克隆抗体和Peg菌毛多克隆抗体均发生凝集，与生理盐水不发生凝集。
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产毒性大肠杆菌菌毛抗原F_(41)单克隆抗体的制备及其特异性研究;李元,吕苹,吴玉水,汪美先;细胞与分子免疫学杂志(第03期);全文 *

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